Informacija

Kaip įvyksta nukleofilinė ataka DNR replikacijos metu?

Kaip įvyksta nukleofilinė ataka DNR replikacijos metu?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Sveiki,

Esu sutrikęs dėl to, kaip DNR replikacijos metu įvyksta nukleofilinis priepuolis. Žiūrėjau šį vaizdo įrašą iš biologijos profesoriaus (https://www.youtube.com/watch?v=y4hKibS2fAo)

Žiūrėjau šį vaizdo įrašą, kuriame teigiama, kad DNR replikacijos metu hidroksilo grupė sudaro kovalentinį ryšį su fosfatu, o dvi fosforo grupės yra išeinančios grupės.

Suprantu tokių reakcijų pagrindus, bet tai tiesiog atrodo painu. Matau, kad deguonis, kuris buvo hidroksilo grupės dalis, sudaro kovalentinę jungtį su fosforu. Bet kas atsitiks su vandeniliu? Ir kodėl dviguba jungtis ir HO padėtis keičia padėtį iš pirmos nuotraukos į antrą?

Taip pat yra keletas nuotraukų, kuriose matyti, kaip gaminamas vanduo. Tačiau vaizdo įraše teigiama, kad hidroksilo grupė sudaro ryšį su fosfato grupe. Kaip tai veikia?

Labai ačiū


Polimerazės naudoja dviejų metalų jonų mechanizmą, kad prie augančios RNR grandinės pridėtų naują NTP. Šiame procese naudojami du Mg2+ jonai; metalo jonas A dalyvauja formuojantis nukleofilui (O-), kad įvyktų SN2 reakcija, o metalo jonas B dalyvauja reakcijoje vykstančios pereinamosios būsenos stabilizavime. Kad įvyktų NTP pridėjimas prie RNR grandinės, aktyvuota 3' hidroksilo grupė (O-) veikia kaip nukleofilas ir atakuoja gaunamo NTP alfa fosfatą. Reakciją inicijuoja deprotonacijos įvykis. Metalo jonas A prisideda prie šio deprotonavimo, nes sumažina hidroksilo pKa (todėl jis yra rūgštesnis), todėl lengviau deprotonuojasi ir susidaro nukleofilas, protoną priima netoliese esanti aspartato liekana (ne vandens) – doi: 10.1021/ja403842j. Po hidroksilo atakos mechanizmas vyksta per pentakovalentinę pereinamąją būseną, kaip ir standartinėje Sn2 reakcijoje, o pirofosfato grupė (PPi) pašalinama. Vaizdas yra ne mano, bet iš šio popieriaus: https://doi.org/10.1038/34542, kuris yra gana geras, kaip ir šis dokumentas: doi: 10.1074/jbc.274.25.17395 ir šis https://doi .org/10.1016/j.molcel.2006.03.013


DNR replikacija ir taisymas

DNR replikacija yra procesas, kurio metu genetinė medžiaga, užkoduota DNR sekoje, yra nukopijuojama, kad ją būtų galima perduoti naujoms ląstelėms ir palikuonims. Žmonėms DNR replikacija yra priežastis, dėl kurios esame panašūs į savo tėvus ir giminaičius.

Nors replikacijos tikslas yra gauti identišką originalios DNR kopiją, dėl proceso klaidų tai tampa neįmanoma ir atsiranda mutacijų. Nors šios mutacijos gali būti mirtinos ląstelėms, daugelis jų nėra ir veikia kaip ląstelių palikuonių įvairinimo priemonė. Replikacijos procesas yra būtinas ląstelių augimui ir dauginimuisi.

Diskusiją pradėsime pasauliniu mastu pažvelgdami į tai, kaip vyksta DNR replikacija ir kokios mutacijos dažniausiai atsiranda. Tada konkrečiau pažvelgsime į molekules, atsakingas už replikacijos palengvinimą, ir į cheminius šio proceso mechanizmus. Galiausiai pažvelgsime į tai, kaip integruotos taisymo sistemos, kurias DNR naudoja, kad sukurtų patikimas kopijas, išlaiko žemą mutacijų dažnį.

2′ dezoksiribonukleozido trifosfatas – DNR replikacijos statybiniai blokai. Penkių narių, deguonies turintis ribozės cukraus žiedas, turintis tris fosfatų grupes, prijungtas prie 5′ anglies ir arba adenino, citozino, guanino arba timino bazinę grupę, prijungtą prie 1′ anglies.

Bazinės poros iškirpimas – Viena DNR taisymo sistemos klasė. Atpažįsta ir pašalina vieno nukleotido mutacijas, kurios atsiranda dėl nenatūralių bazių.

Dukra sruogelė – Nurodo naujai susintetintą DNR grandinę, kuri DNR replikacijos metu nukopijuojama pridedant komplementarių nukleotidų iš vienos jau egzistuojančios DNR grandinės.
DNR helikazė – Fermentas, atsakingas už dviejų DNR grandžių atskyrimą spirale, kad jas būtų galima kopijuoti DNR replikacijos metu.

DNR ligazė– Fermentas, atsakingas už sandarumą, nutrūksta arba įtrūksta DNR grandinėje. Atsakingas už Okazaki fragmentų sujungimą atsiliekančioje grandinėje DNR replikacijos metu.
DNR polimerazė – Fermentas, atsakingas už nukleotidų substratų pridėjimą prie DNR tiek DNR replikacijos metu, tiek po jo.

Primase – Fermentas, atsakingas už RNR pradmenų sintezės inicijavimą atsiliekančioje grandinėje DNR replikacijos metu.

Holofermentas – Terminas, naudojamas apibūdinti įvairių fermentų, veikiančių kartu tam tikrame procese, pvz., DNR replikacijos, rinkinį.

Hidrolizė – Procesas, kurio metu į molekulę chemiškai pridedamas vanduo.

Atsiliekanti sruoga – Atliekant DNR replikaciją, jau egzistuojančios DNR grandinė, kuri yra orientuota 5′–3′ kryptimi, atsižvelgiant į replikacijos kryptį, kurioje sintezė yra nepertraukiama.

Pirmaujanti kryptis– DNR replikacijos metu jau egzistuojančios DNR grandinė, orientuota 3′–5′ kryptimi, atsižvelgiant į replikacijos kryptį, kurioje replikacija yra nenutrūkstama.

Neatitikimo remontas – Viena DNR taisymo sistemos klasė. Atpažįsta ir pašalina mutacijas, atsirandančias dėl bazių poravimosi, kuris nėra vienas kitą papildantis.

Okazaki fragmentas – Trumpi naujai susintetintos DNR ruožai, rasti atsiliekančioje grandinėje DNR replikacijos metu.

Replikacijos kilmė – DNR replikacijos pradžios vieta. Trumpas, dažniausiai vidinis DNR spiralės ruožas, kuris atsidaro taip, kad kiekviena grandinė yra atskira DNR replikacijai.

Tėvų kryptis – DNR replikacijoje reiškia iš anksto egzistuojančią vieną DNR grandinę, kuri yra nukopijuota į naują DNR grandinę per komplementarią bazių porą.

Pirofosfatas– Dviejų fosfatų turinti molekulė. DNR replikacijos metu jis išsiskiria iš 2′ dezoksiribonukleozido trifosfato, kai jis pridedamas prie augančios, naujai susintetintos DNR grandinės. Vėlesnė jo hidrolizė suteikia energijos prisijungimo reakcijai.

Replikacija šakutė – Terminas, naudojamas apibūdinti sandūrą, kurioje nukleotidų substratai pridedami prie augančios DNR grandinės DNR replikacijos metu. Jo forma primena “Y”, kur dvi šakos žymi vienos grandinės dukterines DNR grandines, o bazė – spiralinę DNR.

RNR pradmenys – Trumpi ribonukleotidų (RNR substratų) ruožai, rasti atsiliekančioje grandinėje DNR replikacijos metu. Padeda inicijuoti atsiliekančių sruogų replikaciją ir vėliau pašalinamos.

Pusiau konservatyvus– Nurodo faktą, kad po vienos DNR spiralės replikacijos kiekvienoje iš dviejų susidariusių dukterinių spiralių yra po vieną naujai susintetintą ir vieną jau esamą DNR grandinę.

Trumpas pleistro ekscizija – Viena DNR taisymo sistemos klasė. Atpažįsta ir pašalina trumpus DNR ruožus, kurie supa mutacijas, atsirandančias dėl didelių DNR grandinės aduktų, trukdančių DNR replikacijai.

Viengrandžiai surišantis baltymas – Baltymas, padedantis išlaikyti DNR grandines, atskirtas DNR helikaze, nuo atsitraukimo spirale. Jis veikia padengdamas atskiras sruogas taip, kad neuždengtų pagrindo, todėl jie gali likti laisvi, kad būtų galima susieti pagrindą.

Timino dimeras – DNR pažeidimo forma, atsirandanti dėl radiacijos. Gretimi timinai toje pačioje DNR grandinėje sudaro ryšį, dėl kurio susidaro tūrinis aduktas, kuris gali trukdyti DNR replikacijai.

Tautomerizacija– Procesas, kurio metu molekulėje vyksta elektronų persitvarkymas, dėl kurio tos pačios molekulės struktūra šiek tiek skiriasi. Dvi tos pačios molekulės formos vadinamos viena kitos “tautomerais”.

DNR replikacija

DNR replikacija yra pusiau konservatyvi

Vienos DNR spiralės DNR replikacija lemia dvi identiškas spirales. Jei pradinė DNR spiralė vadinama „tėvų“ DNR, dvi gautos spiralės gali būti vadinamos „dukterinės spiralės“. Kiekviena iš šių dviejų dukterinių spiralių yra beveik tiksli tėvų spiralės kopija (dėl mutacijų ji nėra 100% vienoda). DNR sukuria „dukteris“, naudodama tėvines DNR grandines kaip šabloną arba vadovą. Kiekviena naujai susintetinta DNR grandinė (dukterinė grandinė) yra pagaminta pridedant nukleotidą, kuris yra komplementarus pirminei DNR grandinei. Tokiu būdu DNR replikacija yra pusiau konservatyvi, o tai reiškia, kad viena pirminė grandinė visada perduodama dukterinei DNR spiralei.

Replikacijos šakės ir replikacijos ištakos

Pirmasis DNR replikacijos žingsnis yra dviejų DNR grandžių, sudarančių kopijuojamą spiralę, atskyrimas. DNR helikazė išsuka spiralę tose vietose, kurios vadinamos replikacijos pradžia. Replikacijos pradžia sudaro Y formą ir vadinama replikacijos šakute. Replikacijos šakutė juda žemyn DNR grandine, paprastai iš vidinės vietos į grandinės galą. Rezultatas yra tai, kad kiekviena replikacijos šakutė turi dvigubą replikacijos šakutę, judančią priešinga kryptimi nuo tos pačios vidinės vietos iki priešingo gijos galo. Viengrandžiai surišantys baltymai (SSB) veikia su helikaze, kad išliktų išvyniota tėvų DNR spiralė. Jis veikia padengdamas išvyniotas sruogas standžiais SSB subvienetais, kurie neleidžia sruogoms susijungti atgal į spiralę. SSB subvienetai padengia atskiras DNR grandines taip, kad neuždengtų bazių, todėl DNR gali išlikti prieinama bazėms susieti su naujai susintetintomis dukterinėmis sruogomis.


kai dvi pagrindinės DNR grandinės yra atskirtos, kad prasidėtų replikacija, viena grandinė yra orientuota 5′-3′ kryptimi, o kita grandinė yra orientuota 3′-5′ kryptimi. Tačiau DNR replikacija yra nelanksti: replikaciją vykdantis fermentas, DNR polimerazė, veikia tik 5′–3′ kryptimi. Ši DNR polimerazės savybė reiškia, kad dukterinės grandinės sintetinasi skirtingais metodais: viena po vieną prideda nukleotidus replikacijos šakutės kryptimi, kita gali pridėti nukleotidus tik gabaliukais. Pirmoji grandinė, kuri atkartoja nukleotidus po vieną, vadinama pirmaujančia grandine, o kita grandinė, kuri replikuojasi dalimis, vadinama atsiliekančia grandine.

Pirmaujančios ir atsiliekančios kryptys

Pirmaujanti kryptis

Kadangi DNR replikacija juda išilgai pagrindinės grandinės 5′–3′ kryptimi, replikacija gali įvykti labai lengvai pirmaujančioje grandinėje. Kaip matyti iš , nukleotidai pridedami nuo 5′ iki 3′ kryptimi. Suaktyvinama RNR primazės, kuri prideda pirmąjį nukleotidą prie besiformuojančios grandinės, DNR polimerazė tiesiog sėdi šalia replikacijos šakutės, juda kaip šakutė, pridedant nukleotidus vieną po kito, išsaugodama tinkamą antilygiagrečią orientaciją. Tokio tipo replikacija, nes ji apima vieną nukleotidą iškart po kito, yra vadinama tęstine.

Atsiliekanti kryptis

Kadangi DNR polimerazė pirminėje grandinėje gali tiesiog sekti replikacijos šakutę, nes DNR polimerazė turi judėti 5′–3′ kryptimi, o atsiliekančioje grandinėje fermentas turi tolti nuo šakutės. Bet jei fermentas nutolsta nuo šakutės, o šakutė atskleidžia naują DNR, kurią reikia replikuoti, kaip iš viso galima replikuoti atsilikusią grandinę? Į šio klausimo keliamą problemą atsakoma pasitelkus išradingą metodą. Atsiliekanti grandinė kartojasi mažais segmentais, vadinamais Okazaki fragmentais. Šie fragmentai yra 100–200 nukleotidų atkarpos žmonėms (1000–2000 bakterijoms), kurios sintezuojamos 5′–3′ kryptimi nuo replikacijos šakutės. Tačiau nors kiekvienas atskiras segmentas yra replikuojamas toliau nuo replikacijos šakės, kiekvienas paskesnis Okazaki fragmentas yra atkartojamas arčiau tolstančios replikacijos šakės nei ankstesnis fragmentas. Tada šie fragmentai sujungiami DNR ligaze, sukuriant ištisinę grandinę. Šis replikacijos tipas vadinamas nepertraukiamu.

Kaip matote aukščiau esančiame paveikslėlyje, pirmasis susintetintas Okazaki fragmentas atsiliekančioje grandinėje yra toliausiai nuo replikacijos šakės, kuri pati tolsta į dešinę. Kiekvienas paskesnis Okazaki fragmentas prasideda replikacijos šakute ir tęsiasi tol, kol susitinka su ankstesniu fragmentu. Tada du fragmentai sujungiami DNR ligaze.

Aukščiau pateiktame paveikslėlyje taip pat matome, kaip replikacija atsiliekančioje grandinėje šiek tiek atsilieka nuo pirmaujančios grandinės. Kadangi atsiliekančios grandinės sintezė vyksta „atgalinio susiuvimo”“ mechanizme, jos replikacija šiek tiek vėluoja, palyginti su sinteze pagrindinėje grandinėje. Atsiliekanti grandinė turi palaukti, kol pradinės spiralės lopinėlis atsidarys nedideliu atstumu prieš naujai susintetintą giją, kad galėtų pradėti sintezę atgal į dukterinės grandinės galą. Šis “vėlavimo” laikas nevyksta priekinėje grandinėje, nes jis sintezuoja naują giją sekdamas tiesiai iš paskos, kai spiralė išsivynioja ties replikacijos šakute.
Kita atsiliekančios grandinės replikacijos komplikacija yra replikacijos inicijavimas. Nors RNR pradmuo pirminėje grandinėje turi suaktyvinti grandinės inicijavimą tik vieną kartą, atsiliekančioje grandinėje turi būti suaktyvintas kiekvienas atskiras Okazaki fragmentas. Tada atsiliekančioje grandinėje fermentas, vadinamas primaze, judantis su replikacijos šakute, sintezuoja daugybę RNR pradmenų, kurių kiekvienas skatina Okazaki fragmento augimą. RNR pradmenys galiausiai pašalinami, paliekant tarpus, kurias užpildo replikacijos mechanizmas.

Problemos

Problema: kodėl DNR replikacija vadinama „pusiau konservatyvia“?
DNR replikacija yra pusiau konservatyvi, nes kiekviena sukurta spiralė turi vieną grandinę iš spiralės, iš kurios ji buvo nukopijuota. Dėl vienos spiralės replikacijos susidaro dvi dukterinės spiralės, kurių kiekvienoje yra viena iš pirminių tėvų spiralės gijų. Jis yra pusiau konservatyvus, nes pusė kiekvienos pirminės spiralės yra konservuota kiekvienoje dukterinėje spiralėje.
Problema: DNR spiralės replikacijos šakių skaičius dažnai yra lyginis. Paaiškinkite šį atradimą.
Kadangi replikacijos pradžios vietos paprastai randamos ne spiralės gale, o spiralės viduje, dėl vienos replikacijos pradžios susidaro dvi replikacijos šakės. Taigi replikacijos šakės paprastai randamos poromis.
Problema: kokia kryptimi (nuo 5′ iki 3′ arba nuo 3′ iki 5′) vyksta biologinė DNR replikacija?
Biologinė DNR replikacija VISADA vyksta 5′–3′ kryptimi.
Problema: grandinė, kurioje DNR replikacija yra nenutrūkstama, vadinama ___________. Strypas, kuriame DNR replikacija yra nenutrūkstama, vadinama ___________.
Pirmaujanti kryptis. Atsiliekanti sruogelė.
Problema: replikaciją atsiliekančioje grandinėje tarpininkauja maži nukleotidų segmentai, vadinami kuo?
Okazaki fragmentai.

DNR replikacijos substratų pridėjimo chemija

Nors pirmaujanti ir atsiliekanti grandinė replikuojasi skirtingai, kiekvienas atskiras nukleotidas, pridėtas prie kiekvienos grandinės, yra prijungtas per tą patį mechanizmą. Šiame skyriuje išnagrinėsime nukleotidų prijungimo mechanizmą. Pastaba: tokiose pamokose kaip AP biologija nereikalaujama žinoti šiame skyriuje nagrinėjamų temų.

DNR replikacijos statybiniai blokai yra dezoksiribonukleotidai
Statybiniai blokai, pridedami prie augančios dukterinės grandinės, yra atskiri nukleotidai. Atminkite, kad DNR trūksta -OH grupės ribozės žiedo 2′ padėtyje. Dėl to DNR sintezės substratai vadinami 2′ dezoksiribonukleotidais.

Paveikslas %: 2′ dezoksiribonukleozido trifosfatas
Prie kiekvieno dezoksiribozės žiedo yra prijungta bazinė grupė (C, G, A arba T) ir trifosfato grupė. Trys fosfatai žymimi alfa, beta ir gama (alfa yra arčiausiai ribozės žiedo). Šie fosfatai atlieka pagrindinį vaidmenį pridedant vėlesnių nukleotidų į dukterinę grandinę.

Papildymas atsiranda per nukleofilinį išpuolį

Deoksiribonukleozidų trifosfatai, kaip ką tik minėjome, yra DNR statybiniai blokai. Be to, prisiminkite, kad visa DNR polinukleotidinė grandinė turi tik vieną fosfato grupę ir kad per šią fosfatų grupę kiekvienas nukleotidas yra prijungtas prie kitos. Kodėl tada substratas yra trifosfatas, o ne tik monofosfatas? Atsakymas į šį klausimą slypi chemijoje, kuria grindžiamas nukleotidų pridėjimas prie augančios dukterinės DNR grandinės.

Nors kiekviename nukleotide, pridėtame prie augančios DNR grandinės, 2′ padėtyje nėra -OH grupės, jis išlaiko savo 3′-OH. Ši hidroksilo grupė naudojama atakuoti gaunamo nukleozido trifosfato alfa fosfato grupę. Atakos metu 3′ -OH pakeičia beta ir gama fosfatus, kurie iš komplekso išsiskiria kaip pirofosfato molekulė. Rezultatas yra fosfodiesterio jungties susidarymas tarp augančios dukterinės grandinės ir kito nukleotido. Naujai pridėto nukleotido 3′ -OH dabar yra veikiamas augančios grandinės gale ir gali atakuoti kitą nukleotidą tokiu pačiu būdu.

Paveikslas %: Nukleotidų pridėjimas prie augančios dukterinės gijos
Aukščiau pateiktame paveikslėlyje parodyta supaprastinta augančios polinukleotidų grandinės schema. Linijos žymi ribozės cukrų, iš kurios išsišakoja vienas 3′-OH. Kiekvienas p reiškia fosfatų grupę. Šis paveikslas iliustruoja keletą pagrindinių DNR replikacijos taškų. Pirma, matome, kad pagrindinė kryptis yra nukreipta 3′–5′ kryptimi. Antra, kiekvienas naujas nukleotidas, pridėtas prie augančios dukterinės grandinės, papildo nukleotidą ant pagrindinės grandinės, esančio priešais ją, ir tarp jų susidaro ryšys. Galiausiai matome, kaip 3′ -OH grupė išstumia dvi atokiausias gaunamo nukleotido fosfato grupes, kad pridėtų jį prie augančios grandinės.

Papildymo reakcijos varomoji jėga

Kiekvienas gaunamas nukleotidas tiekia energiją, reikalingą jo pridėjimui didelės energijos jungtimi tarp beta ir gama fosfatų, kurie išstumiami pridedant. Reakciją lemia ne pirofosfato išsiskyrimas, o vėliau vykstanti hidrolizė. Daug didesnis energijos kiekis išsiskiria, kai per hidrolizės reakciją du fosfatai yra atskiriami į atskirus fosfatus.

Problemos →
Problema: kas lemia, kuris nukleozido trifosfatas bus pridėtas prie augančios DNR grandinės?
Cheminį nukleotidų pridėjimą prie augančios DNR grandinės lemia kopijuojama pirminė grandinė. Nukleozido trifosfatas, papildantis bazę pagrindinėje grandinėje, bus pridėtas prie augančios grandinės.

Problema: kokia nukleozido trifosfato (DNR statybinio bloko) šoninė grupė yra atsakinga už kito nukleotido pridėjimą?
Nukleotidai pridedami per nukleofilinį 3′ –OH ataką prieš nukleotido dezoksiribozės cukraus grupę, esančią augančios DNR grandinės gale.

Problema: kas suteikia energijos nukleotidams pridėti prie augančios DNR grandinės replikacijos metu?
Pridėjimo reakcijos metu iš pridedamo nukleozido trifosfato išsiskiria pirofosfato grupė. Vėlesnė pirofosfato hidrolizė suteikia energijos, kuri skatina sudėjimo reakciją.

Problema: tiesa ar klaidinga. DNR replikacija vyksta 5′-3′ kryptimi, nes 3′-5′ replikacija chemiškai neįmanoma. Paaiškinkite savo atsakymą.

Netiesa. Nors DNR replikacija vyksta kryptimi nuo 5′ iki 3′, priežastis nėra ta, kad nuo 3′ iki 5′ replikacija yra chemiškai neįmanoma. Iš esmės gali atsirasti replikacija nuo 3′ iki 5′. Įeinančio nukleotido 3′ –OH vietoj augančios grandinės gale pritvirtinto nukleotido būtų atakuojanti grupė.

Problema: kodėl atsiliekančios grandinės replikacija yra sudėtingesnė nei pagrindinės grandinės replikacija?
Atsiliekančios grandinės sintezė yra sudėtingesnė, nes reikia, kad DNR replikacija vyktų 5′–3′ kryptimi. Kadangi pagrindinės sruogos yra nukreiptos antilygiagrečiai, viena sruogelė yra orientuota 5′–3′ kryptimi, o kita kryptis – 3′–5′ kryptimi. Sintezė grandinėje, kuri yra orientuota 3′–5′ (pirminė grandinė) kryptimi, gali įvykti lengvai, nes replikacija tiesiog prasideda nuo 3′ galo (sintezuojant dukterinės gijos 5′ galą) ir tęsiasi kartu su replikacijos šakutė. Sintezė grandinėje, kuri yra orientuota 5′–3′ kryptimi (atsilikusi grandinė), negali sekti replikacijos šakutės krypties, nes tai sukeltų antrinės grandinės sintezę nuo 3′ iki 5′. Vietoj to sintezė turi vykti mažuose segmentuose, kad būtų išsaugota tinkama sintezės kryptis.

DNR tikrinimas ir atstatymas
r

DNR replikacijos klaidos

Mažas bendras mutacijų greitis DNR replikacijos metu (1 bazinės poros pokytis viename milijarde bazinių porų per replikacijos ciklą) neatspindi tikrojo klaidų, įvykusių replikacijos proceso metu, skaičiaus. Tokį mažą skaičių išlaiko korektūros sistema, kuri tikrina, ar naujai susintetintoje DNR nėra klaidų, ir jas ištaiso, kai jos yra randamos. DNR replikacijos klaidos gali būti įvairių formų, tačiau dažniausiai jos sukasi apie nukleotido su neteisinga baze pridėjimą, o tai reiškia, kad pagrindinės ir dukterinės grandinės bazių poravimas nėra vienas kitą papildantis. Neteisingos bazės pridėjimas gali vykti procesu, vadinamu tautomerizacija. Bazinės grupės tautomeras yra nedidelis jo elektronų persitvarkymas, leidžiantis skirtingai jungtis tarp bazių. Pavyzdžiui, dėl to C gali būti suporuotas su A vietoj G.

Paveikslas %: Citozino tautomerizacija

DNR išlaiko aukštą tikslumo lygį, kai atlieka korektūros skaitymo funkciją.

3′–5′ tikrinamoji egzonukleazė

3′–5′ tikrinamoji egzonukleazė veikia skenuodama tiesiai už nugaros, nes DNR polimerazė prideda naujų nukleotidų į augančią grandinę. Jei paskutinis pridėtas nukleotidas nesutampa, tada visas replikacijos holofermentas sukuria atsarginę kopiją, pašalina paskutinę neteisingą bazę ir vėl bando pridėti tinkamą bazę. Fermentas yra nuo 𔄛′ iki 5′”, nes jis skenuoja priešinga DNR replikacijos kryptimi, kuri, kaip mes sužinojome, visada turi būti nuo 5′ iki 3′. Korektūros skaitymo sistemos mechanizmas suteikia paaiškinimą, kodėl DNR replikacija turi vykti šia kryptimi.

Turėdami omenyje cheminį mechanizmą, kurį išmokome pridėti nukleotidų prie augančios DNR grandinės, įsivaizduokite, kas atsitinka, kai korektūros sistema pašalina neteisingai suporuotą bazę. Egzonukleazė pašalina bazę, suardydama ką tik susidariusį fosfodiesterio ryšį. Vykstant 5′–3′ sintezei, 3′ -OH lieka pritvirtintas prie augančios grandinės galinio galo, pasiruošęs atakuoti kitą nukleotidą.

Paveikslas %: nuo 3′ iki 5′ egzonukleazės veiksmas

Jei sintezė vyktų priešinga kryptimi, augančios grandinės galiniame gale būtų trifosfato grupė, o ne -OH grupė. Šis trifosfatas taptų tikrinimo egzonukleazės taikiniu, o jo pašalinimas sustabdytų DNR replikaciją.

% pav.: neteisinga 3′–5′ sintezė

DNR pažeidimo tipai

Po to, kai DNR buvo visiškai atkartota, dukterinė grandinė dažnai nėra tobula pirminės grandinės, iš kurios ji kilo, kopija. Dėl mutacijų replikacijos metu ir žalos po replikacijos būtina turėti taisymo sistemą, kuri ištaisytų bet kokias naujai susintetintos DNR klaidas. Yra trys pagrindiniai DNR pažeidimo šaltiniai.

Vandens ataka, dėl kurios gali būti pašalinta amino grupė iš nukleotido bazinės grupės arba gali būti prarasta visa bazinė grupė.
Cheminis pažeidimas, kuris visam laikui pakeičia DNR struktūrą.
Radiacinė žala, dėl kurios gali atsirasti įtrūkimų DNR stubure arba susidaryti timino dimerai, kurie bus aptarti vėliau.
Dėl šių skirtingų žalos šaltinių atsiranda skirtingų kategorijų DNR pažeidimai. Dėl vandens atakos padarytos žalos gali susidaryti nenatūralūs pagrindai. Cheminė ir radiacinė žala sukelia didelių aduktų susidarymą augančioje DNR grandinėje arba įtrūksta. Ankstesniame skyriuje aptarėme 3′–5′ tikrinamąją egzonukleazę, kuri yra atsakinga už neatitikimų taisymą. Kadangi tai nėra tobula sistema, ji gali praleisti nesuderinamus pagrindus. Dėl to trečioji DNR pažeidimų kategorija yra nesuderintos bazės.

Kadangi šios DNR pažeidimų kategorijos yra skirtingos, reikia kelių taisymo sistemų.

Iškirpimo taisymo sistema

Pirmasis remonto sistemos tipas, kurį aptarsime, yra iškirpimo taisymo sistema. Akcizuoti paprasčiausiai reiškia pašalinti, todėl ši remonto sistema veikia pašalindama pažeistą vietą. Specialūs fermentai atpažįsta pažeistą DNR. Ši taisymo sistema yra dviejų formų: bazinio iškirpimo taisymas ir trumpojo nukleotido iškirpimas.

Bazinės poros ekscizijos remontas

Atliekant bazinių porų eksciziją, identifikuojamos ir pašalinamos pavienės bazių poros. Tada susidaręs tarpas užpildomas DNR polimeraze, o plyšys užsandarinamas DNR ligaze.

Trumpalaikis ekscizijos remontas

Trumpojo lopo ekscizija skiriasi nuo bazinių porų ekscizijos tuo, kad jo fermentai atpažins ir pašalins pažeistas DNR trumpąsias lopines. Šios trumpos žalos dėmės atsiranda dėl didelių pažeidimų, pvz., timino dimerų. Ši pažeidimo forma yra sukelta spinduliuotės ir dėl to susidaro ryšys tarp gretimų timino bazių toje pačioje DNR grandinėje. Šis ryšys sukelia DNR iškraipymą, dėl kurio trumpas ruožas aplink timino dimerį negali tinkamai susieti bazių poros. Trumpo iškirpimo taisymo sistema atpažįsta tokius iškraipymus ir nupjauna pažeistą sruogą abiejose pažeistos srities pusėse, palikdama sruogoje 12 bazinių porų tarpą. Tada helikazė išvynioja spiralės ruožą su pažeidimais, kuriuos vėliau galima užpildyti ir užsandarinti DNR polimeraze ir ligaze. Trumpalaikio iškirpimo taisymas taip pat gali būti naudojamas ištaisyti žalą, atsiradusią dėl nenatūralių pagrindų.

Neatitinkančių pagrindų taisymas

Kitas pagrindinis remonto sistemų tipas ištaiso žalą, atsiradusią dėl nesutampančių bazių, vadinama neatitikimo taisymo sistema. Neatitikimo taisymo sistema gali nustatyti neatitikimo klaidas, nes tokia žala sukelia nedidelį DNR pagrindo iškraipymą. Nustačiusi nesuderinamą bazių porą, ji pažymi vietą pjūviu ir naudoja egzonukleazę, kad suvirškintų arba „suvalgytų“ žymeklio DNR. Tada DNR polimerazė gali užpildyti spragą atitinkama baze.

Lieka vienas pagrindinis klausimas: kaip neatitikimo taisymo sistema žino skirtumą tarp sruogos, kurioje yra teisingas pagrindas, ir to, ant kurio ji turėtų padaryti pjūvį? Jis atskiria dvi sruogas naudojant žymeklį, kuris replikacijos metu pridedamas prie pagrindinės grandinės. Papildomas metilas (-CH3), pridėtas prie pagrindinės grandinės adenino bazinių grupių, veikia kaip neatitikimo taisymo sistemos vėliavėlė, kad ji žinotų, kaip įpjauti priešingą grandinę.

Metilinti adeninai randami tik pagrindinėje sruogoje

Problemos
Problema: kaip veikia 3′–5′ tikrinamoji egzonukleazė?
Tikrinimo egzonukleazė nuskaito naujai susintetintą DNR grandinę priešinga DNR replikacijos kryptimi, ieškodama bazių poravimosi klaidų. Radęs klaidą, jis išpjauna neteisingą bazių porą iš naujai susintetintos grandinės, o visas replikacijos holofermentas sukuria atsarginę kopiją ir bando iš naujo įvesti teisingą bazę.
Problema: kur egzonukleazė nupjauna dukterinę sruogą, kad pašalintų netinkamai suporuotą pagrindą?
Egzonukleazė suardo fosfodiesterio jungtį, esančią tarp netinkamos bazės fosfato grupės ir ankstesnės bazės 3′ –OH antrinėje grandinėje.

Problema: kokie yra trys pagrindiniai DNR pažeidimo šaltiniai?
Trys pagrindiniai šaltiniai yra hidrolizė, cheminė žala ir radiacinė žala.

Problema: kokia DNR taisymo sistema koreguoja timino dimerų mutacijas?
Trumpalaikio iškirpimo taisymo sistema.

Problema: kaip neatitikimo taisymo sistemoje egzonukleazė atskiria, kuri bazė yra teisinga?
Adenino bazės, esančios pirminėje arba pirminėje DNR grandinėje, yra metiluojamos replikacijos metu. Kai neatitikimą taisanti egzonukleazė randa nesuderinamą bazių porą, ji pašalina bazę, esančią grandinėje, kurioje nėra metilintų adeninų.


25.1.2 DNR replikacija prokariotuose

DNR replikacija buvo gerai ištirta bakterijose pirmiausia dėl mažo genomo dydžio ir turimų mutantų. E. coli turi 4,6 milijono bazinių porų (Mbp) vienoje žiedinėje chromosomoje ir visa tai atkartojama maždaug per 42 minutes, pradedant nuo vienos replikacijos kilmė ir apeinant apskritimą abiem kryptimis (t. y. abiem kryptimis) (25.1.3 pav.). Tai reiškia, kad per sekundę pridedama maždaug 1000 nukleotidų. Procesas yra gana greitas ir vyksta su nedaug klaidų. E. coli turi singlą replikacijos kilmė, paskambino oriC, vienoje chromosomoje. Replikacijos pradžia yra maždaug 245 bazių porų ilgio ir joje gausu adenino-timino (AT) sekų.

25.1.3 pav. Prokariotų DNR replikacija. DNR replikacija prokariotuose prasideda nuo vienos replikacijos pradžios, parodytos paveikslėlyje kairėje, ir tęsiasi dvikrypčiu būdu aplink apskritą chromosomą, kol replikacija baigiasi. Dvikryptis replikacijos pobūdis sukuria dvi replikacijos šakes, kurios aktyviai tarpininkauja replikacijos procesui. Dešinėje pusėje parodytas dinaminis šio proceso modelis. Raudoni ir mėlyni taškai reiškia dukterinės grandinės nukleotidų įtraukimą replikacijos proceso metu.

Replikacijos apžvalga

Atviros DNR sritys, kurios aktyviai replikuojasi, vadinamos replikacijos šakės. Visi baltymai, dalyvaujantys DNR replikacijoje, agreguojasi replikacijos šakės kad susidarytų replikacijos kompleksas, vadinamas a atgrasus(25.1.1 lentelė ir 25.1.4 pav.).DNR replikacija modeliniame organizme E. coli buvo plačiai ištirtas, suteikdamas pagrindą suprasti įvairius genomo dubliavimo mechanizmus, kuriuos naudoja visi organizmai. Į E. coli, DNR replikacija pradedama oriC (25.1.3 pav.). oriC yra &lsquomeled&rsquo dėl veiksmų DnaA iniciatoriaus baltymas atskleisti dvi šablonines ssDNR kryptis, kurios veikia kaip replikatyvo įkėlimo platformos DnaB helikazė. Vienas pilnas DnaB heksameras įkeliamas į kiekvieną ssDNR grandinę, naudojant helicase krautuvas, DnaC. Papildoma veikiama ssDNR greitai padengiama ssDNR surišantis baltymas (SSB), kuri apsaugo DNR ir blokuoja papildomą DnaB helikazės įkėlimą. Kiekvienas DnaB heksameras įdarbina primasė (DnaG), kuri sintetina RNR pradmenis, naudojamus DNR sintezei inicijuoti, kartu su subvienetais, kurie sudaro replikacinį DNR polimerazės III holofermentas (PolIII HE). Šie baltymai sudaro pagrindines replisomas, kurios kopijuoja E. coli genomo. Surinktos replisomos replikuojasi dviem kryptimis nuo oriC kol, idealiu atveju, jie bus užprogramuoti išmontuoti baigimo srityje, kur jie susiduria ter susietos svetainės Tus baltymai kurios sukuria &lsquoreplication fork spąstus'. Pasibaigus DNR replikacijai, naujai susintetinti genomai yra atskiriami ir atskiriami į dukterines ląsteles.

25.1.1 lentelė Prokariote, E. coli, DNR replikacijoje dalyvaujantys fermentai

25.1.4 pav. Bendra DNR replikacijos šakutės apžvalga. Replikacijos pradžioje topoizomerazė II atpalaiduoja superspiralinę chromosomą. Dvi replikacijos šakutės susidaro atsivėrus dvigrandei DNR pradžioje, o helikazė atskiria DNR grandines, kurios yra padengtos vienagrandžiais rišančiais baltymais, kad grandinės būtų atskirtos. DNR replikacija vyksta abiem kryptimis. RNR pradmenį, papildantį pirminę grandinę, sintetina RNR primazė ir pailgina DNR polimerazė III, pridedant nukleotidų prie 3 ir pirminio-OH galo. Pirmojoje grandinėje DNR sintetinama nuolat, o atsiliekančioje grandinėje DNR sintetinama trumpais ruožais, vadinamais Okazaki fragmentais. RNR pradmenys atsiliekančioje grandinėje pašalinami dėl DNR polimerazės I egzonukleazės aktyvumo, o Okazaki fragmentai sujungiami DNR ligaze.

Grįžti į viršų

Primosome surinkimas

Kaip minėta aukščiau, bakterijų chromosomos replikacija pradedama ar aš C kur jungiasi iniciatorius baltymas DnaA, kad būtų pradėtas fermentinės replisomos mašinos surinkimas. Ankstyvosiose šio proceso stadijose reikia surinkti a pirmykštis, kuris išvynioja dvi DNR grandines replikacijos šakutėse ir prideda RNR pradmenis prie DNR šablonų, kuriuos DNR polimerazės fermentai panaudos replikacijai pradėti. Po DnaA sukeltos replikacijos pradžios remodeliavimo, nuo bakterijų krautuvo priklausomos primosomos surinkimas vyksta atskirais etapais ir apima mažiausiai keturis skirtingus baltymus (iniciatorinį baltymą, helikazę, helikazės įkėlimo baltymą ir primazę), kurie veikia koordinuotai. ir nuosekliai (25.1.1 lentelė).

The oriC prokariotų regione yra labai konservuoti sekos motyvai, apimantys AT turtingą dėžutės domeną, kuris tarnauja kaip DnaA iniciatoriaus baltymo surišimo atpažinimo seka. Pradinis DnaA prisijungimas prie oriC skatina DNR dvigubos spiralės tirpimą ir kelių DnaA subvienetų, kurie sudaro spiralinį oligomerą, susikaupimą išilgai naujai atidarytos vienos grandinės DNR (ssDNR) (25.1.5 pav.). DnaA baltymą sudaro keturi pagrindiniai domenai. III ir IV domenai yra neatsiejami nuo ssDNR surišimo, o I domenas yra susijęs su baltymų ir baltymų sąveika. II domenas sudaro lanksčią jungtį tarp baltymų sąveikos domeno ir DNR surišimo domenų.

25.1.5 pav. Primosomos surinkimas. DNR tirpsta ties oriC ir DnaB įkėlimas6&ndash(DnaC)6 helicase&ndashloader kompleksą ant DNR burbulo. Apatinė schema: ATP surištas DnaA (iniciatorinis baltymas) jungiasi prie DnaA dėžučių per IV domeną, tokiu būdu skatindamas dsDNR apsivynioti aplink DnaA giją, sukeldamas dsDNR sukimo įtempimą. Tuo tarpu DnaA III domenas prisijungia prie vienos iš dviejų DNR išsiplečiančio elemento ssDNR grandžių ir ištempia grandinę. Dėl šių sąveikų AT turtingas DNR išsivyniojantis elementas ištirpsta ir susidaro burbulas. Tuo pačiu metu DnaC (helikazės įkroviklio) surišimas sulaiko DnaB (helikazę) atviroje užrakto ploviklio konformacijoje, kad būtų galima įkelti jį į ssDNR. DnaC sąveikauja su DnaA kaitinimo siūlelio gale ir tarnauja kaip adapteris vienam DnaB&ndashDnaC kompleksui įkelti. Nežinoma, ar DnaB užsidaro aplink ssDNR ir susidaro heksamerinis žiedas prieš DnaC disociaciją arba kartu su ja. DnaA I domenas sąveikauja su DnaB N-galiniu domenu, padėdamas įkelti kitą DnaB & ndashDnaC į papildomą grandinę. Viršutiniai įdėklai: DnaA spiralinis siūlas, sudarytas iš III domenų (šviesiai oranžinė) ir IV (šviesiai žalia) Aquifex aeolicus DnaA (PBP: 3R8F) ir IV domenas E. coli DnaA (šviesiai žalia) prijungta prie dsDNR (PDB: 1J1V). SsDNR jungiasi DnaA gijos viduryje sąveikaudama su DnaA AAA+&thinspDomain III.

Viduje konors E.coli Sistemoje helikazės krautuvo baltymas DnaC, sudarytas komplekse su ATP, jungiasi su heksamerine helikaze DnaB ir sudaro DnaB&ndashDnaC kompleksą, kuris buvo patvirtintas krioelektroninio mikroskopo (krio-EM) tyrimais. Krautuvo baltymas pristato helikazę į DnaA&ndash ori C nukleoproteino komplekso ištirpusias DNR atskiras grandines replikacijos pradžioje. In vivo , šis pristatymas yra susijęs su iniciatoriaus baltymu DnaA, kurio amino-galinis domenas (NTD), kaip manoma, turi įtakos įkeliant helikazę ir helikazės įkroviklio kompleksą į arba C sąveikaudamas su helikaze, DnaB. Po to, kai krautuvo baltymas atsiskiria nuo helikazės žiedo, helikazės NTD sąveikauja su primazės karboksigaliniu domenu (CTD) ir sudaro funkcinį. pirmykštis. Primosomoje helikazė (DnaB) veikia, kad išvyniotų dvigrandę spiralę, o primazė (DnaG) sintezuoja RNR pradmenis tiek pirmaujančiose, tiek atsiliekančiose DNR grandinėse.

Helikazės yra motoriniai baltymai, kurie kryptingai juda išilgai nukleorūgščių fosfodiesterio pagrindo, atskirdami dvi atkaitintas nukleorūgščių grandines, tokias kaip DNR ir RNR, naudojant ATP hidrolizės energiją. Yra daug helikazių, atspindinčių daugybę procesų, kurių metu turi būti katalizuojamas sruogų atskyrimas. Maždaug 1% eukariotų genų koduoja helikazes. Žmogaus genomas koduoja 95 neperteklines helikazes: 64 RNR helikazes ir 31 DNR helikazę. Daugelis ląstelių procesų, tokių kaip DNR replikacija, transkripcija, vertimas, rekombinacija, DNR atstatymas ir ribosomų biogenezė, apima nukleorūgščių grandinių atskyrimą, dėl kurio reikia naudoti helikazes. Į E. coli, DnaB helikazė (25.1.5 pav.) yra atsakinga už dviejų pirminių DNR grandžių išvyniojimą, kad išsivyniotų, ir atskirti jas viena nuo kitos, kad susidarytų "Y" formos replikacijos šakutė. Replikacijos šakės yra tikroji DNR kopijavimo vieta. Replikacijos metu šakėje susidaro spiralę destabilizuojantys baltymai, vadinami viengrandžiai surišantys baltymai (SSB), jungiasi prie vienos grandinės sričių, neleidžiant sruogoms vėl susijungti.

Grįžti į viršų

DNR polimerazės

DNR polimerazės fermentai būtini dukterinėms grandinėms išilgai kiekvienos šabloninės DNR grandinės surinkti.Visoms DNR polimerazėms reikalingas DNR šablonas ir pradmenys, naudojami replikacijos procesui pradėti. Pradmenys yra trumpa RNR grandinė, kurią primazės fermentas uždeda ant DNR šablono. Taip pat prisiminkite, kad DNR turi dvi antilygiagrečias grandines ir kad DNR polimerazės, sintetindamos dukterines DNR grandines, gali pridėti naujų nukleotidų tik 5'–3' kryptimi. Kadangi abi DNR grandinės vienu metu replikuojasi ta pačia replisoma, pirmaujanti kryptis,kur dukterinė DNR grandinė juda 5'–3' kryptimi, yra nuolat kartojama ir teka ta pačia kryptimi, kaip ir replisominis judėjimas. The atsiliekanti sruogelė, kuris yra antiparalelinėje kryptyje, turi būti sintetinamas priešinga replisomų judėjimo kryptimi ir sukuriamas naudojant trumpus DNR polimerazės aktyvumo pliūpsnius, dėl kurių susidaro Okazaki fragmentaipalei šablono sruogą.Taigi, atsiliekanti sruoga turi būti nuolat užpildomas trumpomis RNR sekomis, kad būtų išlaikytas formavimasis Okazaki fragmentai. Tada RNR pradmenų sekos turi būti pakeistos DNR, o spragas DNR stubure taip pat reikia pataisyti.

E. coli iš viso turi penkis DNR polimerazės. Trys iš šių fermentų dalyvauja DNR replikacijoje (I, II ir III DNR polimerazės). DNR polimerazė III yra pagrindinė polimerazė, dalyvaujanti tiek pagrindinės grandinės biosintezėje, tiek Okazaki fragmentų sintezėje DNR replikacijos metu. DNR polimerazės III holofermentą sudaro 10 skirtingų baltymų, suskirstytų į tris funkciškai skirtingus, bet fiziškai tarpusavyje susijusius mazgus: (1) &alfa&epsilon&teta šerdį, (2) &beta.2 stumdomas spaustukas ir (3) &delta&taun&gama3-n&delta'&PsiX spaustukų krautuvų kompleksas (25.1.6 pav.). Polimerazės šerdyje &alfa yra polimerazės subvienetas, &epsilon 3&rsquo&ndash5&rsquo korektūros egzonukleazė ir &teta yra mažas subvienetas, stabilizuojantis &epsiloną. Po to, kai DnaG pagamina RNR pradmenį, &beta2spaustukas ant grunto galų uždedamas spaustuku. &alfa ir &epsilon subvienetai atskirai suriša spaustuką, kiekvienas per trumpą linijinį spaustuko surišimo motyvą (CBM) prie dviejų simetriškai susijusių CBM surišančių &beta kišenių.2. Pririštas prie spaustuko, Pol III gali sintetinti DNR dideliu greičiu (&sim1000&thinspNt/s) ir daug didesniu proceso našumu (>150&thinspkb).

25.1.6 pav. DNR replisoma. a) Standartinis vadovėlio DNR replisomos modelis, rodantis susietus ir labai koordinuotus pirmaujančios grandinės ir atsiliekančios grandinės sintezės procesus. DNR polimerazė III yra prijungta prie DnaB helikazės per spaustuko įkroviklio komplektų &tau subvienetą, o dvi ar trys polimerazės šerdys vienu metu replikuoja DNR iš pirmaujančios ir atsiliekančios grandinės DNR šablonų. SsDNR atsiliekančioje grandinės kilpoje yra surišta su ssDNR surišančiais baltymais (SSB). (b) Naujausi tyrimai parodė, kad E. coli DNR polimerazė III yra lengvai keičiama šakute ir kad pirmaujančios grandinės ir atsiliekančios grandinės sintezė gali būti neglaudžiai susieta arba netgi gali būti atlikta naudojant skirtingus DNR polimerazės III holofermentus. DnaB helikazė taip pat gali būti atsieta nuo DNR polimerazės komplekso ir persikelti prieš šakės viršūnę.

Bakterijų replisomos yra labai lanksčios ir mobilios mašinos, kurių dinamiką tarpininkauja ir kontroliuoja skirtingo stiprumo baltymų ir ndashproteinų sąveikos tinklas. Daugelis replikacijos baltymų yra arba konformaciškai lankstūs, arba juose yra lanksčių arba nestruktūruotų regionų, todėl struktūrinius tyrimus rentgeno kristalografija arba BMR sunku atlikti. Tačiau per dešimtmečius trukusias pastangas, visų struktūrų E. coli replikacijos baltymai arba jų bakterijų homologai buvo išspręsti kaip kompleksai, sveiki baltymai arba domenai. Naujausi pavienių dalelių krioelektroninės mikroskopijos (krio-EM) laimėjimai atskleidė didelių replisomų pogrupių struktūras, net visą bakteriofago T7 replisomą, nors iki šiol tik nedidelės skiriamosios gebos.

Krio-EM struktūros E. coli Pol III šerdis&ndashclamp&ndash&tauC (Clamp-loader &tau subvieneto C-galinis domenas) pradmenų ir ndashtemplate DNR kompleksai polimerizacijos ir korektūros režimais neseniai buvo išspręsti atitinkamai 8 ir 6,7&thinspÅ, kartu su DNR neturinčio komplekso struktūromis (9.7 pav.). Šios struktūros primena anksčiau pasiūlytus struktūrinius modelius, su tam tikrais netikėtumais. Pavyzdžiui, su DNR surištame polimerizacijos komplekse &beta2 spaustukas tampa beveik statmenas DNR grandinėms (25.1.7a, b pav.), priešingai nei jo pakreipta konfigūracija su DNR surištos &beta kristalinėje struktūroje2. Nors Pol III ir alfa polimerazės subvienetas jungiasi su DNR konformacija, panašia į surištos DNR kristalinę struktūrą Thermus aquaticus (Taq) &alfa, C-galo domenų (&alphaCTD, apimančio oligonukleotidą surišantį domeną OB ir &tau surišantį, TBD domenus) vietos yra skirtingos. Viduje konors Taq &alfa struktūra ir DNR neturintis kompleksas, &alphaCTD yra arti polimerazės aktyvios vietos, o OB domenas yra taip, kad surištų ir pristatytų ssDNR šabloną į aktyviąją vietą (25.1.7c, d pav.). Su DNR surištose krio-EM struktūrose šie domenai pasislenka link &alfa mažojo piršto domeno, domeno, kuris tiesiogiai liečiasi su &beta.2 suspausti, todėl jie yra toli nuo šablono gijos, patenkančios į aktyviąją vietą (25.1.7e pav.). OB domenas susisiekia su mažojo piršto ir nykščio &alfa domenais, taip pat su &beta versijos domenais2 spaustukas ir &epsilonas. OB domeno veidas, kuris, kaip manoma, yra susijęs su ssDNA šablono surišimu, dabar yra tiesiogiai nukreiptas į dsDNR ir yra gana arti jo. Be to, &epsilon pleištas tarp &alfa nykščio srities ir spaustuko. Šis anksčiau neįvertintas sąveikos tinklas, matyt, stabilizuoja visą kompleksą.

25.1.7 pav E. coli polimerazė&ndashclamp-&tauC&ndashDNR kompleksai. a) Polimerizacijos (kairėje) ir korektūros (dešinėje) kompleksų paviršiaus atvaizdai. &alfa N-galiniai domenai (&alphaNTD, likučiai 1&ndash963, yra spalvoti gilioje lašišoje), o OB (964&ndash1072) ir &tau surišimo domenai (TBD, 1173&ndash1160) &alphaCTD atitinkamai rudoje ir tamsioje lašišoje, &epsilone. &beta2 akvamarine, & teta oranžinėje ir &tauC šiferyje. Polimerizacijos kompleksas neapima &theta ir &tauC o &alphaCTD nėra korektūros komplekse. b) Kompleksų animaciniai vaizdai, rodantys pradmenų ir šablono DNR skirtumus. Polimerizacijos komplekse (kairėje) DNR turi B formos struktūrą, o korektūros komplekse pradmenų DNR yra subraižyta su naujai susintetintos grandinės galu aktyviame &epsilon centre. Korektūros kompleksas šiek tiek pasukamas, kad DNR būtų rodomas aktyviajame &epsilon centre, o &teta subvienetas aiškumo dėlei praleistas. c) &alphaNTD paviršiaus atvaizdas iš DNR surišto polimerizacijos komplekso (PDB: 5FKV), rodantis nykštį, delną, pirštus ir PHP domenus. d) &alphaCTD padėtis kompleksuose be DNR (PBP: 5FKU). (e) &alphaCTD padėties DNR surištame polimerizacijos komplekse (PBP: 5FKV). Nors OB domenas DNR neturinčiame komplekse yra arti aktyvios Pol III & alfa vietos, jis yra toli su DNR surištame komplekse. OB domenas yra spalvotas jūrine spalva, o TBD - purpurine spalva. Dviejų kompleksų &alphaNTD (pilka) rodo palyginti nedidelius pokyčius, palyginti su &alphaCTD.

Apskritai, DNR polimerazės III komplekse vyksta reikšmingi konformaciniai pokyčiai, kai prisijungia prie DNR, todėl polimerazės uodega pasislenka iš sąveikos su spaustuku, esanti su DNR surišta būsena, į padėtį 35 ir plonu atstumu nuo DNR spaustuko. -laisva būsena (vaizdo įrašas 25.1.1). Buvo iškelta hipotezė, kad šis didelis konformacinis pokytis gali padėti polimerazei veikti kaip jungiklis, palengvinantis atsiliekančios grandinės sintezę. Atsiliekančioje grandinėje polimerazė persikelia į naujai paruoštą vietą kas &sim1000 bp. Norėdami tai padaryti, polimerazė turi atlaisvinti ir spaustuką, ir DNR. Į jungiklį panašus polimerazės uodegos judėjimas gali turėti įtakos polimerazės išsiskyrimui ir dėl to perkėlimui Okazaki fragmento gale.

Vaizdo įrašas 25.1.1 DNR surišimas sukelia didelius konformacinius DNR polimerazės III komplekso pokyčius. Vaizdo įraše parodytas linijinis DNR neturinčios DNR keitimas į su DNR susietą būseną, rodantis didelius konformacijos pokyčius tarp dviejų būsenų. Žalias subvienetas yra &beta spaustukas, &alfa subvienetas rodomas oranžine spalva su aktyviosios vietos liekanomis purpurine spalva, &alfa-C-galinis domenas (&alfa-CTD rodomas rudai, &epsilon subvienetas geltonai ir &tau-tail rodoma mėlyna spalva.

Korektūros kompleksas yra gana panašus į polimerizacijos kompleksą, su nedideliais atskirų baltymų komponentų judesiais (25.1.7a,b pav.). Svarbiausi judesiai yra dvipusės DNR sukimasis ir pakreipimas prieš &beta plokštumą2, užrakina DNR prie vidinio &beta paviršiaus2 žiedas (25.1.7b pav.). Polimerazės nykščio domenas ir &epsilon taip pat juda link DNR. Nykščio domenas įsiterpia tarp dviejų DNR grandžių su nesuderinamomis bazių poromis, todėl DNR substratas yra labai iškraipytas ir subraižytas. Todėl naujai susintetinta grandinė gali pasiekti &epsilon nukleazės aktyviąją vietą redaguoti. Atsižvelgiant į tai, kad korektūros kompleksas yra gana panašus į polimerizacijos kompleksus, o dvipusė DNR su dviem nesuderinamomis bazių poromis linkusi subyrėti, siūloma, kad &epsilon veiktų pasyviai laukdamas, kol DNR pasieks aktyvųjį nukleazės centrą, kai įtrauktas netinkamas nukleotidas, o ne aktyviai reaguoti į netinkamo įtraukimo įvykį. Atliekant papildomą vienos molekulės biofizinį tyrimą, buvo įrodyta, kad spaustukais surišta Pol III šerdis yra nepaprastai stabili ir produktyvi korektūros režimu, kai nėra gaunamų dNTP.

Ilgą laiką buvo manoma, kad bakterinės replisomos yra labai koordinuotos, labai produktyvios mašinos, galinčios nukopijuoti visą chromosomą be disociacijos. Dvi ar trys tos pačios polimerazės šerdys E. coli Manoma, kad Pol III HE sintetina abi DNR grandines, o atsiliekančios grandinės polimerazė buvo pakartotinai perdirbama naujai Okazaki fragmento sintezei, kaip aprašyta aukščiau. Buvo diskutuojama, kad atsiliekančios grandinės polimerazės perdirbimą gali sukelti įvairūs susidūrimo ar signalizacijos mechanizmai, gerai kontroliuojami, o tai greičiausiai susiję su &tau-tail srities judėjimu. Tačiau naujausi tyrimai rodo, kad bakterijų polimerazės taip pat lengvai keičiasi replikacijos šakėse ir kad pirmaujančios ir atsiliekančios grandinės DNR sintezė ne visada gali būti glaudžiai susieta. 9.6b paveiksle pavaizduotas siūlomas šio mainų modelis.

Apskritai, DNR polimerazė III yra labai produktyvus fermentas, apimantis nuo 600 iki 1 000 bazių per sekundę ir daugiau nei 100 000 bazių per vieną prisijungimo įvykį, o klaidų dažnis yra maždaug 1 iš milijono.

DNR polimerazė I, padeda atsiliekančios grandinės sintezės procesui, nes ši polimerazė pašalina RNR pradmenis ir įtraukia DNR į savo vietą. DNR polimerazė II, Nors ir nėra gerai suprantama, manoma, kad jos atlieka redagavimo vaidmenį po DNR polimerazės I atsiliekančios grandinės sintezės. DNR I ir II polimerazės taip pat atlieka svarbų vaidmenį DNR atstatyme, kaip ir IV ir V DNR polimerazės.

DNR polimerazėyra panašus į DNR polimerazę III, nes turi 5'-3' polimerazės aktyvumą ir taip pat turi 3'-5' egzonukleazės aktyvumą, kuris tarpininkauja fermento procesui ir DNR korektūros funkcijai. Be to, DNR polimerazėje I taip pat yra didelis baltymų domenas, vadinamas Klenow fragmentaskuri pasižymi 5'–3' egzonukleazės aktyvumu (25.1.8 pav.). 5'–3' egzonukleazės aktyvumas yra atsakingas už RNR pradmenų pašalinimą išilgai atsiliekančios grandinės. Šio fermento procesyvumas leidžia polimerazei šias spragas užpildyti DNR. Tačiau DNR polimerazė I negali sujungti naujai susintetintų Okazaki fragmentų pagrindo su pasroviui esančiu fragmentu. DNR stuburo spragų taisymas yra tarpininkaujamas a DNR ligazės fermentas.

25.1.8 pav. Struktūra E. coli DNR polimerazė I. DNR polimerazė I demonstruoja 5'-3' polimerazės aktyvumą ir 3'-5' egzonukleazės aktyvumą, tarpininkaujant fermento procesui ir tikrinamajam skaitymui. DNR polimerazė I taip pat turi 5'–3' egzonukleazės aktyvumą, esantį specialiame fermento domene, vadinamame Klenow fragmentu. Šis domenas yra atsakingas už RNR pradmenų sekų pašalinimą iš naujai susintetintos DNR. Tada 5'–3' polimerazės aktyvumas naudojamas RNR pradmeniui pakeisti DNR. 3'–5' egzonukleazės aktyvumas užtikrina, kad būtų įtrauktos tinkamos bazės.

Grįžti į viršų

DNR ligazės fermentai užsandarinti DNR stuburo plyšius, atsirandančius DNR replikacijos, DNR pažeidimo arba DNR atkūrimo proceso metu. Biocheminis DNR ligazių aktyvumas sukelia pertraukas tarp 5&pagrindinio fosfato ir 3&pagrindinio hidroksilo galų DNR grandinėje. DNR ligazės buvo diferencijuojamos kaip priklausomos nuo ATP arba nuo NAD + priklausomai nuo kofaktoriaus (arba kosubstrato), kuris naudojamas jų reakcijos metu. Paprastai organizme randama daugiau nei vieno tipo DNR ligazė. Kaip parodyta 25.1.9 paveiksle, DNR ligazės fermentas yra kovalentiškai modifikuotas pridedant AMP fragmentą prie fermento lizino liekanos. AMP yra gaunamas iš ATP arba NADH kofaktoriaus. Pasroviui esantis 5'-fosfatas, esantis DNR plyšio vietoje, gali tarpininkauti nukleofiliniam atakai prieš AMP-fermento kompleksą, todėl AMP pereina į DNR 5'-fosfato padėtį. AMP yra gera paliekanti grupė prieš 3'-OH esantį nukleofilinį ataką su 5'-fosfatu, kad užsandarintų DNR pagrindą ir išlaisvintų AMP.

25.1.9 pav. DNR ligazės reakcija. DNR ligazės katalizuoja esminį žingsnį, kai sujungiamos dvipusės DNR pertraukos DNR taisymo, replikacijos ir rekombinacijos metu, ir kaip kofaktoriui reikalingas adenozino trifosfatas (ATP) arba nikotinamido adenino dinukleotidas (NAD+). Parodyta ant viršutinė kairė yra DNR ligazė I, atkurianti chromosomų pažeidimus. Trys matomos baltymų struktūros yra: DNR surišimo domenas (DBD), kuris yra susietas su DNR mažuoju grioveliu tiek prieš, tiek pasroviui nuo pažeistos vietos. OB raukšlės domenas (OBD) šiek tiek išvynioja DNR per šešių bazių porų intervalą ir paprastai yra susijęs su nukleino rūgščių surišimu. Adenilinimo domene (AdD) yra fermentiškai aktyvių liekanų, kurios sujungia suskaidytus nukleotidus, katalizuodamos fosfodiesterio jungties susidarymą tarp fosfato ir hidroksilo grupės. Tikėtina, kad visos žinduolių DNR ligazės (I, III ir IV ligazės) turi panašią žiedo formos architektūrą ir gali atpažinti DNR panašiu būdu. The viršutinė dešinė diagramayra didelės raiškos struktūra E. coli LigA komplekse su nikuota adenilinta DNR iš PDB 2OWO, vizualizuota UCSF Chimera. Įvairūs domenai žymimi skirtingomis spalvomis ir yra susiję su nurodytais Pfam domenais. The apatinė diagrama pavaizduotas DNR ligazės I katalizinis mechanizmas. ATP kofaktorius sudaro kovalentinį ryšį su lizino liekana &alfa-fosfato padėtyje, apgaubdamas difosfato išsiskyrimą. AMP naudojamas aktyvuoti 5' fosfato grupę, leidžiančią prieš srovę esančiai 3'-OH grupei tarpininkauti atakai prieš centrinį fosforo atomą. AMP tarnauja kaip paliekanti grupė.

Paveikslas viršuje kairėje: Ellenberger, T Vašingtono universiteto medicinos mokykloje, Sent Luisas, MO, paveikslas dešinėje: Pergolizzi, G., Wagner, GK ir Bowater, RP (2016) Biosci Rep 36(5) ) e00391, o apatinis skaičius: Showalter, A. (2002)

DNR replikacijos proceso santrauka parodyta 25.1.2 vaizdo įraše

Vaizdo įrašas 9.2 DNR replikacijos proceso apžvalga

Grįžti į viršų

Topoizomerazės fermentai

Dvigubos spiralės išvyniojimas replikacijos šakėje sukuria DNR apvijos įtampą teigiamų superritių pavidalu prieš replikacijos šakę. Fermentai vadinami topoizomerazės neutralizuoti tai įvesdami į DNR neigiamas superspirales, kad sumažintumėte šį įtampą spiralinėje molekulėje replikacijos metu. Yra keturi žinomi topoizomerazės fermentai E. coli kurios skirstomos į dvi pagrindines klases – I tipo topoizomerazes ir II tipo topoizomerazes (25.1.10 pav.). Topoizomerazė I ir III yra I tipo topoizomerazės, o DNR girazė ir topoizomerazė IV yra II tipo topoizomerazės.

25.1.10 pav. I ir II tipo topoizomerazės struktūros. (A) I tipo topoizomerazės kristalinė struktūra, parodyta mėlyna spalva, surišta su DNR, parodyta oranžine ir geltona spalva. (B) II tipo topoizomerazės kristalinė struktūra. Topoizomerazė II sudaro tetramerinę struktūrą, pavaizduotą žalia ir mėlyna spalva. ATP kofaktoriai (rožiniai) rodomi susieti su fermentu.

I tipo topoizomerazės sumažinti įtampą, atsirandančią vyniojant ir išvyniojant DNR. Vienas iš būdų, kaip jie gali tai padaryti, yra vienoje DNR dvigubos spiralės grandinėje įpjauti arba įpjauti (25.1.11 pav.). Įtrūkusios DNR grandinės 5'-fosforilo pusė lieka kovalentiškai surišta su fermentu ties tirozino liekana, o 3'-galą nekovalentiškai palaiko fermentas. I tipo topoizomerazės sukasi arba sukasi DNR 3' galą aplink nepažeistą DNR grandinę. Tai atpalaiduoja DNR apviją ir veiksmingai atpalaiduoja įtampą. Fermentas užbaigia reakciją iš naujo užsandarindamas fosfodiesterio pagrindą arba perrišimas nutrūkusią sruogą vėl kartu. Apskritai reakcijos mechanizmo metu nutrūksta tik viena DNR grandinė ir yra NEATP poreikis reakcijos metu. The E. coli Topo I fermentas gali pašalinti tik neigiamas DNR superspirales, bet ne teigiamas. Taigi šis fermentas nedalyvauja atleidžiant teigiamą superspiralę, kurią replikacijos metu sukelia DNR helikazė. Tai skiriasi nuo eukariotų Topo I, kuris gali sumažinti tiek teigiamą, tiek neigiamą superspiralizaciją. Nors E. coli Topoizomerazė I nėra tiesiogiai susijusi su DNR replikacijos sukeltos įtampos mažinimu, ji yra būtina E. coli gyvybingumas. Manoma, kad jis padeda subalansuoti II tipo topoizomerazių veikimą ir padeda išlaikyti optimalų superspiralės tankį chromosomų DNR. Taigi manoma, kad Topo I padeda išlaikyti homeostatinę chromosomų superspiralizavimo pusiausvyrą viduje E. coli. Atrodo, kad Topo III, kuris taip pat yra I tipo topoizomerazė, vaidina svarbų vaidmenį dukterinių chromosomų dekatenavime DNR replikacijos metu, bet neatlieka jokio vaidmens atpalaiduojant superspiralizaciją.

25.1.11 pav. I tipo topoizomerazių reakcija. Reakcijos metu I tipo topoizomerazės išardo vieną DNR grandinę. Vienas įtrūkusios DNR galas yra kovalentiškai prijungtas prie fermento, apatinėse diagramose parodytas šviesiai žalia spalva.Kitas galas laikomas nekovalentiškai ir pasukamas aplink dvigubą spiralę, kad išvyniotų superspiralę ir atpalaiduotų DNR. Atleidus superspiralinę įtampą, stuburas vėl užsandarinamas ir atpalaiduojamas topoizomerazės I fermentas.

Paveikslas remiksuotas iš: Notahelix ir JoKalliauer bei Nacionalinio žmogaus genomo tyrimų instituto

II tipo topoizomerazės ląstelėje atlieka daugybę funkcijų. Jie gali padidinti arba sumažinti vyniojimo įtampą DNR viduje arba gali išardyti arba dekatanuoti DNR, susipainiojusią su kita grandine (25.1.12 pav.). Tai daro pavojingesniu metodu nei jų I tipo kolegos, sulaužydami abi DNR grandines jų reakcijos mechanizmo metu. Fermentas yra kovalentiškai prijungtas prie abiejų pažeistų pusių, o kita DNR spiralė praeina per pertrauką. Tada dvigubos gijos pertrauka vėl užsandarinama.

25.1.12 pav. II tipo topoizomerazių reakcija. Siūlomas II tipo topoizomerazės reakcijos ciklas yra topoizomerazės IV pavyzdys. Topoizomerazės IV subvienetai žymimi pilka, žalsvai mėlyna ir geltona spalvomis. Vartai arba G-DNR yra žalios spalvos, o transportuojama arba T-DNR yra rausvos spalvos. ATP, susietas su ATPazės domenais, pažymėtas raudonu tašku. 1 žingsnyje G-DNR susijungia su fermentu. ATP ir T-DNR segmentas susijungia su fermentu 2 pakopoje. 3 veiksme G-DNR suskaidoma ir T-DNR praeina per pertrauką. Vaistams pritaikyti domenai II tipo topoizomerazės komplekse yra paryškinti A, B ir C poskyriuose su pavyzdžiais dešinėje paveikslo pusėje.

DNR girazė yra II tipo topoizomerazės fermentas, kuris pirmiausia yra susijęs su teigiamos superspirazės įtampa, atsirandančia dėl helikazės išsivyniojimo replikacijos šakėje. II tipo topoizomerazės, ypač Topo IV, taip pat sprendžia pagrindinį mechaninį iššūkį, su kuriuo susiduria bakterijų replisoma nutraukiant DNR replikaciją. Apvalus bakterijų chromosomos pobūdis lemia, kad replisomų pora, kuri prasideda nuo vienos replikacijos pradžios, galiausiai susilieja viena su kita orientacija „galva į galvą“. DNR girazės, kuri paprastai pašalina teigiamas superspirales, riboja mažėjantis turimos DNR šablono kiekis. Vietoj to, superspiralės gali difuzuoti už replisomų, sudarydamos prekatananus tarp naujai išplitusios DNR. E.coli jas turi išspręsti Topo IV, kad įvyktų chromosomų segregacija.

Tus baltymai ir replikacijos nutraukimas

Tinkamas DNR replikacijos nutraukimas yra svarbus genomo stabilumui. E. coli replikacija baigiasi priešingoje srityje oriC. Yra dešimt 23 bp nutraukimas (Ter) svetaines regione su tam tikrais sekos variantais, kurie lemia jų surišimo afinitetus su monomerinio termino baltymas Tus (25.1.13 pav.). Tus rišasi prie Ter su dideliu afinitetu santykiu 1:1, ir Tus&ndashTer gali toliau sudaryti labai stabilų &lsquolock&rsquo kompleksą, jei citozinas-6 iš griežtai konservuotos G&ndashC(6) bazinės poros Ter yra išverstas iš DNR duplekso ir surištas į iš anksto suformuotą citoziną surišančią Tus kišenę (25.1.13b pav.). „Tus&ndash“.Ter užrakto kompleksas yra poliarinis, turintis leistiną veidą, leidžiantį netrukdomai praeiti, ir neleistiną veidą, kuris gali blokuoti replisomą. Dešimt Ter svetainės yra suskirstytos į dvi priešingai orientuotas grupes po penkias, leidžiančias replisomai praeiti pirmąją grupę ir būti blokuojamai antrojoje. Tai užtikrina, kad dvi replikacijos šakės susilieja galinėje srityje, kad būtų tinkamai atskirtos chromosomos.

25.1.13 pav. Replisomo blokavimo Tus&ndash mechanizmaiTer replikacijos užbaigimo kompleksai.a) Scheminis vaizdavimas E. coli chromosoma, rodanti padėtis oriC ir Ter svetaines. Pagal laikrodžio rodyklę judanti šakutė eina per leistinas vietas, parodytas žaliai, ir sustabdoma neleistinose vietose, pažymėtose raudonai. b) Scheminis &lsquolocked&rsquo Tus- struktūros vaizdasTer kompleksas (PBP: 2I06), kurio rišamojoje kišenėje Tus yra citozinas-6. c) Tus likučio Arg198 sąveika su abiem sruogomis Ter kompleksuose su dvigrandžiu laukiniu tipu Ter (PBP: 2I05, kairėje) ir Tus&ndashTer UGLC kompleksas (GC(6) bazinė pora apversta PDB: 4XR3, dešinėje).

Grįžti į viršų


Įvadas

DNR pažeidimai atsiranda dėl egzogeninių ir endogeninių procesų. Kancerogenai, neatsižvelgiant į jų kilmę, įvairiais mechanizmais gali sukelti DNR pažeidimą. Tai apima, pavyzdžiui, kovalentinį kancerogeno surišimą su DNR arba DNR dvigubų grandžių pertraukomis (DSB), susidariusiomis dėl jonizuojančiosios spinduliuotės (IR) sukeltos laisvųjų radikalų susidarymo [1,2]. Kancerogenai klasifikuojami kaip cheminiai arba fiziniai veiksniai [3], sukeliantys DNR pažeidimus dėl jų fizikinių ir cheminių savybių, tokių kaip DNR molekulės iškraipymas arba DNR kryžminis ryšys [3𠄶]. 1 lentelėje parodytas nedidelis aplinkos ir (arba) mitybos kancerogenų pogrupis, tačiau yra daug kitų pavyzdžių, kuriais žmonės gali būti veikiami (1 lentelė).

ਁ lentelė

Kandidatai į agentusApžvalgaNuorodos
Heterocikliniai aromatiniai aminai (HAA)HAA yra nuo aktyvacijos priklausomos, karščio sukeltos mutageninės medžiagos, daugiausia esančios maisto produktuose, kuriuose yra azoto ir kreatino komponentų. HAA molekulinė struktūra priklauso nuo temperatūros ir į maistą perduodamos šilumos lygio. Gali generuoti SSB, chromosomų aberacijas ir DNR aduktus regionuose, kuriuose gausu guanino. Suaktyvinti metabolitai gali atakuoti guanino N 2 padėtį (dažniausiai) arba guanino C8 atomą (atsiranda rečiau).[13�]
Policikliniai aromatiniai angliavandeniliai (PAH)Deginant organines medžiagas susidaro PAH. Tai yra gausiausi netiesioginio poveikio kancerogenai, su kuriais žmonės susiduria kasdien. Poveikis buvo susijęs su krūties, odos ar plaučių vėžio išsivystymu. Norint, kad šios medžiagos pasižymėtų mutageninėmis savybėmis, kurias pirmiausia skatina citochromo P450 fermentai, būtina PAH biologiškai aktyvuoti. Bioaktyvuoti metabolitai nukreipti į kelias genomo vietas, įskaitant guanino ir adenino bazes per PAH diolio epoksidus. Dėl to susidaro didelių gabaritų BPdG cheminių DNR aduktų, pavyzdžiui, chinono sąlygotas guanino N7 padėties ir adenino N3 padėties kryžminis susiejimas.[11,16]
Ultravioletinė (UV)Tiesiogiai ir netiesiogiai veikianti genotoksinė vėžį sukelianti medžiaga, kurią pirmiausia absorbuoja epidermio komponentai, tokie kaip DNR bazės (timinas ir citozinas) ir baltymai. Šis agentas yra susijęs su odos navikų priežastimi, nukreipdamas į pirimidino bazes. Epidermio ir dermos poveikis skatina ląstelių dauginimosi reguliavimą ir fotoproduktų susidarymą, įskaitant CPD ir (6𠄴) pirimidino pirimidinus.[5,17�]
Aristolochinė rūgštis (AA)Natūraliai gautos rūgštys iš Aristolochiaceae augalų. Nurodyta, kad šių kancerogenų nurijimas daugiausia susijęs su inkstų žievės nefrotoksiškumu ir tolesniu šlapimo pūslės bei kepenų pažeidimu, greičiausiai dėl didelių cheminių DNR aduktų susidarymo. Labiausiai paplitusi ir mutageninė DNR adukto forma, susijusi su AA, yra dA-AA. 2� egzonuose TP53, dideli cheminiai DNR aduktai sukelia mutacijas, daugiausia A:T bazių porų.[20�]
NitrozaminaiVėliau nitrozaminų metabolizmas sukelia alkilinimo DNR pažeidimus dėl DNR aduktų, tokių kaip O 6 -alkilguanino, susidarymo, oksidacinio streso ir diazonio jonų gamybos. Žmonės su šiais veiksniais susiduria per įvairius maisto produktus ir tabako dūmus.[25,26]
MikotoksinaiMikotoksinai yra grybelinės kilmės metabolitai, kurie pirmiausia užteršia maistą. Dažniausiai randamas mikotoksinas yra aflatoksinas B1, atrastas septintojo dešimtmečio pradžioje. Tai netiesioginiai kancerogenai, kuriuos reikia biologiškai aktyvuoti per CYP, kad susidarytų DNR aduktai. Adukto susidarymas, nukreiptas į guanino bazes, sukeliantis G → T transversijas 249 kodone TP53.[27�]
Jonizuojanti spinduliuotė (IR)Jonizuojančiosios spinduliuotės poveikis netiesiogiai arba tiesioginiu būdu sukelia DNR pažeidimus. Netiesioginį kancerogeninį poveikį sukelia vandens radiolizė, kuri skatina ROS gamybą ir sukelia oksidacinę žalą, dėl kurios gali atsirasti SSB. Tiesioginis poveikis apima tiesioginę elektronų sąveiką su DNR, dėl kurios atsiranda molekuliniai iškraipymai ir DSB.[5,6]
AsbestasAsbestas yra labai kancerogeniškas ir istoriškai naudojamas pramonėje ir buityje. Skaidulų poveikis yra tiesiogiai susijęs su asbestoze, pleuros apnašomis ir mezoteliomą. Matmenys, forma ir cheminė sudėtis yra asbesto patogeniškumo veiksniai. Žala atsiranda dėl oksidacinio streso (gali nutrūkti DNR grandinės), fibrozės ir sąveikos su besidalijančių ląstelių mitoziniu aparatu. Plaučių vėžio priežastinis sinergizmas pastebimas su kitais mutagenais, įskaitant PAH, dėl netirpios asbesto šerdies, per kurią adsorbuoti kancerogenai patenka į tikslines vietas, kur jie daro genotoksinį poveikį.[30,31]
Nanodalelės (NP)Nanotechnologijų inžinerijos srityje nanodalelės vis dažniau naudojamos medicinos, kosmetikos ir elektronikos pramonėje. NP yra vieno matmens 𼄀 nm, padedantys prasiskverbti į ląsteles įkvėpus, per odą arba per burną ir dėl to gali pakenkti DNR. Žala gali būti tiesioginė, o genotoksinis poveikis apima DNR aduktus, atsirandančius dėl oksidacinio pažeidimo, epigenetinius pokyčius ir DNR grandinės pertraukas.[32�]

Kancerogenų poveikis gali tiesiogiai [7] arba netiesiogiai [1, 8] sukelti DNR pažeidimus. Vėlesni taisymo mechanizmai gali sukelti DNR sekos pakitimus, ty mutacijas [2,9]. Sukeltos mutacijos gali sukelti vėžio priežastinį reiškinį, kai pažeidimas fiksuojamas onkogenuose arba naviką slopinančiuose genuose [10]. Tokiai rizikai taip pat gali turėti tiesioginės įtakos individualus jautrumas ir genetinis nestabilumas [11]. Pavyzdžiui, esant paveldėtam genetiniam sutrikimui Xeroderma Pigmentosum (XP), XP baltymų mutacijos sutrikdo DNR atstatymą, todėl odos DNR susidaro saulės šviesos sukeltų pažeidimų ir daugėja odos vėžio atvejų [12].


Proteazės genų sutrikimas mikrobuose heterologinių baltymų gamybai

3.6.1.4 Svetainės rekombinacija

Vietos specifinė rekombinacija yra tam tikra genetinės rekombinacijos sistema, kurioje vyksta segmentai, turintys tam tikrą sekos homologijos laipsnį, DNR grandžių mainai (Bode ir kt., 2000). Konkrečios vietos rekombinacijos sistema yra labai efektyvi, greita ir specifinė. Buvo pranešta, kad tiek homologinės, tiek heterologinės rekombinacijos būdu gijinių grybų žiedinio vektoriaus DNR, įskaitant plazmidžių sekas, gali būti integruota į genų rinkinį viena arba keliomis kopijomis (Miller ir kt., 1985). Skirtingose ​​gentyse homologinių:heterologinių integracijų santykis labai skiriasi (Hinnen ir kt., 1978). Tikimasi, kad pirmieji integracijos įvykiai apima dvigubos grandinės pertraukų tarp integruoto vektoriaus ir chromosomų gretutinių sekų taisymą. Integracija taip pat reikalauja sekos analizės (Mohr ir kt., 1989). Aštuntajame dešimtmetyje rekombinantinės DNR technologijų kūrimas padėjo pagrindus įvairių heterologinių baltymų ekspresijos sistemų pažangai. Escherichia coli, S. cerevisiae, metilotrofinės mielės P. pastoris, o gijiniai grybai buvo plačiai naudojami heterologinių baltymų ekspresijai (Hitzeman ir kt., 1981 Li ir kt., 2007 Lubertozzi ir Keasling, 2009). Heterologinės baltymų ekspresijos technologijos yra svarbi baltymų arba fermentų paruošimo technika akademiniams eksperimentams ir pramoninei svarbai. Kai kurios specifinės vietos rekombinacijos ypatybės yra šios: (1) specifinėse sąveikaujančios (-ių) DNR molekulės (-ių) vietose vyksta rekombinacija (2) rekombinacija yra konservatyvi ir (3) mažuose DNR regionuose vyksta homologinės grandinės mainai. svetainių perjungimas.

Pagal in vitro sąlygomis, manipuliuojant didelėmis DNR molekulėmis Cre rekombinazė taip pat tapo galingu įrankiu (Sauer ir Henderson, 1988). Cre rekombinazė yra tirozino rekombinazės fermentas, naudojant į topoizomerazę I panašų mechanizmą, kad sukeltų vietos specifinius rekombinacijos įvykius. P1 bakteriofago gyvavimo cikle svarbų vaidmenį atlieka fermentai, tokie kaip linijinio genomo ciklizacija ir dimerinių chromosomų skyrimas (Van Duyne, 2001). Buvo pranešta, kad Cre yra veiksminga rekombinazė, išskyrus E. coli ir mielėse (Sauer, 1987). Tiek mielių, tiek žinduolių ląstelėse Cre gali nukreipti specifinę IoxP turinčio nukreipimo vektoriaus integraciją į chromosomoje esantį loxP taikinį, kaip tai daro FLP rekombinazė žinduolių ląstelėse (O'Gorman ir kt., 1991 Sauer ir Henderson, 1990). FLP rekombinazė, gauta iš S. cerevisiae yra naudojami manipuliuoti genomų struktūra ir kontroliuoti genų ekspresiją. Flp-FRT rekombinacija yra į vietą nukreiptos rekombinacijos tipas. Flp baltymas yra tirozino šeima, kurioje vietos specifinė rekombinazė atlieka savo funkciją per IB tipo topoizomerazės mechanizmą, sukeldama dviejų atskirų DNR grandžių rekombinaciją. Pradinis žingsnis rekombinacijos metu sukelia Holiday sankryžos tarpinės dalies sukūrimą. Antrasis žingsnis lėmė dviejų vienas kitą papildančių grandžių rekombinaciją (Ma ir kt., 2007).


Neoplazija

Stan K. Bardal bakalauras (farmacija), MBA, mokslų daktaras, . Douglas S. Martin, taikomosios farmakologijos mokslų daktaras, 2011 m

MOA (veiksmo mechanizmas)

Alkilinimo agentai perneša alkilą (cheminis) grupės į DNR. DNR alkilinimas branduolyje veda prie ląstelės mirtis.

Patekę į ląstelę, alkilinančios medžiagos struktūriškai persitvarko, todėl susidaro nestabilus tarpinis produktas – etileno amonio jonas.

Šis jonas tiesiogiai arba per kitą tarpinį produktą, karbonio joną, perkelia alkilo grupes į nukleorūgštis, tokias kaip guaninas, arba į kitas ląstelių sudedamąsias dalis.

Guanino ar kitų bazių alkilinimas sukelia nenormalų bazių poravimąsi taip pat šių pagrindų iškirpimas, o tai savo ruožtu sukelia sruogų lūžimą.

Alkilinimo agentai laikomi ląstelių ciklo faze nespecifinis, su ląstelėmis G1 ir S fazės yra jautriausios (20-1 pav.).

Ryšys tarp DNR alkilinimo ir vėžio ląstelės mirties nenustatytas, tačiau vienas iš tikėtinų mechanizmų yra DNR pažeidimas, kurio pakanka proapoptotiniams baltymams, tokiems kaip p53, aktyvuoti, o tai lemia ląstelių mirtį.

Nitrozourea turi papildomą veikimo mechanizmą. Nitrozourea patiria kitą reakciją, vadinamą karbamoilinimas, su baltymų lizino likučiais. Karbamoilinimas yra karbamoilo (NH2CO) grupės į aminogrupes, tokias kaip aminorūgštyse.

Šios reakcijos produktas vadinamas a karbamoilintas baltymas, ir atrodo, kad šis procesas riboja vėžio ląstelės gebėjimą pataisyti DNR. Šis unikalus veikimo mechanizmas riboja kryžminį atsparumą tarp nitrozarbamido ir kitų šios klasės atstovų.

Pasipriešinimo mechanizmai

Atsparumo mechanizmai apima šiuos: ▴

Sumažėjęs vaisto patekimas į ląstelę

Alkilinimo agento inaktyvavimas glutationu

Kryžminis atsparumas būdingas įvairiems alkilinančių medžiagų poklasiams, išskyrus nitrozkarbamidus.


Biocheminė (S_N1) reakcija

Kaip matysime 10 skyriuje, fermentų katalizuojamos (S_N1) reakcijos atlieka svarbų vaidmenį angliavandenių ir DNR/RNR nukleotidų metabolizme. Toliau pateikta reakcija yra nukleotidų biosintezės dalis:

Atkreipkite dėmesį į keletą dalykų: pirma, difosfato paliekanti grupė stabilizuojama sąveikaujant su aktyviojoje vietoje surištu (Mg^<+2>) jonu, taip pat vandeniliniu ryšiu su aktyvios vietos aminorūgščių liekanomis (neparodyta). Karbokationo tarpinę jungtį stabilizuoja rezonansas su vienišomis deguonies poromis (žr. 8.5 skyrių), taip pat aktyvios vietos aspartato šoninė grandinė. Amoniako nukleofilas yra aktyvioje vietoje taip, kad jis artėtų iš plokščiosios karbokacijos tarpinės dalies „viršaus“, o pakeitimas sukelia konfigūracijos inversiją. Atminkite: (S_N1) reakcijos, kurios vyksta laisvai tirpale, paprastai sukelia stereoizomerų mišinį, tačiau fermentų katalizuojamos reakcijos, įskaitant tokias fermentines (S_N1) reakcijas, kaip ši, paprastai yra stereo- ir regioninės specifinės, Tai reiškia, kad beveik visada gaunamas vienas izomerinis produktas, o ne produktų mišinys.

Prisiminkite teiginį iš 8.4 skyriaus, kad blogai paliekančias grupes dažnai reikia paversti gerai paliekančiomis grupėmis. Atlikus vieną metabolizmo etapą iš aukščiau pavaizduotos reakcijos, matome, kad prastai (hidroksidą) paliekanti grupė ant ribozės-5-fosfato pirmiausia paverčiama gerąja (difosfato) paliekančia grupe, kuri gali stabilizuotis sąveikaujant su aktyvia ribozės vieta. fermentas, katalizuojantis (S_N1) reakciją.

Šis preliminarus fosforilinimo etapas, kuriam reikalingas ATP (adenozino trifosfatas) kaip difosfatų grupės donoras, yra reakcija, kurią daug išsamiau išnagrinėsime 9 skyriuje.


DNR polimerazės savybės:

  • Didelis procesiškumas: DNR polimerazės katalizė yra greita, ji gali pridėti net 1000 nukleotidų per sekundę prie pradmenų grandinės. DNR polimerazės atveju proceso laipsnis apibrėžiamas kaip nukleotidų, pridedamų kiekvieną kartą, kai fermentas sujungia pradmenų: šablono jungtį, skaičius.
  • Keli substratai: Procesiniame fermente kiekvieną kartą, kai fermentas sujungia pradmenį: šabloną jungtis su keliais substratais, į pradmenį pridedama dNTP. Priešingai nei joks procesinis fermentas, į pradmenį prideda vieną dNTP, o po to išsiskiria iš pradmenų: šablono jungties.

Didesnį procesiškumą palengvina DNR polimerazės gebėjimas slysti išilgai DNR šablono. DNR polimerazė glaudžiai sąveikauja su didžiąja dvigrandės DNR dalimi nespecifiniu būdu. Šios sąveikos apima elektrostatinę sąveiką tarp fosfato pagrindo ir nykščio srities bei sąveiką tarp mažojo DNR griovelio ir delno srities. Tolesnis procesyvumo padidėjimas pasiekiamas dėl sąveikos tarp DNR polimerazės ir baltymo “Sliding clamp”.

  • Egzonukleazės aktyvumas: Retkarčiais pamatų mirgėjimas į ‘neteisingą’ tautomerinę formą. Ši alternatyvi bazių forma leidžia tinkamai išdėstyti neteisingas bazių poras katalizei. Egzonukleazės patikrina naujai susintetintą DNR. Tokio tipo egzonukleazė vadinama korektūros egzonukleazė. Šios egzonukleazės gali skaidyti DNR, pradedant nuo 3′ DNR galo, tai yra nuo augančio naujos DNR grandinės galo, ir pašalinti netinkamą nukleotidą.

Neteisinga DNR pakeičia 3′ OH geometriją ir gaunamą nukleotidą dėl prastos sąveikos su delno sritimi. Ši pakeista geometrija sumažina nukleotidų pridėjimo greitį ir padidina korektūros egzonukleazės aktyvumo greitį. korektūra gali vykti neatleidžiant DNR iš polimerazės. Kai aptinkama nesutampanti pora, pradmenų: šablono jungtis nuslysta nuo DNR polimerazės aktyvios vietos ir patenka į egzonukleazės vietą. pašalinus netinkamą nukleotidą, teisingai suporuotas pradmenų: šablono jungtis slenka atgal į aktyviąją polimerazės vietą ir DNR sintezė tęsiasi.

DNR polimerazė, atliekanti sintezę ir redagavimą

  • Nukleotidai pridedami prie abiejų šablonų replikacijos šakute tuo pačiu metu.
  • Būtinas gruntas. DNR polimerazei reikia pradmenų, kad inicijuotų DNR polimerazę.

Maža DNR polimerazės III gausa ir didelis procesyvumas

DNR polimerazė III turi daug savybių, kurių tikimasi iš replikacinės polimerazės. Viena iš DNR polimerazės III tyrimų komplikacijų yra ta, kad įvairios formos buvo išskirtos įvairiomis procedūromis. Dabar suprantame, kad šios formos skiriasi atskirtame fermente esančių subvienetų skaičiumi. Jei fermentai turi kelis subvienetus, kompleksą su visais subvienetais, reikalingais jo pagrindinei funkcijai, vadiname holofermentas arba holokompleksas . DNR polimerazės holofermentas turi dešimt subvienetų, kurie bus išsamiai aptariami kitame skyriuje.

Būtent DNR polimerazės holofermentas pasižymi replikacinei polimerazei būdingomis savybėmis, o DNR polimerazė I neturi (žr. palyginimą 5.1 lentelėje). tai yra mažiau gausios nei DNR polimerazė I, tačiau daug replikuojančių DNR polimerazių ląstelėje nereikia. Kiekvienoje replikacijos šakutėje gali būti naudojama tik viena ar dvi polimerazės, todėl pakaks 10 DNR polimerazės III holofermento molekulių. DNR polimerazė III žymiai greičiau katalizuoja DNR sintezę nei DNR polimerazė I, maždaug 70 kartų. Išmatuotas DNR polimerazės III holofermento pailgėjimo greitis (42 000 nukleotidų per minutę) yra artimas išmatuotam replikacijos šakutės judėjimo greičiui. in vivo in E. coli (60 000 nukleotidų per minutę).

Pagrindinė replikacinės DNR polimerazės savybė yra didelis procesiškumas , kuri yra stulbinanti DNR polimerazės III holofermento savybė. Procesiškumas yra polimerizacijos kiekis, kurį fermentas katalizuoja kiekvieną kartą, kai jis prisijungia prie atitinkamo šablono arba pradmenų šablono DNR polimerazių atveju. Jis matuojamas nukleotidais, polimerizuotais per prisijungimo įvykį. Siekiant atkartoti 4,5 megabazės chromosomą E. coli per 30–40 minučių DNR polimerazė turi greitai ir labai procesyviai sintetinti DNR. DNR polimerazė I susintetina mažiau nei 200 nukleotidų per vieną surišimo įvykį, bet kaip holofermentas, DNR polimerazė III yra daug produktyvesnė ir viršija tyrimo, naudoto 5.1 lentelėje apibendrintiems rezultatams gauti, ribas. Priešingai, DNR polimerazės III šerdis, turinti tik tris subvienetus (žr. kitą skyrių), pasižymi labai mažu procesyvumu.

5.1 lentelė. DNR polimerazių I ir III (Pol I ir Pol III) palyginimas

nukleotidai polimerizuoti min -1 (molekulinis fermentas) -1

procesiškumas [per iniciaciją polimerizuoti nukleotidai]

3'-5' egzonukleazė, korektūra

Pastaba: + ir nurodo nurodyto aktyvumo buvimą arba nebuvimą fermente.

5.6 klausimas. Jei išmatuotas replikacijos šakės judėjimo greitis in vivo in E. coli yra 60 000 nukleotidų per minutę, kiek šakučių reikia, kad chromosoma pasikartotų per 40 min? Prisiminkite, kad dydis E. coli chromosoma yra 4,64 10 6 bp.


Papildomas 1 paveikslas SRAP išsaugojimas.

a. Struktūra pagrįstas sekos derinimas tarp E. coli YedK ir žmogaus HMCES SRAP domenas, kartu su SRAP domenų sekos suderinimu iš 8 papildomų rūšių. Virš lygiavimo parodyta antrinė YedK DPC struktūros struktūra. Virš konkrečių liekanų esantys simboliai žymi tuos, kurie dalyvauja surišant DNR (apskritimai), iškraipant DNR 5′ AP vietos pusėje (pleištas, mėlyni apskritimai), jungiantis prie dsDNR iškart 3′ nuo AP vietos (lentyna, rausvai raudoni apskritimai) ir stabilizuojant tiazolidino skersinį ryšį (Cys2 kišenė, „ד). b. Stačiakampiai YedK DPC struktūros spalvotos vaivorykštės vaizdai nuo N (mėlyna) iki C galo (raudona). c. Superpozicija E. coli YedK DPC (mėlyna / auksinė) ir žmogaus HMCES SRAP domenas (PDB ID 5KO9, sidabras). R.m.s.d. tarp struktūrų yra 1,40 Å visiems pagrindo atomams. d. YedK DPC (mėlyna / rausvai raudona) ir laisvo YedK (oranžinė) superpozicija. YedK DPC kilpos, kurių laisvasis baltymas yra sutrikęs, yra rausvai raudonos spalvos. Baltymai rodomi kaip Cα stuburo pėdsakas.

Papildoma 2 pav. Išsami informacija apie SRAP aktyvią vietą.

Stereovaizdiniai likučių, susisiekiančių su tiazolidino ryšiu dviejuose baltymo-DNR kompleksuose YedK DPC struktūros asimetriškame vienete, su 1σ 2Fo-Fc elektronų tankiu, vaizdai. Brūkšninės linijos ir skaičiai rodo vandenilio jungčių ilgį Å.

3 papildomas paveikslas Nekovalentinio SRAP-DNR komplekso struktūrinė informacija.

a. YedK superpozicija, kovalentiškai sujungta su AP-DNR (mėlyna) ir nekovalentiškai surišta su C3 tarpinės DNR (rausvai raudona). Pagrindinė vieta pažymėta žvaigždute. Dvigalvė rodyklė rodo reikšmingiausią skirtumą tarp dviejų struktūrų – β-plaukų segtuko (β7-β8) judėjimą, kuris stabilizuoja DNR stuburą 3′ į AP vietą. b. YedK aktyviosios vietos stereofoninis vaizdas YedK/C3-spacer-DNR struktūroje, uždengtas 1σ 2Fo-Fc elektronų tankiu. C3 tarpiklis yra žalios spalvos, o šalia esantys nukleotidai yra auksiniai. Brūkšninės linijos ir skaičiai rodo vandenilio jungčių ilgį Å. c. DNR DPC (viršuje) ir nekovalentinės C3 tarpinės (apačios) struktūrose, nuspalvintos B faktoriumi. d. Vidutinis kiekvieno nukleotido B faktorius DPC (juoda) ir nekovalentinio C3 tarpiklio (mėlyna) struktūrose.

Papildomas 4 paveikslas HMCES SRAP domeno susiejimas su ssDNR ir ssDNA / dsDNA jungtimis, turinčiomis tetrahidrofurano (THF) abazinės vietos analogą.

Prisirišimas buvo stebimas pasikeitus fluorescencinei anizotropijai, nes baltymas buvo titruojamas prieš DNR, kuriose buvo FAM etiketė THF grandinės 5′ gale. Maksimalus anizotropijos pokytis (rišimosi izotermos amplitudė esant prisotinimui) priklauso nuo FAM etiketės sukimosi greičio, kuris skiriasi kiekvienam iš trijų substratų. Disociacijos konstantos (Kd) buvo gauti iš dviejų būsenų, vienos vietos susiejimo modelio netiesinio mažiausių kvadratų pritaikymo prie duomenų.