Informacija

Kaip FACS rūšiuoja atskiras ląsteles scRNA-Seq protokole?

Kaip FACS rūšiuoja atskiras ląsteles scRNA-Seq protokole?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aš esu skaičiavimo vaikinas, bandantis suprasti, kaip veikia FACS rūšiavimas naudojant scRNA-Seq protokolą. Dėl pavienių ląstelių rūšiavimo kiekviename 384 šulinėlių plokštelės šulinyje turiu klausimą, į kurį būčiau dėkingas, jei galėtumėte į jį atsakyti.

Protokole rašoma, kad ląstelės yra rūšiuojamos šuliniuose pagal jų žymenų lygius. Pavyzdžiui, sakoma:

Pavienės NK ląstelės buvo surinktos iš CD19-/TCR-β- įvykių, nustatant NK-1.1+ įvykius NK-1.1 ir Gr1.

Aš nesuprantu, kaip galima iš anksto žinoti teigiamus/neigiamus įvykius ar net spėlioti apie įvykius? Žinau, kad FACS pirmiausia ištiria žymenis, o paskui surūšiuoja juos į teigiamus, neigiamus arba atliekų rinkinius. Štai mano klausimas:

Bet kaip žinoti, koks išraiškos lygis yra priimtinas norint ląstelę vadinti teigiama, o taip pat sudėtingesniu atveju, kaip patekti į ląstelių subpopuliaciją (pvz., viršutinį dešinįjį kvadrantą), kai jokie įvykiai dar neperžengė lazerio spindulio, nes mes dar nežinome CD žymenų išraiškos lygių pradinės linijos?

Pavyzdžiui, gali būti, kad mano skydelio sąrankoje CD žymeklis niekada negali pasiekti didesnės nei X reikšmės, bet jūsų sąrankoje jis niekada negali pasiekti didesnės nei X/2 reikšmės.

N.B. Kaip sakoma protokole, imant pagrindinį FACS mėginį neįmanoma iš anksto nustatyti šių verčių, nes labai tikėtina, kad skirtingų ląstelių tipų populiacijos nėra išsaugotos subimtyje.


Prie protokolo pridėsiu ankstesnį sakinį ir paryškinsiu tai, kas gali padėti:

Norėdami gauti B ląsteles, NK ląsteles ir monocitus, splenocitų suspensiją buvo nudažytas PE-Cy7 konjuguotu CD19, eFluor 450 konjuguotu NK-1.1, PerCP Cy5.5 Gr1, FITC TCR-β, APC CD11b ir PE B220 (CD45R). B220+ ir B220neg (germinalinio centro) B ląstelės buvo renkamos nustatant CD19+ (TCR-βneg) ląsteles, o po to B220 prieš CD19 žymenį. Pavienės NK ląstelės buvo surinktos iš CD19neg/TCR-βneg įvykių, nustatant NK-1.1 teigiamus įvykius NK-1.1 ir Gr1.

Aptariami ląstelių tipai turi unikalių savybių, kurias galima nudažyti naudojant (imuno)histochemiją, t. y. chemines medžiagas ir (arba) antikūnus. Patys antikūnai linkę būti konjuguoti, t.y. jie yra kovalentiškai surišti su fluoroforais, kurie paprastai yra fluorescenciniai. Tai reiškia, kad ląstelių tipą galima pažymėti fluorescencija, o FACS aparatas gali rūšiuoti fluorescencines ląsteles nuo nefluorescencinių ląstelių.

Jie nudažo skirtingus ląstelių tipus skirtingais žymenimis. Žymekliai pakankamai skiriasi vienas nuo kito, kad kai kuriais atvejais būtų galima juos naudoti kartu. Pavyzdžiui, bet koks FITC gali būti naudojamas kartu su PE-Cy7 konjuguotu antikūnu.

  1. Pirma, jie surenka du B ląstelių pogrupius (B220 teigiamas ir neigiamas ląsteles), naudodami CD19 žymeklį (PE-Cy7 konjuguotą antikūną, kuris jungiasi su CD19).
  2. Tada iš vieno iš pogrupių, B220 teigiamo, jie išrūšiuoja kitą pogrupį, kuris yra teigiamas eFluor 450 (kuris yra konjuguotas su NK-1.1 antikūnu). Šis surinktas pogrupis atitinka NK ląstelių kriterijus.
  3. Šis pogrupis naudojamas atskiroms ląstelėms užfiksuoti ant plokštelės (pvz., SMART-seq2) arba naudojant mikroskysčius (pvz., 10X Chromium).

FACS aparatui galite pasirinkti slenksčio lygį pvz. florescencija, kuri bus naudojama kaip riba tarp teigiamų ir neigiamų įvykių (ląstelių). Tai savavališka ir paprastai yra išbandoma.


mes dar nežinome CD žymenų išraiškos lygių pradinės linijos?

Yra standartiniai nustatymai, kuriuos galima naudoti tarp paleidimų, kurie užtikrins vienodus rezultatus nuo vieno mėginio iki kito. Taip pat yra valdiklių (fluorescencinių karoliukų), kuriuos galima paleisti iš anksto, kad būtų galima nustatyti aparatą ir užtikrinti, kad šie standartiniai nustatymai veiktų, ir leidžia atlikti palyginti nedidelius pakeitimus, kad jie atitiktų nuoseklų diapazoną.

Bet jūs taip pat turite kitą klaidingą supratimą:

Atrinkus pagrindinio FACS mėginio dalį, šių verčių iš anksto nustatyti neįmanoma, nes labai tikėtina, kad skirtingų tipų ląstelių populiacijos subimtyje nėra išsaugotos.

Tai, kad teigiamų ląstelių nėra pavyzdyje, nereiškia, kad negalite nustatyti normalių verčių.

Svarbiausia, kad teigiama ląstelė nėra subtilus dalykas. Įprastoje srauto citometrijos dėmėje jūsų teigiamai nudažytos ląstelės bus daug ryškesnės nei negatyvios; blogiausiu atveju dešimtis kartų, dažnai tūkstančius kartų šviesesnis. Vartelių nustatymas gana arti viršutinio negatyvo galo (savo pavyzdyje) praktiškai garantuos, kad teigiami elementai bus už vartų.

Griebiau atsitiktinį pavyzdį iš Google paieškos; tai gana tipiškai atrodantys vartai:

Atkreipkite dėmesį, kad kiekvienuose vartuose teigiama populiacija yra tūkstantį kartų iki kelių tūkstančių kartų ryškesnė už neigiamą (X ašis yra log skalė). Kai turite tiek erdvės darbui, į subtilius subtilius bazinių nustatymų efektus galima saugiai nepaisyti.


Įvadas į vienos ląstelės RNR sekos nustatymą

Per pastarąjį dešimtmetį didelio našumo sekos nustatymo metodai pakeitė visą biologijos sritį. Galimybė labai išsamiai ištirti ištisus transkriptus naudojant RNR seką (RNA-seq) paskatino daug svarbių atradimų ir dabar yra įprastas biomedicininių tyrimų metodas. Tačiau RNR-seq paprastai atliekama „masiškai“, o duomenys rodo genų ekspresijos modelių vidurkį nuo tūkstančių iki milijonų ląstelių, o tai gali užgožti biologiškai svarbius ląstelių skirtumus. Vienos ląstelės RNR-seq (scRNA-seq) yra būdas išspręsti šią problemą. Išskirdama atskiras ląsteles, fiksuojant jų nuorašus ir generuojant sekos bibliotekas, kuriose nuorašai yra susieti su atskiromis ląstelėmis, scRNA-seq leidžia įvertinti pagrindines ląstelių populiacijų ir biologinių sistemų biologines savybes precedento neturinčia skiriamąja geba. Čia pristatome dažniausiai naudojamus scRNA-seq protokolus ir duomenų analizės pagrindus bei aptariame veiksnius, į kuriuos svarbu atsižvelgti prieš planuojant ir kuriant scRNA-seq projektą. © 2018, John Wiley & Sons, Inc.


5 patarimai, kad jūsų vienos ląstelės RNR-seq eksperimentai būtų sėkmingi

Padaryti RNA-seq bibliotekas iš labai mažos RNR masės atskirose ląstelėse gali būti sudėtinga. Šie patarimai padės išvengti įprastų problemų, kad galėtumėte kuo geriau išnaudoti savo vienos ląstelės RNR-seq eksperimentus!

1. Prieš apdorodami mėginius, atlikite bandomąjį eksperimentą

Net tiems, kurie yra susipažinę su vienos ląstelės RNR-seq darbo eiga, gali tekti optimizuoti eksperimentus, kai jie naudoja skirtingus mėginių tipus. Bandomieji eksperimentai gali padėti anksti nustatyti bet kokias problemas ir neeikvoti reagentų bei laiko didesniems eksperimentams. Bandomieji eksperimentai paprastai apima kelis eksperimentinius mėginius, teigiamą kontrolę ir neigiamą kontrolę. Kontrolinių reakcijų atlikimas gali padėti nustatyti su eksperimentine technika susijusias problemas (aptarta 2 patarime). Kai kontroliniai elementai veikia taip, kaip tikėtasi, cDNR išeiga ir dydžio pasiskirstymas gali informuoti apie eksperimento pakeitimus, kad eksperimentiniai mėginiai būtų veiksmingiausi. Kadangi skirtingų tipų ląstelių RNR kiekis gali labai skirtis, gali tekti koreguoti PGR ciklų skaičių, kad gautumėte optimalų išeigą bibliotekai paruošti.

Mėginio tipas Apytikslis RNR kiekis (masė ląstelėje)
PBMC 1 p
Jurkat ląstelės 5 psl
HeLa ląstelės 5 psl
K562 ląstelės 10 p
2 ląstelių embrionai 500 psl

I lentelė. RNR masė ląstelėje pagal dažniausiai naudojamus mėginių tipus.

2. Visada atlikite teigiamas ir neigiamas kontrolines reakcijas

Nesvarbu, ar anksčiau atlikote vienos ląstelės RNR seką vieną ar tūkstantį kartų, šios kontrolinės reakcijos yra neįkainojamos jūsų eksperimentų trikčių šalinimui. Visuose „Takara Bio“ NGS rinkiniuose yra teigiamų kontrolinių mėginių, o geriausios teigiamos kontrolės RNR įvesties masė yra panaši į jūsų eksperimentinius mėginius (pvz., 10 pg RNR kaip atskirų ląstelių atskaitos taškas arba žr. aukščiau esančią lentelę). Panašiai geriausia neigiama kontrolė yra ta, kuri traktuojama taip pat, kaip ir jūsų tikrieji mėginiai (pvz., netikras FACS mėginio buferis). Kai kurie nauji vartotojai gali pastebėti mažą cDNR kiekį savo teigiamuose kontroliniuose mėginiuose. Kol nesate patenkinti protokolu, galbūt norėsite išbandyti dvi teigiamos kontrolės įvestis (pvz., 10 pg ir 100 pg). Nauji vartotojai kartais taip pat gali matyti aukštą foną savo neigiamuose valdikliuose, o tai yra labai svarbi problema (žr. 4 ir 5 patarimus, kaip sumažinti foną).

3. Užtikrinkite, kad jūsų ląstelės būtų pakabintos ir (arba) FACS surūšiuotos į atitinkamą buferį

Atvirkštinės transkripcijos (RT) sąlygos vienos ląstelės RNR-seq eksperimentuose yra kruopščiai kalibruojamos, kad būtų užtikrintas didžiausias derlius iš labai mažo pradinės medžiagos kiekio. Terpės, DEPC, Rnazės, magnis, kalcis arba EDTA, pernešamos su ląstelėmis, gali trukdyti RT reakcijai ir sumažinti cDNR išeigą bei jautrumą. Jei įmanoma, rekomenduojame išplauti ir resuspenduoti masinę ląstelių suspensiją 1x PBS be EDTA, Mg 2+ ir Ca 2+, ypač jei naudojami fermentinės disociacijos metodai, tokie kaip tripsinizacija. Jei atskiroms ląstelėms izoliuoti naudojate FACS, taip pat galite resuspenduoti ląsteles buferyje, pvz., BD FACS išankstinio rūšiavimo buferyje, kuris gali padėti išlaikyti ląstelių suspensiją ir be EDTA, Mg 2+ ir Ca 2+. . Jei įmanoma, kaip apvalkalo skystį rekomenduojame naudoti EDTA, Mg 2+ ir Ca 2+ neturintį 1x PBS, tačiau kiti apvalkalo skysčiai, kuriuose yra mažos EDTA koncentracijos, greičiausiai neturės įtakos RT reakcijai.

Skirtinguose protokoluose pateikiamos skirtingos rekomendacijos dėl tinkamo buferio ir tūrio, į kurį FACS rūšiuoja ląsteles, tačiau gera nykščio taisyklė yra rūšiuoti į ką tik paruoštą lizės buferį, kuriame yra RNazės inhibitorius. Žemiau esančioje lentelėje rasite rekomendacijų, pritaikytų mūsų vienos ląstelės RNR-seq rinkiniams. Jei atliekant eksperimentą reikia pakoreguoti vieną ar daugiau šių parametrų, bandomasis eksperimentas yra geriausias būdas nustatyti šio (-ių) nuokrypio (-ų) poveikį. Pavyzdžiui, palyginkite cDNR, pagamintos iš 10 pg kontrolinės RNR, cDNR išeigą ir dydžio pasiskirstymą su terpės ar buferio kiekiu, kurį tikitės gauti kartu su ląstelėmis, ir be jo.

rinkinys Rekomenduojamas FACS surinkimo buferis Apimtis Sudėtyje yra Alternatyvūs surinkimo buferiai
SMART-Seq v4 1X reakcijos buferis 11,5 &mikro Lizės buferis ir Rnazės inhibitorius < 5 &mikrolis be Mg 2+ ir Ca 2+ 1X PBS
SMART-Seq HT CDS rūšiavimo sprendimas 12,5 &mikro Lizės buferis, RNazės inhibitorius ir CDS pradmuo 11,5 &mikrolio paprasto rūšiavimo tirpalo (be CDS oligo) arba < 5 &mikrolio Mg 2+ ir Ca 2+ be 1X PBS
SMART-Seq suvyta Be Mg 2+ ir Ca 2+ 1X PBS 7 &mikro Fosfatu buferinis fiziologinis tirpalas 8 µl 1,25X lizės buferio mišinys

II lentelė. Rekomenduojami ir alternatyvūs FACS rinkimo parametrai SMART-Seq v4, SMART-Seq HT ir SMART-Seq Stranded rinkiniams. Tikslūs mūsų rekomenduojamų FACS surinkimo buferių buferių receptai yra įtraukti į atitinkamus vartotojo vadovus. Atkreipiame dėmesį, kad rūšiavimas į alternatyvų buferį gali turėti įtakos mūsų rinkinių veikimui ir reikės pakeisti siūlomus RT reakcijos pagrindinius mišinius.

4. Dirbkite greitai

Kai ląstelės buvo dedamos į plokštelių arba mėgintuvėlio juostelių šulinėlius ir švelniai centrifuguojamos 100g, mėginiai turi būti nedelsiant apdoroti arba greitai užšaldyti sausame lede ir iki apdorojimo laikomi 80°C temperatūroje. Sumažinus laiką tarp ląstelių surinkimo, greito užšaldymo ir cDNR sintezės etapų, sumažės RNR degradacija ir nepageidaujami transkripto profilio pokyčiai. Viso protokolo metu sutrumpėjus apdorojimo laikui, ribojama mėginio užteršimo arba suirimo tikimybė.

5. Praktikuokite gerus RNR-seq laboratorinius metodus

Darbas su ypač mažo kiekio mėginiais yra sudėtingas, be to, eksperimento metu lengva užteršti arba prarasti mėginio medžiagą. Procedūros metu visada dėvėkite švarų laboratorinį chalatą, rankovių dangtelius ir pirštines. Nepamirškite pasikeisti pirštinių tarp protokolo žingsnių. Taip pat gera praktika yra išlaikyti atskiras darbo vietas prieš ir po PGR. Idealiu atveju darbo vieta prieš PGR turėtų būti švarioje patalpoje su teigiama oro srautu, o tai labai sumažins amplikono ar aplinkos užteršimo riziką. Naudojant RNazės ir DNazės neturinčius ir mažai RNR bei DNR surišančius plastikinius įrankius (pipetės antgalius, plokšteles/vamzdelio juosteles ir kt.), turėtų sumažėti mėginio praradimas. Karoliukų valymo veiksmai gali būti dar viena svarbi mėginio praradimo priežastis. Prieš pašalindami supernatantą, leiskite granulėms visiškai atsiskirti, nes kitaip prarasite daug medžiagos. Stipraus magnetinio prietaiso naudojimas pagerins ir pagreitins šį atskyrimą. Po plovimo etanoliu būtinai laikykitės protokolo rekomendacijų dėl džiovinimo ir drėkinimo laiko.

„Takara Bio“ yra vienaląsčių RNR-seq srities ekspertas, ir mes daugelį metų buvome šios technologijos pionieriai ir sistemingai tobulinami. Siūlome daugybę vienos ląstelės RNR-seq rinkinių, įskaitant oligo-dT ir atsitiktinio pradėjimo sprendimus. Šiais patarimais siekiama sumažinti vienos ląstelės RNA-seq sunkumus, tačiau jei turite konkrečių klausimų apie mūsų rinkinius arba susiduriate su eksperimentinėmis problemomis, mūsų techninio palaikymo komanda laukia ir mielai padės.

Papildomas vienos ląstelės RNR-seq eksperimentų skaitymas

Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A. & Lönnberg, T. Praktinis vienos ląstelės RNR sekos nustatymo vadovas biomedicininiams tyrimams ir klinikiniam pritaikymui. Genome Med. 9, 75 (2017).

Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C. & Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Mol. Ląstelė 58, 610&ndash620 (2015).

Wu, A. R., Wang, J., Streets, A. M. & amp Huang, Y. Single-Cell Transcriptional Analysis. Annu. Anal. Chem. 10, 439&ndash462 (2017).

Takara Bio USA, Inc.
Jungtinės Valstijos / Kanada: +1.800.662.2566 & Bull Azijos ir Ramiojo vandenyno: +1.650.919.7300 & Bull Europa: +33.(0)1.3904.6880 & Bull Japonija: +81.(0)77.565.6999
TIK TYRIMO NAUDOJIMAS. NĖRA NAUDOTI DIAGNOSTIJOS PROCEDŪROMS. &kopija 2021 Takara Bio Inc. Visos teisės saugomos. Visi prekių ženklai priklauso „Takara Bio Inc.“ arba jos filialui (-ėms) JAV ir (arba) kitose šalyse arba atitinkamiems jų savininkams. Tam tikri prekių ženklai gali būti registruoti ne visose jurisdikcijose. Papildomą informaciją apie produktą, intelektinę nuosavybę ir ribotą naudojimą rasite adresu takarabio.com.

„Takara Bio Europe“ priklauso „Takara Bio Group“ – pirmaujančiai gyvosios gamtos mokslų bendrovei, kuri yra įsipareigojusi gerinti žmonių būklę pasitelkdama biotechnologijas. Per savo prekės ženklus „Takara“, „Clontech“ ir „Cellartis“ mūsų misija yra kurti aukštos kokybės naujoviškus įrankius ir paslaugas, kad būtų paspartintas atradimas.


Galia atskirai: įžvalgos iš atskirų ląstelių

Šio mėnesio „Genome Watch“ išryškina vienaląsčių metodų rinkinį, suteikiantį galingų įžvalgų apie mikrobų biologiją.

Nors mikroorganizmų genomo sekos nustatymas dabar yra įprastas, iššifruoti, kaip genomo turinys yra susijęs su organizmo, aplinkos ir ekologiniais procesais, tebėra didžiulis iššūkis. Naujausių tyrimų rinkinys sėkmingai pritaikė daugybę vienaląsčių metodų, skirtų susieti mikrobų genus ir genomus.

Viename tyrime Doudas ir jo kolegos 1 sukūrė vienos ląstelės genomo sekos nustatymo strategiją, kad nustatytų celiuliozę ardančius mikroorganizmus sudėtingoje bendruomenėje. Pirmiausia jie į mėginius, paimtus iš natūralios vandens aplinkos, įvedė fluorescenciniu būdu pažymėtas celiuliozės daleles kaip „masalą“. Tada, naudodamiesi fluorescencija aktyvintu ląstelių rūšiavimu (FACS) ir viso genomo amplifikavimu, jie sukūrė tikslinį metodą, kaip išgauti dominančius mikroorganizmus, kurie buvo prijungti prie substrato, o tai rodo, kad jie gali skaidyti celiuliozę. Atskirų sugautų su celiulioze surištų mikrobų ląstelių genomų seka atskleidė retą blogai apibūdinto klado biosferos narį. Aukso bakterijos, pakrautas tariamais celiulazės genais. Tada autoriai funkciškai patvirtino celiuliozę skaidančių fermentų aktyvumą šioje naujoje padermėje, pavadintoje Candidatus „Cellulosimonas argentiregionis, kuris padės anotuoti panašius genus greitai augančiose bakterijų genomo duomenų saugyklose.

Nors šis metodas efektyviai identifikuoja nežinomus mikroorganizmus, turinčius pageidaujamą funkciją sudėtingoje bendruomenėje, jis priklauso nuo sekų palyginimo su anksčiau apibūdintais genais ir genomais, kad būtų galima interpretuoti funkcines galimybes. Norėdami išspręsti šį iššūkį, Thibault ir kolegos 2 sukūrė papildomą vienos ląstelės metodą, panaudodami neseniai sukurtus mikrofluidikos metodus, kad būtų galima nustatyti lašelių transpozono seką (dTn-Seq). Skirtingai nuo tradicinių Tn-Seq, kai įterpimo mutantai yra auginami kaip sujungtos bibliotekos kontroliuojamomis ir pakeistomis sąlygomis, dTn-Seq leidžia šimtus tūkstančių atskirų mutantų užfiksuoti mikrolašeliuose ir auginti atskirai. Tai pašalina klaidinantį veiksnį, dažnai pastebimą masinės kultūros Tn-Seq metoduose, kai atskirų mutantų fenotipus gali slopinti kitų padermių buvimas bendruomenėje. Pavyzdžiui, geno, reikalingo išskiriamo kvorumo jutimo faktoriaus susidarymui, mutacija gali turėti įtakos izoliuotai auginamos mutantinės padermės populiacijos dinamikai, tačiau jos nebus galima aptikti skystoje kokultūroje su daugeliu kitų mutantų. Thibault ir kt. naudojo dTn-Seq, kad nustatytų tūkstančių fenotipus Streptococcus pneumoniae mutantai. Kai mutantai buvo auginami lašeliuose, paaiškėjo daugelio genų kūno rengybos indėlis, kuris būtų praleistas, jei būtų auginami kartu. Ši technologija suderinama su įterpimo sekos nustatymu (IN-seq), FACS, į transpozoną nukreiptu įterpimo vietos sekvenavimu (Tra-DIS) ir didelio našumo įterpimo stebėjimu naudojant gilųjį sekvenavimą (HITS), kuris leidžia ją taikyti tiek bakterijoms, tiek vienaląsčiams eukariotams. pavyzdžiui, mielės. Jis taip pat gali būti derinamas su mikroskopija ir dviguba kapsuliacija interaktyviam atrankai su kitomis mikrobų padermėmis ar rūšimis, esančiomis mikrolašeliuose.

Genetikos ir genomikos metodai sėkmingai nustato bendruosius mikrobų genų ir funkcinių savybių ryšius. Tačiau norint gauti daugiau kiekybinių įžvalgų apie genų ir genų reguliavimo tinklų vaidmenį, paprastai reikia funkcinių genomikos metodų, tokių kaip transkribuotos RNR matavimai. Vienos ląstelės RNR sekos nustatymas (scRNA-seq) sujungia mikrofluidinių ląstelių išskyrimą su transkripto brūkšniniu kodu ir sekos nustatymu. Dabar jis įprastai naudojamas tiriant daugialąsčius organizmus, tačiau vis dažniau taikomas ir vienaląsčiams eukariotams. Pavyzdžiui, scRNA-seq tyrimai patogeniškumo Plasmodium ir Toksoplazma rūšys suteikė tiesioginį langą į jų parazitinių gyvavimo ciklų transkriptinius kraštovaizdžius.Šie išskaidyti atskirų ląstelių transkripcijos heterogeniškumo vaizdai atskleidė naujus ląstelių pogrupius ir perėjimo taškus, tokiu būdu atskleidžiant svarbius būdus suprasti ląstelių ciklo progresavimą ir virulentiškumą 3, 4, 5 . Panašių metodų pritaikymas bakterijoms ir archėjoms dar neįmanomas, nes nustatyti scRNA-seq protokolai paprastai remiasi išplėstomis poliadenilintomis transkripto uodegomis, esančiomis eukariotuose. Tačiau tobulėjant technologijoms, tikimasi, kad panašūs metodai taps prieinami bakterijoms ir archėjoms, o tai taip pat žada atskleisti neišpasakytas pavienių ląstelių paslaptis.


3. Vienaląsčių technologijų naudojimas siekiant suprasti pieno liaukų biologiją

Nuo tada, kai buvo paskelbti pirmieji vienaląsčių rankraščiai, apibūdinantys pogimdyminę pieno liauką [71], [72], vis daugiau tyrimų (1 lentelė) sutelkė dėmesį į pieno ląstelių palyginimą skirtingose ​​normalaus vystymosi stadijose (1 pav.). Šių tyrimų tikslas yra visapusiškai apibūdinti pieno ląstelių subpopuliacijas ir diferenciacijos trajektorijas, naudojant masės citometriją, scRNA-seq ir scATAC-seq, kad būtų galima atsakyti į pagrindinį klausimą, pavyzdžiui, ar reta bipotentinių pirmtakų populiacija egzistuoja po embriono vystymosi.

1 lentelė

Normalių pieno liaukų ir naviko ląstelių vienos ląstelės duomenų rinkiniai.

NuorodaLabRūšisAudinio tipas (normalus / vėžys / abu)Laiko taškų pavyzdžiaiPieno frakcija (epitelinė / stromos imuninė / abi)Ląstelių paruošimas prieš atskirų ląstelių sekos nustatymąTechnika + technologijaProfiliuotų ląstelių/branduolių skaičius
Andersson ir kt. bioRxiv 2020 m. (išankstinis spausdinimas)LundebergasŽmogusVėžys8x HER2 + krūties navikaiAbuLąstelės, erdviai parinktos iš fiksuotų audinių sekcijųErdvinė transkriptomika sukūrė Ståhl ir kt. Mokslas 20161007 dėmės (kai taškas reiškia nedidelę kaimynystę, apgyvendintą kelių langelių)
Azizi ir kt. Ląstelė 2018Pe𠆞r ir RudenskyŽmogusAbu8 kartus pirminis krūties karcinomos auglys ir atitiko normalų krūties audinį, periferinį kraują ir limfmazgiusStroma-imuneCD45 + FACS surūšiuotos ląstelėsscRNA-seq naudojant inDrop platformą47 016 ląstelių
Bachas ir kt. Nature Comm 2017Marioni ir KhaledasPelėNormalusPieno ląstelės paimtos nėštumo metu (14.5 diena), laktacijos metu (6 diena), involiucijos metu (11 diena) ir iš 8 savaičių amžiaus C57BL/6N pelių.EpitelinisGyvos linijos neigiamos EpCAM + ląstelės, surūšiuotos naudojant FACSscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą23 184 ląstelės
Bachas ir Pensa ir kt. Nature Comm 2021Khaledas ir MarioniPelėAbuDuomenų apie navikogenezę rinkinys: 13 x Blg-Cre Brca1f/fp53 + /- pelių (30 ir #x0201348 sav. amžiaus, negimusios) ir 2 x C57BL/6N pelės (36 ir 40 savaičių amžiaus)3AbuGyvybingos ląstelės buvo išskirtos naudojant MACS Dead Cell Removal KitscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą102 829 ląstelės
Nėštumo duomenų rinkinys: 9 x C57BL/6N pelės 4,5/9,5/14,5 nėštumo dienos, taip pat 3 x C57BL/6N pelės (12 savaičių amžiaus)
Bartoschek ir kt. Nature Comm 2018PietrasPelėVėžys14 savaičių amžiaus MMTV-PyMT pelių navikaiStroma-imuneEpCAM – /CD45 – /CD31 – /NG2 – FACS surūšiuotos mezenchiminės ląstelėsscRNA-seq naudojant Smart-Seq2768 ląstelės
Baslan ir kt. eGyvenimas 2020HicksŽmogusVėžysIš 16 pacientų, įtrauktų į II fazės klinikinius tyrimus, kuriuos atliko Browno universiteto onkologijos grupė (BrUOG), buvo paimtos šviežios biopsijos prieš gydymą.AbuBranduoliai buvo izoliuoti ir FACS surūšiuoti pagal ploidijąVieno branduolio kopijų skaičiaus analizė sukūrė Baslan ir kt. Gamtos protokolai 2012Vidutiniškai 116 pavienių branduolių vienam navikui
Carli ir kt. J Pieno liaukos biolinė neoplazija 2020RudolfasŽmogusNormalusŽmogaus pieno ląstelės iš dviejų dalyviųAbuGyvybingos ląstelės buvo išskirtos naudojant FACSscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą3740 ląstelių
Casasent ir kt. Ląstelė 2018Edgertonas ir NavinasŽmogusVėžys10x latakų karcinoma savo vietoje (DCIS) ir invazinės latakų karcinomos (IDC) navikų mėginiaiAbuLąstelės atrinktos naudojant vienos ląstelės lazerinį skaidymąTopografinė vienos ląstelės seka (TSCS, scDNA sekos nustatymas)Vidutiniškai 129 ląstelės vienam pacientui
Chung ir kt. Nature Comm 2017ParkasŽmogusVėžys11x naviko ląstelių iš skirtingų krūties vėžio potipiųAbuNegyvos ląstelės buvo pašalintos naudojant Ficoll-Paque PLUSscATAC-seq naudojant Fluidigm C1 platformą515 ląstelių
Chung ir kt. Ląstelių ataskaitos 2019WahlPelėNormalusPieno ląstelės iš E18 vaisiaus ir 8 savaičių suaugusių CD1 peliųEpitelinisEpCAM + /Lin - FACS surūšiuotos ląstelėssnATAC-seq7846 aukštos kokybės pavieniai branduoliai
Engelbrechtas ir Twiggeris ir kt. bioRxiv 2020 m. (išankstinis spausdinimas)Scheelis ir KhaledasŽmogusNormalusVieno dalyvio krūties audinys buvo virškinamas 3 būdais (3 h prieš 16 h santrauka ir 10 rpm prieš 100 rpm. kratymo greitis).AbuGyvybingos ląstelės buvo išskirtos naudojant MACS Dead Cell Removal KitscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq11 191 langelis
Gao ir kt. Nature Comm 2017NavinasŽmogusVėžysKrūties vėžio ląstelių linijos technikos patvirtinimui ir vienas trigubas neigiamas krūties naviko mėginysAbuBranduoliai, išskirti iš užšaldytų navikų ir ląstelių linijųNano tinklelis snRNR sek796 pirminių ląstelių branduoliai
Giraddi ir kt. Cell Rep 2019Wahl ir SpikePelėNormalusPieno ląstelės, išskirtos iš 16/18 embrioninių (E16, E18), 10 dienų po gimdymo (P10) ir 10� savaičių suaugusių C57BL/6 peliųEpitelinisEpCAM + FACS surūšiuotos ląstelėsscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq ir Fluidigm C1 platformas6060 ląstelių naudojant 10x ir 262 langelius naudojant Fluidigm C1
Gkountela ir kt. Ląstelė 2019AcetoŽmogusVėžysKraujo mėginiai, kuriuose yra cirkuliuojančių naviko ląstelių (CTC), iš 43 pacientų, sergančių progresuojančiu krūties vėžiuAbuGyvi CTS buvo nudažyti EpCAM, HER2 ir EGFR ir surūšiuoti pagal CTCVienos ląstelės viso genomo bisulfito sekos nustatymas sukūrė Farlik ir kt. Cell Rep. 201589 atskiri CTC ir 71 CTC klasteriai iš pacientų ir ksenografų
Grosselin ir kt. Gamtos genetika 2019Griffiths, Vallot ir GérardPelė ir žmogusVėžysPacientų gauti xenogrft pelių modeliai, skirti luminaliniam ir gydymui atspariam krūties vėžiuiAbuGyvybingos ląstelės buvo išskirtos naudojant MACS Dead Cell Removal KitscChIP-seq ir scRNA-seq2728 ląstelės, profiliuotos scRNA-seq
Han ir kt. Ląstelė 2018GuoPelėNormalusPieno ląstelės, paimtos nėštumo, laktacijos, involiucijos metu ir iš grynų C57BL/6 peliųAbu*Ląstelės iš visų pagrindinių pelių organų, įskaitant pieno liaukas. *Tačiau nebuvo užsiminta apie pieno limfmazgių pašalinimą prieš pieno liaukų disociaciją.scRNA-seq naudojant microwell-seq61 196 pieno liaukų ląstelės
Kanaya ir kt. Commun Biol 2019ChenPelėNormalusPieno ląstelės iš 9 savaičių BALB/cj pelių, kurioms buvo atlikta ovariektomija (chirurginė menopauzė) ir kurios buvo gydomos nešikliu, E2 ir (arba) PBDEAbuNegyvos ląstelės buvo pašalintos naudojant mikrogranuliusscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą14 856 ląstelės
Karaayvaz ir kt. Nature Comm 2018EllisenŽmogusVėžys6x pirminiai trigubai neigiami krūties navikaiAbuGyvybingos naviko ląstelės buvo išskirtos rūšiuojant FACSscRNA-seq naudojant Smart-seq21189 ląstelės
Knapp ir kt. Ląstelių ataskaitos 2017KarnizaiŽmogusAbu7x krūties vėžio ląstelių linijos ir 8x normalūs pirminiai krūties audinio mėginiaiAbuN/AMasės citometrija naudojant 35 žymenis (16 tarpląstelinių ir 19 tarpląstelinių)Neatskleidžiama
Li ir kt. Ląstelių ataskaitos 2020BriugėPelėNormalusPieno ląstelės iš jaunų (3𠄴 mėn., n =ਃ) ir senų (13� mėn., n =਄) senų mergaičių C57BL/6 JAbuNė vienasscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą13 684 ląstelės
Lo ir kt. Vėžiai 2020DžouPelėNormalusPieno ląstelės buvo išskirtos iš įprastos ir riebios dietos (HFD), maitinamos 2 mėnesių amžiaus C57BL/6. Brca1 -/- 53 p +/- pelėsStroma-imuneEpCAM – FAC rūšiuoja gyvybingas stromos ir imunines ląstelesscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą3892 ląstelės
Murrow ir kt. bioRxiv 2020 m. (išankstinis spausdinimas, v4)GartnerŽmogusNormalusPieno ląstelės, išskirtos iš 28 kartus daugiau moterų prieš menopauzę, kurių KMI ir amžius skiriasiAbuGyvos (DAPI - ) ląstelės buvo surūšiuotos naudojant CD31 - /CD45 - /EpCAM +/- / CD49f +/- ir CD45 + scRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą87 793 ląstelės
Nguyen ir kt. Nature Comms 2018KesenbrockŽmogusNormalusPieno ląstelės, išskirtos iš 7 kartus daugiau asmenų, kuriems buvo atlikta redukcinė mammoplastikaEpitelinisCD31 - / CD45 - epitelio ląstelės, praturtintos FAC rūšiavimu naudojant CD49f ir EpCAMscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq ir Fluidigm C1 platformas24 646 ląstelės naudojant 10x ir 868 ląstelės naudojant Fluidigm C1
Pal ir kt. Nature Comms 2017VisvaderisPelėNormalusPieno ląstelės buvo išskirtos iš ankstyvo postnatalinių (2 savaičių amžiaus), vidutinio brendimo (5 savaičių amžiaus) ir subrendusių suaugusių (10 savaičių, arba iš mergelių, arba iš nėščių) FVB/NJ pelių.EpitelinisCD45 - /CD31 - /CD24 + epitelio ląstelės buvo praturtintos FACSscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq ir Fluidigm C1 platformas3308 ląstelės naudojant 10x ir 460 ląstelių naudojant Fluidigm C1
Pervolarakis ir kt. Ląstelių ataskaitos 2020Watanabe ir KessenbrockPelėNormalusPieno ląstelės buvo išskirtos iš 10 savaičių FVB / NJ peliųAbuFACS rūšiavimas naudojant žymenis CD31, CD45, EpCAM ir CD49f atskyrė gyvas ląsteles scRNA-seq ir bazines / luminalines ląsteles scATAC-seqscRNA-seq ir scATAC-seq buvo atlikta naudojant 10x Genomics Chromium platformas26 859 ląstelės buvo profiliuotos naudojant scRNA-seq ir 23 338 ląstelės buvo profiliuotos naudojant scATAC-seq
Salmén ir kt. bioRxiv 2018 m. (išankstinis spausdinimas)LundebergasŽmogusVėžys10 pacientų, kuriems diagnozuotas HER2 + krūties vėžys, auglio audinio pjūviaiAbuN/AErdvinė transkriptomika sukūrė Ståhl ir kt. Mokslas 2016 ir kiti1007 erdvinės dėmės
Sebastian ir kt. Vėžiai 2020GrobimaiPelėVėžysPieno ląstelės buvo išskirtos iš 10 savaičių BALB/c pelių, turinčių 4T1 išvestus pieno liaukos navikus (sinergetinis trigubo neigiamo krūties vėžio modelis)StromaNaudojant magnetinį ląstelių atskyrimą, buvo suskirstytos CD45 išeikvotos arba CD45/CD90.1 išeikvotos ląstelės, taip pat masinės ląstelės ir CD140a + /EpCAM - /CD45 - /7AAD - FACS surūšiuoti fibroblastai.scRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą6420 ląstelių
Sun ir kt. J. Biol. Chem. 2018DengPelėNormalusPieno ląstelės buvo išskirtos iš 3–4 mėnesių mergelės arba 12,5 dieną nėščių FVB pelių.EpitelinisLinija teigiamos (Lin +, endotelio ar imuninės) ląstelės buvo pašalintos naudojant EasySeq pelės epitelio ląstelių praturtinimo rinkinį. Šviesos ir bazinės ląstelės buvo surūšiuotos pagal FACS, naudojant CD24 ir CD29scRNA-seq naudojant Fluidigm C1 platformą239 ląstelės
Thong ir kt. Priekyje. Cell Dev. Biol. 2020ColacinoŽmogusNormalusPieno ląstelės buvo išskirtos iš 3x normalių mammoplastinių audinių mėginių. Be to, 3 pacientų pieno ląstelės buvo sąlyginai perprogramuotos in vitro ir taip pat seka.AbuNė vienasscRNA-seq naudojant Macosko ir kt. sukurtus drop-seq protokolus. 2015 m.Neatskleidžiama
„Tabula Muris“ konsorciumas Gamta 2020PelėNormalusPieno ląstelės, paimtos iš 3, 18 ir 21 mėnesio iš C57BL/6JN peliųAbu*Ląstelės iš visų pagrindinių pelių organų, įskaitant pieno liaukas. *Tačiau nebuvo užsiminta apie pieno limfmazgių pašalinimą prieš pieno liaukų disociaciją.scRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą15 577 pieno liaukų ląstelės
Tognetti ir kt. bioRxiv 2020 m. (išankstinis spausdinimas)BodenmilerisŽmogaus ląstelių linijosAbu62x krūties vėžio ląstelių linijos ir 5x normalios ląstelių linijosN/AN/AMasės citometrija naudojant 34 žymeklius>ꂀ mln. langelių
Twigger ir kt. bioRxiv 2020 m. (išankstinis spausdinimas)Khaledas ir ScheelisŽmogusNormalus4x mėginiai iš dalyvių, dovanojančių mammoplastinį audinį, ir 4x motinos pieno mėginiai iš žindančių moterųAbuNė vienasscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą24 666 nežindančios krūties ląstelės ir 27 023 žmogaus pieno ląstelės
Vatter ir kt., „Cell Reports“, 2018 mBodenmiller, LaBarge ir LorensŽmogusNormalusBuvo profiliuoti 57 mėginiai, sudaryti iš 44 moterų kultivuotų ląstelių ir 13 nekultūringų krūties epitelio mėginių.EpitelisN/AMasės citometrija naudojant 29 žymeklius880 000 ląstelių
Vagneris ir kt. Ląstelė 2019BodenmilerisŽmogusAbu144x žmogaus krūties navikai ir 50x normalūs krūties audinio mėginiaiAbuN/AMasės citometrija naudojant 73 žymeklius26 milijonai ląstelių
Wang ir kt. eGyvenimas 2020SchwertfegerPelėNormalusPieno ląstelės, išskirtos iš 10 savaičių amžiaus dioestrus FVB / NJ peliųStroma-imuneCD45 + ląstelės buvo praturtintos naudojant magnetinį ląstelių atskyrimąscRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformąBuvo nukreipta į 13 000 ląstelių
Wu ir kt. EMBO J 2020SwarbrickŽmogusVėžys5x trigubai neigiami krūties navikaiAbuGyvybingos ląstelės buvo praturtintos naudojant „EasySep Dead Cell Removal Kit“.scRNA-seq naudojant Chromium 10x Drop-Seq platformą24 271 langelis
Wuidartas ir kt. Nat Cell Biol 2018BlanpainPelėNormalusPieno ląstelės buvo išskirtos iš 14 embriono dienos (E14) ir >ਈ savaičių suaugusių peliųEpitelinisEmbrioninės CD49f Hi / Lgr5 Hi ląstelės, suaugusiųjų CD24 + / CD29 Hi bazinės ir suaugusiųjų CD24 + / CD29 Lo luminalinės ląstelės buvo praturtintos FACSscRNA-seq naudojant Smart-seq2193 ląstelės

Pelės ir žmogaus pieno liaukų vystymosi ir vėžio pavienių ląstelių tyrimų apžvalga.

3.1. Embrioninių pieno liaukų sudėtis

Naujausi tyrimai palygino embrionines ir po gimdymo pieno liaukų ląstelių subpopuliacijas (1 pav.), naudojant scRNA-seq ir ATAC-seq (1 lentelė), bandant atsakyti, ar po gimimo egzistuoja bipotentiniai pirmtakai, sukeliantys ir luminalines, ir bazines ląsteles. Naudodami daugiaspalvį linijos sekimą ir scRNA-seq, Wuidart ir kt. nustatė, kad 14 embriono dieną (E14) pelių pieno liaukoje egzistuoja viena embrioninių daugiapotencinių progenitorių (EMP) populiacija. Šios ląstelės turi hibridinį transkripcijos parašą, susidedantį iš žymenų genų iš luminalinės ir bazinės linijos [23]. Šiame tyrime buvo nustatyta, kad p63 yra pagrindinis bazinių ląstelių reguliatorius, kur pakanka pernelyg didelės ekspresijos luminalinėse ląstelėse, kad jas paverstų baziniu fenotipu. Vienas iš šio tyrimo apribojimų yra tas, kad tik nedidelis ląstelių skaičius buvo ištirtas atliekant atskirų ląstelių analizę ir kad skirtingų vystymosi laiko taškų palyginimai buvo riboti (69 EMP, palyginti su 51 suaugusiųjų bazine ląstele ir 73 suaugusiųjų luminalinėmis ląstelėmis). Tačiau tais pačiais metais Giraddi ir kt. paskelbė kitą tyrimą. kuris palygino vienos ląstelės ląstelių profilį embriogenezės metu (E16 ir E18), po gimdymo 4 dieną (P4) ir iš suaugusių pelių pieno liaukos. Kaip buvo pastebėta ankstesniame tyrime, pieno ląstelės iš E16 ir E18 sukūrė atskiras vaisiaus ląstelių grupes, o po gimdymo buvo galima nustatyti ir luminalines, ir bazines ląsteles, kurios suaugusio žmogaus liaukoje buvo atskirtos į subrendusias ir alveolines luminalines grupes ir atskirą bazinę grupes. klasteris [73]. Pradinė masinė ATAC-seq analizė, kurią atliko Dravis ir kt., minima Girraddi ir kt., parodė, kad E18 vaisiaus krūties kamieninės ląstelės (fMaSC) turi atvirų savybių tiek luminalinių, tiek bazinių genų distalinėse stipriklio ir proksimalinėse promotoriaus srityse [74]. Naudojant vieną branduolį ATAC-seq (snATAC-seq), tolesni tyrimai patvirtino, kad vėlyvosios embriogenezės metu (E18) atskirose ląstelėse buvo arba bazinis panašus (Krt5, Acta2) arba pan luminal/luminal progenitor tipo (Krt8, Krt18, komplektas) chromatino prieinamumo profilis kartu su vaisiaus praturtintais genais, tokiais kaip Sox10 ir Sox21 [75]. snATAC-seq ir scRNA-seq duomenys iš Giraddi ir kt. buvo integruota siekiant ištirti vystymosi trajektoriją, kuri nustatė, kad tiek E16, tiek E18 vaisiaus ląstelės išlieka glaudžiai susitelkusios. Nors buvo nustatyta, kad sugrupuotos ląstelės ties E18 buvo neatskiriamos transkriptominiu lygmeniu, linijos pradėjimas buvo nustatytas naudojant snATAC-seq, kai ląstelės buvo prieinamos arba luminalinei, arba bazinei ląstelių likimui [75]. Vėliau buvo tik pogimdyminės kilmės ribotos luminalinės arba bazinės ląstelės, kurios, prasidėjus brendimui, luminalinės ląstelės toliau suskaidomos į luminalines alveolines ir į hormonus reaguojančias luminalines ląsteles (šioms populiacijoms dažniausiai naudojamos nomenklatūros santrauka pateikta 2 lentelėje).

2 lentelė

Suaugusiųjų pieno epitelio ląstelių potipių nomenklatūros santrauka.

Bazinis Luminal
NuorodaOrganizmasTechnikaBazinisŠviesos pirmtakasSekrecinė alveolėReaguoja į hormonus
Bachas ir kt. 2017 mPelėscRNA-seqBazinisŠviesos pirmtakasDiferencijuota sekrecinė alveolėHormonų jutimas
Chung ir kt. 2019 mPelėsnATAC-seqBazinisŠviesos pirmtakasN.A.a Subrendęs šviestuvas
Engelbrechtas ir kt. 2020 mŽmogusscRNA-seqBazinis / mioepitelinis (BA)Šviesos hormono receptorių neigiami pirmtakai (LHR - )N.A.a Luminal hormonų receptorių teigiamos brandžios ląstelės (LHR + )
Giraddi ir kt. 2018 mPelėscRNA-seqBazinisAlveolių pirmtakasN.A.a Subrendęs šviestuvas
Han ir kt. 2018 mPelėscRNA-seqMioepitelinės ląstelėsŠviesos pirmtakasOrtakio šviestuvasSekretorinės alveolėsN.A.
Knapp ir kt. 2017 mŽmogusMasės citometrijaBazinės ląstelės (BC)Šviesos pirmtakai (LP)Šviesos ląstelės (LC)
Li ir kt. 2020 mPelėscRNA-seqMioepitelinisHS-AVAlveolių (AV)N.A.a Hormonų jutimas (HS)
Murrow ir kt. 2020 mŽmogusscRNA-seqBazinis / mioepitelinisSekretorinis šviestuvasN.A.a Reaguojantis į hormonus (HR+)
Nguyen ir kt. 2017 mŽmogusscRNA-seqBazinisMioepitelinisSekretorinis L1 tipoN.A.a Į hormonus reaguojantis L2 tipas
Pal ir kt. 2017 mPelėscRNA-seqBazinis / mioepitelinisPieno kamieninės ląstelės (MaSC)Šviesos pirmtakasŠviesos tarpinis (Lum Int)AlveoliųSubrendęs luminal/ductal
Pervolarakis ir kt. 2020 mPelėscRNA-seq/scATAC-seqMioepitelinisŠviesos sekrecija (L-sek.)Reaguoja į hormonus
Šviesos pirmtakasLaktacijos pirmtakas / pirmtakasSekrecinė alveolė
Reganas ir Smalley 2020 mN.A.N.A.Mioepitelinės ląstelėsEstrogenų receptorių neigiamos (ER-) latakų ląstelėsSekrecinės alveolių ląstelėsĮ hormonus reaguojančios estrogenų receptorių teigiamos (ER+) ląstelės
Sun ir kt. 2018 mPelėscRNA-seqMioepitelinis / bazinisProliferacinės luminalinės ląstelės (PLC)Keratinizuotos šviesos ląstelės (KLC)Subrendusios šviesos ląstelės (subrendusios LC)Lipidų biosintetinės luminalinės ląstelės (LBLC)Į stimulus reaguojančios šviesos ląstelės (SRLC)
Proliferacinės bazinės ląstelės (PB)Wnt signalizaciją reaguojančios bazinės ląstelės (WRBC)Pieno kamieninės ląstelės (MaSC)
Thong ir kt. 2020 mŽmogusscRNA-seqMioepitelinis1 šviesa (L1)N.A.a Luminal 2 (L2)
Twigger ir kt. 2020 mŽmogusscRNA-seqBazinės ląstelės (BA)Šviesos pirmtakas (LP)Sekrecinė alveolėReaguojantis į hormonus (HR)
1 šviesa (LC1)Luminal 2 (LC2)
Vatter ir kt. 2018 mŽmogusMasės citometrijaBazinis mioepitelis (MEP)Šviesos epitelis (LEP)
Wuidartas ir kt. 2018 mPelėscRNA-seqBazinės ląstelės (BC)Šviesos ląstelės (LC)

3.2. Suaugusiųjų pieno liaukų epitelio ląstelių sudėtis

Netgi dėl dramatiškų pokyčių, vykstančių nėštumo, žindymo laikotarpiu ir suaugusiųjų pieno liaukų involiucija, scRNA-seq išvados iš Bach ir kt. patvirtina išvadas, kad po gimdymo egzistuoja tik ribotos kilmės progenitoriai. Epitelinėms ląstelėms, paimtoms iš neapdorotų, nėščių, žindančių ir involiucinių pelių, buvo apibūdintos skirtingos ląstelių subpopuliacijos iš luminalinės arba bazinės linijos [71]. Šios ląstelių klasteriai buvo išdėstyti pagal pseudolaiko trajektoriją ir buvo nustatyta, kad tiek luminalinės, tiek bazinės ląstelės neturėjo bendro pirmtako [71]. Tačiau buvo nustatyta, kad luminalinės ląstelės turi diferenciacijos tęstinumą, kurį sukelia Aldh1a3 + luminaliniai pirmtakai ir tęsiasi iki dviejų pagrindinių sekrecinių alveolių ir reaguojančių į hormonus. Aišku, atkartoti tokius eksperimentus su žmonėmis būtų sunku, todėl tyrimai, atliekantys žmogaus pieno ląstelių scRNA-seq, pateikė naujų išvadų apie funkcinių žmogaus pieno liaukų ląstelių brendimą laktacijos metu [76], [77]. Neseniai atliktas mūsų laboratorijos darbas, tiriant 4 donorų pieno ląsteles ir 4 nežindančių krūties audinių mėginius, nustatė dvi sekrecinių luminalinių ląstelių populiacijas, kurios yra transkripcijos požiūriu panašios į luminalines pirmtakes iš nežindančios krūties [76]. Šis darbas rodo, kad luminaliniai progenitoriai gali sukelti sekrecines alveolių ląsteles žmonėms, taip pat pelėms. Be to, kitame neseniai paskelbtame tyrime nustatyta, kad luminalinių pirmtakų ląstelių diferenciacija yra nenormali, dėl kurios pasireiškia pagrindiniai pieno baltymai. Lalba, Csn2 ir Wap, gali rodyti ankstyvą navikogenezę Brca/p53 pelių modeliuose [78]. Tai pabrėžia, kaip svarbu išspręsti luminalinių pirmtakų vaidmenį vystantis, kad būtų galima geriau suprasti krūties vėžio vystymąsi. Bendro luminalinio pirmtako radiniai suaugusiųjų pieno liaukoje sutampa su Giraddi ir kt. tačiau prieštarauja naujausiems giminės atsekimo tyrimams, kurie rodo, kad šios dvi luminalinių ląstelių linijos yra neveiksmingos suaugusioms pelėms [22], [79], [80], [81], [82]. Gali būti, kad šiuose scRNA-seq tyrimuose nustatytos bipotentinės luminalinės ląstelės yra aktyvios ankstyvosiose embriono ir priešbrendimo stadijose ir kad vėliau vystantis dvi luminalines linijas palaiko atitinkami jų pirmtakai. Įdomu tai, kad buvo nustatyta, kad paritetas sukėlė Aldh1a3 + luminalinės progenitorinės ląstelės egzistuoja po involiucijos, kurios, atrodo, buvo nukreiptos į alveolių liniją ir išreiškė daugybę su laktacija susijusių genų, tokių kaip Lipa, Xdh ir kazeino genai, tokie kaip Csn2 ir Csn3 [71]. Neseniai atlikto tyrimo, kuriame scATAC-Seq ir scRNA-seq buvo derinami 10 savaičių suaugusių pelių tyrimo rezultatai, patvirtino Bacho tyrimo išvadas, nustatant vieną mioepitelinę populiaciją ir Foxa1 + į hormonus reaguojanti luminalinė populiacija ir Elfas5 + /Rinkinys + luminalinės ląstelės (vadinamos L -sec, reiškiančios luminalinę sekreciją, žr. 2 lentelę) [83]. L-sec ląstelės buvo toliau padalintos į Rspo1 + /Aldh1a3 + luminalinis pirmtakas ir Lalba + /Csn2 + /Lipa + laktacijos progenitorines ląsteles, kurios, remiantis pseudolaikine analize, leidžia manyti, kad pirmoji sukelia antrąjį ląstelių potipį [83]. Šio tyrimo apribojimas buvo tas, kad analizė buvo atlikta tik vienu metu, kai palyginus atrasto laktacijos progenitoriaus genų ekspresijos profilius ir anksčiau aprašytas sekrecines alveolių ląsteles [71], šie atradimai būtų pagrįsti vystymosi kontekstu.

Panašios ląstelių populiacijos buvo praneštos suaugusio žmogaus pieno liaukoje vienu laiko momentu [84], [85]. Normalaus pirminio pieno liaukos audinio masės citometrija nustatė bazinių, luminalinių (atitinka subrendusių luminalinių, žr. 2 lentelę) ir luminalinių pirmtakų ląstelių epitelio pogrupius [85]. Stebėtina, kad pastarojoje populiacijoje nedideliame ląstelių pogrupyje buvo padidėjęs aktyvios kaspazės-3 kiekis, išlaikant klonogeniškumą, o tai rodo galimą didesnį genomo nestabilumą ir padidėjusią onkogeninės transformacijos riziką šiame luminalinių progenitorinių ląstelių rinkinyje [85]. Nguyen ir kt. taip pat nustatė 3 pagrindinius epitelio ląstelių tipus, naudodami scRNA-seq, kurias jie pavadino mioepitelinėmis, luminalinėmis 1 (L1) ir luminal 2 (L2) ląstelėmis (žr. 2 lentelę). The SLPI + L1 populiacija buvo padalinta į ELF5 + /RINKINYS + L1.2 (panašios į luminalines progenitorines ląsteles, 2 lentelė) ir LTF + L1.1 ląstelės (panašios į sekrecines alveolių ląsteles, 2 lentelė). Nustatyta, kad L1.2 luminalinės progenitorinės ląstelės diferenciacijos hierarchijoje yra virš kitų luminalinių ląstelių tipų. L2 ląstelės išreiškė žymenį ANKRD30A kartu su hormonų receptoriais ESR1, PGR ir AR rodo į hormonus reaguojančią subpopuliaciją (2 lentelė). Įdomu tai, kad atidžiau ištyrus bazinį klasterį, identifikuotą naudojant 10x Genomics scRNA-seq, ląstelių, labai išreikštų susitraukiančių genų, pogrupį (ACTA2, TGLN, KRT14), kurias autoriai vėliau nustatė kaip specifines mioepitelines ląsteles [84]. Tačiau neseniai atlikto išankstinio spausdinimo duomenys rodo, kad skirtinga adhezijos žymenų ekspresija gali būti ilgo virškinimo artefaktas, o ne dėl skirtingų žmogaus pieno ląstelių potipių subklasterių [86]. Nguyen darbe autoriai rankiniu būdu nustatė pseudolaiko pradžią, kad ji būtų bazinių ląstelių tipo ribose, ir nustatė, kad gauta trajektorija skiriasi nuo bazinių ląstelių iki mioepitelinės šakos ir dvišakės luminalinės šakos, kurią papildė L1.2 luminaliniai pirmtakai [ 84]. Nors iki šiol aprašyti tyrimai rodo vienodą vaizdą apie pieno ląstelių subpopuliacijas pelių ir žmonių embrioninėje ir pogimdyminėje pieno liaukoje, buvo paskelbti prieštaringi rezultatai [72], [87], [88], [89] ir apžvelgta [90], [91], siūlanti bipotentinius pirmtakus, egzistuojančius po gimdymo.

3.3. Suaugusiųjų pieno liaukos daugiapotentės linijos pirmtakai

Panašiai kaip Bach ir kt., kitu tuo pačiu metu paskelbtu tyrimu [72] buvo tiriamos pogimdyminės pieno liaukų ląstelių subpopuliacijos pelėms šiek tiek skirtingais vystymosi laiko momentais (iki brendimo, brendimo, suaugusiųjų ir nėštumo, taip pat skirtingose ​​rujos ciklo stadijose). tačiau padarė kitokias išvadas. Šio tyrimo išvados rodo, kad iki brendimo daugumą epitelio ląstelių sudaro bazinis fenotipas, kai reta į bazinį panaši populiacija, išreiškianti kai kurias šviesines savybes, yra teigiamas žymeniui. CD55 [72]. Brendimo metu ši populiacija tarsi plečiasi, o po brendimo CD55 + ląstelės daugiausia yra luminalinių ląstelių skyriuje. Buvo nustatytos kitos luminalinės subpopuliacijos, įskaitant tarpines (ir luminalinių pirmtakų, ir į hormonus reaguojančių ląstelių pasidalijimo žymenis) ir mišrius (išreiškiančius abu Kit/Elf5 šviesiniai žymekliai ir Acta/Krt14 baziniai žymenys) ląstelių subpopuliacijos [72]. Išsami diskusija apie šį tyrimą, kartu su kitais ankstyvaisiais krūties scRNA-seq tyrimais, kurie klasifikavo naujus ląstelių tipus pagal žymenų, tokių kaip c-Kit, ekspresiją.rinkinys), galima rasti [92]. Naujausias tyrimas su pelėmis taip pat nustatė hibridinę luminalinių ląstelių subpopuliaciją, kuri išreiškė genus, būdingus tiek hormonų jutimui (HS), tiek alveolinėms progenitoriams (AV), vadinamoms HS-AV ląstelėmis, kurių mažėjo su amžiumi [93]. Tiek aprašytos “intermediate” [72], tiek “HS-AV” [93] luminalinės ląstelės išreiškė didesnį Prlr ir Cituota nei luminalinės progenitorinės/alveolių ląstelės, ir didesnis kiekis Csn3 ir Trf nei į hormonus reaguojančios ląstelės. Li ir kt. žengė toliau ir patvirtino imunofluorescencijos būdu šias dvigubos luminalinės linijos ląsteles, iliustruodamas progesterono receptoriaus dažymą pieno riebalų rutuliu-EGF faktoriumi 8 (PR + /MFGE8 +) ir estrogenų receptorių su laktoferinu (ER + /LTF + ) [93]. Nepaisant naujų luminalinių ląstelių tipų nustatymo, Pal ir kt. nepastebėjo atskiros retos pieno liaukos kamieninių ląstelių populiacijos, kuri būtų teigiama Epcam ir Procr arba Lgr5 ir Tspan8 to tikėtasi remiantis ankstesnių tyrimų duomenimis [72]. Panašiai Sun ir kt. ištyrė epitelio ląsteles, paimtas iš suaugusios pelės nekaltos ir nėščios būsenos, taip pat pastebėjo, kad nėra unikalios ląstelių populiacijos, kuri ekspresuotų. Lgr5 ir Tspan8 [87]. Šio tyrimo išvados pastebėjo a Cdh5 + /Procr + ląstelių populiacija, kuri gyveno baziniame skyriuje, kuri proliferavo in vitro ir turėjo in vivo pieno liaukų repopuliacijos potencialas [87]. Vystymosi trajektorijų analizė parodė, kad nėštumo metu šis ląstelių tipas buvo pieno epitelio ląstelių hierarchijos viršuje, tačiau tai nebuvo grynosios liaukos atveju.

Tolesniuose tyrimuose buvo naudojamos naujos bioinformatinės priemonės, skirtos palyginti skirtingus duomenų rinkinius, siekiant suderinti iki šiol rastus skirtumus tarp vienos ląstelės tyrimų. Viename iš tokių tyrimų buvo sukurtas modelis, pavadintas „Single Cell Entropy Landscape of Single Cell Entropy“ (LandSCENT), kuriame pateikiamas atskirų ląstelių stiprumo balas, neatsižvelgiant į linijos žymenis, kuriuos vėliau jie panaudojo linijos trajektorijos algoritmų šakninėms būsenoms apibrėžti [88]. Taikant šį metodą, šiame tyrime buvo pakartotinai išanalizuotas suaugusio žmogaus duomenų rinkinys [84], kuriame buvo nustatytos didelio stiprumo ląstelės, susietos su bazinių ir nesubrendusių alveolių grupių periferija. Šioje bipotentinėje būsenoje esančios ląstelės per daug išreiškė transkripcijos faktorius YBX1 ir ENO1 kurie buvo susiję su bazine krūties vėžio rizika ir buvo pasiūlyti kaip potencialūs žymenys, identifikuojantys daugiapotencinius pirmtakus [88]. Tačiau šiame dokumente buvo pažymėta, kad duomenys iš Nguyen ir kt. Tyrimas nebuvo pakankamai kokybiškas, kad būtų galima nustatyti kamieninių ląstelių populiacijas be šio metodo ir kad būsimi tyrimai turėtų ištirti daugiau ląstelių giliau. Naujausiame tyrime taip pat buvo atliktas retrospektyvus daugelio duomenų rinkinių palyginimas ir, be to, sukurtas naujas duomenų rinkinys, apibūdinantis normalias žmogaus mammoplastikos ląsteles iš 3 donorų kartu su kultivuotomis ląstelėmis [89]. Nors šiame tyrime daugiausia dėmesio buvo skiriama pieno liaukų ląstelių epitelio skyriui, jie užfiksavo visas pastebėtas epitelio populiacijas kartu su stromos ir imuninių ląstelių potipiais [89]. Pirminės pieno ląstelės buvo kultivuojamos 2D formatu ant apšvitintų fibroblastų, kad ląsteles būtų galima sąlygiškai perprogramuoti [94]. Po to autoriai nustatė skirtingas „chibrid“ epitelio ląstelių populiacijas, atsirandančias, įskaitant bazines / luminalines (KRT14 + /KRT18 + ), epitelinis/mezenchiminis (EPCAM + /VIM + ) ir kai kurie išreiškė visus 4 žymenis (keturis kartus teigiamos ląstelės, KRT14 + /KRT18 + /EPCAM + /VIM + ). Visų pirma, jie, lygindami savo duomenis su ankstesniais tyrimais [71], [73], [84], nustatė, kad normalus žmogaus pieno liaukos audinys, susietas su suaugusių pelių pieno audiniais, ir sąlyginai perprogramuotos ląstelės yra arčiau embrionų kamieninės populiacijos. pelės ląstelės. Palyginę su visais šiais laiko taškais, jie pastebėjo, kad “hibrid” ląstelės egzistavo skirtingais laiko momentais, daugiausia per gimdoje laikotarpis, nėštumas ir laktacija. Šiame dokumente pateikiamas pirmasis žvilgsnis į visas suaugusio žmogaus pieno liaukose egzistuojančias pieno ląstelių subpopuliacijas (įskaitant stromą), tačiau neatsižvelgiama į žymenų ekspresijos profilių skirtumus tarp pelių ir žmogaus ląstelių, būtent į tai, kad KRT14 ekspresija buvo reguliariai stebima suaugusio žmogaus luminalinių ir bazinių ląstelių patologai [95]. Tikslus žymenų naudojimas skirtingiems ląstelių tipams apibrėžti yra svarbus aprašant, ar ląstelių subpopuliacijose yra žymenų iš luminalinių ir bazinių ląstelių. Be to, svarbu atsiminti, kad šiuose tyrimuose užfiksuotos ląstelės tai daroma vienu momentiniu momentu ir kad jų laiko trajektorijos daromos tik iš šių atskirų laiko taškų. Todėl įtikinami teiginiai apie biopotenciją turi būti toliau tikrinami naudojant in vivo modelius, kaip aptarė Watsonas ir Khaledas [96], ir gali pasinaudoti naujomis technologijomis, tokiomis kaip scGASTALT/LINNAEUS [97], [98], kurios derina nešališką linijos sekimą su scRNA-seq aptinkamu genetiniu baidymu.

3.4. Iššūkiai, išlikę kuriant vieningą pieno ląstelių atlasą

Prieš bandant suprasti ląsteles, skatinančias krūties vėžio formavimąsi, darosi vis aiškiau, kad turime suvienodinti krūties vystymosi tyrimų rezultatus, kad galėtume apibūdinti, kurios pieno ląstelių subpopuliacijos egzistuoja visuotinai, kurias rūšiai būdingus žymenis jie išreiškia ir apibrėžia dažniausiai naudojamus. kiekvieno iš šių ląstelių potipių nomenklatūra. Šiuo tikslu bandėme apibendrinti pagrindinius pieno liaukų vienaląsčių tyrimus (1 lentelė) ir bendrą nomenklatūrą, naudojamą keturiems pagrindiniams suaugusiųjų epitelio potipiams (2 lentelė). Ne visi tyrimai nustato tuos pačius pieno liaukų potipius, tačiau dauguma tyrimų sutinka, kad ląstelių subpopuliacijos, tokios kaip adipocitai arba sekrecinės alveolinės ląstelės laktacijos metu (žr. Bach ir kt.), buvo nevisiškai profiliuotos dėl sunkumų atskiriant nepažeistas ląsteles disociacijos metu. Ateities pastangos sukurti pieno liaukų ląstelių atlasą turi ištirti įvairius audinių / ląstelių izoliavimo metodus, pvz., Keičiant virškinimo trukmę [86] arba fermentų temperatūrą [99], siekiant įveikti tam tikrus ląstelių tipus, kurie neproporcingai praturtinami arba išeikvojami ruošiant mėginį.

Kaip aprašyta aukščiau, kai kurie subklasteriai, klasifikuojami kaip epitelio ląstelės, buvo nepakartojamai stebimi, įskaitant Cd55 + [72] ir Cdh5 + [87] pogrupius arba ZEB1 + /TCF4 + [84], VIM + /EPCAM + ir KRT18 + /KRT14 + ląstelės [89]. Cd55 + ir Cdh5 + klasteriai labai išreiškia genus, tokius kaip Axl ir Sparc arba CD36 ir Pecam1, kurios buvo susijusios su fibroblastais ir endotelio stromos subpopuliacijomis [100]. Tai rodo, kad panaudota CD24 / CD29 rūšiavimo strategija negalėjo būti pakankama, kad būtų pašalintos užterštos stromos ląstelės. Panašiai Procr + ląstelių klasteris, klasifikuojamas kaip bazinės ląstelės, taip pat išreiškė kai kuriuos, bet ne visus pericitų žymenis, todėl autoriai pripažino, kad šios ląstelės gali užteršti ne epitelines ląsteles [71]. Kiti reti epitelio ląstelių potipiai, tokie kaip ZEB1 + /TCF4 + ląstelės [84], VIM + /EPCAM + ląstelės ir KRT18 + /KRT14 + ląstelės [89] buvo identifikuotos vien tik žymenų ekspresija, kai ląstelės nesudarė atskirų grupių, atsirandančių dėl klasterizacijos ar matmenų mažinimo analizės. Be stačiakampio patvirtinimo (pvz., audinių dažymo) sunku nustatyti šių rezultatų biologinę svarbą dėl galimos techninės klaidos, pvz., dvigubų artefaktų arba klaidingų nuorašų aptikimo. Akivaizdu, kad labai sunku apibūdinti pieno ląstelių subpopuliacijas remiantis ribotu žymenų skaičiumi. Taigi, einant į priekį, ląstelės, profiliuotos naudojant vienos ląstelės technologijas, turėtų būti suskirstytos į subpopuliacijas, naudojant ląstelių pasaulinį transkriptą, pirmiausia naudojant ląstelių parašus, sudarytus iš daugybės skirtingų patvirtintų genų.

Iš tiesų, skirtingų ląstelių tipų suvienijimas skirtinguose organuose yra universali ląstelių biologijos problema, o įvairūs konsorciumai pradėjo kataloguoti skirtingus ląstelių tipus naudodami vienos ląstelės technologijas. Neseniai atliktas Han ir kt. apibūdino daugybę skirtingų audinių, įskaitant: pieno liauką, plaučius, inkstus, sėklidę ir placentą, naudojant scRNA-seq kaip išteklius kuriant pelių ląstelių atlasą [101]. Konkrečiai, kalbant apie pieno liauką, audiniai buvo tiriami iš gryno, nėščiojo, žindančio ir involiucinio audinio. Nors daugelis trumpai aprašytų radinių atitinka tai, kas aprašyta anksčiau atliktuose tyrimuose [101], kadangi limfmazgiai nepašalinami prieš audinių virškinimą, sunku atskirti, ar praneštos imuninės ląstelės yra limfmazgiuose, ar pieno liaukos audiniuose. gyventojas. Kitas panašus tyrimas, kurį atliko Tabula Muris konsorciumas, bandė išsiaiškinti, kiek skirtingų organų sensta skirtingai [102]. Skirtingų organų ląstelės buvo išskirtos ir sekvenuotos iš pelių nuo 1 mėnesio iki 2,5 metų. Įdomu tai, kad pastebėta, kad pieno liaukoje labai sumažėjo T ląstelių (tai gali būti supainioti dėl limfmazgių, kurie galbūt nebuvo pašalinti prieš liaukos disociaciją), ir apskritai buvo padidėjęs API transkripcijos faktorių šeimos reguliavimas (Junb, Jund, Fos) su amžiumi [102]. Šių tyrimų rezultatai rodo, kad svarbu atsižvelgti į veiksnius, nesusijusius su normaliu vystymusi, pvz., amžių, kurie gali turėti įtakos pieno ląstelių pogrupiams ir genų ekspresijos profiliams.

3.5. Senėjimo, menopauzės, pariteto ir nutukimo poveikis suaugusiųjų pieno liaukoms

Senėjimo, menopauzės, pariteto ir nutukimo poveikis pieno ląstelių subpopuliacijos proporcijoms buvo ištirtas daugelyje tyrimų [93], [100], [103], [104]. Straipsnio, kuriame tiriamos sveikų moterų pirminės pieno ląstelės, naudojant masinę citometriją, išvadose pastebėtas su amžiumi susijęs tam tikrų šviesinių ląstelių subpopuliacijų padidėjimas ir atitinkamas mioepitelinių ląstelių proporcijų sumažėjimas [104]. Panašiai neseniai paskelbtame straipsnyje, kuriame nagrinėjamos jaunų pelių pieno liaukos, palyginti su pagyvenusiomis pelėmis, nustatyta, kad liaukoje yra pakitusios epitelio ir stromos ląstelių proporcijos ir genų ekspresijos profiliai [93]. Įdomu tai, kad jie nustatė, kad padidėjo epitelio ląstelių dalis, taip pat nustatomas padidėjęs alveolių ląstelių skaičius.Taip pat buvo pastebėta, kad mioepitelinėse ląstelėse sumažėjo genų, susijusių su bazinės membranos baltymų sinteze, ekspresijos lygis, taip pat padidėjo uždegiminių citokinų gamyba mioepitelinėse, kraujagyslių endotelio ir makrofagų ląstelėse [93]. Šie radiniai rodo dramatiškus senstančiose ląstelių stromos pokyčius, kurie gali sudaryti auglį skatinančią mikroaplinką.

Dėl senėjimo menopauzė yra krūties vėžio vystymosi rizikos veiksnys, todėl įvairūs pieno ląstelių subpopuliacijų pokyčiai gali būti šio reiškinio mechanizmas. Chirurginės menopauzės (atliekant kiaušidžių pašalinimą) kontekste buvo ištirtas estrogenų (17-beta-estadiolio, E2) papildymas su žalingo endokrininę sistemą ardančio aplinkos teršalo PBDE (polibrominuotų difenilo eterių) poveikiu pieno ląstelių subpopuliacijos proporcijoms [100]. . Šiame tyrime nustatyta, kad menopauzės transporto priemonėje esančioje pelėje yra daug fibroblastų ir stomos ląstelių, turinčių mažesnę epitelio ląstelių dalį. Tačiau E2 naudojimas skatina galinių galinių pumpurų tipo struktūrų ataugimą, kuris sustiprėja esant PBDE. E2 ir PBDE vartojimas kartu sukėlė progesterono receptorių (PR), nepriklausomų nuo estrogenų receptorių (ERα, Esr1 - ) ląstelių ekspresiją dviejose luminalinių ląstelių populiacijose, taip pat M2 makrofagų populiacijų padidėjimą, kuris gali prisidėti prie pieno liaukos audinių remodeliavimosi ir gamybos. auglį skatinančios mikroaplinkos.

Kitas veiksnys, galintis pakeisti krūties vėžio išsivystymo riziką, yra lygiavertiškumas ir nutukimas. Murrow ir kt. neseniai atnaujintame išankstiniame spaudinyje ištyrė žmogaus pieno liaukų sudėties skirtumus dėl nutukimo arba pariteto [103]. Nustatyta, kad paritetas padidino mioepitelinių ląstelių skaičių ir į hormonus reaguojančių ląstelių transkripcijos atsaką pieno liaukoje, taip pat pakeitė alveolių dydį. Įdomu tai, kad jie nustatė, kad luminalinės progenitorių proporcijos neatrodo koreliuoja su paritetu ir kad nutukusių moterų organizme sumažėja į hormonus reaguojančių ląstelių skaičius. Žvelgiant iš šiek tiek kitokios perspektyvos, kitame tyrime buvo ištirtas riebios dietos (HFD) sukeltas nutukimas, kurį turėjo Brca1-/-, p53+/- krūties vėžio modelio pelių pieno liaukų stomaliai [105]. Šis tyrimas parodė, kad HFD padidino ekstraląstelinės matricos genų ekspresiją.Col3a1, Col6a3, Eln ir Sparc) ir pro-tumorogeniniai M2 makrofagų žymenys monocituose, rodantys, kad nutukusių į krūties vėžį linkusių pelių stromos ląstelių funkcija ir mikroaplinka pasikeitė. Iš šių tyrimų aišku, kad tam tikri rizikos veiksniai, tokie kaip amžius, menopauzė ir nutukimas, keičia ląstelių būsenas ir epitelio bei stromos potipių proporcijas ir rodo, kad norint suprasti krūties vėžio vystymąsi, būtina kruopščiai apibūdinti stomos ląsteles.

3.6. Suprasti krūties stromos įvairovę yra neatsiejama norint suprasti krūties vėžio vystymąsi

Teorijos, susijusios su pieno liaukos stroma, sukeliančia žaizdų gijimo fenotipą, atsirandantį krūtyse, turinčiose didelį mamografinį tankį, nutukimo ir polaktacinio remodeliavimo metu, buvo pateiktos kaip krūties vėžio vystymosi mechanizmas [90]. Todėl svarbu atidžiai apibūdinti normalias stromos ląstelių kompozicijas ir kaip jos gali pasikeisti, kai pieno liauka įgyja navikinį fenotipą. Iš tiesų, ankstyvas scRNA-seq tyrimas, kuriame buvo profiliuotos krūties navikų ląstelės, nustatė, kad daugelis ląstelių, turinčių normalų fenotipą (kaip nustatyta pagal kopijų skaičiaus pokyčius), buvo imuninės ląstelės [106]. Didėjantis susidomėjimas makrofagų dalimi pieno liaukos imuninėse ląstelėse, paskatino vieną grupę ištirti 10 savaičių amžiaus pelių pieno liaukų CD45+ populiaciją. Naudodami scRNA-seq jie nustatė a Lyve-1 + audinių rezidentų makrofagų subpopuliacija, kuri išreiškė didelį su ekstraląstelinės matricos remodeliavimu susijusių genų kiekį [107]. Žmogaus audinyje, atsirandančiame dėl krūties naviko arba atitinkamo normalaus krūties audinio, CD45+ skyriaus scRNA-seq analizė parodė, kad normaliame audinyje nustatytos imuninių ląstelių subpopuliacijos buvo tik nedidelis pogrupis tų, kurie buvo nustatyti navikuose [108]. Įdomu tai, kad jie dažnai aptikdavo M1 ir M2 makrofagais susietus genus toje pačioje ląstelėje, kurie buvo teigiamai koreliuojami, o tai rodo, kad kiekviena būsena gali būti ne tokia viena kitai nesuderinama, kaip manyta anksčiau, o ląstelės būsena gali egzistuoti išilgai kontinuumo.

Kitas svarbus stomos ląstelių tipas yra krūties fibroblastai ir ypač jų panašumas į su vėžiu susijusius fibroblastus (CAF). Sutelkus dėmesį į surūšiuotus fibroblastus, išskirtus iš ikivėžinių MMTV-PyMT pelių pieno liaukų ląstelių, buvo nustatytos trys pagrindinės CAF populiacijos, įskaitant: kraujagysles (vCAF su ciklo CAF pogrupiu, cCAF), matricą (mCAF) ir vystymosi (dCAF) susijusius CAF. [109]. Nustatyta, kad šios ląstelės transkripciniu ir erdviniu požiūriu skiriasi, kai buvo nustatyta, kad vCAF yra iš perivaskulinės vietos, reziduojantys fibroblastai sukėlė mCAF, o dCAF yra piktybinės ląstelės, kurios patyrė epitelio perėjimą į mezenchiminį [109]. Kita vertus, vėlesnis tyrimas, tiriantis CAF ir normalius fibroblastus trigubai neigiamo krūties vėžio (TNBC) modeliavimo BALB/c kilmės 4T1 krūties navikuose, nustatė 6 CAF subpopuliacijas [110]. Šios subpopuliacijos apėmė: Ly6c1 high , α -SMA high , Cd53 high , Crabp1 high , Cd74 high ir cycling CAF, kurios buvo nustatytos pirmiau minėtame tyrime. Šis tyrimas toliau palygino jų išvadas su Bartoschek ir kt. ir nustatė, kad mCAF buvo praturtinti Crabp1, ir kiti žymenys, išreikšti Crabp1 aukštų ląstelių, o tai rodo, kad šios ląstelės gali atstovauti panašias subpopuliacijas. Neseniai atliktas Wu ir kt. ištyrė 6 pacientų pirminių TNBC navikų epitelio ir stromos skyrių ir, be tikėtinų normalių pieno liaukų subpopuliacijų, aptiko bazinio epitelio vėžio grupę, dvi CAF subpopuliacijas ir dvi perivaskulines panašias (PVL) subpopuliacijas [111]. Pažymėtinos subpopuliacijos buvo: į miofibroblastus panašūs CAF (myCAF), uždegiminiai CAF (iCAF) ir subrendusios bei nesubrendusios PVL ląstelės. Čia autoriai teigia, kad ląstelės, aprašytos kaip vCAF, Bartoschek ir kt. tyrime, gali būti PVL ląstelės, nustatytos šiuo tyrimu [111]. Ne visi CAF pogrupiai buvo nustatyti atliekant tyrimus, o tai pabrėžia būtinybę kiek įmanoma sinchronizuoti išvadas, kad būtų galima nustatyti verčiamas ląstelių pogrupius.

3.7. Krūties vėžio navikų profiliavimas

Daugelis pavienių ląstelių metodų buvo panaudoti tiriant žmogaus pieno liaukos navikus ir gali būti laikomi krūties vėžio ląstelių atlaso pradžia. Neseniai atliktas Wagnerio ir kt. naudojo masės citometriją, kad ištirtų 73 baltymų ekspresiją 144 žmogaus krūties navikuose ir 50 ne naviko audinių mėginių, kad nustatytų skirtingas ląstelių subpopuliacijas [112]. Buvo nustatyta, kad nepaisant naviko potipio, atskiruose navikuose buvo daug ląstelių skirtumų. Tačiau visiems krūties vėžio potipiams būdingos PD-1 + T ląstelės ir PD-L1 + su naviku susiję makrofagai (TAM). Kitas neseniai atliktas masės citometrijos tyrimas taip pat sukūrė ląstelių atlasą, tačiau ištyrė 62 krūties vėžio ląstelių linijas ir penkias sveikų audinių linijas [113].

Krūties vėžio ląstelių linijų ir pirminių krūties vėžio navikų palyginimus atliko Gao ir kt. naudojant naują vieno branduolio RNR sekos nustatymo techniką [114]. Panašiai kaip Wagner ir kt., Viename navike galima rasti skirtingų ląstelių pogrupių. Tačiau ištyrus visas populiacijas kartu, buvo nustatyta reta labai proliferuojančių ląstelių subpopuliacija, kuri padidino su krūties vėžiu susijusių genų reguliavimą [114]. Daugiau dėmesio skirdami šešiems trigubai neigiamiems krūties vėžio navikams, Karaayvaz ir kt. nustatė, kad nors dauguma grupių susidarė iš skirtingų navikų iš skirtingų pacientų, vieną klasterį sudarė visi naviko mėginiai [115]. Šis subklasteris turėjo genų ekspresijos profilį, susijusį su daugybe atsparumo gydymui ir metastazių, ir jam buvo būdingas aktyvuotas glikosfingolipidų metabolizmas ir susiję įgimto imuniteto keliai [115].

Naudojant erdvinę transkriptomiką, Salmén ir kt. vietoj to ištyrė kitą krūties vėžio potipią – HER-2 teigiamus navikus ir nustatė, kad integravus topografinę informaciją iš naviko pjūvio vaizdų ir erdvinių dėmių, imuninės ląstelės įsiskverbė į invazinius vėžio regionus [116]. Priešingai, Andersson ir kt. kurie taip pat naudojo erdvinę transkriptomiką, bet vietoj to integravo vaizdo analizę su scRNA-seq duomenimis, nustatė, kad epitelio ląstelės liko atskirtos nuo kryžminių stromos ląstelių [117]. Daugelyje navikų plazmos ląstelės buvo erdviškai atskirtos nuo B ląstelių, kurios, kaip nustatyta, kai kuriems pacientams gana kolokalizuojasi šalia T ląstelių [117]. Erdvinė informacija taip pat buvo integruota su scDNR sekos nustatymu, kai analizuojamas pacientų, sergančių latakų karcinoma, krūties audinys. savo vietoje (DCIS) su invazine latakų karcinoma (IDC), nustatė, kad genomo evoliucija kanaluose vyksta prieš naviko ląstelėms išbėgant iš bazinės membranos ir pradedant kurti IDC audinį [36].

Naviko ląstelių genomo ir epigenomo analizė yra būtina norint nustatyti, kaip vėžio ląstelės įgyja mutacijas ir progresuoja, kad taptų metastazavusios. Naudojant HM-SNS (žr. skyrių apie vienos ląstelės DNR sekos nustatymą), nustatyta, kad kopijų skaičiaus aberacijos (CNA) buvo įgytos ankstyviausiuose trigubo neigiamo krūties vėžio vystymosi etapuose trumpais, taškiniais, o ne palaipsniui, kaip buvo manyta anksčiau. 35]. Įdomu tai, kad Wang ir kt. nustatė, kad trigubai neigiamos naviko ląstelės turėjo didesnį mutacijų greitį, palyginti su ER+ ląstelėmis [29]. Remiantis Gao ir kt. išvadomis. [35], Wang nustatė, kad aneuploidiniai susitarimai atsirado ankstyvoje naviko vystymosi stadijoje ir išliko stabilūs klonų plėtimosi metu [29]. Naujausiame tyrime, naudojant vienos ląstelės kopijų skaičiaus analizę, nustatyta, kad pseudodiploidinės pavienės ląstelės egzistavo skirtinguose PAM50 potipiuose ir turėjo vėžiui būdingų pakitimų (pvz., 1q padidėjimas ir 16q praradimas), o tai rodo vidinį genomo stabilumą ir galimą identifikavimo funkciją, kuri galėtų būti naudojamas ankstyvosios ligos stadijos rizikos vertinimui [118]. Chromatino būsenų analizė pacientų gautuose gydymui atspariuose ksenografijos modeliuose nustatė, kad skirtingų navikų ląstelių pogrupis turėjo bendrą chromatino požymį, kurį sudarė H3K27me3 chromatino žymės praradimas [119]. Kitas tyrimas, tiriantis krūties vėžio ląstelių epigenomą, daugiausia dėmesio skyrė cirkuliuojančių naviko ląstelių DNR metilinimo modeliams ir nustatė, kad stiebo ir su proliferacija susijusių transkriptų surišimo vietos yra specialiai hipometilintos [120]. Daugelio skirtingų vienaląsčių priemonių naudojimas suteikia naujų supratimų apie krūties naviko ląstelių įvairovę ir augimo potencialą, tačiau daugeliu atvejų normalios pieno liaukos ląstelės gali būti neprofiliuotos taip pat, todėl jų negalima palyginti. Kai panašios technologijos lygina naviko ir normalias pieno ląsteles, dažnai būna, kad jos turi labai skirtingus profilius, todėl sunku nustatyti tarpines ląsteles ir atskirti vėžio kilmės ląsteles. Vis daugiau tyrimų dabar yra skirti tirti normalų krūties audinį iš asmenų, turinčių didelę krūties vėžio riziką, o tai gali padėti nustatyti tarpines ikiklinikines ląsteles, kurios gali būti skirtos ankstyvam ligos nustatymui.


Atvejo tyrimas: scRNA-seq naudojimas dendritinių ląstelių ontogenezei išspręsti

Šios apžvalgos atvejo analizės atveju dominantis ląstelių tipas yra dendritinė ląstelė (DC), nes ji yra maža ir yra nevienalytė pogrupiuose (48). Žmogaus periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės susideda iš maždaug 90 % limfocitų, 10 % monocitų ir 1 % dendritinių ląstelių. Neseniai paskelbtoje ataskaitoje scRNA-seq naudojant 10X Genomics Chromium sistemą buvo atlikta 68 000 nerūšiuotų periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių (PBMC), siekiant nustatyti įvairias imuninių ląstelių populiacijas (7). Nors šiuo tyrimu pavyko nustatyti visas pagrindines kraujyje esančias imuninių ląstelių populiacijas, autoriams buvo sunku nustatyti ar nustatyti ląstelių tipus, kurių dažnis buvo mažesnis nei 1%. Nors tokio tipo metodas gali suteikti naudingą tam tikro audinio ląstelių sudėties momentinį vaizdą, prieš pradedant scRNA-seq gali prireikti praturtinti retų ląstelių tipus, pavyzdžiui, iš anksto rūšiuojant naudojant žinomus ar naujus paviršiaus žymenis. Iš tiesų, šią strategiją neseniai naudojo dvi atskiros grupės, siekdamos nustatyti žmogaus dendritinių ląstelių (prieš DC) pirmtakus žmogaus periferiniame kraujyje (8, 10). Villani ir jo kolegos daugiausia dėmesio skyrė 02212 HLA-DR + ląstelėms, kurias sudaro žinomi kraujo DC ir monocitai (8). Savo tyrime autoriai atliko SMART-seq2 su 2400 linijinių − HLA-DR + pavienių ląstelių ir aptiko transkripcijos požiūriu skirtingas ląstelių grupes, kurias buvo galima identifikuoti naudojant naujus paviršiaus žymenis, taip palengvinant jų išskyrimą naudojant FACS ir tolesnę analizę naudojant scRNA. -seq transkripcijos tapatybei patvirtinti. Naudodami šį metodą, autoriai sugebėjo nustatyti keletą naujų DC ir monocitų tipų, taip pat naują DC pirmtakų populiaciją. Atskirai mūsų grupė daugiausia dėmesio skyrė žmogaus kraujo linijai – HLA-DR, CD135 ir 43 ląstelėms, kurias sudaro ir nuolatinės srovės pogrupiai, ir jų pirmtakai (10). Atlikome MARS-seq 710 linijinių − HLA-DR + CD135 + pavienių ląstelių ir nustatėme dvi transkripcijos požiūriu skirtingas plazmacitoidinių DC (pDC) grupes, dvi įprastinės DC (cDC) subpopuliacijas ir naują klasterį, kuris vėliau buvo nustatyta, kad tai buvo iki DC. Tolesnis šios naujos populiacijos iki DC tyrimas žmogaus kaulų čiulpuose ir periferiniame kraujyje atskleidė, kad skyriuje iki DC buvo atskiros kilmės pogrupiai (vienas ankstyvas “uncommitted” CD123 didelis iki DC pogrupis ir du CD45RA & #43 CD123 žemos kilmės pogrupiai su skirtingomis funkcinėmis savybėmis). Kartu šie tyrimai rodo, kad skirtingos scRNA-seq platformos gali būti sėkmingai taikomos panašiems biologiniams klausimams viena kitą papildančiais būdais.

Nežinomų pavienių ląstelių tipo identifikavimo skaičiavimo metodas

Prieš atsirandant scRNA-seq metodams, ląstelių tipai paprastai buvo apibrėžiami naudojant antikūnų grupę, nukreiptą prieš iš anksto atrinktus ląstelės paviršiaus žymenis (dažnai vadovaujantis ankstesnėmis žiniomis apie atitinkamą ląstelių liniją ir bendru atitinkamų antikūnų prieinamumu). Tobulėjant technologijoms, vienoje ląstelėje esančių žymenų, kuriuos galima išmatuoti naudojant srauto citometriją arba masės citometriją, skaičius padidėjo nuo 㰐 iki 㹀. Šis didelis žymenų skaičius leidžia išskaidyti ląstelių heterogeniškumą daug detaliau, tačiau vis tiek atsilieka nuo skiriamosios gebos lygio, įmanomo naudojant nešališkus ląstelių tipo identifikavimo metodus, kuriuose naudojami transkriptominiai arba proteominiai metodai. Iš tiesų, scRNA-seq technologijos dabar gali išmatuoti kelių tūkstančių atskirų ląstelių transkriptus tik per trumpą laiką, o sparti skaičiavimo metodų pažanga leido atlikti patikimą šių ląstelių identifikavimą visiškai nešališkai. Tačiau pagrindinis iššūkis biologams, gavus scRNA-seq duomenis, yra žinoti, kaip sugrupuoti duomenis ir (arba) atlikti ląstelių identifikavimą. Šiuo metu vieno langelio duomenims sugrupuoti naudojama daugybė skirtingų algoritmų, įskaitant bendrąjį artimiausią kaimyną (SNN) (49), SNN-Cliq (50), pcaReduce (51), grupavimą imputacijos ir matmenų mažinimo būdu (CIDR) (52), vieno langelio duomenis. - ląstelių konsensuso grupavimas (SC3) (53), vienos ląstelės RNR sekų profiliavimo analizė (SINCERA) (54), retų ląstelių tipo identifikavimas (RaceID) (39), GiniClust (55) ir vienos ląstelės latentinis kintamasis modelis (scLVM). ) (56). Nustačius ląstelių grupes, kiekviename klasteryje skirtingai išreikšti genai nustatomi ir priskiriami kaip žinomi / nauji ląstelių tipai (remiantis galimai šališkomis išankstinėmis žiniomis apie linijos žymenų apibrėžimą).

Čia nagrinėjame metodo, ląstelių tipo identifikavimo, panaudojimą, įvertindami santykinius RNR nuorašų pogrupius (CIBERSORT) (57), nešališkame vienos ląstelės transkriptų ląstelių tipo identifikavime, kai analizavome žmogaus periferinio kraujo mononuklearines ląsteles (PBMC). ) scRNA-seq duomenys iš dviejų skirtingų tyrimų, kuriuose buvo naudojamos 10X Genomics Chromium (7) arba SMART-seq2 (8) platformos. Zheng ir kt. atliko 68 000 žmogaus PBMC vienos ląstelės RNR seką, naudodamas 10X Genomics Chromium sistemą (7), tada skaičiavimo būdu suskirstė ląsteles į 10 atskirų pogrupių (1A pav.) ir nustatė klasteriui būdingus genų ekspresijos modelius. Ląstelių tipų tapatumas kiekviename klasteryje buvo nustatytas suderinus klasteriui būdingus genus su žinomais skirtingų PBMC populiacijų žymenimis (1B pav.), Taip pat palyginus su 11 išgrynintų PBMC pogrupių scRNA-seq profiliu. Vienos ląstelės transkriptai buvo lyginami su vidutiniais 11 išgrynintų populiacijų transkriptais pagal Spearman' koreliaciją. Tada kiekvienai ląstelei buvo priskirta tokia pati tapatybė kaip ir išgrynintai populiacijai, su kuria ji turėjo didžiausią koreliaciją, o metodas iš esmės atitinka įprastus žymenimis pagrįstus metodus. Abiejose analizėse nustatyta, kad 9 klasteryje yra monocitų ir nuolatinės srovės, o 10 klasteryje buvo tik DC. Vėliau ląstelės iš 9 ir 10 grupių buvo išskirtos tolesnei analizei. Ląstelės, priskirtos 9 klasteriui, buvo atskirtos į 4 atskiras pogrupius, kai buvo toliau analizuojamos naudojant Seurat paketą (58) (1C pav.). Šiuos 4 pogrupius buvo galima vizualiai patikrinti t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (tSNE) sumažintų matmenų sklypuose. tSNE, kaip naudojo Becher ir kt. siekiant apibrėžti pelių mieloidinių pogrupių populiacijas (4), vizualizuoja didelių matmenų ląstelių panašumus dvimačiame žemėlapyje, kuriame panašių savybių ląstelės vaizduojamos arti vienas kito, taip leidžiant interpretuoti kiekvieną ląstelių tipą pagal vietą (59, 60). ). Iš pradžių pavienės ląstelės buvo identifikuotos kaip skirtingos linijos, koreliuojant su išgrynintomis PBMC populiacijomis, esančiomis tSNE sklype (1D pav.). Nustatyta, kad 2 klasterį daugiausia sudaro DC, o 0, 1 ir 3 klasteriai daugiausia susideda iš CD14 + monocitų. Nors koreliacija pagrįsta ląstelių tipų klasifikacija iš esmės atitinka klasterizacijos metodus, daugelis ląstelių, esančių monocitų klasteriuose, iš tikrųjų buvo identifikuotos kaip DC. Norėdami išsiaiškinti, ar šios ląstelės iš tikrųjų buvo monocitai, ar tikroji DC, atlikome ląstelių tipo identifikavimą CIBERSORT analize (57), naudodami monocitų ir DC genų parašus, apibrėžtus vienos ląstelės transkriptominiais duomenimis (ty iš 11 išgrynintų PBMC pogrupių). Pirmiausia išskyrėme CD14 + monocitus ir DC ir apskaičiavome vidutinį genų ekspresijos lygį kiekvienam ląstelių tipui. CIBERSORT analizei buvo atrinkti genai su maksimalia ekspresija Ϡ.0001 UMI, o kiekvienai atskirai ląstelei apskaičiuotas parašo genų praturtėjimas procentais, taip leidžiant priskirti linijos tapatumą pagal labiausiai praturtintus genų rinkinius. Kai ši CIBERSORT pagrįsta ląstelių tipo klasifikacija buvo padengta tSNE diagramoje, mes pastebėjome daug didesnį atitikimą tiek klasterizavimui, tiek tSNE segregacijai (1E pav.).

figūra 1. Ląstelių tipų identifikavimas naudojant scRNA-seq duomenis iš 10X Genomics Chromium sistemos. (A) tSNE atskirų ląstelių grupavimas PBMC. (B) Klasterių suderinimas su žinomomis imuninių ląstelių populiacijomis. (C) Kombinuotų 9 ir 10 grupių SNE grupavimas, kuris buvo nustatytas kaip monocitai ir DC. (D) Sudėtas koreliacijos nustatytas ląstelių tipas 9 ir 10 kombinuoto klasterio tSNE vaizde. (E) CIBERSORT pagrindu sukurta ląstelių tipų klasifikacija pagal 9 ir 10 kombinuotų grupių tSNE atvaizdavimą.

Šiame tyrime su 10X Genomics Chromium sistema, naudojant išgrynintų PBMC etalonines populiacijas, buvo galima klasifikuoti nerūšiuotas vienos ląstelės transkriptus į 11 pagrindinių imuninių ląstelių tipų. Mes sujungėme DC iš 9 ir 10 grupių ir toliau juos sugrupavome į atskirus pogrupius. Yra žinoma, kad žmogaus kraujyje esantys DC apima dvi cDC populiacijas (CD141 + cDC1 ir CD1c + cDC2), taip pat pDC pogrupį (5) ir atskirą prieš DC populiaciją (10). Mūsų tyrime (10) mes surūšiavome grynas CD141 + cDC1, CD1c + cDC2, pDC ir pre-DC populiacijas iš žmogaus kraujo ir generavome masinius mikrogardelių duomenis, iš kurių gavome būdingus kiekvieno pogrupio genų parašus. Toliau patvirtinome šiuos genų parašus pagal paskelbtus SMART-seq2 vienos ląstelės duomenis kiekvienai iš keturių DC populiacijų, aprašytų Villani ir kt. (8). Atskiroms ląstelėms, sujungtoms iš kiekvienos populiacijos, buvo sumažintas SNE matmuo, o po to suskirstytos į keturis pogrupius, naudojant Seurat paketą (2A, S2A paveikslai). CIBERSORT palyginus šiuos duomenis su mikrogardelių gautais genų parašais, buvo galima apskaičiuoti ląstelių tapatybes, kurios labai atitiko FACS klasifikaciją (2B, C paveikslai). Išrūšiuotas CD141 + cDC1, CD1c + cDC2 ir pDC populiacijas CIBERSORT iš esmės priskyrė atitinkamam ląstelių tipui, tik nedidelė kiekvienos jų dalis buvo klasifikuojama kaip iki DC (tikėtina, kad tai yra pirmtakės ląstelės, įsipareigojusios cDC1 arba cDC2 likimai, taip pat neįsipareigojęs išankstinis DC, turintis fenotipinių panašumų su pDC). Dar įdomiau, kad buvo prognozuojama, kad dauguma surūšiuotų dvigubai neigiamų ląstelių yra prieš DC, o tai rodo, kad šiame skyriuje gali būti tikrų cDC pirmtakų. Nebuvo įmanoma nustatyti kai kurių ląstelių tipų, kuriuose yra permutacija p-vertės buvo Ϡ.05. Tačiau nepaisant to, kad ląstelių rūšiavimą mikromatricoms ir SMART-seq2 atliko dvi nepriklausomos laboratorijos, šis darbas patvirtino, kad iš mikromatricos gauti parašai galėjo padėti SMART-seq2 pavienių ląstelių liniją identifikuoti per CIBERSORT. Todėl mes pradėjome taikyti tuos pačius genų parašus numatydami ląstelių tipus atskiroms ląstelėms, analizuotoms naudojant 10X Genomics Chromium duomenų rinkinį. Pirmiausia atlikome tSNE matmenų sumažinimą ir atskirų nuolatinės srovės grupavimą naudodami Seurat (2D pav.), o tSNE sklype uždengėme CIBERSORT išvestus ląstelių tipus (2E, F paveikslai). Tarp 3 sugeneruotų grupių 2 klasterį daugiausia sudarė CD141 ir #43 cDC1. Neprižiūrimas klasterizavimas atitiko ląstelių tipo išvadą, naudojant surūšiuotas ląsteles, o tai rodo, kad įprastas žymekliu pagrįstas cDC1 identifikavimas yra gerai apibrėžtas ir gali būti patvirtintas naudojant metodą be žymenų. Priešingai, 0 klasteris reiškė mišrią CD1c + ir neapibrėžtų ląstelių populiaciją, o 1 klasterį sudarė pDC, prieš DC ir neapibrėžtų ląstelių mišinys. Šios išvados atitinka ankstesnes ataskaitas, kad CD1c ir #43 cDC2 iš tikrųjų yra nevienalytė, prastai apibūdintos sudėties populiacija (8, 10, 61), o pDC yra fenotipiškai panašūs į iki DC (todėl kai kurios progenitorinių ląstelių funkcijos greičiausiai buvo klaidingos). priskiriamas pDC dėl užteršimo prieš DC) (10). 0 klasteris ir 1 klasteris buvo priskirti atitinkamai kaip CD1c + cDC2 ir pDC (S2B pav.). Palyginti su SMART-seq2, 10X Genomics Chromium duomenų rinkinys sukūrė daugiau nerūšiuotų ląstelių, kurios buvo pažymėtos kaip nenustatytos. Šios ląstelės nebuvo reikšmingai praturtintos cDC1, cDC2, pDC ar pre-DC parašais, o tai rodo, kad tai gali būti nežinomi pogrupiai, įgyti iš nerūšiuotų ląstelių scRNA-seq be žymenų.

2 pav. Ląstelių tipų identifikavimas naudojant scRNA-seq duomenis iš SMART-seq2. (A) tSNE dendritinių ląstelių pogrupių grupavimas. (B) Sudėtas CIBERSORT pagrįstas ląstelių tipų klasifikavimas SMART-seq2 duomenų rinkinio tSNE vaizde. (C) SMART-seq2 klasterių suderinimas su DC pogrupių mikromasyvo duomenų rinkiniu. (D) tSNE DC klasterio grupavimas, gautas iš 10X Genomics Chromium duomenų rinkinio. (E) Sudėtas CIBERSORT pagrįstas ląstelių tipų klasifikavimas DC klasterio tSNE vaizde, gautame iš 10X Genomics Chromium duomenų rinkinio. (F) Nuolatinės srovės klasterių suderinimas su nuolatinės srovės pogrupių mikromasyvo duomenų rinkiniu.

Apibendrinant, mes panaudojome du skirtingus metodus – Spearman's koreliaciją ir CIBERSORT, kad nustatytų ląstelių tipus 10X Genomics Chromium PBMC duomenų rinkinyje. Mes nustatėme, kad CIBERSORT veikė šiek tiek geriau nei koreliacija pagrįstas metodas. Pagrindinė to priežastis gali būti ta, kad CIBERSORT pirmiausia nustatė kiekvieno ląstelių tipo parašo genus, o po to buvo atliktas papildomas vektoriaus regresijos žingsnis, siekiant apskaičiuoti genų parašo praturtinimo balą. Bet kokiu atveju abu metodai naudoja masinius nuorašus, todėl jie labai priklauso nuo ląstelių tipų, esančių pamatiniame duomenų rinkinyje. Atitinkamai, naudojant išsamų duomenų rinkinį, kuris yra tiesiogiai susijęs su dominančiu tyrimu, žymiai pagerės ląstelių tipo identifikavimo tikslumas.

Duomenų integravimas ir techninių skirtumų taisymas

Padidėjus „scRNA-seq“ duomenų kiekiui, mokslininkai dabar gali išgauti esamus duomenų rinkinius, kad galėtų atlikti kelių skirtingų tipų analizę. Tačiau skirtingų scRNA-seq platformų sugeneruotus duomenų rinkinius dažnai reikia integruoti prieš atliekant tolesnę analizę, o techniniai duomenų rinkinių skirtumai turi būti pataisyti prieš juos derinant. Taikant scRNA-seq daugybei ląstelių, eksperimentai paprastai atliekami partijomis, todėl tarp tyrimų atsiranda ryškus kintamumas, galintis paslėpti biologinį nevienalytiškumą. Pavyzdžiui, Villani ir kt. atliko SMART-seq2 dviejose atskirose surūšiuotų cDC1, cDC2, dvigubai neigiamų DC ir pDC (8) partijose, prieš atlikdama t-SNE matmenų mažinimo ir grupavimo analizę, kuri nustatė dvi atskiras kiekvieno įvesties ląstelių tipo pogrupius (3A pav. ). Perdėjus partijos informaciją ant tSNE sklypo, paaiškėjo, kad šios subpopuliacijos atitiko du atskirus tyrimo paleidimus (3B pav.). Norėdami pašalinti šį paketinį efektą, Seurat paketas įgyvendina kanoninės koreliacijos analizės (CCA) algoritmą, kuris nustato dimensijas, kuriose 1 ir 2 partijos turi didžiausią koreliaciją, ir projektuoja langelius pagal šiuos matmenis. Normalizavus CCA, tie patys ląstelių tipai iš 1 ir 2 partijos buvo gerai suderinti (3A pav.), be akivaizdaus ląstelių atskyrimo tarp tyrimo eigų (3B pav.).

3 pav. SMART-seq2 duomenų rinkinio paketinio efekto taisymas. (A) Partijos efektas buvo pastebėtas dviejuose atskiruose SMART-seq2 duomenų rinkiniuose prieš CCA normalizavimą, tačiau pritaikius CCA normalizavimą to nebuvo. (B) Ląstelių klasteriai atitiko SMART-seq2 duomenų rinkinį prieš CCA normalizavimą. Pritaikius CCA normalizavimą, abi pavienių ląstelių partijos sutapo viena su kita.

Tada naudojome CCA, kad integruotume vienos ląstelės duomenis, sugeneruotus naudojant SMART-seq2 metodą ir 10X Genomics Chromium sistemą. Pavienės ląstelės, išskirtos iš išgrynintų cDC1, cDC2, dvigubai neigiamų ląstelių ir pDC populiacijų, buvo paruoštos naudojant SMART-seq2. Vienos ląstelės duomenys iš nerūšiuotų PBMC buvo sugeneruoti naudojant 10X Genomics Chromium sistemą ir buvo išskirti tik DC, kad būtų galima integruoti su SMART-seq2 duomenimis. DC iš 10X Genomics Chromium eksperimento buvo išvestos remiantis CIBERSORT analize, kaip minėta anksčiau. Prieš normalizuojant CCA, ląstelės iš SMART-seq2 metodo ir 10X Genomics Chromium sistemos buvo gerai atskirtos (4A pav.), o kiekvienai linijai buvo nustatyti du skirtingi pogrupiai, atspindintys dviejų skirtingų analizės platformų naudojimą (4B pav.). Normalizavus CCA, kiekvienos platformos analizuojamos ląstelės buvo gerai sumaišytos (4C pav.) ir buvo suskirstytos daugiausia pagal ląstelių tipą (4D pav.). Pažymėtina, kad dvigubos neigiamos ląstelės, kurios anksčiau buvo atskirtos nuo kitų linijų, taip pat susilieja su CD1c + populiacija po CCA. Toliau bandėme integruoti šiek tiek skirtingos ląstelių sudėties duomenų rinkinius, pridėdami monocitų prie 10X Genomics Chromium duomenų, o SMART-seq2 duomenų rinkinį vis dar sudarė tik DC. Ląstelės buvo suskirstytos daugiausia pagal ląstelių tipą, neatsižvelgiant į naudojamą platformą, išskyrus tai, kad dvigubai neigiami DC dabar buvo priskirti monocitų klasteriui, o kai kurios CD141 + ląstelės dabar buvo CD1c + klasteryje (5 pav.).

4 pav. Nuolatinės srovės pogrupio duomenų rinkinio techninių skirtumų taisymas iš 10X Genomics Chromium ir SMART-seq2 duomenų rinkinių. (A) SMART-seq2 ir 10X Genomics Chromium duomenų rinkinio tSNE grupavimas. (B) Ląstelių tipo identifikavimas kombinuotuose SMART-seq2 ir 10X Genomics Chromium duomenų rinkinio tSNE klasteriuose. (C) DC pogrupių CCA normalizavimas iš SMART-seq2 ir 10X Genomics Chromium duomenų rinkinio. (D) Ląstelių tipų nustatymas po CCA normalizavimo.

5 pav. Monocitų ir nuolatinės srovės pogrupio duomenų rinkinio techninių skirtumų taisymas iš 10X Genomics Chromium ir SMART-seq2 duomenų rinkinių. (A) SMART-seq2 ir 10X Genomics Chromium duomenų rinkinių SNE grupavimas. (B) Ląstelių tipo identifikavimas kombinuotuose SMART-seq2 ir 10X Genomics Chromium duomenų rinkinių tSNE klasteriuose. (C) Monocitų ir nuolatinės srovės pogrupių CCA normalizavimas iš SMART-seq2 ir 10X Genomics Chromium duomenų rinkinių. (D) Ląstelių tipų nustatymas po CCA normalizavimo.

Mūsų analizė rodo, kad CCA gali ištaisyti paketinio efekto trikdžius, kai eksperimentiniuose pakartojimuose nesiskiria jokie kiti biologiniai veiksniai. CCA algoritmas daro prielaidą, kad abiejų paketų duomenys turi tą pačią arba panašią ląstelių sudėtį. Svarbu pažymėti, kad CCA vis tiek gali priversti partijas lygiuotis, net jei jų ląstelių sudėtis skiriasi, o tai gali užmaskuoti tikrą biologinį kitimą. Norint įveikti šį apribojimą, gali būti naudojamas abipusio artimiausio kaimyno (MNN) algoritmas (62), kad būtų galima nustatyti panašias ląstelių populiacijas arba “pairs”, kurios yra abiejose partijose. MNN poros naudojamos analitiniam poslinkiui tarp tyrimo eigų apskaičiuoti ir vėliau kompensuoti visų esančių ląstelių partijos efektą. Jei nėra bendros struktūros, žinomos sudėties ląstelių populiacija (pvz., ląstelių linija) taip pat gali būti įtraukta į kiekvieną mėginį, kad būtų pašalintas paketinis poveikis, sukuriant vienodą atskaitos populiaciją. Nors ir CCA, ir MNN yra galingi įrankiai, keli kiti normalizavimo būdai (ir dabartiniai, ir būsimi) gali dar labiau pagerinti paketinio efekto korekciją ateinančiais metais. Tačiau norint nustatyti, kurie metodai geriausiai tinka kokiems duomenų rinkiniams, reikės nuodugniai palyginti šiuos naujus metodus naudojant kintamus įvesties duomenis.


ScRNA-seq taikymas smegenyse

Žinduolių smegenys yra laikomos sudėtingiausiu organu dėl savo ląstelių įvairovės, funkcijų įvairovės ir apimties bei transkripcijos reguliavimo [92]. Ankstesniais tyrimais buvo siekiama ištirti smegenų ląstelių įvairovę per RNR-seq mėginius iš išgrynintų smegenų žievės populiacijų [93, 94]. Pastaruoju metu scRNA-seq naudojama kaip priemonė įvertinti smegenų sudėtingumą ir nustatyti naujas ląstelių subpopuliacijas, specifinius genų parašus ir pagrindinius reguliavimo tinklus. Šiame skyriuje bus pateikta atitinkamų scRNA-seq tyrimų, susijusių su įvairių tipų smegenų ląstelėmis, apžvalga. Išsamesnis pasirinktų tyrimų aprašymas pateiktas  1 ir ​ bei 2 2 lentelėse ir pavaizduotas  1 pav.

Smegenų ląstelių tipų nustatymas

Smegenyse yra labai sudėtingų nervų ląstelių tipų / potipių. Tradiciškai nervinės ląstelės buvo identifikuojamos pagal morfologiją, jaudrumą, jungiamumą ir ląstelės vietą [95]. Neseniai scRNA-seq buvo naudojamas skirtingiems nervų tipams ir potipiams nustatyti bei naujiems ląstelėms būdingiems žymenims atrasti. Pavyzdžiui, Amit Zeisel ir kt. [8] sekvenavo 3005 vienaląstes ir atskleidė 9 pagrindines ląstelių klases (S1 ir CA1 piramidinius neuronus, interneuronus, oligodendrocitus, astrocitus, mikroglijas, kraujagyslių endotelio ląsteles, sienines ląsteles ir ependimines ląsteles). Autoriai nustatė specifinius naujus genų žymenis skirtingiems ląstelių tipams, pavyzdžiui, S1 piramidinės ląstelės buvo apibūdintos Gm11549 (ilgą nekoduojančią RNR), hipokampo piramidines ląsteles Spink8 (serino proteazės inhibitorius), o interneuronai Pnoc (prepronociceptinas).

Striatum yra subkortikinė priekinės smegenų dalis. Striato disfunkcija gali sukelti daugybę neuropsichinių sutrikimų, pavyzdžiui, Parkinsono ir Hantingtono ligas, obsesinį kompulsinį sutrikimą ir autizmą [96, 97]. Tradiciškai striatum neuronų sudėtį apibrėžė daugiausia vidutiniai spygliuotieji neuronai (MSN) ir nedidelė interneuronų populiacija [74]. MSN anatomiškai ir funkciniu požiūriu buvo suskirstyti į D1 ir D2 MSN [98], tačiau striatalinė įvairovė nebuvo įvertinta.

Ozgun Gokce ir kt. [74] taikė du metodus: mikrofluidinį vienaląsčių RNR sekos nustatymą (MIC-scRNA-seq) ir vienos ląstelės išskyrimą fluorescenciniu būdu aktyvintu ląstelių rūšiavimu (FACS-scRNA-seq), kad analizuotų 1028 pavienių striatalinių ląstelių transkriptus. Transkriptai atskleidė dešimt skirtingų ląstelių subpopuliacijų, įskaitant neuronus, astrocitus, oligodendrocitus, kamienines ląsteles, imunines, ependimines ir kraujagyslių ląsteles. Naudojant tvirtą PCA, buvo nustatyta, kad nauji genų žymenys atskiria D1 ir D2 MSN ląsteles.

Neuroninės kamieninės ląstelės (NSC) gali savaime atsinaujinti ir gaminti nervinių ląstelių tipus, įskaitant neuronus, astrocitus ir oligodendrocitus [99, 100]. NSC palaiko pusiausvyrą tarp ramybės ir aktyvuotos būsenos [101, 102]. Jei smegenys bus sužalotos, endogeninis NSC bus aktyvuotas, kad atstatytų smegenų audinį [103]. Ankstesnius darbus ribojo nedidelis analizuotų veiksnių skaičius ir mišrios ląstelių populiacijos. Nebuvo visiškai suprantama, kaip NSC suaktyvėjo. Neseniai dviejuose tyrimuose buvo naudojami vienos ląstelės metodai, siekiant ištirti miegančių neuronų kamieninių ląstelių aktyvavimą po sužalojimo. Viename tyrime Llorens-Bobadilla su kolegomis tyrė ramybės būsenos NSC aktyvacijos po smegenų traumos ypatybes [22]. Autoriai nustatė NSC ramioje ir aktyvioje būsenoje ir atskleidė aktyvacijos progresavimą naudojant vienos ląstelės seką. Jie nustatė naujus NSC subpopuliacijų genų žymenis ir nustatė, kad smegenų išemijos metu ramybės būsenos NSC aktyvuojasi per interferono gama signalus. Kitas tyrimas taip pat parodė, kad centrinės nervų sistemos (CNS) pažeidimas gali suaktyvinti CD133 + ramias NSC. Luo ir kt. [104] įrodė, kad kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF) gali aktyvuoti CD133 + ependiminę nervinę kamieninę ląstelę (NSC), o kartu su baziniu fibroblastų augimo faktoriumi iššaukti nervinės linijos diferenciaciją ir migraciją. Neseniai atliktame tyrime Dulken ir kt. [57] sekvenavo 329 aukštos kokybės pavienės ląstelės, surūšiuotos pagal FACS iš keturių skirtingų populiacijų [astrocitų, ramybės būsenos nervinių kamieninių ląstelių (qNSC), aktyvuotų nervinių kamieninių ląstelių (aNSC) ir nervinių pirmtakų ląstelių (NPC)] subventrikulinėje zonoje. suaugusių pelių. Naudodami PCA, autoriai sugebėjo atskirti ramias ląstelių rūšis (astrocitus ir qNSC) nuo aktyvių ir proliferuojančių ląstelių tipų (aNSC ir NPC). Įdomu tai, kad autoriai palygino savo vienaląsčius transkriptus su panašių ląstelių [NSC ir tranzito amplifikavimo progenitoriais (TAP)], surūšiuotomis su skirtingais ląstelių žymenimis [22]. Kad būtų galima palyginti vienos ląstelės duomenų rinkinius, apdorotus skirtingomis partijomis, taigi ir su skirtingais bibliotekos preparatais bei sekos nustatymo gyliu, Dulken ir kt. suplanavo Llorens-Bobadilla ir kolegų duomenų rinkinius naudodami savo dujotiekį ir tada atliko PCA su kintamiausiais genais. Be to, jie atliko pseudolaikinį užsakymą naudodami Monocle su savo konsensuso tvarka atliekamais genais ir nustatė panašią dinaminę genų ekspresiją, susijusią su NSC ramybe ir aktyvavimu. Atlikdami šią metaanalizę, autoriai galėjo stebėti aukštą ryšį tarp abiejų tyrimų NSC, nepaisant skirtingų izoliavimo metodų ir partijos efektų.

Oligodendrocitai buvo laikomi svarbia funkciškai vienalyte CNS populiacija, tačiau šios ląstelės morfologijos yra įvairios [105]. Neaišku, ar morfologijos įvairovę lemia oligodendrocitai, sąveikaujantys su vietine aplinka brendimo metu, ar dėl jų vidinio funkcinio heterogeniškumo [106, 107]. Marques ir kt. [75] FACS metodu išskyrė pavienes ląsteles iš 10 skirtingų jauniklių ir suaugusių pelių CNS regionų ir pagal scRNA-seq sekvenavo 5072 oligodendrocitus. Autoriai nustatė 13 skirtingų subpopuliacijų, iš kurių 12 yra diferenciacijos stadijos nuo oligodendrocitų pirmtakų ląstelių iki subrendusių oligodendrocitų. Tikslios diferenciacijos stadijos buvo nustatytos naudojant t-SNE matmenų mažinimui ir grupavimo įrankį BackSPIN2 pseudo laiko analizei. Tokiu būdu, naudojant scRNA-seq metodus, autoriai atskleidė oligodendrocitų diferenciacijos ir brendimo dinamiką.

Sunku ištirti pagrindinį atskirų neuronų transkripcijos kraštovaizdį. Anksčiau daugelis pavienių suaugusio žmogaus neuronų tyrimų priklausė nuo šviežiai izoliuotų neurochirurginių audinių iš ribotų regioninių mėginių prieinamumo [109]. Nors šviežiai izoliuoti neurochirurginiai audiniai yra geresni atskiriems neuronams analizuoti, pomirtiniai audiniai gali pateikti daugiau įvesties mėginio. Lake'as su kolegomis sukūrė naują metodą, kuriuo galima sekvenuoti ir kiekybiškai įvertinti RNR izoliuotuose pomirtinių smegenų neuronų branduoliuose [108]. Jie išpjaustė šešis skirtingus smegenų žievės regionus ir sukūrė 3227 vieno neurono RNR-seq duomenų rinkinius. Po grupavimo ir klasifikavimo buvo nustatyta 16 neuronų potipių ir buvo įvertinti pagal žinomus žymenis ir žievės citoarchitektūrą.

Smegenų vystymosi reguliavimas ilgomis nekoduojančiomis RNR (lncRNR)

Tyrimai atskleidė tūkstančius lncRNR žinduolių transkriptose [110]. lncRNR evoliucijos metu nėra gerai konservuotos [111], tačiau lncRNR promotoriai yra labiau konservuoti nei baltymus koduojantys genai [112, 113]. lncRNR turi specifinę audinių ekspresiją žmogaus smegenyse [114, 115] ir įrodyta, kad jos dalyvauja reguliuojant smegenų ligas ir neurologinio vystymosi sutrikimus [116, 117]. Ankstesni tyrimai, pagrįsti tūriniais audiniais, rodė, kad lncRNR ekspresijos lygis yra mažesnis nei baltymus koduojančių genų [114, 118], tačiau nežinoma, ar visose ląstelėse lncRNR ekspresuojamos žemai [119].

Mokslininkai ištyrė lncRNR raišką išgrynintose pelių smegenų ląstelėse ir nustatė jų vaidmenį nustatant oligodendrocitų pirmtakų ląstelių (OPC) likimą [120].Naujausi metodai dabar skirti spręsti lncRNR smegenų scRNA-seq mėginiuose. Liu ir kt. [119] naudojo scRNA-seq lncRNR analizei besivystančiame žmogaus neokortekse. Autoriai išskyrė bendrą RNR iš 276 skirtingų žmogaus neokortekso vystymosi stadijų pavienių ląstelių ir išanalizavo jų transkriptus. Norėdami įvertinti, ar lncRNR buvo ekspresuojamos aukštu lygiu ląstelių subpopuliacijose, autoriai naudojo lncRNR: mRNR medianinį santykį, kuris lygina lncRNR ekspresijos medianą su vidutine mRNR ekspresija. Palyginti su lncRNR iš masinio audinio (vidutinis lncRNR:mRNR santykis buvo 0,31), daugelis lncRNR buvo gausiai ekspresuojamos atskirose ląstelėse (pavienėse ląstelėse 32,2 % ląstelių vidutinis lncRNR:mRNR santykis viršijo 1,0). Autoriai nustatė, kad lncRNR LOC646329 buvo praturtintas skilvelių zonoje, kur yra dauguma radialinių glijų. Kada LOC646329 buvo numuštas, sumažėjo U87 ląstelių dauginimasis. Rezultatai rodo, kad lncRNR gali reguliuoti ląstelių proliferaciją.


2.6 Eksperimentiniai metodai

2.3 pav.: Moore'o dėsnis vienos ląstelės transkriptomikoje (vaizdas paimtas iš Svensson ir kt.)

Naujų scRNA-seq metodų ir protokolų kūrimas šiuo metu yra labai aktyvi tyrimų sritis, o per pastaruosius kelerius metus buvo paskelbti keli protokolai. Neišsamus sąrašas apima:

  • CEL-seq (Hashimshony ir kt., 2012 m.)
  • CEL-seq2 (Hashimshony ir kt., 2016 m.)
  • Drop-seq (Macosko ir kt., 2015)
  • „InDrop-seq“ (Klein ir kt., 2015 m.)
  • MARS-seq (Jaitin ir kt., 2014)
  • SCRB-seq (Soumillon ir kt., 2014)
  • „Seq-well“ (Gierahn ir kt., 2017 m.)
  • „Smart-seq“ (Picelli ir kt., 2014 m.)
  • Smart-seq2 (Picelli ir kt., 2014 m.)
  • STRT-seq (Islam ir kt., 2013)

Metodai gali būti skirstomi į įvairias kategorijas, tačiau svarbiausi yra du aspektai kiekybinis įvertinimas ir užfiksuoti.

Kiekybiniam įvertinimui yra du tipai, visas ilgis ir pagal žymą. Pirmasis bando pasiekti vienodą kiekvieno nuorašo skaitymo aprėptį. Priešingai, žymėmis pagrįsti protokolai užfiksuoja tik kiekvienos RNR 5' arba 3' galą. Kiekybinio įvertinimo metodo pasirinkimas turi svarbių pasekmių, kokio tipo analizėms duomenys gali būti naudojami. Teoriškai viso ilgio protokolai turėtų užtikrinti vienodą nuorašų aprėptį, tačiau, kaip matysime, aprėptis dažnai yra šališka. Pagrindinis žymėmis pagrįsto protokolo pranašumas yra tas, kad juos galima derinti su unikaliais molekuliniais identifikatoriais (UMI), kurie gali padėti pagerinti kiekybinį nustatymą (žr. 4.6 skyrių). Kita vertus, apsiribojus vienu nuorašo galu, gali sumažėti atvaizdavimas ir taip pat sunkiau atskirti skirtingas izoformas (Archer ir kt., 2016).

Fiksavimui naudojama strategija lemia pralaidumą, kaip galima pasirinkti langelius, taip pat kokią papildomą informaciją, be sekos, galima gauti. Trys dažniausiai naudojamos parinktys mikrošulinukas-, mikroskystis - ir lašelis- pagrįstas.

2.4 pav.: Mikrošulinėlių plokštelių vaizdas (vaizdas paimtas iš Vikipedijos)

Gerai pagrįstose platformose ląstelės išskiriamos naudojant, pavyzdžiui, pipetę arba lazerinį gaudymą, ir dedamos į mikroskysčių šulinėlius. Vienas iš gerai pagrįstų metodų pranašumų yra tas, kad juos galima derinti su fluorescenciniu aktyvintų ląstelių rūšiavimu (FACS), todėl galima atrinkti ląsteles pagal paviršiaus žymenis. Taigi ši strategija yra labai naudinga tais atvejais, kai norima atskirti tam tikrą ląstelių pogrupį, kad būtų galima nustatyti seką. Kitas privalumas yra tai, kad galima fotografuoti ląsteles. Vaizdas suteikia papildomą būdą, o ypač naudinga taikymas yra identifikuoti šulinėlius, kuriuose yra pažeistų ląstelių arba dubletų. Pagrindinis šių metodų trūkumas yra tas, kad jie dažnai yra mažo našumo, o vienai ląstelei gali prireikti daug darbo.

2.5 pav.: 96 šulinėlių Fluidigm C1 lusto vaizdas (vaizdas paimtas iš Fluidigm)

Mikrofluidinės platformos, tokios kaip Fluidigm's C1, suteikia labiau integruotą sistemą, skirtą ląstelėms užfiksuoti ir reakcijoms, reikalingoms bibliotekos paruošimui, atlikti. Taigi jie užtikrina didesnį pralaidumą nei mikrošulinėlių platformos. Paprastai tik apie 10% ląstelių yra užfiksuota mikrofluidinėje platformoje, todėl jos netinka, jei susiduriama su retais ląstelių tipais arba labai mažais įvesties kiekiais. Be to, lustas yra palyginti brangus, tačiau kadangi reakcijas galima atlikti mažesniu tūriu, galima sutaupyti pinigų reagentams.

2.6 pav. Scheminė drop-seq metodo apžvalga (vaizdas paimtas iš Macosko ir kt.)

Lašeliais pagrįstų metodų idėja yra įkapsuliuoti kiekvieną atskirą ląstelę nanolitro lašelyje kartu su granulėmis. Karoliukas yra prikrautas fermentų, reikalingų bibliotekai sukurti. Visų pirma, kiekviename rutulyje yra unikalus brūkšninis kodas, kuris pridedamas prie visų tos ląstelės nuskaitymų. Taigi, visi lašeliai gali būti sujungti, suskirstyti į vieną seką, o vėliau rodmenys gali būti priskirti kilmės ląstelei, remiantis brūkšniniais kodais. Droplet platformos paprastai turi didžiausią pralaidumą, nes bibliotekos paruošimo išlaidos yra (.05) USD už langelį. Vietoj to, sekos nustatymo išlaidos dažnai tampa ribojančiu veiksniu, o įprastas eksperimentas, kai aprėptis yra nedidelė, aptikta tik keli tūkstančiai skirtingų nuorašų (Ziegenhain ir kt., 2017).


Mikrofluidika pagrįsti metodai

„Smart-Seq 2“ darbo eigos alternatyvos yra mikrofluidikos metodai, kuriuose naudojama panaši molekulinė biologija (jie taip pat remiasi, pavyzdžiui, šablonų perjungimu), tačiau skiriasi ląstelių fiksavimu ir pralaidumu. Lašeliu pagrįstos darbo eigos metu [7, 8] atskiros ląstelės yra kapsuliuojamos į nanolitrų lašelius, kuriuose yra DNR brūkšninio kodo skaitymai, skirti atvirkštinei transkripcijai. cDNR atveju atkūrimo lašeliai suskaidomi ir cDNR paruošiama biblioteka. Šis metodas leidžia vienu metu profiliuoti tūkstančius ląstelių, tačiau iš pradžių reikėjo specialios, pagal užsakymą sukurtos įrangos, dėl kurios buvo sunku ją pasiekti. Neseniai buvo išleista keletas mikrolašelių pagrindu veikiančių instrumentų, siūlančių patogias platformas lašelių pagrindu atliekamai vienos ląstelės analizei, kuri trunka 2–3 dienas. Pavyzdžiui, BioRad siūlo ddSeq vieno elemento izoliatorių, susietą su Illumina Nextera rinkiniais. „InDrop by 1CellBio“ siūlo dar vieną alternatyvią mikroskysčių sistemą. „Fluidigm C1“ platforma siūlo mažo našumo mikroskysčius, kurių pranašumas yra galimybė vizualiai kontroliuoti tuščius šulinius ar dubletus po surinkimo. Tačiau šiuo metu dažniausiai naudojama platforma yra vienos ląstelės valdiklis iš 10x Genomics, ir mes aptarsime jo savybes toliau šioje apžvalgoje. Mikrolašeliais pagrįsti metodai skirti įvertinti didelį ląstelių skaičių ir pritaikyti audinių profiliavimui bei naujų ląstelių tipų aptikimui.

Svarbūs sėkmingo, aukštos kokybės duomenų generavimo naudojant mikrolašelių technologiją veiksniai yra ląstelių kokybė ir kiekvienam eksperimentui naudojamas ląstelių skaičius. Idealiu atveju į sistemą tiekiamos tik gyvos ląstelės, todėl labai svarbu greitai atskirti ir švelniai atskirti ląstelių tipus, todėl prieš atliekant tikrąjį eksperimentą tai reikėtų išbandyti (žr. aukščiau). Prieš įkeliant ląsteles į lustą, gyvybingumas gali būti patikimai patikrintas naudojant dažų pašalinimo metodus arba FACS rūšiavimą naudojant gyvų / negyvų ląstelių žymeklį. Dvigubų, inkapsuliuotų į tą patį lašelį, skaičius didėja (∼ 0, 8% / 1000 ląstelių), didėjant ląstelių skaičiui, ir į tai reikia atsižvelgti. Neseniai Allesas ir kolegos [9] pranešė apie metanolio fiksavimo metodą, skirtą vienos ląstelės transkripto profiliavimui naudojant mikrofluidikus. Šis metodas užtikrina transkripto savybių išsaugojimą ir yra ypač naudingas dirbant su retais klinikiniais mėginiais arba laiko trukmės mėginiais, kai apdorojimas turi vykti tuo pačiu metu.


Vienaląstės RNR-Seq paėmimo galimybės

Atsižvelgiant į laiką, biudžetą ar patirtį, naujų scRNA-Seq analizių kūrimas ir atlikimas, sprendžiantis tikslinį tyrimo klausimą, ne visada gali būti pasirinkimas. Tačiau jau yra daug atviros prieigos eksperimentinių duomenų rinkinių įvairiuose duomenų tobulinimo etapuose. Vienas iš svarbių pavyzdžių yra Single Cell Expression Atlas, kuris šiuo metu kataloguoja daugiau nei 150 scRNA-Seq eksperimentų įvairiuose audiniuose ir rūšyse ir leidžia tiesiogiai atsisiųsti eksperimentinius duomenis, atstovaujančius daugiau nei 2 milijonams ląstelių. Kiti, labiau tikslingi, ištekliai taip pat gali būti išgauti aukštos kokybės išraiškos duomenims, pavyzdžiui, Alleno smegenų atlasui.

Iki šiol atlikta daugiau nei 850 vienaląsčių RNR-seq eksperimentų, todėl galimybės rasti jūsų tyrimui svarbių duomenų yra reikšmingos. Be atskirų viešųjų duomenų rinkinių analizės, atvirai prieinami duomenys taip pat gali būti analizuojami kartu su jūsų duomenimis, patvirtinant arba papildant išvadas.

Planuojant scRNA-Seq projektą, svarbu žinoti apie turimus įrankius ir susijusius atviros prieigos duomenis, taip pat apie naudojamos vienos ląstelės platformos galimybes ir apribojimus. Padėti jums planuoti eksperimentą ir pritaikyti bioinformatikos darbo eigą pagal jūsų poreikius yra esminė „Genevia Technologies“ bioinformatikos kaip paslaugos dalis.

Skaitykite daugiau apie mūsų teikiamas transkripto analizes arba palikite mums žinutę žemiau, jei norite su mumis aptarti savo vieno langelio planus!


Žiūrėti video įrašą: Single Cell RNA-Seq: full workflow in R public data to classified UMAP in 30 mins (Gegužė 2022).