Informacija

Kiek kartų galime paleisti Pleurotus ostreatus / Pearl Oyster grybieną?

Kiek kartų galime paleisti Pleurotus ostreatus / Pearl Oyster grybieną?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Galiu sėkmingai užsiauginti grybelį ant panaudotų kavos tirščių. Ir grybiena sėkmingai derina vieną/du kartus ant to paties substrato. Klonuoju paėmęs grybieną iš esamos (kuris šiuo metu duoda vaisius) ir perkeldamas į naują indelį, paleisdamas 8-10 dienų, naudoju naujoje dėžutėje, kad būtų galima duoti vaisių kitai kartai.

Tai, ką aš auginu, yra 4-oji karta (turiu omenyje perdavimo ciklą).

Kadangi esu naujokas, atlikau tam tikrus tyrimus ir pradėjau nuo pagrindinio spawns (gavau jį iš vyriausybės grybų laboratorijų). Bet aš negaliu suprasti vieno dalyko. Ar galima klonuoti naudojant grybieną, ar man reikia klonuoti sporas, ar retkarčiais atlikti pagrindinius ikrus, ar gerai tęsti iki n-osios kartos ir toliau valgyti vaisius.

Ar mano klonavimas turi rimtų problemų?


Parduodamas grybų ikras – pirkite grybų ikrą dabar ir sutaupykite

Jei ieškote parduodamų grybų ikrų, atėjote ten, kur reikia! Turime austrių, šitakių, liūtų karčių ikrų ir dar daugiau. Čia, Fungi Ally, patys gaminame grybų ikrelį ir parduodame jį pasaulinei bendruomenei. Žemiau pateikiame įvairios informacijos tiems, kurie dabar nori įsigyti grybų ikrų.

Parduodamas grybų ikras — pjuvenų ikras

Ar jūs kada nors auginote grybus iš pjuvenų neršto? Jei taip, tikriausiai jau žinote, kad pjuvenos yra puikus substratas grybams auginti, nes kietmedžio dalelės yra neįtikėtinai mažos, todėl galima daug skiepyti. Savo ruožtu tai leidžia grybų grybienai lengvai įaugti į substratą. Daugiau inokuliacijos taškų grybienai augti lemia greitesnę grybienos kolonizaciją. Kuo greičiau grybiena gali kolonizuoti substratą, tuo didesnė tikimybė, kad susidarys grybiena be teršalų. Kuo ilgiau užtrunka grybelio kolonizacija, tuo didesnė tikimybė, kad užteršimas įvyks.

Atkreipkite dėmesį, kad visi mūsų ikrai yra auginami sterilioje laboratorijoje ir nuosekliai gaminami ištisus metus, todėl jums garantuojamas šviežiausias ir švariausias ikrelis. Jei norite sumažinti užteršimo tikimybę augant ant rąstų, totemų ar medžio drožlių, pjuvenų ikrelis kaip tik jums. Šiuo metu parduodame pjuvenų ikrus 5 1/2 svaro maišuose, skirtus visoms šioms prekėms:

  • Šitakių nerštas
  • Mėlynųjų austrių grybų nerštas
  • Geltonųjų austrių grybų ikrai
  • Rožinis austrių grybų ikrelis
  • Vyno kepurės nerštas
  • Liūto karčių nerštas

Pirkite pjuvenų ikrų maišus dabar!

Parduodamas grybų ikrelis — Grūdų ikrelis

  • Šitake grybas LE 46
  • Šitake grybas LE 3782
  • Mėlynųjų austrių grybų nerštas 3015
  • Geltonųjų austrių grybų ikrelis AM1
  • Rožinis austrių grybų ikrelis
  • Liūto karčių grybas
  • Maitake grybas
  • Reishi grybas
  • Kaštonų grybas

Jei pirmą kartą naudojate grūdų ikrus, pabandykite pradėti nuo shiitake LE 46 arba mėlynosios austrės 3015. Mėlynųjų austrių grybų ikrai yra puikus pasirinkimas pradedantiesiems, nes juos gana lengva auginti ir gali būti gausu. Jie taip pat yra gražūs grybai. Šitake LE 46 yra žinomas dėl greito grybienos kolonizavimo ant substrato, o ši atmaina duoda įspūdingą derlių. „Shiitake LE 46“ yra daugelio komercinių grybų augintojų darbo arkliukas, todėl būtinai išbandykite, net jei grybaujate kaip hobis.

Parduodamas grybų ikras – Plug Spawn

  • Šitake grybai
  • Mėlynųjų austrių grybų nerštas
  • Geltonųjų austrių grybų ikrai
  • Maitake grybai
  • Liūto karčių grybai

Įsigykite kištukų kaiščius dabar!

Mūsų parduodamas grybų ikras padės jums pradėti auginti skanius grybus namuose ar savo sode. Atminkite, kad grybai yra puikus pasirinkimas užsiauginti maistą už prieinamą kainą.

Ar turite artimųjų, kurie nori nusipirkti ikrų? Perduokite jiems šį puslapį, kad jie taip pat gautų mūsų aukštos kokybės, be teršalų pagamintą ikrą! Jei turite klausimų prieš perkant grybų ikrus, susisiekite su mumis.


Įvadas

Dauguma auginamų grybų rūšių priklauso prieglaudai Basidiomycota, nors kai kurie Ascomycota pavyzdžiui, genčių nariai Morchella arba Gumbai taip pat buvo sėkmingai auginami ir komerciškai naudojami (Rubini et al. 2014 Liu et al. 2017). Skirtingai nuo augalų, grybai yra heterotrofiniai organizmai, kuriems reikia išorinių maistinių medžiagų, kad augtų vegetatyvinis grybiena (hifa tinklas), tiekia maistines medžiagas bazidiomų augimui (dauginimosi stadija) (Taylor ir Ellison 2010). Grybai gamina daugybę fermentų, įskaitant ligniną skaidančius fermentus (lakazes, lignino peroksidazes, mangano peroksidazes, arilo alkoholio oksidazę, arilalkoholio dehidrogenazę arba chinono reduktazę), hemiceliuliozę ir celiuliozę skaidančius fermentus (ksilazazę arba celiuliozę skatinančius fermentus) lignoceliuliozės substratų irimą (Sánchez 2009 Kabel ir kt. 2017 Vos ir kt. 2017). Be to, norint vystytis normaliai medžiagų apykaitai ir tinkamai augti, grybams reikalingas deguonis ir specifinis pH. C ir N yra dvi pagrindinės makroelementai, kurių grybams reikia struktūriniams ir energijos poreikiams tenkinti P, K ir Mg taip pat laikomi grybų makroelementais, be to, atrodo, kad reikalingi mikroelementai, tokie kaip Fe, Se, Zn, Mn, Cu ir Mo. įvairioms funkcijoms (Chang ir Miles 2004).

Pradinė grybų gamybos fazė susideda iš kieto fermentacijos proceso. Nuo neršto vegetatyvinis grybiena auga kontroliuojamoje aplinkoje ir aseptinėmis sąlygomis, kad kolonizuotų substrato masę prieš sukeldama vaisių (Zervakis ir Koutrotsios 2017). Yra dvi pagrindinės grybų auginimui naudojamų substratų gamybos formulės, kurios buvo optimizuotos atsižvelgiant į rūšį. Abu yra gaunami iš šalutinių žemės ūkio produktų, tokių kaip javų šiaudai, augalų pluoštas / lukštas, mėšlas arba pjuvenos:

Kompostuotos medžiagos, gautos fermentuojant ir pasterizuojant (Pardo et al. 2017 Kabel et al. 2017 Vos et al. 2017), skirtos auginti Agaricus bisporus (Lange) Imbachas (AB) arba A. subrufescens Peckas (Pardo-Giménez ir kt., 2014 m. Pardo ir kt., 2017 m.), Pleurotus ostreatus (Jacq: bulvytės) (PO), P. sajor-caju (kun.) Dainininkas ar P. cistidiosus GERAI. Malūnas. (Chang ir Miles 2004 Sánchez 2010).

Nekompostuotos medžiagos, kurių pagrindinės sudedamosios dalys yra įvairių šalutinių žemės ūkio produktų mišinys, o po to substratas sterilizuojamas garais prieš sėjant grybieną. Tam tikros komercinės rūšys gaminamos naudojant tokį substratą, įskaitant Lentinula edodes (Berk.) Pegleris (LE), Auricularia sp., Flammulina velutipes (Curtis) Dainininkė, Pleurotus eryngii (DC.: Fr.) Quel., Agrocybe aegerita (V. Brig.) Dainininkas, Volvariella volvacea (Bull. Ex Fr.) arba Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigel (Chang ir Miles 2004 Estrada ir kt. 2009 Liang ir kt. 2016 Xie ir kt. 2017 Kleofas ir kt. 2014 Yamanaka 2017).

Kai kurios auginamos rūšys, pavyzdžiui, visame pasaulyje auginami baltieji grybai (A. bisporus).

Grybų papildymas suprantamas kaip ūkininkavimo būdas, pagrįstas fiziniu mitybos pakaitalų įdėjimu į kompostą, kompostavimo proceso metu, žaliavų mišiniu, neršto ar lukšto metu (Estrada ir kt., 2009 Pardo-Giménez ir kt., 2012a, 2016). Praktika papildyti kompostą grybų auginimui neršimo ar apvalkalo metu, siekiant maksimaliai padidinti pasėlių derlių, atsirado septintajame dešimtmetyje (Schisler ir Sinden 1962 Sinden ir Schisler 1962 Lemke 1963) ir yra plačiai pripažinta ir priimta, tačiau jo naudojimas gali būti ribojamas. kai kuriuose sektoriuose dėl techninių ir ekonominių veiksnių. Svarbūs aspektai, į kuriuos reikia atsižvelgti, yra, viena vertus, reikalingų maistinių medžiagų rūšys ir tinkamiausias jų panaudojimo laikas, nepamirštant, kita vertus, ekonomines sąnaudas ir pelną (Randle 1985).

Pastaruoju metu buvo aprašyta, kad galimi grybų augimą skatinantys (MGP) grybai ir bakterijos skatina grybienos augimą ir skatina grybų vaisingumą, kartu sudarydami azoto ar vitaminų rezervuarus (Zarenejad ir kt., 2012 Kertesz ir Thai, 2018). Todėl MGP yra papildoma papildo forma, kuri gali būti tiekiama atskirai arba kartu su maisto papildais, siekiant padidinti pasėlių derlių.

Šioje mini apžvalgoje apibendrinami naujausi grybų auginimo substratų papildymo pasiekimai ir siekiama išsiaiškinti kai kuriuos agronominius aspektus, susijusius su šiuo besiplečiančiu pasėliu (Zhang ir kt., 2014).


Medžio pelenų pasterizavimas

Aš nuolat ieškau ko nors tikslaus medžio pelenų pasterizavimo ir vis randu tuščią. Daug paminėjimų apie tai, bet viskas, ką galiu rasti, trumpai paminima ir paaiškina hidratuotų kalkių pasterizavimą.

Taigi, ar kas nors tai padarė sėkmingai? Koks buvo tavo tek, jei taip? Aš turiu pelenų ir šiaudų, bet tikrai neradau nieko, kas iš tikrųjų pasakytų, kaip juos sujungti kokiais santykiais.

#2 coorsmikey

Štai „Aloha Medicinals“ leidinys. Pereikite į 39 puslapį ir galite naudoti koeficientus, kad padarytumėte mažesnius kiekius. Daug kitų įdomių dalykų, pavyzdžiui, šalta fermentacija. grybavimas.pdf 3,69 MB 1950 atsisiuntimų

Nebrangūs / žemų technologijų metodai grybams auginti

Grybų auginimas yra ir mokslas, ir menas, todėl daugelis žmonių sukūrė savo unikalius grybų auginimo metodus. Kai kurie iš šių metodų yra geri, kai kurie reikalauja daug darbo, kitais būdais gaunami didelio tūrio arba ypatingos kokybės vaisiai. Per daugelį metų, kai dirbame ir konsultavome šioje srityje, matėme daugybę metodų, pradedant nuo auginimo žemėje Meksikoje ir Afrikoje iki aukščiausios technologijos autoklavu pagrįsto metodo, kurį naudoja tarptautiniai agroverslo gigantai. Daugelis šiandien išleistų knygų prasideda nuo prielaidos, kad turite daug pinigų, kad nusipirktumėte brangiausius katilus, maišelius ir autoklavus. Mūsų patirtis rodo, kad taip paprastai nėra, ypač kai tik pradedate veiklą. Taigi norėtume pasiūlyti savo patirties pranašumus ir parodyti keletą žemųjų technologijų metodų, kurie veikia gerai ir kuriuos galima įgyvendinti už mažą kainą.

Bet kurio grybų augintojo tikslas turėtų būti: Užauginti didelį kiekį grybų už mažą kainą per pagrįstą laiką be per daug atliekų, užteršimo ar išlaidų naujai įrangai. Kiti tikslai turėtų būti pakankamai paprasta sistema, kad galėtumėte lengvai išmokyti įprastus ūkio darbininkus atlikti kiekvieną proceso žingsnį. Kadangi dauguma žemės ūkio darbuotojų nėra koledžo išsilavinimą turintys mikrobiologai, praktiškiau būtų kuo labiau supaprastinti sistemą, kad kiekvienas galėtų būti apmokytas atlikti darbą, o ne priklausyti nuo apmokytų darbuotojų, kurie jau žino visas susijusias sąvokas.

Apibrėžkime tikslus šiek tiek plačiau.

Didelis derlingumas: kiekvieną įprastą grybų atmainą galima auginti 100% ar didesniu biologiniu efektyvumu, o iš tikrųjų turi būti, kad projektas būtų sėkmingas. Dažnai auginant austres galima pasiekti 200 % BE. Netgi naudojant „Shiitake“, „Lions Mane“ ar „Maitake“ 100% BE visiškai įmanoma pasiekti, skiriant net minimalų dėmesį jūsų procesui. Taigi, kas tai yra BE ir kaip jis matuojamas?

Biologinis efektyvumas, sutrumpintai BE, yra svarbiausias ir pats svarbiausias iš visų grybų auginimo matavimų. BE yra sauso svorio substrato palyginimas su šviežiai nuskintais grybais. Kitaip tariant, mes visi perkame savo substratą sausą, pavyzdžiui, pjuvenas. Jei perkate 1000 svarų sausų pjuvenų ir galite surinkti 1000 svarų šviežių grybų, tai yra 100% BE. Jei pradėsite nuo 1000 svarų sausų šiaudų ir nuimsite 1500 svarų šviežių austrių grybų, tai yra 150%. Visada atminkite, kad 100% BE yra minimalus priimtinas grybų derlius, kad jūsų ūkis būtų komerciškai sėkmingas. Kaip mes galime pradėti nuo 1000 svarų substrato ir baigti su 1500 svarų grybų? Atminkite, kad grybai dažniausiai yra vanduo, o jo dedama į substratą. Taigi tai, ką nuimate, yra nuo 50% iki 90% vandens. Būtinai išmatuokite savo maišelių svorį ir išmatuokite nuimtų grybų svorį, nes be jūsų proceso BE skaičių neįmanoma optimizuoti produkcijos ir tiksliai numatyti derliaus iš anksto.

BE pokyčių pavyzdžiai būtų dviejų skirtingų austrių grybų štamų palyginimai: jie abu yra Pleurotus ostreatus, bet galbūt vienas kilęs iš didelio aukščio, o kitas – iš atogrąžų miško. Jūsų ūkyje jie neabejotinai veiks skirtingai, o kai auginsite juos greta, jie visiškai ir be jokios abejonės turės skirtingą BE. Taigi, kaip žinoti, kuri atmaina yra geriausia jūsų operacijai? Yra tik vienas būdas sužinoti – atlikti bandymus ir pamatyti, kuris iš jų veikia geriau. Padermė, kuri PUIKIAI tinka kitam augintojui, gali siaubingai pasitarnauti jums. Turite skirtingą klimatą, skirtingus sterilizavimo būdus, skirtingą substratą, skirtingą ikrą, o svarbiausia, kad jūsų ūkyje yra skirtingų konkurentų organizmų. Į šiuos dalykus negalima atsižvelgti iš anksto, tik išbandymai jūsų ūkyje suteiks jums realius BE skaičius. Tačiau VISI įprastai auginami grybai suteiks jums BENDŽIAU 100% BŪTI, taigi, jei to negaunate iš operacijos, vadinasi, kažkas negerai.

Kyla klausimas „kokį grybą auginti? Dauguma žmonių, užsiimančių šia prekyba, nori pradėti auginti šitake. Kaip ir dauguma vairavimo besimokančių vaikų nori naujo Ferrari. Galbūt jiems praktiškiau išmokti vairuoti seną šeimyninį Fordą ir pakilus įgūdžių lygiui (ir pajamoms!) pereiti prie lenktyninio automobilio. Tas pats pasakytina ir apie grybų auginimą. Daug lengviau (ir pigiau!) pradėti auginti austrių grybus, o vėliau pereiti prie kitų rūšių, augant jūsų įgūdžių lygiui ir turimai įrangai. Taigi likusi šios diskusijos dalis daugiausia bus skirta austrių grybams, nors bendrosios sąvokos galioja ir kitoms rūšims.

Remiantis kai kurių šiandien prieinamų knygų mokymais, daugelis žmonių pradeda auginti grybus mirkydami šiaudus karštame vandenyje, kad pasterizuotų. Ši sistema veikia, nors dėl daugelio priežasčių ji yra mūsų mažiausiai mėgstama iš visų pasterizavimo metodų, o tai susiję su pagrindiniais „Didelio grybų kiekio užauginimo už mažą kainą“ tikslus. Karšto vandens metodas yra sudėtingas, brangus ir pernelyg dažnai nesukuria 100%+ BE. Pirmenybę teikiame šalto pasterizavimo būdams, nes esame tingūs, pigūs ir nemėgstame grumtis dideliais karštų šlapių šiaudų ryšuliais. O taip, ar aš minėjau, kad tai visada duoda didesnį BE?

Šaltojo pasterizavimo būdai:

Prieš sėjant ikrą, substratą būtina pasterizuoti arba sterilizuoti. Sprendimas dėl pasterizavimo eilių sterilizavimo priklauso ir nuo jūsų substrato, ir nuo auginamos rūšies. Apskritai, jei turite mažai maistinių medžiagų, pavyzdžiui, popierių, kartoną ar šiaudus, pasterizavimas yra pakankamas ir daug pigesnis nei tikras sterilizavimas. Pjuvenų maistinė vertė skiriasi ir kartais gali gerai veikti atliekant paprastą pasterizavimo veiksmą, o kartais jas reikia sterilizuoti. Tiems, kurie sako, kad šitake negalima auginti ant pasterizuotų šiaudų, raginu pažiūrėti šį trumpą San Diego augintojo, kuris gana sėkmingai šitake augina ant šiaudų, užrašą. Kadangi šiaudai geriausiai tinka austrių grybams, aprašysiu procesą ant šiaudų:

Norėdami atlikti šalto pasterizavimo veiksmą, turėsite pamirkyti šiaudus tirpale, kuris sudrėkintų šiaudus ir sunaikins daugumą esamų vienaląsčių organizmų. Tam galite naudoti daugybę dalykų, tačiau geriausia yra hidratuotos kalkės. Tiksli koncentracija nėra kritinė, tik didelė dviguba sauja 55 galonų vandens būgne. Tada panardinkite šiaudus, pasverkite, kad neplauktų, ir palaukite 12–24 valandas. Nebereikia, nes nenorite sukurti krūvos kalkėms atsparių organizmų, 16–18 val. Po mirkymo nusausinkite vandens perteklių, supilkite šiaudus ir pasėkite juos savo ikre. Puikiai veikia, tipinis BE yra nuo 150% iki 175%, o vaisiakūnių kokybė geresnė nei naudojant karšto vandens metodą.

Štai patarimai, kokias kalkes naudoti:

Kalkių rūšys ir naudojimas grybų auginimui

Terminas „Lime“ yra plačiai vartojamas anglų kalboje, o tas pats terminas dažnai reiškia skirtingas medžiagas. Taigi įvairių kalkių rūšių ir jų naudojimo paaiškinimas yra tinkamas:

1) Kalcio karbonato kalkės – tai kalkakmenis, marmuras, kreida, kiaušinio lukštas, koralas arba austrės lukštas. Ši medžiaga naudojama kaip pH buferis substrate ir terpėje. Šios rūšies kalkės nesukelia didelio pH pokyčio, bet veikia kaip buferis, ty palaiko pH pastovų, kai grybai auga. Tai yra pageidautinas substrato pakeitimas, siekiant užtikrinti, kad substratas per augimo ciklą netaptų per rūgštus. ŠIO RŪŠIO KALKĖS NETINKS PASTIRUZINTI!

2) Kalcio hidroksidas arba hidratuotos kalkės, taip pat žinomos kaip negesintos kalkės. Jis naudojamas pH didinimui ir pirmiausia naudojamas substrato pasterizavimui arba sterilizavimui. Daugelis grybų blogai auga, jei į substratą dedama šios rūšies kalkių, todėl NEnaudojama substrato koregavimui, naudojama tik pasterizavimui, naudojant greito pH pasikeitimo mechanizmą. Į statinę vandens įpylus apie 3 svarus hidratuotų kalkių (didelę dvigubą saują), gaunamas aukštas pH, maždaug 12–13 pH, kurio pakanka šiaudams pasterizuoti per maždaug 4–6 valandas.

Hidratuotos kalkės gaminamos deginant kalkakmenį (kalcio karbonatą), kuris paverčia jį kalcio hidroksidu. Pradinė medžiaga gali būti bet kuris kalcio karbonato šaltinis arba žaliavos šaltinis gali būti Dolomite Lime, kuriame yra daug magnio. Kai hidratuotos kalkės gaminamos iš dolomito, jos dažnai vadinamos „statybinėmis kalkėmis“ ir naudojamos betono pramonėje. Didelio magnio kalkės arba statybinės kalkės NEVEIKS grybams auginti. Kai perkate hidratuotas kalkes substrato pasterizavimui, įsitikinkite, kad tai yra didelio kalcio kalkių (90% ar daugiau kalcio – paprastai apie 95–96% kalcio).Jei ant maišelio parašyta, kad daug magnio arba magnio procentas viršija 10%, jo nenaudokite. Didelis magnio kiekis stabdys grybų augimą.

Tinkama kalkių rūšis šiaudams pasterizuoti


Yra ir kita medžiaga, dažnai vadinama žemės ūkio kalkėmis, dolomitinėmis kalkėmis arba tiesiog dolomitu. Jame yra daug magnio ir NEVEIKS grybams auginti.

Gipsas nėra kalkės, tai yra kalcio sulfatas ir naudojamas kitiems tikslams. Jis reikšmingai nekeičia pH ir neveikia kaip buferis. Jis naudojamas fizinėms substrato savybėms keisti. Jis taip pat prideda šiek tiek metabolinės sieros į substratą.

Muilas taip pat yra gera pasterizavimo priemonė. Koks muilas? Tiks beveik bet kas, mums patinka pigiausias parduotuvėje parduodamas indų ploviklis arba skalbimo milteliai, tokie kaip „Tide“, arba beveik bet koks muilas. Paruoškite gerą stiprų muilo tirpalą, mirkykite 12–24 valandas, nuleiskite vandens perteklių ir pasėkite. Austrių grybai šiaudus ir muilą naudoja kaip maisto šaltinį, o grybuose nelieka muilo likučių, visa tai biologiškai paverčiama grybų audiniu.

Dar viena gera pasterizavimo priemonė – medžio pelenai. Veikia taip pat kaip kalkės ar muilas, o BE yra šiek tiek aukštesnės nei bet kuris kitas. Norėdami gauti PDF pristatymą apie pelenų pasterizavimo metodą, spustelėkite čia [PDF]

Tikiuosi, kad šis mažas rašymas padės suprasti kai kurias jūsų galimybes. Pažiūrėkite į šias austrių ūkio nuotraukas, dėl kurių mes konsultavomės. Šiame ūkyje naudojama tik kalkių pasterizacija, jose nuolat yra 150 % BE, nėra užteršimo, o gamybos pajėgumas yra 5000 svarų per mėnesį. Visa tai be šilumos – tik kalkių mirkymas. Pigu, efektyvu ir pelninga – atitinka visus aukščiau iškeltus tikslus.

Norėdami gauti daugiau informacijos šia tema, skaitykite straipsnį http://www.alohaecow. ture-part1.html

Džiaugiamės galėdami pasiūlyti konsultavimo paslaugas, kurios padės jums pradėti savo ūkį arba sugrąžinti į vėžes telefonu arba vietoje. Jei jus domina ši paslauga, skambinkite mums numeriu (775) 886-6300 arba el. paštu [email protected]

Kalkių pasterizuotų šiaudų ūkis:

Pažvelkite į Elmalini miniatiūrinę austrių atmainą, sukurtą unikaliu metodu, labai paklausų grybą! Tai Pleurotus ulmarius guobos A atmaina.

Redagavo coorsmikey, 2018 m. vasario 8 d. - 21:42.

# 3 Ferather

Gali tekti pereiti prie pelenų, o ne kalkių, ačiū už nuorodą coorsmikey.

#4 scott_1971_h

Ačiū ir iš manęs, mikey, skaitau.

# 5 Misterbill

Štai „Aloha Medicinals“ leidinys. Pereikite į 39 puslapį ir galite naudoti koeficientus, kad padarytumėte mažesnius kiekius. Daug kitų įdomių dalykų, pavyzdžiui, šalta fermentacija. grybavimas.pdf

žemųjų technologijų augimas

Mačiau šį, bet jame be pelenų taip pat rekomenduojama naudoti hidratuotas kalkes. Man buvo įdomu, ar tai galima padaryti tik su pelenais. Tame puslapyje, kurį paminėjote, parašyta 1,25 kg hidratuotų kalkių 4,24 kg sijotų medžio pelenų, todėl vis dar nesu tikras, ar tai galima padaryti, ar tai daroma naudojant vien pelenus.

#6 coorsmikey

Redagavo coorsmikey, 2018 m. vasario 8 d. - 21:30.

# 7 Misterbill

Štai „Aloha Medicinals“ leidinys. Pereikite į 39 puslapį ir galite naudoti koeficientus, kad padarytumėte mažesnius kiekius. Daug kitų įdomių dalykų, pavyzdžiui, šalta fermentacija. grybavimas.pdf

žemųjų technologijų augimas

Nebrangūs / žemų technologijų metodai grybams auginti

Grybų auginimas yra ir mokslas, ir menas, todėl daugelis žmonių sukūrė savo unikalius grybų auginimo metodus. Kai kurie iš šių metodų yra geri, kai kurie reikalauja daug darbo, kitais būdais gaunami didelio tūrio arba ypatingos kokybės vaisiai. Per daugelį metų, kai dirbame ir konsultavome šioje srityje, matėme daugybę metodų, pradedant nuo auginimo žemėje Meksikoje ir Afrikoje iki aukščiausios technologijos autoklavu pagrįsto metodo, kurį naudoja tarptautiniai agroverslo gigantai. Daugelis šiandien išleistų knygų prasideda nuo prielaidos, kad turite daug pinigų, kad nusipirktumėte brangiausius katilus, maišelius ir autoklavus. Mūsų patirtis rodo, kad taip paprastai nėra, ypač kai tik pradedate veiklą. Taigi norėtume pasiūlyti savo patirties pranašumus ir parodyti keletą žemųjų technologijų metodų, kurie veikia gerai ir kuriuos galima įgyvendinti už mažą kainą.

Bet kurio grybų augintojo tikslas turėtų būti: Užauginti didelį kiekį grybų už mažą kainą per pagrįstą laiką be per daug atliekų, užteršimo ar išlaidų naujai įrangai. Kiti tikslai turėtų būti pakankamai paprasta sistema, kad galėtumėte lengvai išmokyti įprastus ūkio darbininkus atlikti kiekvieną proceso žingsnį. Kadangi dauguma žemės ūkio darbuotojų nėra koledžo išsilavinimą turintys mikrobiologai, praktiškiau būtų kuo labiau supaprastinti sistemą, kad kiekvienas galėtų būti apmokytas atlikti darbą, o ne priklausyti nuo apmokytų darbuotojų, kurie jau žino visas susijusias sąvokas.

Apibrėžkime tikslus šiek tiek plačiau.

Didelis derlingumas: kiekvieną įprastą grybų atmainą galima auginti 100% ar didesniu biologiniu efektyvumu, o iš tikrųjų turi būti, kad projektas būtų sėkmingas. Dažnai auginant austres galima pasiekti 200 % BE. Netgi naudojant „Shiitake“, „Lions Mane“ ar „Maitake“ 100% BE visiškai įmanoma pasiekti, skiriant net minimalų dėmesį jūsų procesui. Taigi, kas tai yra BE ir kaip jis matuojamas?

Biologinis efektyvumas, sutrumpintai BE, yra svarbiausias ir pats svarbiausias iš visų grybų auginimo matavimų. BE yra sauso svorio substrato palyginimas su šviežiai nuskintais grybais. Kitaip tariant, mes visi perkame savo substratą sausą, pavyzdžiui, pjuvenas. Jei perkate 1000 svarų sausų pjuvenų ir galite surinkti 1000 svarų šviežių grybų, tai yra 100% BE. Jei pradėsite nuo 1000 svarų sausų šiaudų ir nuimsite 1500 svarų šviežių austrių grybų, tai yra 150%. Visada atminkite, kad 100% BE yra minimalus priimtinas grybų derlius, kad jūsų ūkis būtų komerciškai sėkmingas. Kaip mes galime pradėti nuo 1000 svarų substrato ir baigti su 1500 svarų grybų? Atminkite, kad grybai dažniausiai yra vanduo, o jo dedama į substratą. Taigi tai, ką nuimate, yra nuo 50% iki 90% vandens. Būtinai išmatuokite savo maišelių svorį ir išmatuokite nuimtų grybų svorį, nes be jūsų proceso BE skaičių neįmanoma optimizuoti produkcijos ir tiksliai numatyti derliaus iš anksto.

BE pokyčių pavyzdžiai būtų dviejų skirtingų austrių grybų štamų palyginimai: jie abu yra Pleurotus ostreatus, bet galbūt vienas kilęs iš didelio aukščio, o kitas – iš atogrąžų miško. Jūsų ūkyje jie neabejotinai veiks skirtingai, o kai auginsite juos greta, jie visiškai ir be jokios abejonės turės skirtingą BE. Taigi, kaip žinoti, kuri atmaina yra geriausia jūsų operacijai? Yra tik vienas būdas sužinoti – atlikti bandymus ir pamatyti, kuris iš jų veikia geriau. Padermė, kuri PUIKIAI tinka kitam augintojui, gali siaubingai pasitarnauti jums. Turite skirtingą klimatą, skirtingus sterilizavimo būdus, skirtingą substratą, skirtingą ikrą, o svarbiausia, kad jūsų ūkyje yra skirtingų konkurentų organizmų. Į šiuos dalykus negalima atsižvelgti iš anksto, tik išbandymai jūsų ūkyje suteiks jums realius BE skaičius. Tačiau VISI įprastai auginami grybai suteiks jums BENDŽIAU 100% BŪTI, taigi, jei to negaunate iš operacijos, vadinasi, kažkas negerai.

Kyla klausimas „kokį grybą auginti? Dauguma žmonių, užsiimančių šia prekyba, nori pradėti auginti šitake. Kaip ir dauguma vairavimo besimokančių vaikų nori naujo Ferrari. Galbūt jiems praktiškiau išmokti vairuoti seną šeimyninį Fordą ir pakilus įgūdžių lygiui (ir pajamoms!) pereiti prie lenktyninio automobilio. Tas pats pasakytina ir apie grybų auginimą. Daug lengviau (ir pigiau!) pradėti auginti austrių grybus, o vėliau pereiti prie kitų rūšių, augant jūsų įgūdžių lygiui ir turimai įrangai. Taigi likusi šios diskusijos dalis daugiausia bus skirta austrių grybams, nors bendrosios sąvokos galioja ir kitoms rūšims.

Remiantis kai kurių šiandien prieinamų knygų mokymais, daugelis žmonių pradeda auginti grybus mirkydami šiaudus karštame vandenyje, kad pasterizuotų. Ši sistema veikia, nors dėl daugelio priežasčių ji yra mūsų mažiausiai mėgstama iš visų pasterizavimo metodų, o tai susiję su pagrindiniais „Didelio grybų kiekio užauginimo už mažą kainą“ tikslus. Karšto vandens metodas yra sudėtingas, brangus ir pernelyg dažnai nesukuria 100%+ BE. Pirmenybę teikiame šalto pasterizavimo būdams, nes esame tingūs, pigūs ir nemėgstame grumtis dideliais karštų šlapių šiaudų ryšuliais. O taip, ar aš minėjau, kad tai visada duoda didesnį BE?

Šaltojo pasterizavimo būdai:

Prieš sėjant ikrą, substratą būtina pasterizuoti arba sterilizuoti. Sprendimas dėl pasterizavimo eilių sterilizavimo priklauso ir nuo jūsų substrato, ir nuo auginamos rūšies. Apskritai, jei turite mažai maistinių medžiagų, pavyzdžiui, popierių, kartoną ar šiaudus, pasterizavimas yra pakankamas ir daug pigesnis nei tikras sterilizavimas. Pjuvenų maistinė vertė skiriasi ir kartais gali gerai veikti atliekant paprastą pasterizavimo veiksmą, o kartais jas reikia sterilizuoti. Tiems, kurie sako, kad šitake negalima auginti ant pasterizuotų šiaudų, raginu pažiūrėti šį trumpą San Diego augintojo, kuris gana sėkmingai šitake augina ant šiaudų, užrašą. Kadangi šiaudai geriausiai tinka austrių grybams, aprašysiu procesą ant šiaudų:

Norėdami atlikti šalto pasterizavimo veiksmą, turėsite pamirkyti šiaudus tirpale, kuris sudrėkintų šiaudus ir sunaikins daugumą esamų vienaląsčių organizmų. Tam galite naudoti daugybę dalykų, tačiau geriausia yra hidratuotos kalkės. Tiksli koncentracija nėra kritinė, tik didelė dviguba sauja 55 galonų vandens būgne. Tada panardinkite šiaudus, pasverkite, kad neplauktų, ir palaukite 12–24 valandas. Nebereikia, nes nenorite sukurti krūvos kalkėms atsparių organizmų, 16–18 val. Po mirkymo nusausinkite vandens perteklių, supilkite šiaudus ir pasėkite juos savo ikre. Puikiai veikia, tipinis BE yra nuo 150% iki 175%, o vaisiakūnių kokybė geresnė nei naudojant karšto vandens metodą.

Štai patarimai, kokias kalkes naudoti:

Kalkių rūšys ir naudojimas grybų auginimui

Terminas „Lime“ yra plačiai vartojamas anglų kalboje, o tas pats terminas dažnai reiškia skirtingas medžiagas. Taigi įvairių kalkių rūšių ir jų naudojimo paaiškinimas yra tinkamas:

1) Kalcio karbonato kalkės – tai kalkakmenis, marmuras, kreida, kiaušinio lukštas, koralas arba austrės lukštas. Ši medžiaga naudojama kaip pH buferis substrate ir terpėje. Šios rūšies kalkės nesukelia didelio pH pokyčio, bet veikia kaip buferis, ty palaiko pH pastovų, kai grybai auga. Tai yra pageidautinas substrato pakeitimas, siekiant užtikrinti, kad substratas per augimo ciklą netaptų per rūgštus. ŠIO RŪŠIO KALKĖS NETINKS PASTIRUZINTI!

2) Kalcio hidroksidas arba hidratuotos kalkės, taip pat žinomos kaip negesintos kalkės. Jis naudojamas pH didinimui ir pirmiausia naudojamas substrato pasterizavimui arba sterilizavimui. Daugelis grybų blogai auga, jei į substratą dedama šios rūšies kalkių, todėl NEnaudojama substrato koregavimui, naudojama tik pasterizavimui, naudojant greito pH pasikeitimo mechanizmą. Į statinę vandens įpylus apie 3 svarus hidratuotų kalkių (didelę dvigubą saują), gaunamas aukštas pH, maždaug 12–13 pH, kurio pakanka šiaudams pasterizuoti per maždaug 4–6 valandas.

Hidratuotos kalkės gaminamos deginant kalkakmenį (kalcio karbonatą), kuris paverčia jį kalcio hidroksidu. Pradinė medžiaga gali būti bet kuris kalcio karbonato šaltinis arba žaliavos šaltinis gali būti Dolomite Lime, kuriame yra daug magnio. Kai hidratuotos kalkės gaminamos iš dolomito, jos dažnai vadinamos „statybinėmis kalkėmis“ ir naudojamos betono pramonėje. Didelio magnio kalkės arba statybinės kalkės NEVEIKS grybams auginti. Kai perkate hidratuotas kalkes substrato pasterizavimui, įsitikinkite, kad tai yra didelio kalcio kalkių (90% ar daugiau kalcio – paprastai apie 95–96% kalcio). Jei ant maišelio parašyta, kad daug magnio arba magnio procentas viršija 10%, jo nenaudokite. Didelis magnio kiekis stabdys grybų augimą.

Tinkama kalkių rūšis šiaudams pasterizuoti


Yra ir kita medžiaga, dažnai vadinama žemės ūkio kalkėmis, dolomitinėmis kalkėmis arba tiesiog dolomitu. Jame yra daug magnio ir NEVEIKS grybams auginti.

Gipsas nėra kalkės, tai yra kalcio sulfatas ir naudojamas kitiems tikslams. Jis reikšmingai nekeičia pH ir neveikia kaip buferis. Jis naudojamas fizinėms substrato savybėms keisti. Jis taip pat prideda šiek tiek metabolinės sieros į substratą.

Muilas taip pat yra gera pasterizavimo priemonė. Koks muilas? Tiks beveik bet kas, mums patinka pigiausias parduotuvėje parduodamas indų ploviklis arba skalbimo milteliai, tokie kaip „Tide“, arba beveik bet koks muilas. Paruoškite gerą stiprų muilo tirpalą, mirkykite 12–24 valandas, nuleiskite vandens perteklių ir pasėkite. Austrių grybai šiaudus ir muilą naudoja kaip maisto šaltinį, o grybuose nelieka muilo likučių, visa tai biologiškai paverčiama grybų audiniu.

Dar viena gera pasterizavimo priemonė – medžio pelenai. Veikia taip pat kaip kalkės ar muilas, o BE yra šiek tiek aukštesnės nei bet kuris kitas. Norėdami gauti PDF pristatymą apie pelenų pasterizavimo metodą, spustelėkite čia [PDF]

Tikiuosi, kad šis mažas rašymas padės suprasti kai kurias jūsų galimybes. Pažiūrėkite į šias austrių ūkio nuotraukas, dėl kurių mes konsultavomės. Šiame ūkyje naudojama tik kalkių pasterizacija, jose nuolat yra 150 % BE, nėra užteršimo, o gamybos pajėgumas yra 5000 svarų per mėnesį. Visa tai be šilumos – tik kalkių mirkymas. Pigu, efektyvu ir pelninga – atitinka visus aukščiau iškeltus tikslus.

Norėdami gauti daugiau informacijos šia tema, skaitykite straipsnį http://www.alohaecow. ture-part1.html

Džiaugiamės galėdami pasiūlyti konsultavimo paslaugas, kurios padės jums pradėti savo ūkį arba sugrąžinti į vėžes telefonu arba vietoje. Jei susidomėjote šia paslauga, skambinkite mums (775) 886-6300 arba el. paštu [email protected]m.

Kalkių pasterizuotų šiaudų ūkis:

Pažvelkite į Elmalini miniatiūrinę austrių atmainą, sukurtą unikaliu metodu, labai paklausų grybą! Tai Pleurotus ulmarius guobos A atmaina.

<script data-cfasync="false" src="https://mycotopia.net/cdn-cgi/scripts/d07b1474/cloudflare-static/email-decode.min.js"></script>

Dar kartą užsimenama apie pelenus, o po to paaiškinama apie kalkę arba apibrėžiami pelenai su kalkėmis. Tai, ko aš ieškau (jei toks yra), yra tik pelenai. Galbūt niekas nebandė arba nebandė ir tai neveikia, bet aš nemačiau nei vieno atvejo įrodymų.


Auginimas Pleurotus ostreatus ir kiti valgomieji grybai

Pleurotus ostreatus yra antras labiausiai auginamas valgomasis grybas pasaulyje po Agaricus bisporus. Jis turi ekonominių ir ekologinių vertybių bei gydomųjų savybių. Grybų kultūra pasistūmėjo į įvairovę su kitų grybų gamyba. Valgomieji grybai gali kolonizuoti ir suardyti daug įvairių lignoceliuliozės substratų ir kitų atliekų, kurios susidaro daugiausia vykdant žemės ūkio, miškų ir maisto perdirbimo pramonės veiklą. Ypač P. ostreatus reikalauja trumpesnio augimo laiko, palyginti su kitais valgomaisiais grybais. Jų auginimui naudojamas substratas nereikalauja sterilizacijos, tik pasterizavimas, kuris kainuoja pigiau. Augantys austrių grybai didelę substrato dalį paverčia vaisiakūniais, todėl padidėja pelningumas. P. ostreatus Nereikalauja mažai aplinkos kontrolės, o jų vaisiakūnius dažnai neužpuola ligos ir kenkėjai, juos galima auginti paprastai ir pigiai. Visa tai daro P. ostreatus auginimas yra puiki alternatyva grybų auginimui, palyginti su kitais grybais.

Tai prenumeruojamo turinio peržiūra, prieiga per jūsų įstaigą.


Gaukite pranešimą, kai turime jus dominančių naujienų, kursų ar įvykių.

Įvesdami savo el. pašto adresą, sutinkate gauti pranešimus iš Penn State Extension. Peržiūrėkite mūsų privatumo politiką.

Dėkojame už pateiktą informaciją!

Substrato paruošimas baltiesiems grybams

Straipsniai

Penn State vadovas komerciniams grybų augintojams

Vadovai ir leidiniai

Pensilvanijos grybų integruoto kenkėjų valdymo vadovas

Vadovai ir leidiniai

Listeria Monocytogenes naikinimas grybų pjaustymo ir pakavimo aplinkoje

Straipsniai

Grybų GAP auditas ir FSMA ištekliai

Straipsniai

Ligninai

Jean-Claude Sigoillot, . Eva Uzan-Boukhris, Botanikos tyrimų pažanga, 2012 m.

2 Arilo alkoholio oksidazė

AAO pirmą kartą buvo aptiktas Polystictus versicolor pateikė Ūkininkas ir kt. (1960). Panaši veikla buvo toliau identifikuota, išgryninta ir apibūdinta trimis Pleurotas rūšis (P. sajor-caju: Bourbonnais ir Paice, 1988 m P. eryngii: Guillenas ir kt., 1990 ir P. ostreatus: Sannia ir kt., 1991) ir in B. adusta (Muheimas ir kt., 1990). Šie fermentai labai skiriasi nuo AAO, esančių Fusarium solani (Ivahara ir kt., 1980 ), P. chrysosporium (Asada ir kt., 1995) ir nelignolitinį grybelį Penicillium simplicissimum (de Jong ir kt., 1992 ).

AAO gamina nedaug grybų rūšių, o jų fiziologinis vaidmuo iki šiol buvo sunkiai ištirtas, palyginti su kitomis grybelių oksidoreduktazėmis. AAO of P. chrysosporium pirminio metabolizmo metu susidaro daug azoto turinčiose terpėse. Šis fermentas taip pat yra vienintelis AAO, apie kurį pranešta, kad jį indukuoja arilo alkoholiai, tokie kaip vanililo alkoholis. Didžiausia AAO gamyba iki P. chrysosporium gaunamas augimo pabaigoje, kai gliukozė riboja (Asada ir kt., 1995 ). Pleurotas AAO yra nuodugniausiai ištirtos AAO. Geriausia natūralaus AAO produkcija (2500 U/L) gauta auginant P. pulmonarius terpėje, kurioje yra gliukozės ir peptonų (Varela ir kt., 2000a). AAO iš P. eryngii buvo klonuotas ir išreikštas A. nidulans. Ši heterologinė išraiška leido pagaminti 400–500 U/L, maždaug 10 kartų daugiau nei AAO. P. eryngii auginami optimaliomis sąlygomis ( Varela ir kt., 2001 ).

AAO yra flavoproteinai, kurių vienoje fermento molekulėje yra viena FAD grupė.Jie katalizuoja α- ir β-nesočiųjų aril-γ-alkoholių oksidaciją į atitinkamus aldehidus, kartu redukuodami O.2 pas H2O2 (Muheimas ir kt., 1990). Tai glikoproteinai, kurių molekulinė masė svyruoja nuo 70 iki 80 kDa. Buvo nustatyti du AAO izofermentai P. sajor-caju remiantis pI skirtumu, kurį patvirtino šių baltymų N-galinė analizė. N-galo seka P. ostreatus ir P. eryngii yra labai konservuoti ir turi konsensuso sekas Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly, būdingas dinukleotidus jungiantiems baltymams ( Wierenga ir kt., 1985 ).

Po geno, koduojančio AAO, klonavimo P. eryngii ir baltymo kristalizacija, nustatyta šio fermento trimatė struktūra. Šis AAO, matyt, yra suskirstytas į 15 spiralių ir dviejų β lakštų domenų. Šį fermentą taip pat gali stabilizuoti disulfidinis tiltas tarp cisteinų 248 ir 263 (Varela ir kt., 2000b). Kristalizacija P. pulmonarius AAO pateikė daugiau informacijos. Šio fermento N-galo regione yra β-α-β motyvas, turintis tris glicino liekanas, dalyvaujančias nekovalentiniame FAD surišime (25–60 liekanos). Glicinas 530 ir prolinas 537 gali būti įtraukti į aktyviąją vietą. Tačiau 2,8 Å skiriamoji geba nepateikė išsamesnės informacijos apie struktūrą (Varela ir kt., 2000a). FAD veikia kaip redokso centras perkeliant du vandenilio atomus ir du elektronus iš arilo alkoholio į dioksidą. Jo būdinga absorbcija esant 465 nm yra naudinga sekti baltymą gryninimo etapų metu (Varela ir kt., 2000a). AAO katalizinių pajėgumų tyrimai parodė, kad jie visi turi platų specifiškumą įvairiems metoksipakeistiems fenoliams (Bourbonnais ir Paice, 1988 Guillen ir kt., 1990 Sannia ir kt., 1991 ).

Šio fermento fiziologiniai vaidmenys buvo siejami su baltojo puvinio lignolitiniu aktyvumu ir jo gebėjimu generuoti vandenilio peroksidą redukuojančios pusinės reakcijos metu. Baltojo puvinio pagamintas vandenilio peroksidas gali dalyvauti lignino skaidyme, kaip peroksidazių kosubstratas ir (arba) nefermentinėse reakcijose, tokiose kaip Fenton reakcijos (Ander ir Marzullo, 1997). Guillén ir Evans (1994) teigė, kad nuo NADPH priklausomas AAO gali sudaryti redokso sistemą, kurioje grybelio gaminami arilo alkoholiai ir aril-aldehidai užtikrina stabilią H koncentraciją.2O2 dėl lignolitinio aktyvumo.

Marzullo ir kt. (1995) pranešė, kad veratrilo alkoholio oksidazė (arba AAO). P. ostreatus sugebėjo sumažinti dichlorfenolio ir indofenolio kiekį ir slopinti arba nereguliuoti polimerizaciją p-OH cinamono rūgštys pagal lakazes. Lignosulfonatų oksidacijos, kurią sukelia vien lakkazė arba kartu su AAO, tyrimas parodė, kad VA / AAO sistema gali užkirsti kelią lignino polimerizacijai. Tiek VA, tiek benzilo alkoholiai, išsiskiriantys auginimo terpėje, gali atlikti pagrindinį vaidmenį kaip redokso reakcijų substratai arba atramos.


Potencialas Pleurotus sajor-caju kompostas kontrolei Meloidogyne incognita ir pagerinti pomidorų augalų maistinę būklę

1 Daržovių tyrimų skyrius, Sodininkystės tyrimų institutas, Žemės ūkio tyrimų centras, Egiptas
2 Nematologijos tyrimų skyrius, Augalų patologijos tyrimų institutas, Žemės ūkio tyrimų centras, Egiptas
3 Aleksandrijos universiteto Žemės ūkio fakulteto dirvožemio ir vandens mokslų katedra, Aleksandrija, Egiptas

*Adresas korespondencijai: Sherin FA Awd Allah, Nematologijos tyrimų skyrius, Augalų patologijos tyrimų institutas, Žemės ūkio tyrimų centras, Egiptas, Tel: (+20) 11-5823-5078 El. paštas: [email protected]

Abstraktus

Panaudoto austrių grybų komposto potencialas, Pleurotus sajor-caju auginami ant ryžių (MCR) arba kviečių šiaudelių (MCW), buvo įvertinti pagal šaknies nematodą, Meloidogyne incognita ant pomidorų augalų lauko sąlygomis du sezonus iš eilės (2016 ir 2017 m.). Lauko bandymas buvo atliktas priemolio dirvožemyje, natūraliai užkrėstame M. incognita privačiame ūkyje, Kafr El Šeicho gubernijoje, Egipte. Rezultatai atskleidė, kad visi išbandyti gydymo būdai labai slopino galutines populiacijas (Pf), tulžies ir kiaušinių masės skaičius M. incognita per abu sezonus, palyginti su negydytu gydymu. Didžiausias procentas Pf sumažinimas (81,1 - 87 %) ir (80,2 - 86,2 %) buvo pasiektas naudojant cheminį nematicidą Vydate ® 10 G ir (MCR ir MCW) naudojant 1200 g/m 2 1 ir 2 sezonus. , atitinkamai. Be to, vaisių derlius abiem sezonais buvo žymiai padidintas visais taikytais apdorojimais, ypač apdorojant MCW, kai išpurškimo norma yra 1200 g/m2. Be to, naudojant MCR ir MCW apdorojimą, žymiai pagerėjo cheminės vaisių savybės. Be to, apdorojant MCR ir MCW buvo pasiektas didžiausias azoto ir fosforo procentas. Apskritai, rezultatai parodė, kad panaudotas kompostas, gautas po auginimo P. sajor-caju turi nematocidinį potencialą prieš M. incognita, taip pat pagerino mitybos būklę ir padidino pomidorų derlių.

Įvadas

Pomidoras (Solanum lycopersicum Mill.) yra viena iš pagrindinių pramoninių ir eksportuojamų daržovių pasėlių pasaulyje ir Egipte [1]. Atrodo, kad karotenoidai, ypač likopeno pigmentas, esantis pomidorų vaisiuose, yra aktyvus junginys, apsaugantis nuo vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų rizikos ir lėtinantis ląstelių senėjimą, nes turi didelę antioksidacinę ir antiradikalinę galią [2-4].

Pasauliniu mastu augalų parazitiniai nematodai kasmet praranda didelius derliaus nuostolius už maždaug 118 milijardų JAV dolerių [5]. Šakniastiebiai nematodai (Meloidogyne spp.) yra labiausiai paplitę nematodai, dėl kurių pomidorų derlius prarandamas daugiau nei 27 % [6,7]. Egipte šakniavaisiai nematodai puola pomidorų pasėlius ir daro didelę žalą pasėliams, ypač užkrėstoje smėlio dirvoje [8].

Valdymas Meloidogyne spp. yra labai sunkus dėl plataus šeimininkų asortimento, trumpų didelio dauginimosi ir generavimo periodų [9]. Buvo sukurtos kelios strategijos, įskaitant atsparias veisles, organinius dirvožemio pakeitimus ir biologinę kontrolę, kaip alternatyvos cheminėms medžiagoms valdant augalų parazitinius nematodus [10–12]. Nematodų valdymas ekologiškose tvariose žemės ūkio sistemose apima organinių likučių, kaip mažai sąnaudų reikalaujančių medžiagų naudojimą žemės ūkio sistemoje, o tai laikomas ekonomišku aplinkos problemos, kylančios dėl organinių atliekų šalinimo, sprendimu, taip pat dirvožemio struktūros gerinimą ir vandens sulaikymą. talpa [13-16]. Buvo atlikta daug sėkmingų bandymų, skirtų necheminiams metodams valdyti šakniavaisių nematodą, M. incognita užkrėsti pomidorų augalus, prieš sodinant į nematodais užkrėstą dirvą įdedant nekompostuotų medžiagų arba grybų komposto [17-20].

Austrių grybai (Pleurotas spp.) yra naudingi įvairių žemės ūkio atliekų skaidytojai [21]. Austrių grybų auginimas yra biotechnologinis lignoceliuliozės atliekų perdirbimo procesas. Šis procesas turi du tikslus – baltymų turinčio maisto gamybą ir aplinkos teršalų mažinimą. Žemės ūkio likučiai, tokie kaip ryžių ir kviečių šiaudai, yra pagrindinis lignoceliuliozės medžiagų šaltinis, kuris yra geriausias substratas kietajai fermentacijai. Pleurotus sajor-caju [22,23]. Panaudotas grybų kompostas (MC) gali būti naudojamas kaip veiksminga priemonė pomidorų šakniavaisiams nematodams valdyti [24]. Ankstesnių eksperimentų rezultatai atskleidė nematofaginį gebėjimą Pleurotas rūšys [25,26].

Augalai naudoja maistines medžiagas iš įvairių šaltinių, tokių kaip vietinis dirvožemio tiekimas, trąšos ir į dirvą patekusios organinės liekanos [27]. Cheminės trąšos yra nepakeičiamas maistinių medžiagų, būtinų bendram augalų augimui, sveikatai ir kokybei pagerinti, šaltinis. Tačiau intensyvus cheminių trąšų naudojimas gali prisidėti prie aplinkos užteršimo, jei nebus tinkamai tvarkomas [28]. Tvarus žemės ūkis, pagrįstas integruotomis augalų mitybos sistemomis (IPNS). IPNS siekiama integruotai naudoti chemines trąšas ir organines liekanas [29]. Maistinės medžiagos gali sumažinti ligos sunkumą, paveikti aplinką, kad atgrasytų patogenus, taip pat sukelti augalo šeimininko atsparumą arba toleranciją [30]. Nematodai yra tarp ligų sukėlėjų, kuriuos gali paveikti augalų mityba. Trąšų naudojimas gali iš dalies kompensuoti nematodų sukeltą žalą skatinant augalų vystymąsi ir sumažinant cheminės kontrolės poreikį [31, 32].

Todėl šio tyrimo tikslai buvo (1) įvertinti panaudoto komposto panaudojimo galimybes ir galimybes P. sajor-caju kuris buvo auginamas naudojant dviejų rūšių vietines žemės ūkio liekanas (ryžių arba kviečių šiaudus), kaip organinį metodą šakniavaisiams nematodams valdyti, M. incognita tiesiogiai įterpiant panaudotą kompostą į dirvą prieš persodinant pomidorų daigus (2), siekiant nustatyti P. sajor-caju kompostas, kai naudojamas 2,5 ir 5 tonos per pašarą, siekiant pagerinti pomidorų augalų maistinę būklę, derlių ir vaisių kokybę per du sezonus iš eilės (2016 m. ir 2017 m.).

Medžiagos ir metodai

Lauko eksperimentas buvo atliktas 2016 ir 2017 metų vasaros sezonais, siekiant įvertinti panaudoto austrių grybo komposto nematocidinį potencialą. Pleurotus sajor-caju (Fr.) Singer, kuris augino ant ryžių (MCR) arba kviečių šiaudų (MCW), skirtas šakniavaisių nematodų kontrolei, Meloidogyne incognita ant pomidorų (Solanum lycopersicum Mill.) hibridas „Elisa“ ir jų įtaka derliui ir vaisių kokybei, lyginant su cheminiu nematicidu Vydate® (Oxamyl 10% G) privačiame ūkyje, Kafr El-Sheikh gubernijoje, Egipte.

Eksperimentinės dirvožemio vietos fizikinės ir cheminės savybės

Iš eksperimentinės vietos prieš sodinimą abiem sezonais buvo paimti 0-30 cm gylio sudėtiniai paviršiaus dirvožemio mėginiai, išdžiovinti ore, sumalti ir perpilti per 2 mm sietelio poras, po to mėginiai išsiųsti analizei ir fizikinėms-cheminėms savybėms nustatyti. savybės Aleksandrijos universiteto Žemės ūkio fakulteto Dirvožemio ir vandens mokslų katedroje. Fizinės ir cheminės dirvožemio mėginių savybės pateiktos 1 lentelėje.

1 lentelė: Eksperimentinės dirvožemio vietos fizikinės ir cheminės savybės
Fizinės savybės Cheminės savybės
Dalelių dydžio pasiskirstymas (%) *pH **EC (dSm-1) Katijonų ir anijonų koncentracija (meq L-1) Yra
P (mg kg-1)
OM (%) Iš viso N (%)
Smėlis Dumblas Molis Tekstūra Ca2+ Mg2+ K + Na + HCO3- Cl- SO4- -
1 sezonas
23.4 37.6 39.0 Molio priemolis 7.81 2.03 4.83 5.67 0.58 8.92 3.89 6.25 9.86 8.94 2.25 0.19
2 sezonas
25.1 36.4 38.5 Molio priemolis 7.83 2.15 5.00 5.94 0.63 9.87 4.30 7.29 9.85 9.78 2.97 0.20
*pH nustatytas dirvožemio vandens suspensijoje (1:2,5), **EC nustatytas prisotintame dirvožemio pastos ekstrakte
Šiame eksperimente naudotas panaudotas grybų kompostas (MC).

Išbandytas grybų kompostas buvo surinktas baigus nuimti austrių grybų derlių (P. sajor-caju), kuris buvo auginamas ant dviejų rūšių vietinių žemės ūkio atliekų ryžių (MCR) arba kviečių šiaudų (MCW). Įvertintas MCR (panaudotų grybų kilimėlis + kompostuoti ryžių šiaudai) ir MCW (panaudotų grybelių kilimėlis + kompostuoti kviečių šiaudai) buvo gauti iš austrių grybų gamybos padalinio Integruotos apsaugos laboratorijoje, Augalų apsaugos tyrimų stotyje, Sabahiya, Aleksandrijos gubernija, Egiptas. Ryžių ir kviečių šiaudų pavyzdžiai prieš ir po P. sajor-caju augimas buvo išsiųstas į Aleksandrijos universiteto Žemės ūkio fakulteto Dirvožemio ir vandens mokslų katedrą makro ir mikro maistinių elementų kiekio analizei ir nustatymui. Cheminė ryžių ir kviečių šiaudų analizė prieš ir po P. sajor-caju augimas parodytas 2 lentelėje.

2 lentelė: Ryžių ir kviečių šiaudų cheminė analizė prieš ir po austrių grybų auginimo.
Pavyzdys Elementas C:N santykis
N P K C Ca Mg Fe Mn Zn Cu
% ppm
Ryžių šiaudai 0.45 0.37 0.48 21.68 0.29 0.10 48.20 29.01 36.16 11.30 48.2:1
MCR 1.01 0.76 0.85 19.87 1.50 0.65 152.10 97.82 56.30 36.73 19.7:1
Kviečių šiaudai 0.40 0.32 0.57 22.10 0.40 0.17 62.12 25.00 30.75 12.42 55.3:1
MCW 0.87 0.70 1.09 17.86 1.65 0.74 161.80 92.54 51.23 39.10 20.5:1
MCR: panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginami ant ryžių šiaudų substrato, MCW: panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginamas ant kviečių šiaudų substrato.
Lauko eksperimento programos

Eksperimentinis laukas buvo padalintas į sklypus, kurių kiekvieną sudaro 5 m ilgio ir 50 cm atstumu viena nuo kitos esančios eilės, o atstumas tarp augalų buvo 40 cm. Tyrimų sklypai apėmė šešis gydymo būdus, priskirtus atsitiktinių imčių pilno bloko projekte (RCBD). Pradinė populiacija (Pi) apie M. incognita buvo įvertintas prieš persodinimą, sijojant ir dekantuojant [33], naudojant 250 g gerai sumaišyto dirvožemio mėginių, paimtų iš kiekvienos eilės.

2016 ir 2017 m. vasaros sezonais taikytos šios procedūros:

1. MCR taikoma 600 g/m 2 norma (2,5 tonos/maitinimui).

2. MCR taikomas norma 1200 g/m 2 (5 tonos/maitinimas).

3. MCW taikoma 600 g/m 2 norma (2,5 tonos/maitinimui).

4. MCW taikoma 1200 g/m 2 norma (5 tonos/šėrimui).

5. Nematicidas Vydate® (Oxamyl 10% G), naudojamas 5 g/m2 (20 kg/feddan) norma.

Šviežias grybų kompostas (MCR arba MCW) buvo tiesiogiai įterpiamas ir įmaišomas į viršutinį 20–25 cm dirvos paviršiaus plotą, naudojant 600 arba 1200 g/m2, ir greitai laistomas iki lauko talpos. Praėjus dviem savaitėms po gydymo, buvo persodinti hibridinio Elisa (40 dienų amžiaus) pomidorų daigai. Cheminės trąšos buvo įterptos pomidorų augalų augimo stadijose, o kiti žemės ūkio metodai buvo atliekami pagal Egipto žemės ūkio ministerijos rekomendaciją.

Po keturių mėnesių, derliaus nuėmimo metu, pomidorų augalai atsitiktine tvarka paimti iš kiekvienos eilės, kruopščiai išrauti ir užregistruotas tulžies ir kiaušinių masės skaičius vienoje pomidorų augalų šaknų sistemoje. Vidutinis skaičius, iš penkių skaičių, iš M. incognita nepilnamečiai (J2) buvo imtasi siekiant nustatyti galutinį nematodų populiacijos tankį (Pf) dirvožemyje [33]. Taip pat buvo apskaičiuotas dauginimosi koeficientas (Rf) [34]. Sumažėjimas % (R) iš M. incognita populiacija dirvožemyje buvo apskaičiuota eksperimento pabaigoje naudojant Mulla ir kt. formulę. [35] taip:

R (sumažėjimas %) = 100 - [(C1/T1) × (T2/C2) × 100].

C1 = kontrolinis populiacijos tankis prieš gydymą

C2 = populiacijos tankis po gydymo

T1 = populiacijos tankis prieš gydymą

T2 = populiacijos tankis po gydymo.

Vegetatyvinio augimo parametrai

Praėjus 75 dienoms po abiejų sezonų persodinimo, atsitiktiniai pomidorų augalai iš kiekvienos eilės buvo paimti, siekiant nustatyti šiuos parametrus augalo šviežio ir sauso svorio (įskaitant ūglį ir šaknį), šviežią stiebo ir lapų svorį (g/augalui) ir lapų plotą (cm). 2 /augalas) buvo išmatuotas po pirmojo vaisiaus derliaus pagal Yousri [36].

Vaisių skaičius ir derlius

Abu sezonus pomidorų vaisiai buvo skinami kas savaitę per visą derliaus nuėmimo laikotarpį derliaus parametrams įvertinti vaisių/augalo skaičių, netinkamus parduoti vaisius (%) procentais nuo viso vaisiaus derliaus, vidutinį vaisiaus svorį (g) ir vaisių derlių (g/augalui). ).

Vaisių kokybės parametrai

Atsitiktiniai 30 vaisių mėginiai iš kiekvieno apdorojimo buvo paimti per ketvirtą abiejų eksperimentinių sezonų skynimą, siekiant nustatyti bendrą tirpių kietųjų medžiagų kiekį (TSS %), rūgštingumą (%), askorbo rūgštį (vitaminas C mg/g), sausąsias medžiagas (%). ir Ca (%). Visi šie parametrai buvo matuojami AOAC metodais [37].

Lapų cheminė sudėtis

Praėjus 15 dienų nuo paskutinio cheminių trąšų dozių pridėjimo abiem sezonais, bendras chlorofilas buvo ekstrahuotas naudojant N, N-dimetilformaldehidą ir išreiškiamas mg/g šviežio svorio pagal Moran ir kt. [38]. Lapų mėginiai buvo džiovinami orkaitėje 70 °C temperatūroje ir apskaičiuotas N, P, K ir Ca kiekis. Bendras azoto kiekis buvo nustatytas pagal Jones Jr [39] aprašytą metodą. Tuo tarpu bendras fosforo kiekis buvo matuojamas pagal Page ir kt. [40]. Be to, bendras kalio kiekis buvo nustatytas pagal Chapman ir pratt aprašytą metodą [41], o kalcio kiekis buvo matuojamas pagal Jacksoną [42].

Statistinė analizė

Gautiems duomenims buvo atlikta dispersinė analizė (ANOVA) naudojant kompiuterinę programą CoStat Version: 6.303 [43]. Gydymo priemonės buvo palygintos su patikslinto LSD testo verte 5% tikimybės lygiu.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Šiame tyrime nagrinėjamas skirtingas požiūris, kaip naudoti MC valdymui M. incognita tiesiogiai įterpiant MC į dirvą prieš pomidorų sodinimą. 3 lentelės duomenys parodė, kad visi išbandyti taikomi gydymo būdai sumažino galutinę nematodų populiaciją (Pf), dauginimosi faktorius (Rf), tulžies ir kiaušinėlių masės skaičius M. incognita užkrėstų pomidorų augalų lauko sąlygomis abiem sezonais (2016 ir 2017 m.). Pirmajame sezone Vydate ® 10 G buvo veiksmingiausia P slopinimo priemonė.f dirvožemyje tulžies ir kiaušinėlių masės atitinkamai 87, 83,2% ir 83%. Greta gydymo Vydate ® 10 G, didžiausias sumažinimas M. incognita Pf dirvožemyje (81,1 % ir 85,5 %), (77,7 % ir 80,4 %) nematodų šaknų tulžies ir (77,8 % ir 82,1 %) kiaušinėlių masės buvo užregistruotos naudojant MCR ir MCW apdorojimo dažnį (1200 g), palyginti su neapdorotu gydymu. . Tuo tarpu mažas MCR ir MCW naudojimo greitis (600 g) sumažino nematodą Pf dirvožemyje tulžies ir kiaušinėlių masės atitinkamai (74,8 % ir 76 %) (68,7 % ir 73,4 %) ir (68,8 % ir 71,9 %).

3 lentelė: Dviejų rūšių poveikis Pleurotus sajor-caju sunaudotas kompostas (MCR ir MCW) ir cheminis nematicidas Vydate® (Oxamyl 10% G) Meloidogyne incognita užkrėsti pomidorų augalus du sezonus iš eilės (2016 ir 2017 m.).
Gydymas Norma (g/m 2 ) J2 / kg dirvožemio G/augalas R EM/augalas R
Pi Pf R Rf
1 sezonas
MCR 600 4300 2082 m 74.8 0.48 200 b 68.7 180 b 68.8
1200 3878 1412 m 81.1 0.36 142 cd 77.7 128 a 77.8
MCW 600 4250 1968 m 76.0 0.46 170 a 73.4 162 b 71.9
1200 4062 1130 cd 85.5 0.28 125 d 80.4 103 d 82.1
Vydate ® 5 4106 1024 d 87.0 0.25 107 e 83.2 98 d 83.0
Negydoma - 3980 7590 a - 1.91 638 a - 576 a -
2 sezonas
MCR 600 4080 2186 m 70.0 0.54 221 b 71.7 196 b 68.0
1200 3740 1320 d 80.2 0.35 164 a 79.0 149 a 75.7
MCW 600 3962 1796 m 74.6 0.45 197 m.pr.Kr 74.7 190 b 69.0
1200 3658 1012 m 84.5 0.27 133 cd 83.0 116 cd 81.1
Vydate ® 5 3680 910 e 86.2 0.24 116 d 85.1 104 d 83.0
Negydoma - 4056 7150 a - 1.76 780 a - 612 a -
Vidurkis kiekviename stulpelyje, po kurio yra ta pati raidė (-ės), labai nesiskiria p = 0.05.
Pi = pradinė nematodų populiacija J2/ kg dirvožemio Pf = galutinė nematodų populiacija J2/ kg dirvožemio R = sumažinimo procentas buvo apskaičiuotas pagal Mulos formulę (R = 100 - [(C1/T1) × (T2/C2) × 100]) Rf = nematodų dauginimosi koeficientas = (Pf/Pi) G = tulžies skaičius EM = kiaušinių masės skaičius MCR: sunaudotas kompostas P. sajor-caju auginami ant ryžių šiaudų substrato, MCW: Panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginamas ant kviečių šiaudų substrato.

Panašūs rezultatai gauti ir antrąjį sezoną (3 lentelė). Vydate ® 10 G ir apdorojimas (MCR ir MCW) 1200 g/m2 greičiu parodė didžiausią dirvožemio P sumažėjimąf su (80,2 - 86,2%), tulžies skaičiumi (79 - 85,1%) ir kiaušinėlių masėmis (75,7 - 83%), palyginti su neapdorotais augalais. Tuo tarpu 600 g MCR ir MCW slopino nematodą Pf iki (70% ir 74,6%), tulžies skaičiai (71,7% ir 74,7%) ir kiaušinių masė (68% ir 69%).

Cheminių pesticidų pranašumas dažniausiai yra greitas ir veiksmingas atsakas kovojant su augalų parazitiniais nematodais. Gautus šio darbo rezultatus patvirtino Saad ir kt. [44], kurie nustatė, kad oksamilas ir fenamifosas buvo veiksmingiausi gydymo būdai kovojant su šaknies nematodu, M. incognita ant pomidorų augalų.

Tačiau pastaruoju metu buvo priimta daug alternatyvių strategijų, skirtų pakeisti cheminius pesticidus dėl neigiamo jų poveikio aplinkai, sukeliančio atsparumą kenkėjams, toksinio pavojaus žmonių ir gyvūnų sveikatai bei didelių išlaidų [11,12,45,46]. Šio tyrimo rezultatai labai sutampa su kelių tyrimų, kuriuose buvo pranešta, kad šakniastiebių nematodai negali daugintis augalų kultūrose, rezultatus. Pleurotas spp. ir patvirtino austrių grybų gebėjimą sugauti, nužudyti ir virškinti nematodą [47–49]. Barron ir Thorn ir kt. [50] nurodė orientuotą / kryptingą hifų augimą, kuris vėliau pateko į nematodo galvą kaip nukreiptus hifus. Orientuoti hifai dažniausiai buvo stebimi ant negyvų nematodų, kuriuos užpuolė Pleurotas rūšių. P. ostreatus Yra žinoma, kad iš jų hifų išsiskiria toksinas, žinomas kaip trans-2-decenedio rūgštis [51]. Šis toksinas paralyžiuoja nematodus, kai jie liečiasi, o tai leidžia hifams pereiti į vietą, kuri kolonizuoja ir virškina nematodą. Pleurotas spp. nužudė šaknies mazgą nematodą tik po trumpo poveikio jų hifams. Nematodai buvo imobilizuoti, kai tik priartėjo prie grybelio kolonijos [25,50,52,53].

Mūsų rezultatai buvo suderinti ir paremti daugeliu tyrimų, kuriuose pabrėžiama, kad po MC panaudojimo šaknų mazgų nematodai buvo labai slopinami [24,54-56]. Jie nustatė, kad MC buvo veiksmingas kaip dirvožemio pakeitimas valdant Meloidogyne spp. ant pomidorų augalų.

Tiesioginis MC įterpimas į dirvą galėtų užtikrinti tiesioginį grybų grybienos kontaktą su nematodais. Palizi ir kt. [57] pranešė, kad tiesioginis austrių grybų komposto įterpimas į dirvą 3 % (m/m) lauko sąlygomis sumažino daugiau nei 85 % cukrinių runkelių cistinių nematodų (Heterodera schachtii) cistų. Kita vertus, Ching ir Wang ir kt. [58] pranešė, kad tiesioginis MC pakeitimas nepanaikino M. incognita ant baziliko šaknų smėlingoje dirvoje. Gali būti, kad prastai įsitvirtinusi grybiena dirvoje susimaišo su ribota organine medžiaga.

Nematotoksinis MC poveikis gali būti siejamas su MC esančiais fenoliniais junginiais, kurie pasižymi antimikrobiniu aktyvumu ir gali būti veiksminga pomidorų šaknų nematodų biologinė kontrolė [24]. Be to, Pant ir Singh ir kt. [59] pranešė, kad panaudotas P. sajor caju kompostas buvo veiksmingas valdant ir sumažinant šaknų tulžies. M. incognita ant pomidorų augalų, nes jo grybiena yra mėsėdžiai, minta nematodus, išskiria ekstraląstelinius toksinus, kurie apsvaigina nematodus, kur grybiena per savo angas įsiveržia į jo kūną.

Subalansuotas makro ir mikroelementų įterpimas į dirvą yra geriausias būdas užtikrinti, kad pasėliai galėtų atlaikyti nematodų daromą žalą [31]. Grybų kompostas yra grybų pramonės gaminamas šalutinis produktas ir geras maistinių medžiagų šaltinis (0,7 % azoto, 0,3 % P, 0,3 % K ir daug mikroelementų), taip pat naudingas dirvožemio gerinimo įrankis [60, 61]. . Be to, reikšmingą MC poveikį mūsų tyrime gali lemti ir kiti netiesioginiai mechanizmai, pavyzdžiui, stimuliuoja dirvožemio mikroorganizmų, kurie yra antagonistiniai augalų parazitiniams nematodams, veiklą [62,63]. Be to, MC skaidymas lėmė specifinių junginių kaupimąsi dirvožemyje, gali turėti nematocidinį poveikį nematodams. Amonio pavidalo azotas, esantis organinėse medžiagose, labiau kenkia nematodams nei nitratų pavidalu, nes išsiskiria laisvasis amoniakas (NH).3) į dirvą jai irstant [31,64]. Be to, pagerinus pasėlių mitybą ir augalų augimą po MC pakeitimų, gali padidėti augalų tolerancija nematodams [65]. Fosforas yra būtinas augalų augimui ir taip pat gali turėti įtakos nematodų sukeliamoms ligoms. Augalai tampa atsparesni, kai aprūpinami pakankamu kiekiu fosforo ir išskiria mažiau šaknų eksudatų, todėl yra mažiau patrauklūs nematodų pjovimui, sumažinant sergamumą ligomis. Kalcio, kaip ir kitų maistinių medžiagų, dirvožemyje turi būti pakankamai, nes kalcio stokojantys augalai yra jautresni nematodų atakai [31].

Be to, šio tyrimo rezultatai iš esmės sutampa su Abbasi ir kt. [26], kurie įrodė, kad visiškai sumažintas komposto naudojimas neršto metu M. javanica kiaušinių masė ir populiacijos tankis dirvožemyje, apdorotame panaudotu austrių grybų kompostu, nei neapdorotame lauko sąlygomis, ir tai galėtų būti viena geriausių galimų biologinės kontrolės priemonių. Be to, El-Sherbiny ir Awd Allah ir kt. [19] parodė, kad apdorojimas atliekų likučiais P. ostreatus auginimas, nes prieš sodinimą sumažėjo dirvožemio biofumigantų M. incognita tulžies, kiaušinių masės, galutinės populiacijos ir dauginimosi veiksnio jautriems pomidorų augalams lauko sąlygomis ir žymiai padidino vaisių derlių.

Pažymėtina, El-Saedy ir kt. [66] įvertinti ryžių šiaudų ir panaudoto austrių grybo substrato naudojimo efektyvumą (P. ostreatus) ant citrusinių nematodų (Tylenchulus semipenetrans), užkrečiančių Valensijos apelsinmedžius, ir nustatė, kad dirvožemio pakeitimas panaudotu grybų substratu žymiai sumažino J skaičių.2 apie T. semipenetrans dirvožemyje ir J2 ir pateles apelsinų šaknyse bei padidintą apelsinų derlių. Mažiausias sumažinimo procentas buvo užfiksuotas naudojant ryžių šiaudų normas per du išbandytus auginimo sezonus lauko sąlygomis.

Vegetatyvinio augimo parametrai

Dviejų rūšių poveikis P. sajor-caju sunaudotas kompostas (MCR ir MCW), palyginti su cheminiu nematicidu Vydate ® (Oxamyl 10% G) dėl pomidorų augalų vegetatyvinio augimo charakteristikos, pateiktas 4 lentelėje. Apskritai duomenys patvirtino, kad visi apdorojimai abiem sezonais reikšmingai padidino tiriamąjį augimą. parametrus, palyginti su neapdorotais augalais. Abiejų sezonų apdorojimas MCW, naudojant 1200 g/m 2 normą, davė didžiausią reikšmingą augančio augimo poveikį, palyginti su kitais gydymo būdais. Tuo tarpu žemiausios vegetatyvinio augimo reikšmės užfiksuotos naudojant Vydate ® 10 G 2016 ir 2017 m. sezonus (4 lentelė).

4 lentelė: Dviejų rūšių poveikis Pleurotus sajor-caju sunaudotas kompostas (MCR ir MCW) ir cheminis nematicidas Vydate ® (Oxamyl 10% G) pomidorų augalų vegetatyviniams augimo parametrams 2016 ir 2017 metų sezonais.
Gydymas Įvertink (g/m 2 ) Šviežias svoris (g/augalas) Lapų sritis
(cm 2 / augalas)
šviežio augalo svoris (g) Sauso augalo svoris (g)
Stiebas Lapai
1 sezonas
MCR 600 230,2 b 742,0 b 1372,0 m 1259,1 b 103,5 b
1200 272,1 a 769,2 b 1457,2 b 1350,5 m 112,1 a
MCW 600 265,0 a 751,4 b 1450,4 b 1302,3 b 106,8 ab
1200 297,4 a 832,0 a 1872,1 a 1520,7 a 121,7 a
Vydate ® 5 208,5 b 613,6 c 1245,0 c 1135,2 m 91,8 m.pr.Kr
Negydoma - 185,0 c 541,8 d 872,7 d 981,5 d 80,6 c
2 sezonas
MCR 600 262,3 b 735,3 b 1424,1 b 1325,7 b 107.1 ab
1200 285,0 a 789,7 b 1550,3 m 1402,5 b 116,9 a
MCW 600 295,0 a 784,0 b 1595,0 b 1385,4 b 114,6 a
1200 319,6 a 886,2 a 2510,5 a 1579,3 a 125,9 a
Vydate ® 5 232,2 b 638,3 c 1262,0 c 1186,0 c 94,7 b
Negydoma - 202,1 a 570,0 d 951,0 d 1003,2 d 90,0 b
Vidurkis kiekviename stulpelyje, po kurio yra ta pati raidė (-ės), labai nesiskiria p = 0,05, MCR: panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginami ant ryžių šiaudų substrato, MCW: Panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginamas ant kviečių šiaudų substrato.

Šie rezultatai sutampa su kai kuriais ankstesniais tyrimais, kurie rodo, kad MC kaip organinę trąšą pomidorų augalams auginti yra gyvybinga [67–69]. Panašiai Pant ir Singh ir kt. [59] pranešė, kad panaudotas P. sajor caju kompostas veiksmingai pagerino pomidorų augimo parametrus ir dirvožemio derlingumą. Be to, augimo parametrai padidėjo dėl greito MC metabolizmo, maistinių medžiagų, kurios pagreitina šaknų vystymąsi, išsiskyrimo ir viso pomidoro augalų augimo. Be to, MC įmaišymas į dirvą gali pagerinti organines medžiagas, maistinių medžiagų prieinamumą, vandens sulaikymą ir dirvožemio kokybę, o tai svarbu gerinant pomidorų augimą, produktyvumą ir kokybę [27,70-72].

Vaisių skaičius ir derlius

Visų išbandytų procedūrų abiem sezonais žymiai padidėjo (p ≤ 0,05) pomidorų augalų vaisių/augalo skaičius, vidutinė vaisių masė ir derlius (5 lentelė). Apdorojant MCW naudojant 1200 g/m 2 naudojimo normą, buvo gautas maksimalus vaisių derlius/augalas, taip pat mažiausia netinkamų parduoti vaisių procentinė dalis, po to 600 g MCW ir MCR apdorojimas naudojant 600 ir 1200 g/m. 2 per abu sezonus. Tuo tarpu ženkliai mažiausia vaisių derliaus/augalo vertė buvo užfiksuota su neapdorotu augalu abiem sezonais. Daugelis autorių labai palaikė mūsų išvadas [19,26,59,69]. Jie nustatė, kad MC buvo veiksmingas kaip dirvožemio pakeitimas, siekiant pagerinti pomidorų augimą ir vaisių derlių. Taip pat El-Hadi ir Camelia ir kt. [73] pranešė, kad natūralių ekologinių pataisų taikymas turėjo teigiamą poveikį didinant pomidorų derlių ir sumažinant netinkamų parduoti vaisių derlių.

5 lentelė: Dviejų rūšių poveikis Pleurotus sajor-caju sunaudotas kompostas (MCR ir MCW) ir cheminis nematicidas Vydate ® (Oxamyl 10% G) pomidorų derliaus komponentui 2016 ir 2017 m. sezonuose.
Gydymas Įvertink (g/m 2 ) Vaisių skaičius / augalas Neparduotini vaisiai (%) Vidutinis vaisiaus svoris (g) Vaisių derlius g/augalas
1 sezonas
MCR 600 13,6 b 7.1 c 46,8 ab 675 b
1200 15.8 ab 6,6 c 51,6 a 722 b
MCW 600 13,9 b 5,8 cd 49,7 ab 687 b
1200 18.4 a 5,1 d 63,3 a 972 a
Vydate ® 5 16.1 a 10.1 b 45,3 b 635 b
Negydoma - 11,7 c 18.4 a 34,3 b 374 m
2 sezonas
MCR 600 17,8 b 4,5 m.pr.Kr 40,4 ab 660 m.pr.Kr
1200 19,5 a 3,6 c 45,6 a 735 m
MCW 600 19.3 a 2,7 c 40,9 ab 714 b
1200 22,5 a 1,8 d 51,6 a 1007 a
Vydate ® 5 18.3 ab 6,5 b 39.1 b 650 a
Negydoma - 13,4 a 16,9 a 30,8 c 369 d
Vidurkis kiekviename stulpelyje, po kurio yra ta pati raidė (-ės), labai nesiskiria p = 0,05, MCR: panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginami ant ryžių šiaudų, MCW: Panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginami ant kviečių šiaudų.
Vaisių kokybės parametrai

Taikytų MCR, MCW ir Vydate ® 10 G apdorojimo veiksmingumas bendrai tirpių kietųjų medžiagų (TSS %), rūgštingumo (%), vitamino C (mg/g), vaisių sausųjų medžiagų (%) ir Ca (%) atžvilgiu parodytas 6 lentelė. Gauti rezultatai parodė, kad vitamino C ir Ca (%) reikšmės pomidorų vaisiuose reikšmingai padidėjo gydant MCR ir MCW, o vėliau Vydate ® 10 G 2016 ir 2017 m. sezonuose. Tačiau reikšmingo skirtumo tarp vaisių sausųjų medžiagų (%) ir TSS % tarp skirtingų apdorojimų per abu sezonus nepastebėta. Šios išvados sutampa su ankstesnių tyrimų rezultatais, kuriuose teigiama, kad panaudotas grybų substratas gali būti naudojamas kaip kompostas vazoniniuose dirvožemio mišiniuose, siekiant pagerinti pomidorų vaisių kokybę [74, 75]. Taip pat kai kurios ataskaitos parodė, kad organinės trąšos, tokios kaip kompostas, gali padėti pagerinti daržovių auginimo maistinę vertę [76,77].

6 lentelė: Dviejų rūšių poveikis Pleurotus sajor-caju sunaudotas kompostas (MCR ir MCW) ir cheminis nematicidas Vydate ® (Oxamyl 10% G) dėl pomidorų vaisių cheminės kokybės, sausųjų medžiagų (%) ir Ca (%) 2016 ir 2017 metų sezonais.
Gydymas Įvertink (g/m 2 ) TSS (%) Rūgštingumas (%) Vitaminas C (mg/g) Sausosios medžiagos (%) Ca (%)
1 sezonas
MCR 600 7.60 a 0,74 a 88.32 a 5.30 val 0,24 a
1200 7.70 a 0,78 a 89.40 a 5. 35 a 0,21 a
MCW 600 7.50 a 0,66 b 87.20 a 5.29 a 0,22 a
1200 8.20 val 0,77 a 88,76 a 5. 40 a 0,29 a
Vydate ® 5 7.50 a 0,77 a 84.11 b 5.40 a 0,15 b
Negydoma - 8.00 val 0,85 a 84,50 b 5.48 a 0,14 b
2 sezonas
MCR 600 7.60 a 0,65 b 86,57 a 5.27 a 0,21 a
1200 7.50 a 0,70 a 88,60 a 5.20 a 0,23 a
MCW 600 7.40 val 0,61 b 87.50 a 5.23 a 0,23 a
1200 7.80 a 0,69 b 89,58 a 5.42 a 0,26 a
Vydate ® 5 7.30 val 0,71 a 83,20 b 5.36 a 0,12 b
Negydoma - 7.50 a 0,78 a 83,34 b 5.39 a 0,12 b
Vidurkis kiekviename stulpelyje, po kurio yra ta pati raidė (-ės), labai nesiskiria p = 0,05, MCR: panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginami ant ryžių šiaudų substrato, MCW: Panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginamas ant kviečių šiaudų substrato.
Lapų cheminė sudėtis

7 lentelėje pateikti rezultatai parodė MCR, MCW ir cheminio nematicido Vydate ® 10 G poveikį pomidorų augalų lapų cheminei sudėčiai per du sezonus iš eilės. Duomenys parodė, kad apdorojant MCR ir MCW abiem sezonais, tiek lapų azoto, tiek fosforo procentas buvo žymiai didesnis, palyginti su neapdorotais augalais. Apskritai rezultatai aiškiai parodė, kad įvertintas apdorojimas turėjo teigiamą poveikį N, P, K ir Ca % kiekiui pomidorų augalų lapuose ir žymiai pagerino mitybos būklę iki optimalaus pakankamo intervalo, padidindamas chlorofilo kiekį lapuose, palyginti su neapdorotais. augalų abiem sezonais (7 lentelė).

7 lentelė: Dviejų rūšių poveikis Pleurotus sajor-caju sunaudotas kompostas (MCR ir MCW) ir cheminis nematicidas Vydate ® (Oxamyl 10% G) dėl pomidorų augalų lapų cheminės sudėties 2016 ir 2017 m. sezonuose.
Gydymas Įvertink (g/m 2 ) N P K Ca Chlorofilas (mg/g)
%
1 sezonas
MCR 600 4.35 a 0,35 a 3,67 b 1,78 b 47,5 a
1200 4,90 a 0,38 a 3,79 a 1,94 b 47,9 a
MCW 600 4.15 a 0,34 a 3,70 b 1,85 b 48,3 a
1200 4.80 a 0,35 a 3,84 a 2.57 a 49,6 a
Vydate ® 5 3,60 b 0,31 ab 3,60 b 1,63 b 44,6 a
Negydoma - 3,50 b 0,30 b 3,50 c 1,01 a 40,2 b
2 sezonas
MCR 600 4.60 a 0,34 a 3,69 b 1,83 b 46,2 a
1200 5.00 val 0,37 a 3,74 a 1,86 b 48,6 a
MCW 600 4.50 a 0,33 a 3.71 a 1,87 b 47,5 a
1200 4.70 a 0,35 a 3.81 a 2,63 a 48,8 a
Vydate ® 5 3,75 b 0,30 b 3,63 b 1,60 b 45,4 a
Negydoma - 3,70 b 0,30 b 3,52 c 1.04 c 40,4 b
Vidurkis kiekviename stulpelyje, po kurio yra ta pati raidė (-ės), labai nesiskiria p = 0,05, MCR: panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginami ant ryžių šiaudų substrato, MCW: Panaudotas kompostas iš P. sajor-caju auginamas ant kviečių šiaudų substrato.

Pomidorams tiekiamų maistinių medžiagų kiekis ir rūšis gali turėti įtakos ne tik jo derliui, bet ir maistinių medžiagų kiekiui, skoniui bei laikymo po derliaus kokybei. Normaliam augimui ir dauginimuisi reikia dideliais kiekiais maistinių medžiagų, tokių kaip N, P, K, Ca ir Mg. Tuo tarpu kitų elementų, tokių kaip Fe, Cu, Zn, Mn, B ir Mo, reikia mažais kiekiais maistiniu požiūriu „sveikiems“ augalams ir tinkamam pasėlių maitinimui [78]. Lapų sudėtis yra geriausias augalų mitybos būklės rodiklis [79]. Protingas ir racionalus cheminių trąšų naudojimas žemės ūkio gamyboje yra labai svarbus siekiant pagerinti gamybos efektyvumą ir tvarią ekosistemą [70]. Organiniai dirvožemio pakeitimai gali padidinti dirvožemio organines medžiagas ir pagerinti chemines bei fizines dirvožemio savybes, pagerinant dirvožemio derlingumą, o tai savo ruožtu skatina geresnį derlių [62, 80, 81]. MC gali būti naudinga priemonė gerinant dirvožemio sveikatą, aprūpinant organines medžiagas ir tiekiant daug maistinių elementų, tokių kaip azotas, fosforas ir kalis sveikam augalų augimui. Taip pat buvo įrodyta, kad jis turi didelę vandens talpą, todėl sumažėja drėkinimui naudojamas vanduo [26,82]. Apskritai, MC buvo tinkama kaip natūrali trąša ir dirvožemio koregavimo priemonė daržovių laukuose ir gali prisidėti prie pomidorų auginimo maistinės vertės gerinimo [61,76].


Kiek kartų galime paleisti Pleurotus ostreatus / Pearl Oyster grybieną? – Biologija

Ligninolizinės peroksidazės genai austrių grybų genome: heterologinė ekspresija, molekulinė struktūra, katalizinės ir stabilumo savybės bei gebėjimas skaidyti ligniną

7 1 2 http://www.biotechnologyforbiofuels.com/content/7/1/2

2014 m. Fernández-Fueyo ir kt. licencijos turėtojas BioMed Central Ltd. Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal Creative Commons Attribution License sąlygas (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), leidžiančią neribotai naudoti, platinti ir atkurti bet kurioje laikmenoje, jei originalus kūrinys yra tinkamai cituojamas. Šiame straipsnyje pateiktiems duomenims taikomas „Creative Commons“ atsidavimo viešajam domenui atsisakymas (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/), jei nenurodyta kitaip. Genomas Pleurotus ostreatus Ligninolizinės peroksidazės genai Heterologinė išraiška Kristalų struktūra Katalizinės savybės Terminis stabilumas pH stabilumas Genų dubliavimasis Peroksidazės evoliucija

Pleurotus ostreatus , svarbaus valgomojo grybo ir pavyzdinio ligninolizinio organizmo, dominančio lignoceliuliozės biorafinavimo gamyklose dėl gebėjimo delignifikuoti žemės ūkio atliekas, genomas buvo sekvenuotas, siekiant nustatyti ir apibūdinti fermentus, atsakingus už lignino skaidymą.

Heterologinė II klasės peroksidazės genų ekspresija, po kurios buvo atlikti kinetikos tyrimai, įgalino jų funkcinę klasifikaciją. Gautas inventorius atskleidė, kad nėra lignino peroksidazių (LiP) ir yra trys universalios peroksidazės (VP) ir šešios mangano peroksidazės (MnP), dviejų iš jų (VP1 ir MnP4) kristalinės struktūros buvo išspręstos nuo 1,0 iki 1,1&# 160Å, rodantys reikšmingus struktūrinius skirtumus. Genų išplėtimas patvirtina abiejų peroksidazės tipų svarbą šio grybelio baltojo puvinio gyvenimo būdui. Naudodami lignino modelio dimerį ir sintetinį ligniną, parodėme, kad VP gali skaidyti ligniną. Be to, dvigubas Mn tarpininkaujamas ir nuo Mn nepriklausomas P. ostreatus MnP aktyvumas pateisina jų įtraukimą į naują peroksidazės pošeimį. Viso POD repertuaro prieinamumas leido biocheminiu lygiu ištirti pasikartojančių genų egzistavimą. Izofermentų skirtumai neapsiriboja jų kinetinėmis konstantomis.Stebėtini jų veiklos skirtumai T50 ir liekamasis aktyvumas esant rūgštiniam ir šarminiam pH. Siekiant paaiškinti įdomiausių izofermentų katalizines ir stabilumo savybes, buvo sujungta nukreipta mutagenezė ir spektroskopinė / struktūrinė informacija, o jų evoliucijos istorija buvo analizuojama daugiau nei 200 bazidiomicetų peroksidazės sekų kontekste.

P. ostreatus genomo analizė rodo, kad ligniną ardo sistema, kurioje LiP vaidmenį paprastai prisiėmė VP. Be to, tai leido pirmą kartą apibūdinti visą peroksidazės izofermentų rinkinį bazidiomicete, atskleidžiant didelius stabilumo savybių skirtumus ir pateikiant biotechnologiškai svarbius fermentus.

Dauguma šiuo metu turimų bazidiomicetų genomų yra iš medienos irimo grybų (iš Polyporales būrio), tačiau žemės ūkio atliekos ir pasėliai yra tinkamiausia žaliava lignoceliuliozės biorafinavimo gamyklose kurui ir cheminėms medžiagoms gaminti. Šiame kontekste P. ostreatus genomas buvo sekvenuotas JGI kaip tipiškas baltojo puvinio grybelis, galintis delignifikuoti nesumedėjusias lignoceliuliozės medžiagas. Šis faktas kartu su Pleurotus, kaip Agaricales būrio nario, taksonomine padėtimi leido manyti, kad genomo sekos nustatymas gali atskleisti skirtingas fermentines mašinas. Mūsų atlikta preliminari P. ostreatus genomo 17 analizė in silico parodė genus, koduojančius mangano peroksidazes (MnP) ir universalias peroksidazes (VP), bet ne lignino peroksidazes (LiP), kurios dalyvauja lignino skaidyme dėl modelio grybelio P. ostreatus manysosporium chry. kitos medienos puvimo rūšys 18 . Siekiant pagerinti mūsų supratimą apie Pleurotus rūšių lignino skaidymo fermentinį mechanizmą, pirmiau minėti peroksidazės genai iš P. ostreatus genomo dabar buvo heterologiškai išreikšti, struktūriškai apibūdinti naudojant kristalografinius ir į vietą nukreiptos mutagenezės metodus ir įvertintas jų aktyvumas. ant lignino ir susijusių substratų. Be to, buvo išanalizuotas įvairių aptiktų izofermentų stabilumas ir katalizinės savybės, atsižvelgiant į būsimus biotechnologinius pritaikymus.

Peroksidazės genai P. ostreatus genome

Sekos palyginimas, aminorūgščių sudėtis, heterologinė ekspresija, pH stabilumas (4°C ir 25°C), molekulinė struktūra (VP1 ir MnP4 skirtumai ir hemo kišenės) ir ABTS sigmoidinė kinetika (VP1) skirtingiems POD iš P. ostreatus genomo. S1 paveikslas. Hemo peroksidazės sekų filograma iš dviejų P. ostreatus monokarionų genomų. S2 paveikslas. P. ostreatus genomo POD aminorūgščių sudėtis (numatomi subrendę baltymai). S3 paveikslas. E. coli P. ostreatus genomo peroksidazių ekspresija (SDS-PAGE). S4 pav. Devynių P. ostreatus genomo POD stabilumas nuo pHق iki 9 skirtingu inkubacijos laiku. S5 pav. Temperatūros įtaka P. ostreatus genomo POD pH stabilumui. S6 pav. Kai kurių pagrindinių VP1 ir MnP4 kristalų struktūrų skirtumų stereofoniniai vaizdai. S7 pav. Hemo kofaktoriaus, kaimyninių liekanų ir kelių vandens molekulių dalinis 2Fo-Fc elektronų tankio žemėlapis, kontūruotas 1,1 σ lygiu, ir aplinkinių hemo kišenės liekanų padėtis VP1 ir MnP4 kristaluose. S8 pav. ABTS oksidacijos VP (izofermentu VP1) sigmoidinė kreivė, leidžianti apskaičiuoti du kinetinių konstantų rinkinius.

Iš pradžių P. ostreatus POD buvo suskirstyti į penkias MnP ir keturias VP, atsižvelgiant į tai, ar homologijos modeliuose yra: i) tariamos Mn 2+ oksidacijos vietos ir ii) atitinkamai Mn 2+ ir lignino oksidacijos vietos (bet viena). Numanomas VP šio tyrimo metu buvo perklasifikuotas į MnP1). Pirmąją vietą sudaro trys rūgštinės liekanos, kurios jungiasi su Mn 2+ katijonais, o antrojoje yra eksponuotas triptofanas, dalyvaujantis elektronų pernešime iš su ligninu susijusių donorų substratų. Aukščiau paminėtų ir kitų dominančių liekanų padėtis devynių POD išvestinėse aminorūgščių sekose iš P. ostreatus genomo parodyta  1 paveiksle. Devynių subrendusių baltymų sekos ilgis šiek tiek skiriasi (nuo 331 iki 339 liekanų), o aminorūgščių sudėtis šiek tiek skiriasi (1 papildomas failas: S2 pav.). Įdomu tai, kad prolinų skaičius svyruoja nuo 25 iki 26 (MnP2 ir MnP4) iki 30 iki 31 (VP1, VP3 ir MnP5) ir jie nėra tolygiai pasiskirstę išilgai sekos, o C-galo regione yra didžiausia koncentracija (nuo 21 iki 38 % likučių po paskutinio cisteino, pozicijos nuo 307/314 iki 331/339, yra prolinai), palyginti su visu baltymu (nuo 7 iki 9 % prolino liekanų). Tačiau svarbiausias skirtingų POD aminorūgščių sudėties skirtumas yra susijęs su lizino liekanų skaičiumi, kuris MnP4 (20 lizinų) yra beveik dvigubai didesnis nei stebimas kituose POD (nuo septynių iki dešimties lizinų).

Daugkartinis devynių POD aminorūgščių sekų derinimas iš P. ostreatus genomo (dabartinės JGI nuorodos, po rankinio anotavimo, įtrauktos)

Daugkartinis devynių POD aminorūgščių sekų derinimas iš P. ostreatus genomas (dabartinės JGI nuorodos, po rankinio anotacijos, įtrauktos). Konservuotos katalizinės ir kitos svarbios liekanos žymimos skirtingomis spalvomis, įskaitant: aštuonis cisteinus (ciano), sudarančius keturis disulfidinius tiltelius, devynis ligandus (žalias) iš dviejų struktūrinių Ca 2+ jonų, dvi aktyviosios vietos histidinas (tamsiai pilkos) tris rūgštines liekanas (oranžinę), sudarančius Mn 2+ oksidacijos vieta, viena triptofanas (mėlyna), atsakinga už aromatinio substrato oksidaciją VP (taip pat yra MnP1, iš pradžių klasifikuojama kaip VP), kelios aktyviosios vietos konservuotos liekanos (šviesiai pilka) ir kelios lizino (violetinės) ir prolino (geltonos) liekanos. yra ypač dažnas kai kuriose sekose. Lygiavimas buvo paruoštas naudojant ClustalW2 (Europos bioinformatikos institutas, Hinxton, JK). Amino rūgščių numeracija prasideda nuo pirmosios subrendusio baltymo liekanos (raudona žvaigždutė ant lygiavimo). Žemiau esantys simboliai rodo visišką tų pačių (*) arba lygiaverčių likučių (:) išsaugojimą ir dalinį likučių išsaugojimą (.). JGI, Jungtinis genomo institutas MnP, mangano peroksidazė POD, II klasės peroksidazė iš negyvūninių (augalų-grybelinių-prokariotinių) peroksidazių VP superšeimos, universali peroksidazė.

Heterologinė išraiška ir katalizinės savybės

Norėdami patvirtinti aukščiau pateiktą POD klasifikaciją, apibūdinkite dvi šeimas, esančias P. ostreatus, ir ištirkite skirtumus tarp VP ir MnP izofermentų, devynių POD (subrendusių baltymų) DNR sekų, koduojančių iš PC15 (išskyrus 1089895, kuris apima priešlaikinį nutraukimą). kodonas ir buvo pakeistas PC9 aleliu 137757) buvo pernelyg išreikšti Escherichia coli (1 papildomas failas: S3A pav.). Optimizuotu indukcijos laiku peroksidazės baltymai buvo išgauti iš inkliuzinių kūnų (papildomas failas 1: S3B pav.), aktyvuoti in vitro hemo ir struktūriniam Ca 2+ inkorporavimui ir disulfido tiltelio susidarymui, išgryninti ir apibūdinti. Išgryninimo išeiga visada buvo didesnė nei 95% perlankstytų baltymų, nors tai sudarė tik 3–28% viso baltymo, išgauto iš inkliuzinių kūnų, o visi išgryninti fermentai rodė tipiškus Reinheitszahl (Rz A) spektrus. 410/ A 280 santykis) reikšmės 𕟵.8 (2 papildomas failas : S1 lentelė).

Genų inventorius, izofermentų struktūrinės savybės, kristalografiniai duomenys, kinetinės konstantos (gimtoji VP1, MnP4 ir MnP1 bei mutuoti variantai) ir skirtingų POD sekų tapatybės. P. ostreatus genomo. S1 lentelė. Peroksidazės genų inventorius P. ostreatus monokarionų PC9 ir PC15 genomuose ir kai kurios išgrynintų E. coli ekspresijos POD charakteristikos. S2 lentelė. Struktūrinės savybės, potencialiai susijusios su temperatūros/pH stabilumu devyniuose P. ostreatus genomo POD, kartu su eksperimentiškai nustatytu terminiu stabilumu (T50 veiklos) ir pH stabilumo diapazonas. S3 lentelė. P. ostreatus VP1 ir MnP4 kristalografinių duomenų rinkimas ir tikslinimo statistika. S4 lentelė. P. ostreatus VP1 oksiduojančių VA, RB5 ir Mn 2+ variantų W165, E35A, E39A, D175A ir E35A/E39A kinetinės konstantos, palyginti su natūraliu VP1. S5 lentelė. P. ostreatus MnP4, oksiduojančio Mn 2+, E36A, E40A, D179A ir E36A/E40A variantų kinetinės konstantos, lyginant su natūraliu MnP4. S6 lentelė. Dviejų variantų kinetinės konstantos P. ostreatus MnP1 Trp165 aplinkoje, lyginant su natūraliu MnP1 ir giminingu P. pulmonarius MnP, oksiduojančiu VA, RB5, ABTS, DMP ir Mn 2+. S7 lentelė. Aminorūgščių sekos tapatybės tarp devynių POD iš P. ostreatus genomo, P. chrysosporium LiP ir MnP ir dviejų P. eryngii VP.

Devynių P. ostreatus POD katalizinių savybių palyginimas apėmė redukuojančių substratų veratrilo alkoholio (VA), reaktyviojo juodo 5 (RB5), 2,2′-azino-bis(3-) pastovios būsenos kinetinių konstantų įvertinimą. etilbenzotiazolino-6-sulfonatas (ABTS), 2,6-dimetoksifenolis (DMP) ir Mn 2+, o oksiduojančiam substratui H2O2 (  1 lentelė). Keista, kad peroksidazė 1096331, kuri buvo klasifikuojama kaip VP dėl tariamo katalizinio triptofano buvimo, negalėjo oksiduoti didelio redokso potencialo substratų VA ir RB5, todėl buvo pervadinta į MnP1 (ir iš naujo anotuota JGI portale). .

Kinetinės konstantos ( K m, μM k katė, s -1 ir k katė/ K m, s -1 .mM -1 ) devyniems POD iš P. ostreatus genomo a

Trys funkcinės VP oksidavo visus ištirtus substratus, nors ir turėjo skirtingą katalizinį efektyvumą ( k katė/ K m). Apskritai Mn 2+ buvo geriausias jų substratas (nuo 1900 iki 4510 s -1 .mM -1), bet VP1 taip pat efektyviai oksidavo ABTS ir RB5 (kiti izofermentai oksidavo ABTS nuo penkių iki devynių kartų mažesniu efektyvumu). DMP ir ypač VA yra prasti VP substratai, nors VP1 katalizinis efektyvumas buvo didesnis (nuo dviejų iki aštuonių kartų). Bimodalinės kinetinės kreivės, suteikiančios du ABTS ir DMP oksidacijos kinetinių konstantų rinkinius VP, rodo, kad šie substratai yra oksiduojami antroje žemo katalizinio efektyvumo vietoje, be didelio efektyvumo vietos, kuri gali būti tokia pati, kaip VA ir RB5 oksidacija. Šeši MnP nesugebėjo oksiduoti VA ir RB5, o jų efektyvumas naudojant Mn2+ buvo nuo 1200 iki 1930 s -1 .mM -1. Įdomu tai, kad P. ostreatus MnP taip pat gali oksiduoti ABTS (ir kai kuriuos iš jų DMP). Tačiau jų mažas (ABTS) arba labai mažas (DMP) efektyvumas ant šių substratų išskiria juos nuo VP. Devyni POD parodė didelį katalizinį efektyvumą reaguodami su H2O2, su visų MnP, išskyrus vieną (išimtis buvo anomali MnP1), vertės didesnės (3000–3700 s -1 .mM -1) nei VP (1700-2500 s -1 .mM -1).

P. ostreatus POD pH stabilumas

Devyni POD buvo inkubuojami pHق–9 intervale (esant 4°C) penkis laiko tarpus ir buvo nustatytas liekamasis aktyvumas. Normalizuoto aktyvumo palyginimas po 4 valandų inkubacijos (esant penkioms pH vertėms) parodytas  2 A paveiksle (ir visas devynių POD likusių aktyvumų rinkinys po 1 minutės, 1, 4, 24 ir 120 valandų aštuonios pH vertės įtrauktos kaip 1 papildoma byla: S4 pav.). Visi fermentai buvo beveik inaktyvuoti esant pHق po trumpiausio inkubavimo laiko, ir tik MnP4 ir VP3 išlaikė reikšmingą aktyvumą esant pHى, kai inkubacija buvo pratęsta (1 papildomas failas: atitinkamai S4G ir C paveikslai). Įdomu tai, kad MnP4 atrodo kaip stabiliausias POD esant rūgštiniam ir vidutiniškai šarminiam pH, o VP2 buvo stabilus esant pHك, bet nestabilus esant pHى (1 papildomas failas: S4B pav.). Kita vertus, MnP2 ir MnP3 buvo nestabiliausi POD tiek rūgštinėmis, tiek šarminėmis sąlygomis (1 papildomas failas: atitinkamai S4E ir F paveikslai). Palyginimui su spektroskopinėmis analizėmis, pH stabilumas taip pat buvo įvertintas esant 25 °C ir 176 °C, todėl liekamasis aktyvumas buvo mažesnis (1 papildoma byla: S5 pav.).

devynių POD iš P. ostreatus genomo pH stabilumas

devynių POD pH stabilumas iš P. ostreatus genomo. (A) Likutinis aktyvumas po 4 valandų inkubacijos, esant penkioms pasirinktoms pH vertėms nuo pHق iki 9. Buvo nustatytas E. coli ekspresuotų ir in vitro aktyvuotų trijų VP ir šešių MnP izofermentų liekamasis aktyvumas (5 mM ABTS oksidacijos būdu 0,1 M tartrate, pHك,5, išskyrus MnP1 ir MnP6, kuriems 2&#). Naudota 160 mM ABTS) po inkubacijos (esant 4°C) 100 mM B&R buferyje, kurio pHق iki 9 (1 papildomas failas: S4 paveiksle rodomi aštuonių pH verčių duomenys po 1 minutės, 1, 4, 24 ir 120 inkubacijos valandas, o S5 paveiksle parodytas pH stabilumo palyginimas esant 4°176C ir 25°176C). Priemonės ir 95% pasikliovimo ribos. (B) Nestabilių MnP3 ir stabilių MnP4 izofermentų UV matomi spektrai po 0 (juoda), 30 (rausvai raudona), 60 (geltona), 90 (violetinė), 120 (mėlyna), 180 (žalia) ir 240 minučių (raudona) esant pHك ir 8. Rodomi trys papildomi nuskaitymai po 30 (dideli brūkšneliai), 60 (trumpi brūkšniai) ir 90 sekundžių (taškai) inkubacijos ir sustiprinta (x 5 absorbcija) nuo 450 iki 700  nm pradinio MnP3 srities. ir galutiniai spektrai. Nurodomi pagrindiniai maksimumai. (C) Nestabilių MnP3 ir stabilių MnP4 izofermentų tolimųjų UV spindulių CD spektrai po 1 minutės (juodos spalvos) ir 1 valandos (žalios) inkubacijos esant pHك ir 5. Rezultatai rodomi kaip molinė elipsė (θ) ir nurodyti pagrindiniai minimumai. Visi spektrai buvo užfiksuoti 25 ir 176 ° C temperatūroje. ABTS, 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonatas) B&R, Britton-Robinson CD, cirkuliarinis dichroizmas MnP, mangano peroksidazė POD, II klasės peroksidazė iš negyvūnų (augalų ir grybų) superšeimos. prokariotinės) peroksidazės VP, universalioji peroksidazė.

PH poveikis hemo aplinkai ir baltymų struktūrai buvo tiriamas UV matomos absorbcijos ir tolimojo UV žiedinio dichroizmo (CD) spektroskopija. MnP3 ir MnP4 buvo naudojami atitinkamai kaip nestabilių ir stabilių POD modeliai, o spektriniai pokyčiai buvo stebimi 4 valandas esant trims pH vertėms. Ir UV matomas spektras (su Soret juosta ties 407 & # 160 nm ir mažu maksimumu ties 502 ir 640 & # 160 nm), ir CD spektras (su 208 ir 222 & # 160 nm elipsės minimumais) iš esmės nepakito inkubuojant esant pH ir # 160 5 spektrai nerodomi). Tačiau rūgštinės / šarminės sąlygos sukėlė stiprius MnP3 spektro pokyčius ir tik nedidelius MnP4 spektrų pokyčius. Pastarasis parodė labai nedidelį Soret juostos sumažėjimą esant pHك (160 pav. 2 B), bet pastebimą CD spektro pakitimą esant pHو (160 pav. 2 C), sutinkant su daliniu aktyvumo sumažėjimu. esant šarminiam pH. Tačiau inkubavus MnP3 pHك, Soreto juosta iš karto dingo, atsirado plati juosta ties 373 nm (kuri laikui bėgant mažėjo), o matomi maksimumai pasislinko iki 571 ir 674 nm. Pav.  2 B). Stebėtina, kad nors MnP3 inaktyvacija buvo drastiškesnė esant pHو, UV spinduliuose matomi spektriniai pokyčiai buvo ne tokie ryškūs: nedidelis Soreto juostos poslinkis į 413 nm ir naujų maksimumų atsiradimas ties 530 ir 571  &nm. #160 2 B). Tačiau MnP3 CD spektras buvo reikšmingai pakeistas inkubuojant pHو, pagrindiniam minimumui pasislinkus nuo 222 iki 208 nm, o esant pHك spektriniai pokyčiai buvo ne tokie intensyvūs (pav.  2 C).

P. ostreatus POD temperatūros stabilumas

Devynių POD terminis stabilumas buvo ištirtas matuojant likutinį aktyvumą po 10 minučių (  3 A pav.) ir 4 valandų (Pav.  3 B) inkubacijos 25–70°C diapazone (esant pHم). . Veikla T50 reikšmių vidurkis buvo 54°C ir 44°C atitinkamai po 10 minučių ir 4 valandų inkubavimo (atskiros reikšmės įtrauktos į 2 papildomą failą: S2 lentelę). VP1 yra stabiliausias POD, išlaikantis daugiau nei 80% aktyvumo po 10 minučių iki 60 ° C, o po to seka MnP4, VP3, MnP1 ir VP2 (nors VP2 stabilumas smarkiai sumažėjo su inkubacijos laiku). Apskritai VP buvo stabilesni nei MnP abiem 10 minučių (vidutinis T50 veiklos vertės atitinkamai 56°C ir 46°C) ir 4 valandas inkubacijos (vidutinis T50 veiklos vertės atitinkamai 46°C ir 43°C).

Devynių POD iš P. ostreatus genomo terminis stabilumas

Devynių POD šiluminis stabilumas P. ostreatus genomo. (A, B) Likutinė veikla po 10 minučių ir 4 valandų inkubacijos atitinkamai yra 25–70°C. Likutinis aktyvumas buvo nustatytas, kaip aprašyta 2 pav., po 10 minučių ir 4 valandų inkubacijos 10 mM tartrate (pHم) dešimtyje temperatūrų (5°C intervalais). Priemonės ir 95% pasikliovimo ribos. Iš aukščiau pateiktų kreivių 10 minučių ir 4 valandų T50 veiklos buvo gautos reikšmės (2 papildoma byla: S2 lentelė). (C, D) Temperatūrai nestabilaus MnP3 ir stabilaus VP1 denatūravimas atitinkamai, kaip parodyta UV matoma (mėlyna) ir CD (žalia) spektroskopija, palyginti su prarastu aktyvumu (raudona). Temperatūros poveikį (nuo 25 iki 70°C) parodo CD spektro padidėjimas ties 222°160 nm kas 0,5°176°C, absorbcijos sumažėjimas esant Soret maksimumui (prie 407  nm) UV spinduliuose. matomi spektrai įgavo kiekvieną 5°C, o likusio fermento aktyvumo sumažėjimas po 10 minučių inkubacijos, įvertintas kaip aprašyta  2 paveiksle. Visi matavimai buvo atlikti 10 mM tartrate (pHم). T50 vertes, atitinkančias tas temperatūras, kuriose 50 % baltymų denatūracija (pagrindinis lydymosi perėjimas) rodomas CD spektrais (Tm), 50% hemo Soret juostos sumažėjimą rodo UV matomi spektrai (T50-Soret), ir 50% sumažėja fermentinis aktyvumas (T50 veiklos vidurkis ir 95 % pasikliovimo ribos). CD, žiedinis dichroizmas MnP, mangano peroksidazė POD, II klasės peroksidazė iš negyvūninių (augalų-grybelinių-prokariotinių) peroksidazių VP superšeimos, universali peroksidazė.

Termiškai stabiliame VP1 Soret ir matomi maksimumai bei CD spektras buvo tik šiek tiek modifikuoti nuo 25 iki 60°C diapazone, tačiau stipresni pokyčiai buvo sukurti temperatūros nestabiliame MnP3. Esant aukštesnei temperatūrai, MnP3 davė plokščią UV matomą spektrą, tuo tarpu platus smailė apie 400 nm vis dar buvo stebima VP1 esant 70°C temperatūrai, o VP1 CD spektras prarado 222 nm minimumą (kaip jau nustatyta MnP3 žemesnėje temperatūroje ).Skirtingi aukščiau minėtų MnP3 ir VP1 spektrų pokyčių temperatūriniai kursai iliustruoti atitinkamai  3 C ir D paveiksluose, kuriuose pavaizduotas antrinės (spiralės) struktūros praradimas (kaip rodo elipsės pokyčiai esant 222  nm CD. minimumas) ir hemo aplinkos modifikavimas (kaip rodo Soret juostos sumažėjimas) kartu su katalizinio aktyvumo praradimu. Skirtumai tarp MnP3 ir VP1 buvo svarbesni dėl baltymų struktūros praradimo (su Tm pagrindiniam perėjimui atitinkamai 47°C ir 59°C), kuris yra lygiagretus inaktyvavimo profiliams (su T50 veiklos 51°C ir 63°C), nei hemo kofaktoriaus praradimas (su panašesniu T50-Soret vertės atitinkamai 62°C ir 65°C).

VP1 ir MnP4 molekulinės struktūros

P. ostreatus VP ir MnP buvo kristalizuoti ir pirmą kartą palyginus aprašytos visos jų struktūros (duomenų rinkimo ir patikslinimo statistika pateikta 2 papildomoje byloje: S3 lentelė). Dvi išspręstos struktūros atitinka izofermentus, labiausiai stabilius temperatūros (VP1) ir pH (MnP4) kraštutinumams, tarp devynių P. ostreatus POD (Protein Data Bank, PDB, atitinkamai [PDB:4BLK] ir [PDB:4BM1]). ).

Pagrindiniai bendros molekulinės architektūros skirtumai

Bendra VP1 ir MnP4 struktūra parodė hemo grupę, dalijančią baltymą į distalinį daugiausia spiralinį domeną (sudarytą iš keturių pagrindinių spiralių ir nuo dviejų iki trijų mažų) su vienu struktūriniu kalcio jonu ir proksimalinį domeną, kurį sudaro dar šešios spiralės ir netvarkinga sritis, stabilizuota antruoju kalcio jonu. Be bendro dviejų POD panašumų, galima pastebėti keletą skirtumų, iš kurių reikšmingiausi pavaizduoti (tamsesnėmis spalvomis) 4A pav. .

Įdomiausių VP/MnP izofermentų iš P. ostreatus genomo kristalinės struktūros (1,05–1,10 Å)

Įdomiausių VP/MnP izofermentų kristalinės struktūros iš P. ostreatus genomas (nuo 1,05 iki 1,10 Å). (A) VP1 (šviesiai mėlyna) ir MnP4 (šviesiai ruda) bendrų struktūrų superpozicija iš dviejų skirtingų orientacijų. Reikšmingi skirtumai tarp struktūrų parodyti tamsesne spalva, kai kurios šių regionų šoninės grandinės yra lazdelės. (B) Elektrostatinis VP1 ir MnP4 paviršius iš dviejų skirtingų orientacijų, rodančių pagrindinį hemo prieigos kanalą (didesnis apskritimas) ir siauresnį Mn 2+ prieigos kanalą (mažesnis apskritimas), taip pat bazinį MnP4 paviršių su daugybe eksponuotų lizino likučių. (C) Išsami informacija apie VP1 ir MnP4 hemo ir kaimyninius regionus, rodančius: proksimalinį histidiną (atitinkamai H169 ir H175), distalinį histidiną (H47) ir kaimyninį argininą (R43), du konservuotus fenilalaninus proksimalinėje histidino pusėje (atitinkamai F186 ir F182) ir distalinę dalį. Hemo histidino pusė (F46) yra du konservuoti asparaginai (atitinkamai N78 ir N84) ir glutamato liekanos (atitinkamai E72 ir E78), sudarančios H jungčių tinklą iš distalinio histidino dviejų struktūrinių Ca 2+ jonų (rudų sferų) keturi/penki konservuoti ligandai viena vieta Mn 2+ oksidacijai (kurios numatoma padėtis pažymėta raudonu apskritimu) šalia vidinio hemo propionato, kurį sudaro du glutamatai (E36 ir E40) ir vienas aspartatas (atitinkamai D175 ir D181) viena triptofano liekana (W164), sudaranti aromatinių substratų VP1 oksidacijos vietą (pažymėtą raudonu benzeno žiedu) LRET per gretimą leucino likutį (L165) ir keletą vandens molekulių (baltų rutulių) netoli distalinio histidino ir Ca. 2+ jonų. Iš įrašų [PDB:4BLK] (VP1) ir [PDB:4BM1] (MnP4). LRET, ilgo nuotolio elektronų pernešimas MnP, mangano peroksidazė PDB, baltymų duomenų bankas VP, universali peroksidazė.

Pirmasis skirtumas buvo viršutiniame domene, arti kalcio jonų (  pav. 4 A, kairėje). Šioje vietoje VP1 kilpa nuo P56 iki G59 pateikia šešių liekanų įterpimą į MnP4 ir sudaro nedidelę papildomą spiralę, kuri išsikiša į tirpiklį. Be to, likučiai A130 ir V131 šiame VP1 regione įgavo skirtingą konformaciją, palyginti su V135 ir T136 MnP4 (  pav. 5 A ir 1 papildoma byla: S6A pav.). Šie pokyčiai leidžia F62 hidrofobinei šoninei MnP4 grandinei sąveikauti su K137 ir dėl šios sąveikos T136 hidroksilo grupė sąveikauja su vienu iš vandenų, koordinuojančių distalinį kalcio joną. Pirmiau minėta papildoma spiralė taip pat numatoma VP2, MnP2 ir MnP6 homologijos modeliuose.

Trijų regionų VP1 (mėlyna) ir MnP4 (ruda) kristalų struktūrų ir katalizinio triptofano aplinkos palyginimas VP1 ir homologinių regionų MnP4 ir MnP1 palyginimas

Trijų regionų VP1 (mėlyna) ir MnP4 (ruda) kristalų struktūrų ir katalizinio triptofano aplinkos palyginimas VP1 ir homologinių regionų MnP4 ir MnP1 palyginimas. (A) Kilpa arti distalinio kalcio ir jo ligandų, įskaitant dvi vandens molekules (lengvąsias sferas) ir skirtumus VP1/MnP4 D129 – A132/N134 – K137 srityje, įskaitant MnP4 K137, sąveikaujantį su F62 šonine grandine. (B) Du sekos ruožai (V248 iki P252 ir P286 iki H293 VP1 ir I254 iki S259 ir R292 iki P298 MnP4) baltymo gale, nurodant tas liekanas, kurios skiriasi dviejose peroksidazėse (hemo kofaktorius, proksimalinis Ca 2+ Taip pat matomos sferos ir jos ligandai bei VP1 W164). (C) Pasirinkti likučiai ir tirpiklio prieigos paviršius VP1 ir MnP4 hemo prieigos kanale ir aplinkinėje srityje (paviršiaus elektronegatyvumo skirtumai žemiau kanalo įėjimo pažymėti apskritimais). (D) Struktūra (apačioje) ir elektrostatinis paviršius (viršuje), rodantis katalizinį triptofaną ir aplinkines VP1 (įskaitant G260 ir F197, be kita ko) likučius, palyginti su tuo pačiu regionu MnP1 (įskaitant D261 ir I198) ir MnP4 (įskaitant R266 ir F203) ( žali apskritimai rodo konservuoto triptofano padėtį VP1 ir MnP1 arba atitinkamą alaniną MnP4). Iš įrašų [PDB:4BM1] (MnP4) ir [PDB:4BLK] (VP1) ir MnP1 homologijos modelio, pagrįsto [PDB:4BLK]. MnP, mangano peroksidazė PDB, baltymų duomenų bankas VP, universali peroksidazė.

Reikšmingi skirtumai buvo nustatyti ir pagrindiniame hemo prieigos kanale. Juose yra keturi pakeitimai viršutinėje šio kanalo angoje (atitinkamai P76 į A82, A79 į N85, K176 į T182 ir V177 į I183 atitinkamai VP1 ir MnP4) (  pav. 4 C ir 1 papildomas failas: S6B pav.). Rezultatas yra tai, kad kanalas yra platesnis, o hemas yra labiau prieinamas VP1 nei MnP4 (didesni apskritimai   4 B pav.). Kitas skirtumas yra apatinėje kanalo lūpoje (  pav. 5 C). Pirmasis pokytis buvo N214 (VP1) į H220 (MnP4), nes histidinas užima didesnį tūrį, todėl D184 sritis pasislenka į K186. Pirmiau minėtas pakeitimas taip pat turi įtakos D217, kuris MnP4 yra perkeltas į išorę, palyginti su T211 VP1. Kitas pokytis paveikia I214 MnP4 (F208 VP1), kurio mažesnė šoninė grandinė leidžia L219 orientuotis į paviršių, o VP1 didelė fenilalanino šoninė grandinė verčia D213 paveikti tirpikliu. Paskutinis pokytis šiame regione yra susijęs su S180 VP1, kurį užima K186 MnP4, todėl turi įtakos ir paviršiaus formai, ir įkrovimui. VP1 apatinė lūpa turi aiškų neigiamą krūvį ir plataus rezervuaro formą, o MnP4 – mažiau įkrautą paviršių su siauru grioveliu (apskritimai paveiksle  5 C). Pirmiau minėti skirtumai gali turėti įtakos substrato oksidacijai hemo prieigos kanale.

Kitas skirtumas tarp VP1 ir MnP4 yra baltymo gale (paveikslas 4 A, dešinėje), hemo prieigos kanalo atžvilgiu. Tai paveikia du sekos ruožus (V248 iki P252 ir P286 iki H293 VP1 ir I254 iki S259 ir R292 iki P298 MnP4) su skirtingais konformaciniais išdėstymais (  5 B pav. ir 1 papildomas failas: S6C ir D paveikslai). Pirmoji seka yra arti VP1 katalizinio triptofano (W164), o antroji - arti proksimalinės kalcio surišimo vietos. Didžiausias skirtumas pirmojoje atkarpoje yra Q251 pokytis VP1 į P257 MnP4, tačiau antrojo ruožo pokyčiai yra ryškesni. Dauguma jų apima mažų hidrofobinių šoninių grandinių keitimą VP1 didelėmis hidrofilinėmis šoninėmis grandinėmis, pvz., G290 pakeitimą VP1 K296 MnP4. Šis lizinas sąveikauja su D198 ir D200, kurie yra tiesiogiai susiję su proksimalinio kalcio koordinavimu.

Paviršiaus krūvio skirtumai veikia ne tik pagrindinio hemo kanalo aplinką. Kai MnP4 kristalų struktūra buvo išspręsta, ryškus pastebėjimas buvo didelis tirpikliu paveiktų lizinų (iš viso 20) ir kitų pagrindinių likučių (iš viso iki 34) skaičius (  4 B pav.). Priešingai, VP1 turi tik devynis lizinus ir iš viso 21 paviršiaus bazinį likutį. Atskleistų bazinių likučių skaičius devyniuose P. ostreatus POD svyruoja nuo 18 iki 35, o paveiktų rūgštinių likučių skaičius beveik nesiskiria (nuo 29 iki 37). Pirmiau minėti skirtumai koreliuoja su baltymu pI, kuris yra bent vienu vienetu didesnis MnP4 (2 papildomas failas: S2 lentelė). Kita vertus, išanalizavus molekulės paviršių užimančių likučių sąveiką, MnP4 buvo pastebėtas didesnis H jungčių ir druskos tiltelių skaičius nei VP1, kuris stabilizuoja kilpas (E92–S75 H jungtį) ir jungia spirales ir kilpos (R245 sujungtas su T152 ir D243, o E238 su R233).

Hemo aplinka ir Ca 2+ surišimo vietos

Iš viso 28 liekanos sudaro dviejų kristalizuotų baltymų hemo kišenę (1 papildomas failas: S7 pav.), dauguma jų yra konservuoti, išskyrus keturis (I171, A174, K176 ir V177 VP1, yra V177, Q180, T182, ir I183 atitinkamai MnP4). Pirmasis pakeitimas, I171 į V177, buvo toli nuo įėjimo į hemo prieigos kanalą, o kiti trys pakeitimai yra šalia arba prie hemo prieigos kanalo ir modifikuoja kofaktoriaus prieinamumą. Tarp minėtų pakeitimų V177 VP1 iki I183 MnP4 pašalina vieną iš hemo-apoenzimo H jungčių. Aukščiau minėtus hemo kišenės likučių skirtumus lydi I226 pasikeitimas VP1 į F232 MnP4, glaudžiai liečiantis atitinkamai su A174 ir Q180. Didesnis šių dviejų likučių tūris MnP4 išstumia į išorę kilpą, kuri sudaro apatinę hemo prieigos kanalo lūpą (  5 C pav.).

Hemo aplinką VP1 ir MnP4 (pav.  4 C) sudaro proksimalinis histidinas (atitinkamai H169 ir H175), veikiantis kaip penktasis hemo geležies ligandas, ir distalinis histidinas (abiejuose fermentuose H47), užmezgantis H ryšius su keletas hemo kišenės likučių ir vandens molekulių. Vanduo, esantis tarp geležies ir distalinio histidino, turėjo pailgą abiejų struktūrų tankį (1 papildomas failas: S7B ir D paveikslai), o tai gali reikšti daugybę šios molekulės (kuri taip pat jungiasi su konservuotu R43) konformacijomis. Likučiai, besiribojantys su proksimaliniais ir distaliniais histidinais VP1 (atitinkamai S170 ir D48) ir MnP4 (atitinkamai S176 ir D48), dalyvauja koordinuojant du struktūroje esančius Ca 2+ jonus, kartu su keturiomis kitomis liekanomis proksimalinėje pusėje. , ir trys likučiai plius dvi vandens molekulės distalinėje pusėje (visos jos yra 2,4–2,5 Å atstumu) (  4 C pav.). Kalcio ligandai yra konservuoti, išskyrus VP1 V192, kuris MnP4 yra D198. Tiek proksimalinis VP1, tiek MnP4 histidinas ir gretimas Ca 2+ surišantis serinas yra toje pačioje spirale, o kitas Ca 2+ ligandas (atitinkamai D194 ir D200) yra greta kitos spiralės. Todėl šis Ca 2+ jonas stabilizuoja proksimalinio histidino padėtį. Panašiai antrasis Ca 2+ jonas fiksuotų spiralę, kurioje yra distalinis histidinas. Ca 2+ surišančios liekanos taip pat yra konservuotos kituose septyniuose P. ostreatus POD, išskyrus tas, kurios yra homologiškos VP1 Ser170 ir Val192 (tačiau atkreipkite dėmesį, kad šiais dviem atvejais pagrindiniai karbonilai yra Ca 2+ ligandai) (&# pav. 160 1 ir papildoma byla 2 : S2 lentelė).

Substrato oksidacijos vietos

Tiek VP, tiek MnP gali oksiduoti Mn 2+ (  1 lentelė). Vieta, kurioje tai vyksta, yra konservuota ir susideda iš trijų rūgščių liekanų (E36/E40/D175 VP1 ir E36/E40/D181 MnP4), esančios šalia hemo propionato, užimančio vidinę vietą pagrindinio prieigos kanalo atžvilgiu (&# pav. 160 4 C). Šis propionatas tirpikliui pasiekiamas siauru antruoju prieigos kanalu (mažesni apskritimai  4B pav.), kuris atsidaro neigiamo krūvio srityje, maždaug 15 Å atstumu nuo pagrindinio prieigos kanalo. Mn 2+ oksidacijos vieta yra išsaugota visuose P. ostreatus MnP ir VP, kaip rodo homologijos modeliai (1 papildoma byla: S2 pav.).

Be Mn 2+ oksidacijos vietos, VP taip pat turi lignino oksidacijos vietą, kurios buvimas buvo aptiktas naudojant VA ir RB5 kaip substratus (  1 lentelė). Šią VP1 vietą sudarytų W164, prijungtas prie hemo grupės per ilgo nuotolio elektronų perdavimą (LRET) (  pav., 4 C). Indolinė W164 šoninė grandinė VP1 yra iš esmės atvira (pav.  5 D, centras), todėl galima surinkti elektronus iš stambios lignino molekulės. Su ligninu susijusių substratų oksidacija nebuvo aptikta MnP4, kur aktyvus triptofanas yra pakeistas alaninu (  5 D pav., kairėje). Tas pats pakeitimas vyksta MnP3 ir MnP5, o asparto rūgštis užima šią vietą MnP2 ir MnP6 (1 papildomas failas: S2 pav.). Tačiau VP1 W164 yra išsaugotas kituose dviejuose VP (kaip VP2 W170 ir VP3 W164). Be to, MnP1 yra numanoma lignino oksidacijos vieta (ties W165), tačiau fermentas negalėjo oksiduoti VA ir RB5.

P. ostreatus POD nukreipta mutagenezė

Numanomos Mn 2+ ir lignino oksidacijos vietos, nustatytos kristalų struktūrose, buvo patvirtintos trijų rūgščių liekanų, esančių šalia vidinio hemo propionato, ir eksponuoto triptofano mutagenezės (2 papildoma byla: S4 ir S5 lentelės). Gebėjimas oksiduoti Mn 2+ visiškai išnyko po paprastų E36A, E40A arba D179A mutacijų MnP4, taip pat po dvigubos E35A/E39A mutacijos VP1 (paprasti E35A, E39A ir D175A VP1 variantai prarado daugiau nei 99,8 proc. katalizinis efektyvumas, bet išlaikė aptinkamą Mn 2+ aktyvumą). Panašiai W164S mutacija VP1 lėmė visišką VA ir RB5 (naudojamų kaip du paprasti lignino modelio junginiai) aktyvumo praradimą. Priešingai, VP1 E35A, E39A ir E175A (taip pat ir dvigubų E35A/E39A) variantų VA ir RB5 oksidacijos kinetinės konstantos išliko nepakitusios, o W164A ant Mn 2+ buvo tik šiek tiek pakeistos.

Vienas ypatingas atvejis buvo izofermentas MnP1. Šis baltymas pasižymi eksponuojamu triptofanu, būdingu VP (MnP1 W165), tačiau neturi aktyvumo VA ar RB5. MnP1 molekulinis modelis parodė, kad dauguma eksponuotų liekanų, esančių aplink konservuotą triptofaną (W164 VP1 ir W165 MnP1), buvo išsaugotos, tačiau mažas G260 VP1 buvo pakeistas aspartatu (D261) MnP1 (D pav. , 5). teisingai). Tai turėjo įtakos paviršiaus formai ir triptofano aplinkos krūviui, todėl galėjo turėti įtakos substrato surišimui (  pav. 5 D, viršuje). Kiti skirtumai turi įtakos likučiams, esantiems tarp W165 ir hemo kofaktoriaus (  pav. 5 D, apačioje). Tarp jų F197 pakeitimas VP1 I198 MnP1 atrodo ypač aktualus, nes ši liekana yra konservuota visuose kituose P. ostreatus POD (  1 pav.). Todėl buvo įtrauktos MnP1 D261G ir I198F viengubos ir dvigubos mutacijos, o kinetinės konstantos palygintos su natūralių MnP1 ir VP1 (2 papildomas failas: S6 lentelė). Į palyginimą taip pat buvo įtrauktas Pleurotus pulmonarius POD, kuris buvo klasifikuojamas kaip VP, bet turi konservuotą triptofano aplinką, panašią į P. ostreatus MnP1. Kaip įtariama, P. pulmonarius fermentas negalėjo oksiduoti VA ir RB5, todėl turi būti perklasifikuotas į MnP. Kalbant apie MnP1, D261G mutacija nepakeitė katalizinių savybių, o tai rodo, kad sutrikęs substrato surišimas nėra aktyvumo stokos priežastis. Tačiau I198F mutacija, nors jos nepakako, kad būtų suteikta galimybė oksiduoti VA, suteikė MnP1 galimybę oksiduoti antrąjį didelio redokso potencialo VP substratą RB5 (su K. m 2.3 ±𔁚.4 μM, k katė 10.0 ±𔁚.8 s -1 ir k katė/ K m 4270 ±� s -1 .mM -1) ir toks pat rezultatas buvo gautas naudojant dvigubą (I198F/D261G) mutaciją.

Lignino modelio degradacija P. ostreatus VP

P. ostreatus POD repertuare yra funkcinių VP ir MnP, tačiau trūksta ligniną ardančių LiP, nors grybelis yra ligninolizinis. Norėdami ieškoti šio neatitikimo paaiškinimo, nefenolinį β-O-4’ lignino modelio dimerį (pažymėtą 14 C, kad būtų lengviau aptikti produktą) apdorojome P. ostreatus VP1, esant ribojančiam H.2O2 užkirsti kelią fermentų inaktyvavimui. Rezultatai parodė, kad įvyko modelio junginio oksidacinis skaidymas (  6 A pav.). Abu Cα-Cβ jungties skilimas, atpalaiduojantis 4-etoksi-3-metoksibenzaldehidą (2 smailė) ir Cα buvo gauta oksidacija, dėl kurios susidaro atitinkamas dimerinis ketonas (3 smailė). Nedideli kiekiai fenilglicerolio produkto iš Cβ-O-C4’ eterio jungties skilimas (5 smailė) ir atitinkamas CαTaip pat buvo gautas ketonas (4 smailė). Eksperimentas buvo atliktas su dviem modelio dimero stereoizomerais, o VP1 oksidacija sąlygojo santykinai didesnį Cα-Cβ eritro formos jungties skilimas (punktyrinė linija) ir aukštesnė Cα treo formos oksidacija (punktyrinė linija).

P. ostreatus VP gebėjimo skaidyti ligniną įrodymas

Lignino skaidymo gebėjimo demonstravimas P. ostreatus VP. (A) Nefenolinio lignino modelio dimero oksidacinis skaidymas VP1. 14C pažymėto 4-etoksi-3-metoksifenilglicerolio-β-guajacileterio eritro (punktyrinė linija) ir treo (punktyrinė linija) izomerai (1 smailė) buvo apdoroti VP1, o pasibaigusios reakcijos buvo analizuojamos HPLC. Pagrindiniai produktai buvo 4-etoksi-3-metoksibenzaldehidas (smailė 2) ir 1-(4-etoksi-3-metoksifenil)-3-hidroksi-2-(2-metoksifenoksi)-propan-1-onas (smailė 3). Mažosios smailės 4 ir 5 atitinka atitinkamai 1-(4-etoksi-3-metoksifenil)-2,3-dihidroksipropan-1-oną ir 1-(4-etoksi-3-metoksifenil)glicerolį. (B, C) Lignino depolimerizacija naudojant VP1. 14C pažymėtas sintetinis ligninas (DHP) buvo apdorotas VP1 iš P. ostreatus genomo dalyvaujant (B) ir nebuvimas (C) iš VA. Juodi simboliai rodo reakcijas su fermentu, o atviri simboliai rodo valdiklius be fermento.Bendras iš pradžių pridėtos 14 C išgaunamas po užbaigtų reakcijų prieš GPC analizę buvo 62 % reakcijos B ir 92 % reakcijos C. Išgavos iš kontrolinių reakcijų buvo šiek tiek didesnės, kaip buvo pranešta anksčiau22. Rodyklės rodo dviejų polistireno molekulinės masės standartų (1800 ir 500 Da) ir VA (168 Da) eliuavimo tūrius. DHP, dehidrogenavimo polimeras GPC, gelio pralaidumo chromatografija HPLC, didelio efektyvumo skysčių chromatografija VA, veratrilo alkoholis VP, universali peroksidazė.

Svarbiausia, kai β-14C pažymėtas sintetinis ligninas (dehidrogenavimo polimeras, DHP) buvo apdorotas VP1 dalyvaujant VA, o po to analizuojamas gelinio pralaidumo chromatografija (GPC) (  6 B pav.), reikšminga depolimerizacija. buvo pastebėtas lignino kiekis (juodi simboliai), kaip rodo mažos molekulinės masės produktų gamyba (netoli 168 Da žymeklio padėties). Depolimerizacija neįvyko kontroliniame eksperimente be fermento (balti simboliai). Priešingai nei rezultatai, gauti naudojant modelio dimerį (6 pav.), lignino depolimerizacijai VP1 buvo reikalinga VA, nes DHP apdorojant be šio mediatoriaus junginio reikšmingų pokyčių nepastebėta (  6 pav. C).

VP ir MnP apibūdinimas iš P. ostreatus genomo

VP ir trumpos MnP kristalų struktūros

VP1 ir MnP4 kristalų struktūros buvo išspręstos kaip reprezentacinės dviem POD šeimoms, esančioms P. ostreatus genome. Tiriant šio fermento 29 32 35 katalizines vietas buvo aptarti keli P. eryngii VP kristalinės struktūros aspektai, nors palyginamas visos VP struktūros aprašymas nebuvo pateiktas. Kita vertus, P. chrysosporium ilgojo MnP molekulinė struktūra buvo pranešta skirtingomis raiškomis 36 37 38 , tačiau iki šio tyrimo nebuvo galima rasti trumpo MnP kristalinės struktūros.

Kalbant apie trumpąjį MnP, kurio kristalų struktūra dabar išspręsta pirmą kartą (iš P. ostreatus MnP4), pagrindinis jo struktūrinis skirtumas nuo P. chrysosporium ilgojo MnP yra labiau atviros Mn oksidacijos vietos buvimas, nes nėra C. -galinis pratęsimas, kuris P. chrysosporium MnP (iš viso turi 357 liekanas) yra iš dalies fiksuotas penktuoju disulfidiniu tilteliu. Dar reikia patvirtinti, ar šis skirtumas, naudojamas naujai trumpų MnP pošeimiui apibrėžti iš genomų 16 , yra žemo, bet reikšmingo nuo Mn nepriklausomo aktyvumo (ABTS) pagrindas, kurį rodo šie ir kiti trumpi MnP. Kitos MnP4 struktūros charakteristikos, pvz., didelis atvirų bazinių likučių ir H-jungčių/druskos tiltų skaičius bei dviejų struktūrinių Ca 2+ jonų aplinkos skirtumai, aptariamos toliau, atsižvelgiant į POD’. pH stabilumas.

POD izofermentų katalizinės savybės

Skirtingas POD izofermentų stabilumas

Bazidiomicetų POD evoliuciniai santykiai

237 bazidiomicetų POD sekų filograma, įskaitant devynias sekas iš P. ostreatus genomo (pabraukta)

237 bazidiomicetų POD sekų filograma, įskaitant devynias sekas iš P. ostreatus genomas (pabrauktas). Buvo analizuojamos POD sekos iš 21 genomo (ir GenBank). Buvo nustatytos keturios pagrindinės klasteriai, atitinkantys LiP (A), MnP-short/VP 1 ir 2 klasteriai (B, C), ir MnP ilgio (D), kartu su seniausia GP grupe ir nesugrupuotomis sekomis. Tie klasteriai / pogrupiai, kuriuose nėra Pleurotus (PLEOS, P. ostreatus PLEER, P. eryngii PLEPU, P. pulmonarius ir PLESA, P. sapidus ) sekos, buvo sutrauktos, nurodant įtrauktų sekų skaičių ir tipą. Nurodomi du LiP tipo fermentai iš G. subvermispora, atstovaujantys LiP/VP 47 pereinamąsias stadijas, taip pat Cerrena unicolor MnP (AFK91532), susijęs su P. ostreatus trumpais MnPs, ir unikalus Trametes cervina LiP (BAD52441). MnP-netipinis atitinka MnP tipą, kuriame oksidacijos vietoje yra tik dvi rūgštinės liekanos 16 . Baltymų modelių numeriai pateikti devynioms P. ostreatus genomo sekoms, o GenBank nuorodos kitoms šešioms POD sekoms. Žr. Ruiz-Dueñas ir Martínez 19, kur rasite nuorodų apie kitus bazidiomicetų POD. GP, bendroji peroksidazė LiP, lignino peroksidazė MnP, mangano peroksidazė POD, II klasės peroksidazė iš negyvūninių (augalų-grybelinių-prokariotinių) peroksidazių VP, universalioji peroksidazė.

P. ostreatus POD yra dviejose kitose klasteriuose, abiejuose yra trumpos MnP ir VP sekos, todėl trumpųjų MnP sekos tapatesnės su VP, nei ilgų MnP iš P. chrysosporium ir kitų grybų (žr. 2 papildomą failą: S7 lentelę). ). C klasteris apima P. ostreatus MnP2, MnP4 ir MnP6, kartu su kitais trumpais MnP ir VP grupe. B klasterį sudaro: i) Pleurotus grupė, sudaryta iš kitų šešių genomo POD ir dar penkių sekų iš GenBank; ii) antroji trumpų MnPs/VP grupė ir iii) nesugrupuotų trumpų MnP ir du LiP/VP tarpiniai produktai 47 . Pleurotus grupėje P. ostreatus VP1 yra glaudžiai susijęs su P. eryngii VPL, geriausiai apibūdintu VP 29 35 (97 % tapatumas), ir su vieninteliais Pleurotus sapidus ir P. pulmonarius VP, o tai rodo, kad keturios sekos atitinka tas pats izofermentas keturiose giminingose ​​rūšyse. Be to, P. ostreatus VP2 susikaupia su P. eryngii VPS1, antruoju klonuotu VP 28 (98 % tapatumas), atskleidžiant, kad abu taip pat yra tas pats izofermentas, ir tas pats pasakytina apie P. ostreatus MnP1 ir P. pulmonarius MnP ( 96 % sekos tapatumas). Kaip aptarta, dviejų pastarųjų MnP struktūrinės savybės rodo antrinę kilmę iš protėvių VP tipo fermento, kuris pagal filogramą gali būti susijęs su P. ostreatus VP3.

P. ostreatus POD: ligninolizės demonstravimas

Šis genomo tyrimas nustato LiP nebuvimą ligninoliziniame baltojo puvinio grybe P. ostreatus pagal jo genomo in silico analizę, kuri parodė, kad yra tik VP ir MnP genai. Be to, pirmą kartą parodome vieno iš šių VP ligninolizines galimybes, parodydami, kad jis gali: i) suskaidyti dažniausiai pasitaikančias tarpvienetines jungtis lignine (β-O-4’ eterio struktūras) ir ii) depolimerizuoti ligniną. Šios savybės yra panašios į nurodytas P. chrysosporium LiP reakcijų ir gautų produktų atžvilgiu22. Kalbant apie MnP, mes taip pat pateikiame įrodymų apie dvigubą Mn tarpininkaujamą ir nuo Mn nepriklausomą vadinamųjų trumpųjų MnP aktyvumą, randamą P. ostreatus , kurių buvimas buvo praneštas keliuose grybelių genomuose 16 neatlikus atitinkamų katalizinių tyrimų.

Mes parodome, kad P. ostreatus yra POD repertuaras, sudarytas iš VP ir MnP, o buvusios peroksidazės prisiima LiP vaidmenį P. chrysosporium (ir daugumoje kitų baltojo puvinio grybų). Šis skirtingas fermentinis mechanizmas greičiausiai yra susijęs su skirtinga dviejų grybų, atitinkamai priklausančių Agaricales ir Polyporales, filogenetine padėtimi. Atrodo, kad Agaricales POD evoliucijos istorija neapėmė galutinio perėjimo nuo VP prie LiP fermentų prarandant Mn 2+ oksidacijos vietą, kaip įvyko Polyporales 46 .

Atlikę dabartinę genominę atranką, galėjome: i) parodyti, kad modelio agaric P. ostreatus yra peroksidazės repertuaro, kuriame VP atlieka tokį vaidmenį kaip LiP baltojo puvinio poliporose; ii) aprašyti katalizines P. ostreatus MnPs, kaip naujos peroksidazės pošeimos atstovai iii) nustato aukščiau minėtų fermentų evoliucinius ryšius su kitais bazidiomicetų POD iv) aprašo pirmąją trumpojo MnP kristalinę struktūrą, kuri buvo palyginta su išspręsta VP struktūra ir v) parodyti, kad tarp daugybės POD izofermentų, kuriuos koduoja pasikartojantys genai, egzistuoja labai skirtingi terminiai ir pH stabilumai.

Grybų padermės ir genomo sekos nustatymas

Monokarionai PC9 (CECT20311) ir PC15 (CECT20312) buvo išskirti iš P. ostreatus N001 (CECT20600), o jų genominės DNR sekos gautos JGI projekte, kurį koordinavo AG Pisabarro (Navaros viešasis universitetas, Pamplona, ​​Ispanija). Numatoma, kad 35,6 Mbp (PC9 v1.0) ir 34,3 Mbp (PC15 v2.0) agregatai apims atitinkamai 12 206 ir 12 330 genų modelių (rezultatus galima rasti adresu http://genome.jgi.doe.gov/ PleosPC15_2/PleosPC15_2.home.html ir http://genome.jgi.doe.gov/PleosPC9_1/PleosPC9_1.home.html).

Genomo atranka ir peroksidazės modelių analizė

Galutinis hemo peroksidazės genų sąrašas P. ostreatus genome buvo gautas: i) tikrinant automatiškai anotuotus genomus; ii) peržiūrint ir rankiniu būdu kuruojant intronų ir N bei C galų padėtis, naudojant SignalP 3.0 (biologinės sekos centras). Analizė, Kongens Lyngby, Danija) signaliniams peptidams nuspėti iii) lyginant numatomas aminorūgščių sekas su susijusiomis peroksidazėmis po daugkartinio derinimo su MEGA5 (Evoliucinės medicinos ir informatikos centras, Tempe, AZ, JAV) ir iv) patvirtinantis charakteristikų buvimą. likučiai hemo kišenėje ir substrato oksidacijos vietose, atlikus homologijos modeliavimą Swiss-Model serveryje (Protein Structure Bioinformatics Group, Šveicarijos Bioinformatikos institutas ir Bazelio universiteto Biozentrum, Bazelis, Šveicarija), naudojant P. eryngii kristalines struktūras VPL ([PDB:3FJW]) ir P. ostreatus MnP4 (šis tyrimas) kaip šablonus. Galiausiai, pataisytos POD sekos iš sekvenuoto genomo buvo palygintos su visomis turimomis bazidiomicetų POD sekomis (iš viso iki 237 sekų iš 21 genomo ir GenBank), o filogramos buvo sukurtos naudojant MEGA5, naudojant Puasono pakoreguotus atstumus ir nesvertinę porų grupę. metodas su aritmetinio vidurkio (UPGMA) klasterizavimu (bootstrap konsensuso medžiai buvo nustatyti iš 1000 pakartojimų).

Devynių POD genų (modeliai 156336, 199510, 199511, 1041740, 1089546, 1096331, 1099546, 1099546, 1099081 ir 11113241) peržiūrėtos subrendusių baltymų kodavimo sekos iš PC13stheynsG, sintezuotos iš Vokietijos PC13stheensG7:7:75M ir 5113241 modelis patikrinus, ar visi kodonai anksčiau buvo naudojami kitiems genams ekspresuoti tose pačiose E. coli padermėse (ir prireikus juos pakeičiant). Palyginimui taip pat buvo susintetintas MnP koduojantis P. pulmonarius genas ([GenBank: AAX40734]).

I198F ir D261G mutacijos buvo įvestos į P. ostreatus MnP1 (109633) geną PGR būdu, naudojant ekspresijos plazmidę pFLAG1-109633 (žr. toliau) kaip šabloną ir QuikChange rinkinį iš Stratagene (La Jolla, CA, JAV). 5′- CG CCA AAC CTT TTC GAT TCA CAA TTC TTC ATC GAG ACG C 𕒷′ (I198F) ir 5′- C CGC TTC TCC GGA ACG CTG TTC AAG ATG TCG 橗 QG ) buvo susintetinti tiesioginiai pradmenys (mutuoti kodonai kursyvu), ir atvirkštiniai pradmenys, turintys komplementarias sekas. PGR reakcija (50 μl tūrio) buvo atlikta Eppendorf (Hamburgas, Vokietija) Mastercycler pro S terminiu cikleriu, naudojant 20 ng DNR šablono, 500 μM kiekvieną dNTP, 125 ng tiesioginius ir atvirkštinius pradmenis. , 2,5 vieneto Pfu Turbo polimerazės (Stratagene) ir gamintojo buferio. Reakcijos sąlygos apėmė: i) 1 minutės pradžios ciklą 95 °C temperatūroje ii) 18 ciklų po 50 sekundžių 95 °C temperatūroje, 50 sekundžių 55 °C ir 176 °C temperatūroje ir 10 minučių 68 °C temperatūroje ir iii) paskutinį 10 ciklą. minučių 68°C temperatūroje. Mutuotas genas buvo išreikštas E. coli ir išgrynintas kaip ir laukinio tipo genai.

Devynios P. ostreatus genomą koduojančios sekos ir vienintelės P. ​​pulmonarius subrendusios POD koduojančios sekos kartu su dviem mutavusiomis P. ostreatus MnP1 (10963331) sekomis buvo klonuotos į ekspresijos vektorius pFLAG1 (International Biotechnologies Inc, Kodak, CT, JAV). ) arba pET23a (+) (Novagen, Darmstadt, Vokietija) ir gautas plazmides (pET23a-156336, pET23a-1099081, pET23a-1041740, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-137757, pFLAG1-19951-1,8 pFLAG1-1096331 ir pFLAG1-AAX40734) buvo naudojami ekspresijai.

Peroksidazės buvo pagamintos E. coli W3110 (pFLAG1 plazmidės) ir BL21(DE3)pLysS (pET23a plazmidės). Ląstelės buvo auginamos 3 valandas Terrific Broth, indukuotos 1 mM izopropil-β-D-tiogalaktopiranozidu (IPTG) ir toliau auginamos 4 valandas. Apofermentas kaupėsi inkliuziniuose kūnuose, kaip pastebėta SDS-PAGE, ir buvo ištirpintas 8 M karbamidu. In vitro perlankstymas buvo atliktas naudojant 0,16 M karbamido, 5 mM Ca 2+, 20 μM hemino, 0,5 mM oksiduoto glutationo, 0,1 mM ditiotreitolio ir 6,0 pHg1 baltymo. #1609.5 62 . P. ostreatus MnP6 (1041740) perlankstymas buvo gautas naudojant 0,1 M karbamidą, 5 mM Ca 2+, 20 μM heminą, 1,5 mM oksiduoto glutationo, dioksido, glutationo, dio /ml baltymų, esant pHو. Fermentai buvo išgryninti naudojant Resource Q chromatografiją, naudojant gradientą nuo 0 iki 300 mM NaCl (2 ml.min -1, 20 min.) 10 mM natrio tartrate (pHم,5), turinčiame 1 mM CaCl.2 (išskyrus MnP4-1099081, kuriam buvo naudojamas pHن).

Kristalizacija, duomenų rinkimas ir tobulinimas

Kristalizavimo bandymai buvo atlikti sėdimos lašo garų difuzijos metodu, 96 šulinėlių plokštelėse, naudojant Wizard ekranus I–III (Emerald Bio, Bainbridge Island, WA, JAV) ir JBScreen rinkinius 1–10 (Jena Biosciences, Jena, Vokietija). 22°C. Lašai susideda iš 0,2 μl baltymų tirpalo (10 mg/ml 10 mM natrio tartrate, pHم.0) ir 0.2 μl rezervuaro tirpalo. VP1 kristalai priklausė trims kristalų formoms dviejose erdvės grupėse. I forma priklausė P43 grupėje ir buvo gautas esant penkioms šioms sąlygoms: i) 0,1 M natrio acetatas (pHل,6), turintis 8% PEG 4000 ii) 20% PEG 3350 ir 0,2 M amonio chlorido iii) 20% PEG 035 #160M amonio formiatas iv) 0.1 M natrio HEPES buferis (pHه.5), kuriame yra 1.6 M amonio sulfato ir 2% PEG 1000 ir v) 0.1 M natrio HEPES buferis, kuriame yra 0.2 (pH .2) natrio acetatas ir 20 % PEG 3000. II forma taip pat priklausė P43 grupėje ir buvo gautas 0,1 M imidazole (pHو,0), kuriame yra 1,0 M K/Na tartrato ir 0,2 M NaCl. III forma priklausė P21 grupėje ir buvo gautas 0,1 M natrio acetate (pHل,5), kuriame yra 20% PEG 1000 ir 0,2 M cinko acetato. Keturios skirtingos sąlygos suteikė dvi skirtingas MnP4 kristalų formas. I forma priklausė P1 grupei ir buvo gauta 0,1 M natrio citrate (pHم,5), kuriame yra 2,0 M amonio sulfato. Galiausiai II forma priklausė C2 grupei ir buvo gauta: i) 0,1 M natrio acetate (pHل,6), turinčiame 2,0 M amonio sulfato, ii) 0,1 M Tris-HCl buferyje (pHه,0). 2,0 M amonio sulfatas ir 0,2 M ličio sulfatas ir iii) 0,1 M natrio CAPS buferis (pH㺊,5), kuriame yra 1,2 M NaH2PO4/0,8 M K2HPO4 ir 0,2 M ličio sulfatas. Kristalai buvo sumontuoti nailono kilpose ir greitai užšaldyti skystame N2 motininiame tirpale, kuriame yra įvairių krioprotektorių.

Rentgeno spindulių difrakcijos duomenys buvo renkami esant 100 K X06DA ir X06SA spindulių linijoms Šveicarijos šviesos šaltinyje (Villigen, Šveicarija), naudojant 10000 Å bangos ilgį ir Pilatus 2 M ir 6 M detektorius. atitinkamai. Difrakcijos duomenys buvo indeksuojami, integruoti, sujungti ir keičiami naudojant XDS ir XSCALE. Pateikiama tik didžiausios skiriamosios gebos struktūra kiekvienam POD (I kristalinė forma) (jų duomenų rinkimo statistika pateikta 2 papildomame faile : S3 lentelė).

VP1 ir MnP4 struktūros buvo išspręstos molekuliniu pakeitimu naudojant P. eryngii VPL (3FMU) kristalinę struktūrą kaip paieškos modelį ir PHENIX paketo programą AutoMR (Lawrence Berkeley Laboratory, Berkeley, CA, JAV). Galutiniai modeliai buvo gauti nuosekliais tobulinimo etapais, o po to rankiniu būdu su Coot naudojant σA svertiniai 2Fo-Fc ir Fo-Fc elektronų tankio žemėlapiai. Tirpiklių molekulės buvo įtrauktos į tobulinimą, kaip įdiegta PHENIX pakuotėje, ir vizualiai patikrintos. Iš viso R apskaičiuoti buvo naudojami 5% atspindžiųLaisvas vertė viso tobulinimo proceso metu. Galutiniame VP1 modelyje buvo visos sekos liekanos, išskyrus paskutinę (S331) (kurioje nebuvo elektronų tankio), vienas hemo kofaktorius, du Ca 2+ jonai ir 452 vandens molekulės, o galutiniame MnP4 modelyje buvo visos 337 liekanos. sekos vienas hemo kofaktorius, du Ca 2+ jonai ir 1212 vandens molekulių (tipinė informacija apie VP1 ir MnP4 elektronų tankio žemėlapius, atitinkančius hemo kišenę, parodyta 1 papildomame faile: S7 paveikslas). Struktūros buvo patvirtintos naudojant MolProbity (The Richardson Laboratory, Duke University, Durham, NC, JAV). Patikslinimas ir galutinė modelio statistika rodoma 2 papildomame faile: S3 lentelėje. Figūros buvo pagamintos naudojant PyMOL (Schrödinger, Portland, OR, JAV). Koordinatės ir struktūros faktoriai buvo pateikti su PBP prisijungimo kodais [PDB:4BLK] ir [PDB:4BM1].

Pasirinktų substratų kinetinės konstantos

Absorbcijos pokyčiai oksiduojant substratą 0,1 M tartrate (esant įvairioms pH vertėms) buvo užregistruoti esant 25°C Biomate5 spektrofotometrui (Thermo Scientific, Waltham, MA, JAV), naudojant maždaug 0,01 μM fermento koncentraciją, apskaičiuotą iš ϵ406 kiekvieno izofermento (2 papildoma byla: S1 lentelė). Reakciją inicijavo H2O2 (0,1 mM) pridėjimas. Mn 2+ oksidacija buvo stebima esant pHم, stebint Mn 3+ .tartrato kompleksą (ϵ238 6.5 mM -1 .cm -1 ) susidarymas. VA oksidacija buvo stebima veraraldehido pHك (ϵ310 9.3 mM -1 .cm -1 ) susidarymas. RB5, ABTS ir DMP oksidacija buvo tiriama esant pHك,5 ir stebima, ar RB5 išnyksta (ϵ598 30 mM -1 .cm -1) ir ABTS katijonų radikalo susidarymas (ϵ436 29,3 mM -1 .cm -1) ir dimerinis koerulignonas (ϵ469 55 mM -1 .cm -1), atitinkamai. ABTS ir DMP oksidacija VP parodė dvigubą kinetiką su sigmoidinėmis aktyvumo kreivėmis, kai substrato koncentracija didėja (2 papildomas failas: S8 pav.), todėl buvo galima apskaičiuoti du kinetinių konstantų rinkinius. Kinetinės konstantos fermentų aktyvavimui H2O2 buvo nustatyti naudojant 5 mM ABTS (išskyrus MnP1 ir MnP6, kuriems buvo panaudota 2 mM). Michaelio konstantos priemonės ir standartinės paklaidos ( K m) ir fermentų apyvartą ( k katė) vertės buvo gautos netiesiškai pritaikant mažiausiuosius kvadratus pagal Michaelis–Menten modelį.Šių konstantų pritaikymas normalizuotoje lygtyje v  = ( k katė/ K m)[S]/(1 + [S]/ K m) gautos katalizinio efektyvumo vertės ( k katė/ K m) su atitinkamomis standartinėmis paklaidomis.

Norint ištirti išankstinio inkubavimo, esant skirtingoms pH vertėms, poveikį aktyvumui, devyni POD buvo ištirpinti (0,05 μM) Britton-Robinson (B&R) buferyje, kurio pH svyruoja nuo 2 iki 9, ir laikomi 4°C temperatūroje. skirtingi laikotarpiai. Aktyvumas buvo nustatytas oksiduojant prisotintą ABTS koncentraciją (5 mM, išskyrus MnP1-1096331 ir MnP6-1041740, kurioms buvo naudojama 2 mM) 0,1 M tartrate (pHك,5) aukščiau aprašytomis sąlygomis. . Likutinis aktyvumas buvo matuojamas po 1 minutės (norint įvertinti pradinį fermento išgyvenimą esant kiekvienai pH vertei) ir 1, 4, 24 ir 120 valandų inkubacijos. Didžiausias aktyvumas po 1 minutės (esant bet kokiam pH) buvo laikomas 100% aktyvumu, o liekamojo aktyvumo procentas skirtingu laiku ir pH sąlygomis buvo apskaičiuotas pagal šią maksimalią vertę. Tas pats eksperimentas buvo pakartotas su stabilesniu (MnP4) ir mažiau stabiliu fermentu (MnP3), laikant juos 25 ° C, o ne 4 ° 176 ° C temperatūroje.

Šiluminio inaktyvavimo tyrimai

Norint ištirti fermentų išankstinio inkubavimo skirtingose ​​temperatūrose poveikį aktyvumui, devyni POD (0,05 μM) 10 mM tartrate (pHم) buvo inkubuojami 5°C temperatūroje 10 minučių arba 4 valandas. diapazonas nuo 25 iki 70°C. Likutinis aktyvumas buvo nustatytas 25 °C temperatūroje, kaip aprašyta aukščiau, o aktyvumas, gautas po išankstinio inkubavimo 25 °C temperatūroje, buvo laikomas 100%. Temperatūros stabilumas buvo pateiktas kaip 10 minučių ir 4 valandos T50 veiklos vertės, tai yra , temperatūra, kuriai esant 50 % aktyvumo buvo prarasta po inkubacijos aukščiau nurodytu laikotarpiu.

CD ir UV matoma sugerties spektroskopija

PH ir temperatūros poveikis skirtingų POD struktūrai ir kofaktorių surišimui buvo stebimas CD ir UV matomos absorbcijos spektroskopijos. Tolimųjų UV spindulių (190–250 nm) CD matavimai buvo atlikti J-720 spektropoliarimetru (Jasco, Oklahoma City, OK, JAV), turinčiu Peltier temperatūros reguliatorių ir termostatuotą elementų laikiklį, naudojant 0,01  cm kelio ilgį. kvarco ląstelė. Trijų pH (3, 5 ir 8) poveikis CD spektrams buvo įvertintas skirtingais inkubacijos laikais (1 min., 1 valanda ir 4 val.), kai baltymų koncentracija buvo maždaug 50 μM 0,1&# 160 mM B&R buferis, esant 25 ir 176 °C temperatūrai. Spektrai iš penkių vidutinių nuskaitymų buvo pakoreguoti atsižvelgiant į pradinį buferio įnašą, o pastebėtos elipsės buvo paverstos vidutinėmis likučių elipsėmis (θ). Temperatūros poveikis CD spektrams buvo analizuojamas esant maždaug 5 μM baltymo koncentracijai 0,01 mM fosfate (pHن). Terminis denatūravimas buvo įvertintas padidinus temperatūrą nuo 20 iki 70 °C, esant 20 °C.h -1, ir įrašant CD signalą esant 222  nm. Tm reiškia temperatūrą išsiskleidžiančio perėjimo viduryje. UV matomi (nuo 300 iki 800 & # 160 nm) dviejų baltymų sugerties spektrai po inkubacijos esant skirtingam pH ir temperatūrai buvo gauti naudojant 8453E diodų matricos spektrofotometrą (Agilent, Santa Clara, CA, JAV), naudojant 1 ir # 160 cm ilgio kelią. kvarco ląstelė. Trijų pH (3, 5 ir 8) poveikis po skirtingų inkubavimo laikų (0, 30, 60, 90, 120, 180 ir 240 minučių) buvo įvertintas, kai baltymų koncentracija yra maždaug 3,5 μM 0,1  mM B&R buferis, esant 25°C. Įvairių POD UV spinduliuose matomi spektrai taip pat buvo renkami 25–70 °C diapazone po 10 minučių inkubacijos 5–176 °C intervalais, naudojant maždaug 2 μM baltymų koncentraciją 10 mM tartrate (pH&). #1605). T50-Soret reiškia temperatūrą hemo praradimo perėjimo viduryje, įvertintą Soret juostos intensyvumu ties 407 nm.

Lignino modelio dimero oksidacinis skaidymas

Fermentinė sintetinio lignino depolimerizacija

Radioaktyviai pažymėtas siringil-guajacilo DHP (su siringilo/guajacilo santykiu maždaug 4:1) buvo pagamintas kopolimerizuojant β-[14C]-sinapilo alkoholį (0,01 mCi.mmol-1) ir nepažymėtą koniferilą. alkoholis, naudojant krienų peroksidazę ir frakcionuotas 1,8 ×󈎢  cm kolonėlėje su Sephadex LH-20 N,N-dimetilformamidu. Didelės molekulinės masės frakcijos, pašalintos iš kolonėlės (>1  kDa), buvo sujungtos, kad būtų galima naudoti depolimerizacijos eksperimentuose64.

ABTS: 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonatas) B&R: Britton-Robinson CAPS: N-cikloheksil-3-aminopropansulfonrūgštis CD: žiedinis dichroizmas DHP: dehidrogenavimo polimeras (ligninas) DMP: 2,6 -dimetoksifenolis dNTP: dezoksiribonukleotido trifosfatai DOE: Energetikos departamentas DyP: Dažų spalvą mažinanti peroksidazė GC-MS: Dujų chromatografija–masių spektrometrija GP: Bendroji peroksidazė GPC: Gelio prasiskverbimo chromatografija HPES: 4-a-zi-hidroksiperonsulfoninė LC-1-hidroksiperoninė LC. : Aukštos kokybės skysčių chromatografija HTP: Heme-tiolato peroksidazė IPTG: Izopropil-β-D-tiogalaktopiranozidas JGI: Jungtinis genomo institutas kcat: Katalizinė konstanta Km: Michaelio konstanta LiP: Lignino peroksidazė LRET: Ilgojo nuotolio elektronų pernešimas MnP: Mangano peroksidazė PGR: polimerazės grandininė reakcija PDB: baltymų duomenų bankas PEG: polietilenglikolis POD: II klasės peroksidazė iš negyvūninių (augalų-grybelinių-prokariotinių) peroksidazių šeimos RB5: reaktyvus juodas 5 Rz: Reinheitszahl UPGMA: nesverta pora grupės metodas su aritmetiniu vidurkiu VA: Veratrilo alkoholis VP: Universali peroksidazė.

Autoriai pareiškia, kad neturi konkuruojančių interesų.

ATM ir FJR-D sumanė ir suprojektavo eksperimentus. FJM atliko kristalografinį tyrimą. EF-F, FJR-D ir FJM atliko eksperimentus. EF-F, FJR-D, FJM, AR, MJM, KEH ir bankomatas analizavo duomenis. Bankomatas, FJM ir KEH parašė dokumentą. Visi autoriai perskaitė ir patvirtino galutinį rankraštį.

Šis darbas buvo paremtas Europos Sąjungos PEROXICATS (KBBE-2010-4-265397) ir INDOX (KBBE-2013-7-613549) dotacijomis (ATM), BIO2011-26694 (FJR-D) ir BFU2011. -24615 (AR) iš Ispanijos ekonomikos ir konkurencingumo ministerijos (MINECO), o JAV DOE suteikė DE-AI02-07ER64480 (KEH). JAV DOE JGI atliekamą darbą remia JAV DOE mokslo biuras pagal sutarties numerį DE-AC02-05CH11231. AG Pisabarro (Navaros viešasis universitetas, Pamplona, ​​Ispanija) yra pripažintas už P. ostreatus genomo projekto koordinavimą. Dėkojame Michael D Mozuch už pagalbą atliekant lignino depolimerizacijos tyrimus. EF-F pripažįsta CSIC Junta de Ampliación de Estudios stipendiją, kurią bendrai finansuoja Europos socialinis fondas, o FJR-D pripažįsta MINECO Ramón y Cajal sutartį.

Pleurotus ostreatus ir kitų valgomųjų grybų auginimas

Pleurotus vaisiakūniuose yra 3-hidroksi-3-metilglutaril-kofermento-A reduktazės-lovastatino inhibitorių

Iš Pleurotus pulmonarius grybienos ir vaisiakūnių išskirtų polisacharidų cheminis apibūdinimas, antiproliferacinės ir antiadhezinės savybės

Mikrobinis lignino skaidymas: kaip gamtoje efektyviai perdirbamas tūrinis nepaklusnus polimeras ir kaip galime tuo pasinaudoti

Nemedinių medžiagų biopulpingo pažanga: cheminiai, fermentiniai ir ultrastruktūriniai kviečių šiaudų delignifikacijos aspektai su ligninoliziniais grybais iš Pleurotus genties

Niujorkas: Johnas Wiley ir sūnūs

Pleurotus rūšių įvertinimas kviečių šiaudų biopuliavimui

Kviečių šiaudų sudedamųjų dalių cheminė transformacija po kietosios būsenos fermentacijos pasirinktais lignoceliuliozę ardančiais grybais

Grybelinis apdorojimas: alternatyva antros kartos etanoliui iš kviečių šiaudų

Kelias į priekį biokuro ir biomedžiagų srityje

Fermentinis augalų ląstelių sienelių delignifikavimas: nuo gamtos iki malūno

Lignoceliuliozę ardančio grybelio Phanerochaete chrysosporium padermės RP78 genomo seka

Medienos irimo grybelio Postia placenta genomo, transkripto ir sekrecijos analizė palaiko unikalius lignoceliuliozės konversijos mechanizmus

Augalų ląstelių sieneles ardančios mašinos yra miško grybų funkcinės įvairovės pagrindas

Lyginamoji Ceriporiopisis subvermispora ir Phanerochaete chrysosporium genomika suteikia informacijos apie selektyvią ligninolizę

Fermentinio lignino skilimo paleozojaus kilmė, atkurta iš 31 grybelio genomo

Pleurotus ostreatus hemo peroksidazės: in silico analizė nuo genomo sekos iki fermento molekulinės struktūros

Ligniną ardančių hemo peroksidazių molekulinė biologija ir struktūra-funkcija

Peroksidazių, galinčių tapti pramoniniais biokatalizatoriais, struktūrinės ir funkcinės savybės

DyP, unikali dažų spalvą mažinanti peroksidazė, atstovauja naujai hemo peroksidazės šeimai.

Genominių ir komplementarių DNR, koduojančių Pleurotus ostreatus mangano (II) peroksidazę, struktūros

Ligninolizė naudojant išgrynintą lignino peroksidazę

Mangano peroksidazės izofermentai, kuriuos gamina Pleurotus ostreatus, auginami ant medienos pjuvenų

cDNR ir genomo fragmentų, koduojančių pagrindinį mangano peroksidazės izofermentą, išskyrimas iš baltojo puvinio bazidiomiceto Pleurotus ostreatus

Mangano peroksidazės izofermentų gamyba ir indukcija baltojo puvinio grybuose Pleurotus ostreatus

Pleurotus ostreatus mangano peroksidazės izofermento biocheminis ir molekulinis apibūdinimas

Naujos peroksidazės, išskirtos iš ligninolizinio grybelio Pleurotus eryngii, molekulinis apibūdinimas

Universalios peroksidazės, dalyvaujančios natūraliame lignino skaidyme, aprašymas, turinčios ir Mn-peroksidazės, ir lignino-peroksidazės substrato surišimo vietas

Substrato oksidacijos vietos universaliose peroksidazėse ir kitose bazidiomicetų peroksidazėse

Tetramerinio nefenolinio lignino modelio junginio oksidavimas lignino peroksidaze

Pleurotus eryngii ir Bjerkandera adusta manganą oksiduojančių peroksidazių substratų redukavimo tyrimas

Dvi oksidacijos vietos žemo redokso potencialo substratams: kryptinga mutagenezė, kinetinis ir kristalografinis Pleurotus eryngii universalios peroksidazės tyrimas

Įvairios grybelinės manganą oksiduojančios peroksidazės: palyginimas tarp Bjerkandera sp. ir Phanerochaete chrysosporium

Mangano peroksidazių iš kraiką ardančių bazidiomicetų Agrocybe praecox ir Stropharia coronilla valymas ir apibūdinimas

Baltymų radikalai grybelinėje universalioje peroksidazėje: katalizinis triptofano radikalas tiek junginiuose I, tiek junginiuose II ir W164Y, W164H ir W164S variantų tyrimai

Mangano peroksidazės kristalinė struktūra iš Phanerochaete chrysosporium esant 2,06-Å skyrai

Didelės skiriamosios gebos mangano peroksidazės kristalinė struktūra: substrato ir inhibitorių kompleksai

Ypatingai didelės (0,93 angstromo) skiriamosios gebos mangano peroksidazės struktūra iš Phanerochaete chrysosporium: poveikis kataliziniam mechanizmui

Lignino peroksidazės kristalografinis tobulinimas esant 2 Å

Veratrilo alkoholio katijono radikalo stabilizavimas lignino peroksidaze

Lignino peroksidazė iš Phanerochaete chrysosporium. Izofermentų molekulinis ir kinetinis apibūdinimas

Phanerochaete chrysosporium lignino peroksidazės izofermentų fizinės ir fermentinės savybės

Naujausi ligninolizinių grybų molekulinės genetikos pasiekimai

Lignino peroksidazės izofermentai iš Phanerochaete chrysosporium gali būti fermentiškai defosforilinti

Lignino peroksidazės ir mangano (II) peroksidazės izofermentai iš baltojo puvinio bazidiomiceto Trametes versicolor. II. Dalinės sekos, peptidų žemėlapiai ir aminorūgščių bei angliavandenių kompozicijos

Ligniną skaidančios peroksidazės Polyporales: evoliucinis tyrimas, pagrįstas dešimčia sekvenuotų genomų

Ligniną skaidančios peroksidazės iš selektyvaus ligninolizinio grybelio Ceriporiopsis subvermispora genomo

Mangano peroksidazių perteklius Pleurotus ostreatus

Grybienos augimo kinetika ir optimalios temperatūros sąlygos valgomųjų grybų rūšių auginimui ant lignoceliuliozės substratų

Lignino peroksidazė H2 iš Phanerochaete chrysosporium: gryninimas, apibūdinimas ir stabilumas temperatūrai bei pH

Bis(histidil) hemo geležies komplekso susidarymas mangano peroksidazėje esant aukštam pH ir natūralios fermento struktūros atkūrimas kalciu

Grįžtamasis šarminis lignino peroksidazės inaktyvavimas apima tiek distalinės, tiek proksimalinės vietos kalcio jonų išsiskyrimą ir hemo bihistidino koordinavimą.

Baltymų stabilumo didinimas gerinant b posūkius

Krienų peroksidazė: savybių moduliavimas cheminiu būdu modifikuojant baltymą ir hemą

Į DyP panašios želė grybelio Auricularia auricula-judae peroksidazės oksiduoja nefenolinius lignino modelio junginius ir didelio redokso potencialo dažus

DypB iš Rhodococcus jostii RHA1 kaip lignino peroksidazės identifikavimas

Oksidacinis nefenolinių beta-O-4 lignino modelio dimerų skilimas ekstraląsteline aromatine peroksigenaze

Naujos ir klasikinės išskiriamų grybų hemo peroksidazių šeimos

Ligniną skaidantis fermentas iš himenomiceto Phanerochaete chrysosporium Burds

Mangano (II) oksidacija mangano peroksidaze iš bazidiomiceto Phanerochaete chrysosporium. Kinetinis mechanizmas ir chelatorių vaidmuo

Pleurotus eryngii universalios peroksidazės ekspresija Escherichia coli ir lankstymo in vitro optimizavimas

Nepaklusnių nefenolinių lignino struktūrų grybelinis skilimas be lignino peroksidazės


Anumula, K. R. ir Taylor, P. B. (1992). Išsami iš dalies metilinto alditolio acetato gavimo iš glikoproteininių angliavandenių procedūra. Anal. Biochem. 203, 101�. doi: 10.1016/0003-2697(92)90048-c

Aquino-Lopez, A., Senyukov, V. V., Vlasic, Z., Kleinerman, E. S. ir Lee, D. A. (2017). Gama interferonas sukelia natūralių žudikų (NK) ląstelių ligandų ekspresijos pokyčius ir keičia NK ląstelių sukeltą vaikų vėžio ląstelių linijų lizę. Priekyje. Immunol. 8:391. doi: 10.3389/fimmu.2017.00391

Balkwill, F. (2009). Naviko nekrozės faktorius ir vėžys. Nat. Kunigas Vėžys 9, 361�. doi: 10.1038/nrc2628

Bano, Z. ir Srivastava, H. C. (1962). Auginimo tyrimai Pleurotas sp. ant žaliavinių šiaudų. Maisto Sci. 12, 363�.

Bauer, S., Groh, V., Wu, J., Steinle, A., Phillips, J. H., Lanier, L. L. ir kt. (1999). NK ląstelių ir T ląstelių aktyvinimas NKG2D, streso sukeliamo MICA receptoriumi. Mokslas 285, 727�. doi: 10.1126/mokslas.285.5428.727

Cao, X. Y., Liu, J. L., Yang, W., Hou, X. ir Li, Q. J. (2015). Iš Pleurotus ostreatus mycelia išskirto polisacharido priešnavikinis aktyvumas prieš skrandžio vėžį in vitro ir in vivo. Mol. Med. Rep. 12, 2383�. doi: 10.3892/mmr.2015.3648

Chihara, G., Hamuro, J., Maeda, Y., Arai, Y. ir Fukuoka, F. (1970). Priešnavikinis polisacharidas, chemiškai gautas iš natūralaus gliukano (pachimano). Gamta 225, 943�. doi: 10.1038/225943a0

Cerboni, C., Fionda, C., Soriani, A., Zingoni, A., Doria, M., Cippitelli, M. ir kt. (2014). DNR pažeidimo atsakas: įprastas būdas reguliuoti NKG2D ir DNAM-1 ligandų ekspresiją normaliose, užkrėstose ir vėžio ląstelėse. Priekyje. Immunol. 4:508. doi: 10.3389/fimmu.2013.00508

Daba, A. S. ir Ezeronye, ​​O. U. (2003). Iš aukštesnių bazidiomicetų grybų išskirtų polisacharidų priešvėžinis poveikis. Afr. J. Biotechnol. 2, 672�. doi: 10.5897 / ajb2003.000-1123

Deepalakshmi, K. ir Mirunalini, S. (2014). Toksikologinis įvertinimas Pleurotus ostreatus Sprague Dawley žiurkėse. Tarpt. J. Nutr. Pharmacol. Neurol. Dis. 4, 139�.

Denman, C. J., Senyukov, V. V., Somanchi, S. S., Phatarpekar, P. V., Kopp, L. M., Johnson, J. L. ir kt. (2012). Su membrana surištas IL-21 skatina ilgalaikį žmogaus natūralių žudikų ląstelių proliferaciją ex vivo. PLoS One 7:e30264. doi: 10.1371/journal.pone.0030264

Diefenbach, A., Schindler, H., Donhauser, N., Lorenz, E., Laskay, T., MacMicking, J. ir kt. (1998). 1 tipo interferonas (IFNalpha/beta) ir 2 tipo azoto oksido sintazė reguliuoja įgimtą imuninį atsaką į pirmuonių parazitą. Imunitetas 8, 77�. doi: 10.1016/s1074-7613(00)80460-4

Dillon, S., Agrawal, S., Banerjee, K., Letterio, J., Denning, T. L., Oswald-Richter, K. ir kt. (2006). Mielių zimozanas, TLR2 ir dektino-1 stimulas, sukelia reguliuojančias antigenus pateikiančias ląsteles ir imunologinę toleranciją. J. Clin. Investuoti. 116, 916�. doi: 10.1172 / JCI27203

El Enshasy, H. A. ir Hatti-Kaul, R. (2013). Grybų imunomoduliatoriai: unikalios molekulės su neribotais pritaikymais. Tendencijos Biotechnol. 31, 668�. doi: 10.1016/j.tibtech.2013.09.003

Gasser, S., Orsulic, S., Brown, E. J. ir Raulet, D. H. (2005). DNR pažeidimo kelias reguliuoja įgimtus NKG2D receptoriaus imuninės sistemos ligandus. Gamta 436, 1186�. doi: 10.1038/nature03884

Glas, R., Franksson, L., Une, C., Eloranta, M. L., Ohlen, C., Orn, A. ir kt. (2000). Natūralių žudikų (NK) ląstelių įdarbinimas ir aktyvinimas in vivo, nustatomas pagal tikslinės ląstelės fenotipą. Adaptyvusis NK ląstelių sukeltų atsakų komponentas. J. Exp. Med. 191, 129�. doi: 10.1084/jem.191.1.129

Goodridge, J. P., Witt, C. S., Christiansen, F. T. ir Warren, H. S. (2003). KIR2DL4 (CD158d) genotipas įtakoja ekspresiją ir funkciją NK ląstelėse. J. Immunol. 171, 1768�. doi: 10.4049/jimmunol.171.4.1768

Guggenheim, A. G., Wright, K. M. ir Zwickey, H. L. (2014). Imuninė moduliacija iš penkių pagrindinių grybų: taikymas integracinei onkologijai. Integr. Med. 13, 32�.

Herberman, R. B., Nunn, M. E. ir Lavrin, D. H. (1975). Natūralus citotoksinis pelių limfoidinių ląstelių reaktyvumas prieš singeninės rūgšties alogeninius navikus. I. Reaktyvumo ir specifiškumo pasiskirstymas. Tarpt. J. Vėžys 16, 216�. doi: 10.1002/ijc.2910160204

Hong, L., Weiyu, W., Qin, W., Shuzhen, G. ir Lebin, W. (2012). Antioksidacinis ir imunomoduliacinis α-gliukano poveikis iš maitake (Grifola frondosa) vaisiaus kūno. Maisto žemės ūkio. Immunol. 24, 409�. doi: 10.1080/09540105.2012.704901

Jyothi, M. D. ir Khar, A. (2000).Interleukino-2 sukelta azoto oksido sintazės ir branduolinio faktoriaus-kappaB aktyvumas aktyvuotose natūraliose žudikų ląstelėse ir gama interferono gamyba. Scand. J. Immunol. 52, 148�. doi: 10.1046 / j.1365-3083.2000.00762.x

Kodama, N., Komuta, K. ir Nanba, H. (2003). Maitake (Grifola frondosa) D-frakcijos poveikis NK ląstelių aktyvacijai vėžiu sergantiems pacientams. J. Med. Maistas 6, 371�. doi: 10.1089/109662003772519949

Lauwerys, B. R., Garot, N., Renauld, J. C. ir Houssiau, F. A. (2000). NK/T-NK ląstelių, gautų naudojant IL-2, IL-15 arba IL-12 ir IL-18 derinį, citokinų gamyba ir žudikų aktyvumas. J. Immunol. 165, 1847�. doi: 10.4049/jimmunol.165.4.1847

Leonce, S., Perez, V., Lambel, S., Peyroulan, D., Tillequin, F., Michel, S. ir kt. (2001). Ciklino E indukcija ir DNR sintezės slopinimas nauju akronicino dariniu S23906-1 yra prieš negrįžtamą naviko ląstelių sustabdymą S fazėje, sukeliančią apoptozę. Mol. Pharmacol. 60, 1383�. doi: 10.1124/mol.60.6.1383

Lohr, H. F., Goergen, B., Meyer zum Buschenfelde, K. H. ir Gerken, G. (1995). HCV replikacija mononuklearinėse ląstelėse stimuliuoja anti-HCV išskiriančias B ląsteles ir atspindi nereaguojimą į interferoną-alfa. J. Med. Virol. 46, 314�. doi: 10.1002/jmv.1890460405

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. ir Randall, R. J. (1951). Baltymų matavimas naudojant Folin fenolio reagentą. J. Biol. Chem. 193, 265�.

Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. ir Lee, Y. C. (2005). Angliavandenių analizė fenolio-sieros rūgšties metodu mikroplokštelės formatu. Anal. Biochem. 339, 69�. doi: 10.1016/j.ab.2004.12.001

Mitani, M., Iwano, K., Arika, T. ir Kikuchi, M. (1982). [Eksperimentinis imunochemoterapijos, naudojant šizofilaną, tyrimas]. Gan To Kagaku Ryoho 9, 122�.

Nouroz, F., Bibi, F., Noreen, S. ir Masood, N. (2016). Natūralios žudikų ląstelės sustiprina imuninę vėžio priežiūrą. Egiptas. J. Med. Hum. Genet. 17, 149�. doi: 10.1016/j.ejmhg.2015.08.006

Ooi, V. E. ir Liu, F. (2000). Polisacharidų ir baltymų kompleksų imunomoduliacija ir priešvėžinis aktyvumas. Curr. Med. Chem. 7, 715�. doi: 10.2174/0929867003374705

Orucevic, A. ir Lala, P. K. (1996). N(G)-nitro-L-arginino metilo esterio, azoto oksido sintezės inhibitoriaus, poveikis IL-2 sukeltai LAK ląstelių gamybai in vivo ir in vitro sveikose ir auglių turinčiose pelėse. Ląstelių imunolis. 169, 125�. doi: 10.1006/cimm.1996.0100

Rajagopalan, S. ir Long, E. O. (2012). KIR2DL4 (CD158d): HLA-G aktyvinimo receptorius. Priekyje. Immunol. 3:258. doi: 10.3389/fimmu.2012.00258

Santander, J., Martin, T., Loh, A., Pohlenz, C., Gatlin, D. M. ir Curtiss, R. (2013). Edwardsiella ictaluri vidinio atsparumo antimikrobiniams peptidams mechanizmai ir jo įtaka žuvų žarnyno uždegimui ir virulentiškumui. Mikrobiologija 159(7 p.), 1471�. doi: 10.1099/mic.0.066639-0

Sepulveda, C. ir Puente, J. (2000). [Natūralios žudikų ląstelės ir įgimta imuninė sistema infekcinėje patologijoje]. Med. kun. Chil. 128, 1361�.

Suzuki, I., Hashimoto, K. ir Yadomae, T. (1988). Labai šakoto beta-1,3-gliukano, SSG, gauto iš Sclerotinia sclerotiorum IFO 9395, poveikis pelių singeninių navikų augimui. J. Pharmacobiodyn. 11, 527�. doi: 10.1248/bpb1978.11.527

Takeda, K., Hayakawa, Y., Smyth, M. J., Kayagaki, N., Yamaguchi, N., Kakuta, S. ir kt. (2001). Su naviko nekrozės faktoriumi susijusio apoptozę sukeliančio ligando dalyvavimas stebint naviko metastazes kepenų natūraliomis žudikų ląstelėmis. Nat. Med. 7, 94�. doi: 10.1038/83416

Tanaka, A., Nishimura, M., Sato, Y., Sato, H. ir Nishihira, J. (2016). Th1 fenotipo imuninės sistemos stiprinimas vartojant austrių grybų (Tamogitake) ekstraktą dvigubai aklu, placebu kontroliuojamu tyrimu. J. Tradit. Papildyti. Med. 6, 424�. doi: 10.1016/j.jtcme.2015.11.004

Tsan, M. F. ir Gao, B. (2007). Su patogenu susijęs molekulinio modelio užterštumas kaip galimi endogeniniai Toll tipo receptorių ligandai. J. Endotoksinas. Res. 13, 6�. doi: 10.1177/0968051907078604

Vivier, E., Nunes, J. A. ir Vely, F. (2004). Natūralūs žudikų ląstelių signalizacijos keliai. Mokslas 306, 1517�. doi: 10.1126/mokslas.1103478

Wasser, S. P. (2002). Vaistiniai grybai kaip priešnavikinių ir imunomoduliuojančių polisacharidų šaltinis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 258�. doi: 10.1007/s00253-002-1076-7

Wesselkamper, S. C., Eppert, B. L., Motz, G. T., Lau, G. W., Hassett, D. J. ir Borchers, M. T. (2008). NKG2D yra labai svarbus NK ląstelių aktyvacijai šeimininko gynyboje nuo Pseudomonas aeruginosa kvėpavimo takų infekcija. J. Immunol. 181, 5481�. doi: 10.4049/jimmunol.181.8.5481

Xiao, L., Eneroth, P. H. E. ir Qureshi, G. A. (1995). Azoto oksido sintazės kelias gali tarpininkauti žmogaus natūralių žudikų ląstelių citotoksiškumui. Scand. J. Immunol. 42, 505�. doi: 10.1111/j.1365-3083.1995.tb03687.x

Xu, H. M., Xie, Z. H. ir Zhang, W. Y. (1994). Hericium erinaceus polisacharido imunomoduliacinė funkcija. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi 14, 427�.

Xu, S., Huo, J., Lee, K., Kurosaki, T. ir Lam, K. (2009). Fosfolipazė C㬲 yra labai svarbi dektino-1 sukeltam Ca2+ srautui ir citokinų gamybai dendritinėse ląstelėse. J. Biol. Chem. 284, 7038�. doi: 10.1074/jbc.M806650200

Yim, C. Y., McGregor, J. R., Kwon, O. D., Bastian, N. R., Rees, M., Mori, M. ir kt. (1995). Azoto oksido sintezė prisideda prie IL-2 sukeltų priešnavikinių atsakų prieš intraperitoninį Meth A naviką. J. Immunol. 155, 4382�.

York, W., Darvill, A., McNeil, M., Stevenson, T. ir Albersheim, P. (1986). Augalų ląstelių sienelių ir ląstelių sienelių komponentų išskyrimas ir apibūdinimas. Metodai Enzymol. 118, 3�. doi: 10.1016/b978-0-12-743655-5.50007-5

Zhang, M., Zhang, L. N., Cheung, P. C. K. ir Ooi, V. E. C. (2004). Vandenyje tirpių polisacharidų, išskirtų karštu vandeniu ir ultragarsu iš skleročių ir grybelių, molekulinė masė ir priešnavikinis aktyvumas Pleurotus gumbų regionas. Angliavandeniai. Polym. 56, 123�. doi: 10.1016/j.carbpol.2004.01.005

Raktažodžiai: NK ląstelės, grybas, Pleurotus ostreatus, krūties vėžys, plaučių vėžys, polisacharidai, gliukanai

Citata: EL-Deeb NM, EL-Adawi HI, EL-wahab AEA, Haddad AM, EL Enshasy HA, He Y-W ir Davis KR (2019) NKG2D, KIR2DL ir citokinų gamybos moduliavimas Pleurotus ostreatus Gliukanas sustiprina natūralių žudikų ląstelių citotoksiškumą vėžio ląstelėms. Priekyje. Cell Dev. Biol. 7:165. doi: 10.3389/fcell.2019.00165

Gauta: 2019 m. balandžio 14 d. Priimta: 2019 m. liepos 30 d
Paskelbta: 2019 m. rugpjūčio 13 d.

Bin Li, Šanchajaus Jiao Tong universiteto medicinos mokykla, Kinija

Haimingas Wei, Kinijos mokslo ir technologijų universitetas, Kinija
Yan Wu iš Sun Yat-sen universiteto, Kinija

Autorių teisės © 2019 EL-Deeb, EL-Adawi, EL-wahab, Haddad, EL Enshasy, He ir Davis. Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal Creative Commons Attribution License (CC BY) sąlygas. Naudojimas, platinimas ar atgaminimas kituose forumuose yra leidžiamas, su sąlyga, kad pirminis (-i) autorius (-ai) ir autorių teisių savininkas (-iai) yra nurodyti ir cituojamas originalus leidinys šiame žurnale, laikantis priimtos akademinės praktikos. Neleidžiama naudoti, platinti ar dauginti, jei nesilaikoma šių sąlygų.


Žiūrėti video įrašą: Growing oyster mushrooms- how to get the most oyster mushrooms you possibly can from every block (Gegužė 2022).