Informacija

Heterologinės ekspresijos žmogaus ląstelėje pavyzdžiai šalia virusinės ekspresijos

Heterologinės ekspresijos žmogaus ląstelėje pavyzdžiai šalia virusinės ekspresijos



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Paprastai žmonės yra suinteresuoti išreikšti žmogaus baltymus greitai augančiuose organizmuose, pavyzdžiui, bakterijose, kad per trumpą laiką gautų maksimalų baltymų kiekį. Baltymų gamybai padidinti buvo naudojamas kodonų naudojimo harmonizavimas / optimizavimas. Kodono naudojimo vaidmuo buvo ištirtas viruso baltymų ekspresijos kontekste, tačiau ar yra koks nors žmogaus ląstelių linijų naudojimo heterologinei ekspresijai pavyzdys?


Be tyrimų (kaip minėjo mxwsn), žmogaus ląstelių linijose gaminama daug faktinių baltymų pagrindu pagamintų vaistų ir vakcinų. Viena iš pirmųjų masinių žmogaus ląstelių linijos kultūrų buvo beždžionių beždžionių poliomielito vakcinos gamyba (šaltinis). Beveik kiekvienas mokslininkas, dirbantis molekulinėje laboratorijoje, vienu metu per savo karjerą išaugino HeLa ląsteles!


GFP ekspresija žmogaus ląstelių linijose mokslinių tyrimų tikslais yra labai dažnas heterologinių baltymų ekspresijos pavyzdys.

Tyrimo tikslais paprastai nebūtina optimizuoti kodonų, kad būtų padidinta ekspresija, ypač todėl, kad naudojant efektyvesnius stipriklius ir promotorius, ekspresijos lygis pagerėja daug geriau nei kodonų optimizavimas, kuris nėra trivialus ir būdingas rūšiai.


Sintetinė biologija ir medžiagų apykaitos inžinerija augaluose ir mikrobuose A dalis. Mikrobų metabolizmas

J.W.A. van Dijkas, C.C.C. Wang, Methods in Enzymology, 2016 m

Abstraktus

Heterologinė grybelinių antrinių metabolitų genų ekspresija leidžia susidaryti kitaip tyliems antrinių metabolitų biosintezės keliams. Tai taip pat leidžia lengvai išreikšti gamtoje neaptinkamus mutantus arba genų derinius. Dėl šios galimybės modelių grybai yra ideali platforma sintetinei biologijai. Šiame skyriuje pateikiamas išsamus aprašymas, kaip heterologiškai ekspresuoti bet kurį (-ius) grybelio antrinio metabolito geną (-us) gerai išsivysčiusiame šeimininko kamiene. Aspergillus nidulans. Ji apima visus būtinus veiksmus nuo dominančio (-ų) geno (-ų) identifikavimo iki mutantinių padermių kultivavimo, kad susidarytų antriniai metabolitai.


Baltymų ekspresijos apžvalga

Baltymai sintetinami ir reguliuojami priklausomai nuo funkcinio poreikio ląstelėje. Baltymų brėžiniai saugomi DNR ir dekoduojami labai reguliuojamais transkripcijos procesais, kad būtų gauta pasiuntinio RNR (mRNR). Tada mRNR užkoduotas pranešimas paverčiamas baltymu. Transkripcija yra informacijos perkėlimas iš DNR į mRNR, o vertimas yra baltymų sintezė, pagrįsta iRNR nurodyta seka.

Paprasta transkripcijos ir vertimo schema. Tai apibūdina bendrą informacijos srautą nuo DNR bazių poros sekos (geno) iki aminorūgščių polipeptido sekos (baltymo).

Prokariotuose transkripcijos ir vertimo procesas vyksta vienu metu. MRNR vertimas prasideda dar prieš visiškai susintetinant subrendusią mRNR nuorašą. Ši vienalaikė geno transkripcija ir transliacija vadinama susietąja transkripcija ir vertimu. Eukariotuose procesai yra erdviškai atskirti ir vyksta nuosekliai, kai transkripcija vyksta branduolyje, o transliacija arba baltymų sintezė vyksta citoplazmoje.

Prokariotų ir eukariotų transkripcijos ir vertimo palyginimas.

Šiame 118 puslapių vadove pateikiama išsami informacija apie baltymų ekspresiją ir jis padės pasirinkti tinkamą ekspresijos sistemą bei valymo technologijas, atitinkančias jūsų konkrečias taikymo sritis ir poreikius. Gaukite patarimų ir gudrybių pradėdami eksperimentą ir raskite atsakymus į kasdienes problemas, susijusias su baltymų raiška.

Tiek prokariotuose, tiek eukariotuose transkripcija vyksta trimis etapais: iniciacija, pailgėjimas ir pabaiga. Transkripcija prasideda, kai dvigrandė DNR išvyniojama, kad būtų galima prisijungti prie RNR polimerazės. Pradėjus transkripciją, RNR polimerazė išsiskiria iš DNR. Transkripciją įvairiais lygiais reguliuoja aktyvatoriai ir represoriai, taip pat chromatino struktūra eukariotuose. Prokariotams nereikia jokios specialios mRNR modifikacijos, o pranešimo vertimas prasideda dar nepasibaigus transkripcijai. Tačiau eukariotuose mRNR toliau apdorojama, kad būtų pašalinti intronai (splaisavimas), 5' gale pridedamas dangtelis ir 3' mRNR gale yra daug adeninų, kad būtų sukurta poliA uodega. Tada modifikuota mRNR eksportuojama į citoplazmą, kur ji verčiama.

Vertimas arba baltymų sintezė yra daugiapakopis procesas, kuriam reikia makromolekulių, tokių kaip ribosomos, pernešančios RNR (tRNR), mRNR ir baltymų faktoriai, taip pat mažos molekulės, tokios kaip aminorūgštys, ATP, GTP ir kiti kofaktoriai. Kiekvienam vertimo etapui yra specifinių baltymų faktorių (žr. lentelę žemiau). Bendras procesas yra panašus tiek prokariotuose, tiek eukariotuose, nors yra tam tikrų skirtumų.

Iniciacijos metu mažas ribosomos subvienetas, prijungtas prie iniciatoriaus t-RNR, nuskaito mRNR, pradedant nuo 5' galo, kad nustatytų ir surištų iniciacijos kodoną (AUG). Didelis ribosomos subvienetas prisijungia prie mažo ribosomos subvieneto, kad generuotų iniciacijos kompleksą iniciacijos kodone. Baltymų faktoriai, taip pat sekos mRNR dalyvauja atpažįstant iniciacijos kodoną ir formuojant iniciacijos kompleksą. Pailgėjimo metu tRNR prisijungia prie joms paskirtų aminorūgščių (žinomų kaip tRNR įkrovimas) ir perkelia jas į ribosomą, kur jos polimerizuojamos, kad susidarytų peptidas. Aminorūgščių seka, pridėta prie augančio peptido, priklauso nuo transkripto mRNR sekos. Galiausiai, besiformuojantis polipeptidas atpalaiduojamas užbaigimo etape, kai ribosoma pasiekia terminacijos kodoną. Šiuo metu ribosoma išsiskiria iš mRNR ir yra pasirengusi pradėti kitą transliacijos etapą.


Membraniniai baltymai – inžinerija, valymas ir kristalizacija

Simonas Trowitzschas, Robertas Tampé, knygoje Methods in Enzymology, 2015 m.

1.1 Membraninių baltymų ir membraninių baltymų kompleksų atrankos metodai

Be tinkamo ekspresijos šeimininko pasirinkimo, konstrukcijų inžinerija yra raktas į sėkmingą homogeninių ir stabilių membraninių baltymų kompleksų gamybą struktūrinei analizei. Pavyzdžiui, su G baltymu susietų receptorių kristalizacija pirmą kartą buvo įmanoma generuojant T4 lizocimo sintezę (Rosenbaum ir kt., 2007 Rosenbaum, Rasmussen ir Kobilka, 2009). Tačiau įvertinti bendrą stabilizuojantį poveikį membranos baltymams nėra trivialus. Tirpiems baltymams sukurti stabilumo tyrimai remiasi fluorescenciniais zondais, kurie keičia savo fluorescencines savybes, kai prisijungia prie hidrofobinių pleistrų, atsiskleidžiančių tikslinės molekulės išsiskleidimo proceso metu (Niesen, Berglund ir Vedadi, 2007 Vedadi ir kt., 2006). Dėl būdingo membraninių baltymų hidrofobiškumo ir didelės ploviklių bei lipidų koncentracijos membranos baltymų mėginiuose šis metodas netaikomas membraniniams baltymams. Įrodyta, kad membranos baltymų viduje palaidoti cisteinai yra tinkami kaip stabilumo jutikliai (Alexandrov, Mileni, Chien, Hanson ir Stevens, 2008). Šios įterptos liekanos tampa tirpikliu, veikiamos terminiu denatūravimu tiksliniam baltymui ir tada jas atakuoja su tioliu reaguojantis fluorescencinis zondas. Atskirto zondo fluorescencija yra santykinai maža, tačiau stipriai padidėja, kai zondas yra kovalentiškai susietas su cisteinais. Šis įrankis buvo sukurtas siekiant pagerinti membraninių baltymų stabilumą optimizuojant ekspresijos konstrukcijas, identifikuojant stabilizuojančius ligandus ar lipidus ir įvertinant ploviklius (Alexandrov et al., 2008 Liu, Hanson, Stevens, & Cherezov, 2010).

Fluorescenciniai baltymų žymenys ne tik pasirodė esąs būtinos tiriant baltymų ir baltymų sąveiką ir baltymų lokalizaciją gyvose ląstelėse (Day & Davidson, 2009 Kremers, Gilbert, Cranfill, Davidson ir amp Piston, 2011), bet ir buvo sėkmingai pritaikytos baltymų gamybai. stebėti sistemos veikimą ir baltymų gamybą (Drew ir kt., 2001 Fitzgerald ir kt., 2006 Geertsma, Groeneveld, Slotboom ir Poolman, 2008 Nie, Bellon-Echeverria, Trowitzsch, Bieniossek, & Berger, 2014 Trowitz Palmberg, Fisch , Takagi ir amp Berger, 2012). Membraninių baltymų perprodukcijos ir gryninimo sąlygos funkciniams ir struktūriniams tyrimams buvo žymiai pagerintos įdiegus C-galo sintezę žaliai fluorescenciniam baltymui (GFP), kuris buvo naudojamas baltymų gamybai sekti. E. coli ir Saccharomyces cerevisiae (Drew ir kt., 2006, 2001 Hammon, Palanivelu, Chen, Patel ir amp Minor, 2009). Sujungus su membranos baltymo C galu, GFP gali būti naudojamas kiekybiškai pranešti apie membranos baltymo susilankstymo būseną (Newstead ir kt., 2007). GFP susilanksto į natrio dodecilsulfatui (SDS) atsparią fluorescencinę būseną tik tuo atveju, jei ankstesnis tikslinis baltymas taip pat bus tinkamai sulankstytas (Geertsma ir kt., 2008 Pedelacq ir kt., 2002). Fluorescencija pagrįstos koncepcijos išplėtimą pristatė Gouaux laboratorija, skirta greitam membranos baltymų stabilumo ir monodispersiškumo atrankai gelfiltravimo būdu ir buvo pavadinta fluorescencijos aptikimo dydžio išskyrimo chromatografija (FSEC Kawate & Gouaux, 2006). Taikant šį metodą, C-galo fluorescencinio baltymo žyma yra naudojama apibūdinti membranos baltymo oligomerinę būseną tik iš nanogramų neišgryninto mėginio (Sonoda ir kt., 2010). Taigi duomenis apie rekombinantinio membraninio baltymo išeigą, monodispersiškumo laipsnį ir apytikslę molekulinę masę galima gauti iš mažų kultūros mėginių. FSEC metodo, kaip galingo ikikristalizacinės atrankos metodo integraliniams membraniniams baltymams, pritaikymas neseniai buvo įrodytas dviejų jonų kanalų kristalizavimu ir struktūros nustatymu (Gonzales, Kawate ir amp Gouaux, 2009 Kawate, Michel, Birdsong ir Gouaux, 2009). Vėliau ši technika buvo išplėtota iki termostabilumo tyrimo (Hattori, Hibbs ir Gouaux, 2012). FSEC metodas buvo naudojamas tik baltymams, koduojamiems vieno geno, kaip monomeras arba surinkti į homo-oligomerus. Neseniai sukūrėme FSEC metodą, skirtą daugelio baltymų membranų kompleksų analizei, įvesdami žymes su skirtingomis fluorescencinėmis savybėmis (Parcej, Guntrum, Schmidt, Hinz ir Tampé, 2013). Pažymėti skirtingais fluorescenciniais baltymais, kiekviename gryninimo etape galima stebėti atskirus daugiaproteininių membranų kompleksų subvienetus nanogramų kiekiais. per įvairių metodų, kaip aprašyta toliau.


Išraiškos vektoriai: tipai & charakteristikos

Ekspresijos vektoriai yra vektoriai, kurie veikia kaip DNR intarpo nešikliai ir taip pat leidžia efektyviai ekspresuoti DNR intarpą. Tai gali būti plazmidės arba virusai. Ekspresijos vektoriai taip pat žinomi kaip ekspresijos konstruktai.

Ekspresijos vektoriai yra genetiškai modifikuoti, kad genai būtų įvesti į tikslines ląsteles. Be dominančio geno, šiose ekspresijos konstrukcijose taip pat yra reguliavimo elementų, tokių kaip stiprintuvai ir promotoriai, kad įvyktų veiksminga dominančio geno transkripcija.

Paprasčiausios ekspresijos konstrukcijos taip pat žinomos kaip transkripcijos vektoriai tik todėl, kad jos leidžia transkripuoti klonuotą svetimą geną, o ne jo transliaciją. Vektoriai, palengvinantys klonuoto svetimo geno transkripciją ir transliaciją, yra žinomi kaip baltymų ekspresijos vektoriai. Šios baltymų ekspresijos konstrukcijos taip pat skatina rekombinantinio baltymo gamybą.

Dabar transkripcijai ir vertimui būtinas promotorius ir užbaigimo seka. Transkripcija prasideda promotoriuje ir baigiasi pabaigos vietoje. Ekspresijos vektorių promotoriai turi turėti įjungimo/išjungimo jungiklius. Šie jungikliai padeda reguliuoti geno produkto gamybą. Per didelis dominančio geno produkto kiekis gali būti toksiškas ląstelei. Įprastas promotorius, naudojamas ekspresijos konstrukcijose, yra mutantinė lac promotoriaus versija lacUV. LacUV promotorius inicijuoja aukštą transkripcijos lygį indukuotomis sąlygomis. Be to, kai kuriuose ekspresijos vektoriuose ribosomų surišimo vieta yra prieš pradinį kodoną. Ribosomų surišimo vieta palengvina efektyvų klonuoto svetimo geno vertimą.

Ekspresijos vektoriai plačiai naudojami molekulinėje biologijoje tokiuose metoduose kaip nukreipta mutagenezė.

Kaip veikia išraiškų vektoriai?

  • Kai ekspresijos konstrukcija yra ląstelės šeimininkės viduje, transkripcijos būdu gaminamas dominančio geno koduotas baltymas. Vėliau jis naudoja šeimininko organizmo vertimo mašinas ir ribosominius kompleksus.
  • Dažnai plazmidė yra genetiškai modifikuota taip, kad jame būtų reguliavimo elementai, tokie kaip stiprikliai ir promotoriai. Šios reguliatorių sekos padeda efektyviai transkripuoti dominantį geną.
  • Ekspresijos vektoriai yra plačiai naudojami kaip įrankiai, padedantys gaminti mRNR ir, savo ruožtu, stabilius baltymus. Jie labai domisi biotechnologijomis ir molekuline biologija baltymų, tokių kaip insulinas, gamybai. Insulinas yra pagrindinė sudedamoji dalis gydant sudėtingą ligą – diabetą.
  • Kai baltyminis produktas yra išreikštas, jis turi būti išgrynintas. Baltymų gryninimas yra iššūkis, nes dominantis baltymas, kurio genas yra perneštas ekspresijos vektoriuje, turi būti išgrynintas nepriklausomai nuo šeimininko organizmo baltymų. Kad valymo procesas būtų paprastesnis, dominantis genas, esantis ekspresijos vektoriuje, visada turėtų turėti „žymą“. Ši žyma gali būti bet koks žymeklis peptidas arba histidinas (Jo žyma).
  • Ekspresijos vektoriai yra labai išnaudojami tokiuose metoduose kaip nukreipta mutagenezė. Klonavimo vektoriai įveda dominantį geną į plazmidę, kuri savo ruožtu replikuojasi bakterijose. Šie klonavimo vektoriai nebūtinai turi sukelti baltymo ekspresiją.

Todėl ekspresijos vektoriai turi turėti šiuos išraiškos signalus:

  • Stiprus rėmėjas,
  • Stiprus pabaigos kodonas,
  • Atstumo tarp promotoriaus ir klonuoto geno reguliavimas,
  • Įterpta transkripcijos nutraukimo seka ir
  • Nešiojama vertimo inicijavimo seka.

Rėmėjas

  • Promotorius užtikrina patikimą dominančio geno transkripciją. Be to, stiprūs promotoriai taip pat reikalingi veiksmingai mRNR sintezei su RNR polimeraze.
  • Protoriaus reguliavimas yra dar vienas svarbus aspektas, kurį visada reikia turėti omenyje kuriant ekspresijos vektorių.
  • Stipriausi promotoriai yra bakteriofaguose T5 ir T7.

Į E. coli, reklamuotojas reguliuojamas dviem būdais:

Indukcija: cheminių geno transkripcijos jungiklių pridėjimas.

Represijos: cheminių medžiagų pridėjimas išjungia geno transkripciją.

Dažniausiai naudojami promotoriai E. coli išraiškos sistemos yra šios:

  • Jis reguliuoja lac Z geno transkripciją. Lac Z genas yra atsakingas už β-galaktozidazės gamybą.
  • Lac Z geną gali sukelti IPTG, izopropiltiogalaktozidazė.
  • Lac promotoriaus sekos gali būti sujungtos su tiksliniu genu. Tada tai sukels nuo laktozės priklausomą tikslinio geno ekspresiją.
  • Nepaisant to, lac promotorius turi savo trūkumų. Jis yra gana silpnas ir negali būti naudojamas dideliam norimų baltymų gamybos lygiui. Be to, lac genai atlieka bazinį transkripcijos lygį net ir nesant indukcijos (induktoriaus molekulės).
  • Jis atsakingas už genų, dalyvaujančių triptofano biosintezėje, grupės reguliavimą.
  • Triptofanas veikia kaip jo represorinė molekulė ir jį sukelia 3-β-indoleakrilo rūgštis.
  • Jis susidaro hibridizuojant lac ir trp promotorių. Tačiau jis yra stipresnis nei bet kuris iš jų.
  • Tac promotorių indukuoja IPTG, izopropiltiogalaktozidazė.
  • Tai stiprus promotorius ir atsakingas už λDNR transkripciją E. coli
  • λcI geno produktas veikia kaip jo represorius. Jis vadinamas λ represoriumi.
  • Išraiškos konstrukcija su λPL promotorius naudojamas kartu su E. coli mutantinis šeimininkas. Jis atsakingas už temperatūrai jautrios λ represoriaus formos gamybą.
  • Esant žemai temperatūrai, represoriaus baltymas slopina transkripciją, o klonuoto geno transkripcija vyksta aukštoje temperatūroje, nes represorius inaktyvuojamas aukštoje temperatūroje.
  • Kad baltymai būtų ekspresuojami žinduolių ląstelėse, promotorius turi būti prieš klonuotą cDNR, kad būtų veiksmingai transkripcija.
  • Daugeliu atvejų viruso promotoriai naudojami tik todėl, kad jie yra patikimi stipriai konstitucinei ekspresijai.
  • Plačiai naudojami promotoriai yra CMV promotorius (gautas iš citomegaloviruso) ir SV40 promotorius (gautas iš 40 viruso).

Promotoriai komerciškai prieinamuose mielių ekspresijos vektoriuose gali būti aktyvūs konstituciškai arba indukuojami.

Konstitucinis promotorius yra tam tikras promotorius, kuris yra nereguliuojamas ir leidžia nuolat transkripuoti su juo susijusį geną.

Konstitucinio promotoriaus pavyzdys: gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazę koduojančio geno GAP promotorius.

Indukuojamas promotorius yra tas, kuris veikia reguliuojamai ir su jais susijusių genų ekspresija gali būti įjungiama arba išjungiama tam tikru vystymosi etapu arba tam tikru momentu.

Indukuojamų promotorių pavyzdžiai: AOX1, GAL1, GAL10, nmt1, nmt42 ir nmt81.

The AOX1 promotorius alkoholio oksidazę koduojančio geno. Jį sukelia metanolis ir jis geriausiai tinka baltymo ekspresijai Pichia pastoris.

The GAL1 ir GAL10 reklamuotojai yra kiti pavyzdžiai. Juos sukelia galaktozė ir jie yra tinkami baltymų ekspresijai Saccharomyces cerevisiae.

The nmt1, nmt42, ir nmt81 promotoriai, kuriuos tiaminas sukelia baltymų ekspresijai Schizosaccharomyces pombe.

Reporteris Genas

  • Reporterio genas yra atsakingas už baltymo, kurį galima aptikti ir kiekybiškai įvertinti naudojant paprastą tyrimą, gamybą.
  • Jie naudojami kaip priemonė genų ekspresijos efektyvumui išmatuoti ir taip pat aptikti baltymo lokalizaciją ląstelėse.
  • Struktūrinio geno ekspresijos greitis priklauso nuo reguliavimo sekų, esančių prieš jį.
  • Geno ekspresijos greitį galima išmatuoti pakeitus jo baltymą koduojančią dalį. Be to, jis gali būti sujungtas su kitu genu, kuris išreiškia kitą baltymą. Šio kito baltymo buvimą galima lengvai nustatyti.
  • Reporteriniai genai yra naudingi nustatant promotorius, stipriklius ir kitus baltymus arba reguliuojančius elementus, kurie su jais jungiasi.

Dažniausiai naudojami reporterių genai:

  • Ji veikia kaip reporteris dalyvaujant X-gal.
  • Jo lygiai lengvai nustatomi pagal gaunamos spalvos intensyvumą. Mėlynos spalvos intensyvumas yra kiekybiškai įvertintas.

2. CAT (chloramfenikolio acetiltransferazę) koduojantis genas E. coli

  • CAT genas koduoja chloramfenikolio acetiltransferazę.
  • Transferazės fermentas yra atsakingas už acetilo grupių perkėlimą iš acetilo CoA į recipiento antibiotiką chloramfenikolį.

3. Liuciferazę koduojantis ugniagesių genas, Photinus pyralis

  • Liuciferazė yra atsakinga už luciferino oksidaciją.
  • Dėl liuciferino oksidacijos išsiskiria geltonai žalia šviesa. Šviesos spinduliavimas yra lengvai aptinkamas, nepaisant žemo lygio.

4. Žalią fluorescencinį baltymą (GFP) koduojantis medūzos genas, Aequorea victoria

  • GFP atrado Shimomura.
  • Tai autofluorescencinis baltymas su 238 aminorūgščių likučiais, kuriuos gamina bioliuminescencinė medūza Aequorea victoria.
  • GFP β-barelį sudaro vienuolika β gijų. Per centrą eina α-spiralė. Chromoforas yra statinės viduryje. Aminorūgščių liekanos nuo 65 iki 67, kurių seka Ser-Tyr-Gly sudaro chromoforą p-hidroksibenzilidenimidazolinoną, kuris yra fluorescencinis. Chromoforas fluorescuoja esant didžiausiam bangos ilgiui 508 nm (žalia šviesa), kai jis yra apšvitintas UV arba mėlyna šviesa (400 nm).
  • GFP yra baltymų lokalizacijos nustatymo įrankis.
  • Jis tarnauja kaip žyma, per kurią jis suliejamas su baltymu, kurio ekspresija turi būti stebima. Iš esmės tiriama baltymo subląstelinė lokalizacija.
  • Genų inžinerijos metodai padeda gaminti vektorius, kuriuose yra neatpažinto baltymo X, klonuoto į GFP koduojančią seką, kodavimo seka.
  • Šis GFP-X sulietas produktas dabar gali būti transfekuotas į tikslines ląsteles, o X baltymo ekspresija, taip pat tarpląstelinė vieta gali būti lengvai stebima ir aptikta.

Ribosomų surišimo ir vertimo inicijavimo svetainė

  • Ribosomų surišimo vieta (RBS) eina paskui promotorių. Jis atsakingas už veiksmingą klonuoto geno vertimą.
  • Prokariotų vertimo inicijavimo vieta yra žinoma kaip Shine Dalgarno seka. Ši seka įtraukta tik į RBS.
  • Transliacijos inicijavimo vietos konsensuso seka apima 8 bazių porų rinkinį, esantį prieš AUG pradžios kodoną.
  • Vertimas eukariotuose pradedamas tam tikra seka, vadinama Kozako seka.
  • Šioje vietoje sumontuota ribosomų mašina, skirta mRNR vertimui.

Polilinkeriai

  • Kiekvienas vektorius turi tam tikras restrikcijos fermentų atpažinimo vietas. Būtent restrikcijos vietoje vektorius išpjaunamas, kad klonuotų dominantį svetimą geną.
  • Šios vietos dažnai yra arti viena kitos ir todėl vadinamos polilinkeriais arba daugybinėmis klonavimo vietomis (MCS).
  • Šie regionai yra nuo 50 iki 100 bazinių porų ilgio ir gali turėti iki 25 restrikcijos vietų grupę.

Poli-A (poliadenilinimas) Uodega

  • Susidariusios mRNR gale esanti poli-A uodega apsaugo mRNR nuo skilimo, kurį sukelia egzonukleazės arba endonukleazės.
  • Tai labai svarbu mRNR stabilumui.
  • Jis taip pat yra atsakingas už transkripcijos ir transliacijos nutraukimą ir stabilizuoja mRNR gamybą.
  • Nukleolitinis fermentų kompleksas ir poli-A-polimerazė yra būtinos sąlygos poli-A uodegos pridėjimui mRNR gale.

Išraiškos sistema

Baltymų gamybai reikalinga ekspresijos sistema. Yra dviejų tipų ekspresijos sistemos, prokariotinės ir eukariotinės ekspresijos sistemos. Kiekvienas iš jų turi savų privalumų ir trūkumų, į kuriuos galima atsižvelgti kuriant išraiškos sistemą. Tačiau nėra tokios ekspresijos sistemos, kurią būtų galima laikyti universalia heterologinių baltymų gamybai.

Prokariotų raiškos sistema

  • RNR polimerazės promotoriaus specifiškumą prokariotų atveju lemia sigmos faktorius.
  • E. coli yra plačiai naudojama prokariotų ekspresijos sistema.
  • Jis išreiškia didelį baltymų kiekį.
  • The E. coli štamai yra genetiškai manipuliuojami rekombinantinio baltymo gamybai, kad jie būtų saugūs didelio masto eksperimentams ir fermentacijai.
  • Baltymų gryninimas tapo lengvesnis, nes rekombinantinius sulietus baltymus galima išvalyti afinine chromatografija, pavyzdžiui, glutationo-S-transferazę ir maltozę surišančius sulietus baltymus.

Nepriklausomai nuo pažangos ir patobulinimų, vykstančių prokariotų ekspresijos sistemoje, vis dar yra daug sunkumų ir iššūkių, susijusių su baltymų gamyba iš klonuotų svetimų genų. Tokie iššūkiai gali būti suskirstyti į 2 kategorijas:


Diskusija

Duomenys, kuriuos pateikiame šiame tyrime, rodo, kad (a) LEF-10 gali funkcionaliai pakeisti mielių Sup35 baltymo PrD, todėl jis mielėse gali veikti kaip prionas, ir (b) kad LEF-10 baltymas gali egzistuoti dviejuose skirtinguose. konformacijos vabzdžių ląstelėse. Toks elgesys in vivo visiškai atitinka tai, kad LEF-10 yra bakuloviruso koduotas prioną formuojantis baltymas. Iki šiol buvo pranešta apie visus anksčiau nustatytus prionus ląstelių gyvybės formose. Nežinoma, ar virusai, gausiausios ir įvairiausios gyvybės formos, gali naudoti prionus, todėl mūsų atradimas prionus išplečia ir virusų pasaulyje.

Mielių tyrimai atskleidė, kad daugelyje prionų baltymų yra didelės agregacijos tendencijos domenų, kurie paprastai yra praturtinti glutamino ir asparagino likučiais. Remiantis šiais atradimais, buvo sukurti keli PrD numatymo algoritmai 34, 36, 37, 38, 39 , kurie savo ruožtu leido atrasti daugiau prionų kandidatų su Q / N turtingais domenais 7, 11, 12 . Priešingai šiai bendrai charakteristikai, funkciniai PrD taip pat buvo aprašyti prionų baltymuose, kuriuose nėra daug Q / N, pvz., HET-s9, Mod58 ir, kaip parodyta šioje ataskaitoje, LEF-10. Šie netipiniai PrD neturi konsensuso pirminių sekų ir nėra linkę į specifines aminorūgščių liekanas. Kadangi eksperimentinis priono baltymo identifikavimas užima daug laiko, ypač genomo mastu, universalaus skaičiavimo algoritmo sukūrimas yra būtina užduotis. Šis darbas yra iššūkis ir iš dalies priklauso nuo daugiau ne Q / N turtingų prionų baltymų atradimo. Pateikiame dar vieną tokį atvejį, kuris informuos apie būsimus šių algoritmų pokyčius.

Dauguma mielių prionų yra citoplazmoje ir turi ne Mendelio paveldėjimą, tačiau dėl virusų neląstelinio pobūdžio viruso koduoti prionai yra labiau susiję su viruso replikacijos reguliavimu. Kai bakulovirusai užkrečia vabzdžių ląsteles dideliu kiekiu ir LEF-10 ekspresijos lygis pasiekia slenkstį, baltymas linkęs formuoti agregatus, dėl kurių sustabdoma pasroviui esanti geno ekspresija. Toks reguliavimo mechanizmas gali būti naudingas bakuloviruso perdavimui populiacijoje (6c pav.). Keista, kad LEF-10, būdamas šios reguliavimo sistemos jutikliu, yra jautresnis prionų būsenai, nei buvo galima tikėtis. LEF-10 blokuojantis poveikis atsirado tik esant mažesniam nei 1 MOI (papildomas 8 pav.) ir yra gerai žinoma, kad didelis MOI sumažins rekombinantinio baltymo gamybą, naudojant bakulovirusą kaip ekspresijos platformą 40 (nors yra priešingai). ataskaita apie Orgyia pseudotsugata daugiakapsidės branduolinės polihedrozės virusą 41 ). Remdamiesi savo išvadomis, teigiame, kad LEF-10 yra savaime ribojantis veiksnys, blokuojantis viruso vėlyvojo geno ekspresiją esant dideliam MOI, o iš LEF-10 gauto apribojimo atpalaidavimas gali būti veiksmingas būdas pagerinti bakuloviruso ekspresijos vektoriaus sistemos produktyvumą. .

Genų ekspresijos reguliavimas gali vykti įvairiais lygiais. Baltymų aktyvumo keitimas per alosterinius baltymo pokyčius, be abejo, yra greitas būdas reguliuoti genų ekspresiją pasroviui, ypač virusams, kurių generavimo laikas labai trumpas. Kaip parazitiniai organizmai, virusų dauginimasis priklauso nuo aplinkos, kurią sudaro jų šeimininkai. Perjungiama prioną sudarančio baltymo konformacija gali leisti virusams greitai reaguoti į stresą, kurį sukelia jų šeimininkai. Šis pranašumas gali paskatinti į prionus panašių baltymų patikrinimą ir sulaikymą sparčiai vystantis virusui. Mes taip pat spėliojame, kad mažai tikėtina, kad virusų pasaulyje bus reti baltymai, turintys prionų savybių, ir ateityje bus rasta daugiau viruso koduojamų prionus formuojančių baltymų.

Kryžminis sėjimas yra reiškinys, kai heterologinis agreguotas baltymas gali paskatinti kito baltymo de novo konversiją į agreguotą formą 29, 42, 43 . Buvo pranešta apie kelis su žmogaus ligomis susijusio kryžminio sėjimo pavyzdžius. Pavyzdžiui, α-sinukleino agregatai gali skatinti Tau baltymo agregaciją neuronuose42. Amiloidas beta (Aβ) gali pagreitinti Tau agregaciją in vivo 44 ir taip pat gali veikti kaip sėkla, skatinanti α-sinukleino agregaciją in vitro 45 . Be to, buvo pranešta, kad mikrobiotos gaminamas amiloido baltymas padidina α-sinukleino agregaciją senose žiurkėse ir nematoduose 46 . Šie besikaupiantys įrodymai, kad amiloidų formavime plačiai paplitęs heterologinis kryžminis sėjimas, iškyla galimybė, kad patogeniniai baltymai, linkę į agregaciją, taip pat gali sukelti amiloido susidarymą, taigi ir žmonių ligas. Mokslininkai jau seniai pastebėjo ryšį tarp virusinės infekcijos ir Alzheimerio ligos47, o naujausios ataskaitos dar labiau patvirtino šį ryšį48,49. Nors dar per anksti apibendrinti, atradus pirmąjį viruso kilmės prioną, dabar daugiau dėmesio reikėtų skirti tam, ar viruso užkoduoti prionai gali sukelti su prionais susijusių ligų biogenezę po virusinės infekcijos gyvūnams, ypač žmonėms. .


EKSPERIMENTINĖS PROCEDŪROS

Ląstelių kultūros

Įprastos CHO-K1 ląstelės, glikozaminoglikano neturinčios CHO-PgsA-745 ląstelės (ATCC CRL-2242), heparano sulfato trūkumas CHO-PgsD-677 ląstelės (ATCC CRL-2244) ir HEK293 ląstelės buvo gautos iš ATCC ir laikomos standartinėmis sąlygomis DMEM, papildytu 10% FBS. HEK-TetOn pažangios ląstelės buvo gautos iš Clontech ir kultivuojamos standartinėmis sąlygomis.

Stabili, tetraciklino indukuojama ląstelių linija

HEK-TetOn ląstelės buvo kartu transfekuotos su laukinio tipo FGFRL1 ir FGFRL1㥌 pTRE (Tet Responsive Element plazmidėje iš Clontech) ir linijiniu higromicino atrankos žymekliu (Clontech) ir atrinktos 150 μg/ml higromicino 2 savaites. Sveikos kolonijos buvo paimtos klonavimo cilindrais ir patikrintos dėl indukuojamos FGFRL1 ekspresijos Northern blot būdu. Ekspresijai sukelti į auginimo terpę buvo pridėta 1000 ng/ml doksiciklino (Clontech).

Ląstelių ir ląstelių sintezės tyrimas

CHO ląstelės buvo auginamos iki 50% susiliejimo 100 mm lėkštelėse ir transfekuotos 2 μg luciferaze (pTRE-Luc) tetraciklinu indukuojamame ekspresijos vektoriuje (pTRE, Clontech), naudojant Metafectene transfekcijos reagentą (Biontex). HEK-TetOn ląstelės buvo auginamos iki 50% susiliejimo 60 mm lėkštelėse ir transfekuotos 1 μg FGFRL1 ekspresijos konstrukcijų pcDNA3.1 (Invitrogen). Po 36 valandų dvi ląstelių populiacijos buvo tripsinizuotos ir pasėtos į 12 šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo šiek tiek perteklinis. Tada ląstelės buvo paliktos susilieti per naktį, esant 1000 ng/ml doksiciklino (Clontech). Liuciferazės aktyvumas buvo tiriamas po ląstelių lizės naudojant Promega luciferazės tyrimo sistemą. Liuciferazės aktyvumas, išmatuotas šuliniuose, kuriuose yra tik CHO ląstelės, buvo atskaitos taškas ir buvo atimtas kaip fonas. Kaip kontrolė, CHO ląstelės buvo sėjamos kartu su HEK-TetOn laukinio tipo ląstelėmis. Norint blokuoti suliejimą, 2 μg/ml monokloninio humanizuoto Fab fragmento (16) prieš žmogaus FGFRL1 ektodomeną į ląstelių auginimo terpę buvo įdėta po ląstelių sėjimo. 2 μg/ml antikūno prieš FGFRL1 citoplazminį domeną (Santa Cruz Biotechnology) buvo naudojamas kaip kontrolinis antikūnas.

Norint vizualizuoti sintezę, vietoj luciferazės konstrukcijos buvo transfekuotas eGFP (iš Clontech gyvų spalvų ekspresijos plazmidės) pTRE. Suliejimo eksperimentams su FGFRL1 laukinio tipo konstrukcija (1 pav. ir ​ ir 2), 2), 10 μg/ml heparino natrio druskos (Sigma) buvo pridėta į auginimo terpę, sėjant ląsteles.

Latrunculin-B, citochalasin-D ir nocodazole buvo įsigyti iš Axxora (Šveicarija), praskiesti DMSO ir pridedami prie auginimo terpės po ląstelių sėjimo. Heparanase I pirkau iš Sigma. Jis buvo pridėtas, kai ląstelės pradėjo jungtis 5 vienetais / ml DMEM be serumo. Išsamų FGFRL1 ir FGFR konstrukcijų, kurios buvo išbandytos dėl jų fuzogeninio aktyvumo, sąrašą rasite toliau.

Egzogeniniai glikozaminoglikanai

Norint patikrinti egzogeninių GAG poveikį ląstelių ir ląstelių susiliejimui, kiekvieno iš jų buvo pridėta 0,01 � μg/ml į auginimo terpę sėjant. Iš Sigma buvo: Ląstelių kultūros laipsnio heparino natrio druska iš kiaulių gleivinės (H3149), dermatano sulfatas (C3788), chondroitino sulfatas A (chondroitino-4-sulfatas) iš galvijų trachėjos (C9819), dekstrano sulfatas (D7140), chondroitinas-6- ryklio kremzlės sulfatas (C4384), natrio heparano sulfatas iš galvijų inkstų (H7640). Hialurono rūgšties natrio druska iš žmogaus bambagyslės buvo iš Fluka (53740).

Susiliejimo laiko kurso eksperimentas

HEK293 ląstelės buvo transfekuotos FGFRL1㥌𹐒-eGFP, tripsinuotos ir pasėtos kartu su netransfekuotomis, tripsinizuotomis CHO-PgsA ląstelėmis ant dengiamųjų stiklelių 30 mm lėkštelėse esant susiliejančiam tankiui (CHO ir HEK ląstelių santykis 5:1). Laiko taškas, kai ląstelės pradėjo prisitvirtinti (𢏆 val. po sėjos), buvo imtas kaip pradžios taškas. Nuo tada vienas indas buvo tvirtinamas kas 40 minučių ir nudažytas DAPI. Siekiant iliustruoti sintezės proceso eigą, buvo padaryta reprezentatyvi nuotrauka iš kiekvieno laiko taško (iki 160 min.).

GST ištraukimas ir masės spektrometrija

FGFRL1㥌 ir FGFRL1㥌𹐒 sintezės konstrukcijos su glutationu S-transferazė (iš pGEX, GE-Healthcare) buvo sukurta sutapimo PGR ir klonuota į pcDNA3.1. HEK293 ląstelės buvo transfekuotos konstruktais ir stabiliai ekspresuojančios ląstelės buvo atrinktos 800 μg/ml G418 per 3 savaites. Ląstelės buvo auginamos iki susiliejimo 150 mm lėkštelėse, lizuojamos 1% Triton-X100 PBS, papildytos Roche Complete Mini proteazės inhibitoriumi ir centrifuguojamos esant 25 000 × g 30 min 4 ଌ temperatūroje. Supernatantas buvo inkubuojamas su glutationo granulėmis 4 valandas 4 ± 000 °C temperatūroje, po to pakartotinai plaunami karoliukai PBS. Surišti baltymai buvo eliuuojami prisotintu karbamidu (Fluka) PBS. Norint įvertinti ištraukimo efektyvumą, 50% eliuato buvo virinama SDS mėginio buferyje, atskirta SDS-PAGE ir vizualizuota gelio dažymu sidabru (sidabro dažymo rinkinys iš Pierce). Norint identifikuoti baltymus, kurie buvo išgryninti kartu su FGFRL1-GST, likusio eliuate esantys baltymai buvo virškinami tripsinu, atskirti HPLC (Waters Alliance HT2795) ir identifikuoti Bruker Esquire3000plus jonų gaudyklės masės spektrometru. Kaip kontroliniai mėginiai, HEK293 laukinio tipo ląstelės arba ląstelės, ekspresuojančios tik GST, buvo apdorotos tokiu pačiu būdu. Baltymai, aptikti keturių nepriklausomų kontrolinių ištraukiamųjų eksperimentų metu (du laukinio tipo ir du stabiliai transfekuoti GST), buvo atimti iš baltymų, aptiktų keturiuose FGFRL1㥌-GST ir FGFRL1㥌𹐒-GST išskleidžiamuose žemynuose. Be to, teršalų baltymai, kurie paprastai jungiasi su Sepharose karoliukais, paskelbti Trinkle-Mulcahy ir kt. (17), buvo atimti.

FGFRL1 ir FGFR ekspresijos konstrukcijos

C-galu sutrumpintos žmogaus FGFRL1 konstrukcijos buvo sukurtos taip, kaip aprašyta Rieckmann ir kt. (16). Galutinė ekspresijos plazmidė užkoduota šioms aminorūgštims: RL1㥌-(1�), RL1ΔHisΔTyr-(1�), RL1ΔHis2-(00394His2-(1), 00394His2-(1) x02013504). FGFRL1 konstrukcijos su ištrynimais ektodomene buvo pagrįstos C-galo sutrumpinta konstrukcija (1�) ir užkoduotos šioms aminorūgštims: FGFRL1㥌㥁-(1-26 + 113–RL41), FGFRL3–. x0039423- (1 & # x02013144 + 361 & # x02013416), FGFRL1 & # x00394C & # x0039412- (1 & # x0201329 + 238 & # x02013416), FGFRL1 & # x00394C & # x003943- (1 & # x02013240 + 357 & # x02013416), FGFRL1 & # x00394C & # x003942- (1� + 240�). The soluble ectodomain (RL1exSol) covered the nucleotide sequence for amino acids 1�. The FGFRL1㥌 and FGFRL1㥌𹐒 fusion constructs with GST and eGFP were generated by overlap PCR and encoded the proteins described above with a C-terminal GST (from pGEX, Invitrogen) or eGFP (from Clontech Living Colors expression plasmid) moiety. The C-terminally truncated FGFR constructs corresponded to the following amino acids: FGFR1㥌-(1�), FGFR2㥌-(1�), FGFR3㥌-(1�), FGFR4㥌-(1�).

Imunocitochemija

Cells were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS, permeabilized and blocked with 0.2% Triton-X100 and 1% BSA in PBS followed by staining with a monoclonal, humanized Fab-fragment antibody against the FGFRL1 ectodomain (1 μg/ml, described in Rieckmann ir kt. (16)) and secondary anti-human Fab Cy3- or Cy2-coupled antibodies (Jackson Laboratories). The actin cytoskeleton was visualized by staining with TRITC-coupled phalloidin (Sigma). Nuclei were stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Invitrogen). After mounting with Mowiol, the cells were inspected with a Nikon Eclipse E1000M microscope. The confocal images of the C-terminally truncated FGFRL1 proteins and those of FGFRL1 and the actin cytoskeleton were taken on a Carl Zeiss LSM510 confocal microscope.

Surface Biotinylation of FGFRL1

The different FGFRL1 variants were stably transfected into HEK293 cells via puromycin selection. Whole cell extracts were prepared by boiling of the cells in SDS sample buffer, followed by Western blot analysis of FGFRL1 expression with a polyclonal antibody against the ectodomain of human FGFRL1 (Rɭ Systems). All cell lines were grown to 80% confluence in 100 mm cell culture dishes followed by surface biotinylation with the Pierce cell surface isolation kit according to manufacturer's instructions. The isolated surface proteins were separated by SDS-PAGE and biotinylated FGFRL1 was detected by Western blotting with the antibody described above.

Apoptosis Detection

HEK293 cells were transfected with FGFRL1㥌𹐒-eGFP and co-cultured with CHO-PgsA cells. The time point of cell attachment was taken as the starting point. For the caspase 3/7 activity assay, the cells were lysed in the culture dishes by adding 0.2% Triton-X100 to the culture medium at the indicated time points. 50 μl of the lysate was given to 50 μl of luminometric caspase 3/7 detection solution (Promega), incubated for 15 min at room temperature followed by measurement of caspase activity in a luminometer. For the TUNEL staining, the fused cells were fixed after 16 h and stained with the Roche In Situ Cell Death Detection kit according to manufacturer's instructions.


Roles of Micro-RNAs in Metabolism

Abstraktus

Micro-RNAs (miRNAs) are a group of small RNAs that inhibit gene expression by inducing mRNA degradation or repressing mRNA translation. miRNAs represent an ancient and evolutionally conserved mechanism to regulate gene expression in plants and animals. Growing evidence indicated that miRNAs participate in many metabolic processes, including adipocyte differentiation, development of pancreatic islet cells, insulin secretion and signaling, and fatty acid metabolism. Further, certain miRNAs are associated with metabolic dysregulation and thus are candidate targets for therapeutic development. Overall, the studies of miRNA have added a completely new dimension to our understanding of the complex regulatory mechanisms underlying energy homeostasis.


Padėkos

We thank Christiane Schaffitzel and Ralf Wellinger for discussions, as well as Philipp Berger, Yvonne Hunziker, Martina Mijuskovic, Carl DeLuca and Robert Coleman for assistance. We appreciate helpful comments on baculovirus expression from Robert Noad and Polly Roy. I.B. was a Liebig fellow of the Fonds der Chemischen Industrie (FCI, Germany), D.J.F. was supported by a Human Frontiers Science Program (HSFP) post-doctoral fellowship. We appreciate support from the Swiss National Fund through membership in the National Center for Competence in Research Structural Biology.