Informacija

GFP ekstinkcijos koeficiento apskaičiavimas

GFP ekstinkcijos koeficiento apskaičiavimas


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Baltymų įsisavinimą noriu paversti koncentracija. Taigi reikia apskaičiuoti baltymo ekstinkcijos koeficientą (GFP). Internete radau formulę (nTrp)5500+(nTyr)1490, bet negaliu jos naudoti, nes nesuprantu, ką reiškia n prieš aminorūgštis ir kaip pasiekti n reikšmę


Tik aromatinių aminorūgščių triptofano (Trp) ir tirozino (Tyr) kiekis jūsų baltyme labai prisideda prie jo absorbcijos esant 280 nm (ir cisteino (Cys), nors ir mažesniu mastu), taip pat žr. .

Galite gauti baltymo aminorūgščių seką iš uniprot (žr. GFP čia). Žvelgiant per GFP seką, galima nustatyti n=11 (4,6 %) Tyr ir n=1 (0,4 %) Trp. Dabar galite juos įterpti į savo formulę ir gauti ekstinkcijos koeficientą 21'890 M^-1 * cm^-1. Ši formulė galioja tik tuo atveju, jei visos Cys yra sumažintos (GFP turi n = 2 Cys, kurios gali sudaryti disulfido tiltelį).

Jei norite išvengti visų formulių, siūlau nukopijuoti GFP seką ir įklijuoti ją į ExPASy ProtParam. Tokiu būdu gausite gražią savo baltymų aminorūgščių pasiskirstymo apžvalgą ir taip pat gausite ekstinkcijos koeficientą oksiduojančiomis sąlygomis, kurių BTW yra 22'015 M^-1 * cm^-1.


Abstraktus

Fonas: Žaliojo fluorescencinio baltymo (GFP) variantai su skirtingomis spalvomis būtų labai naudingi vienu metu lyginant kelis baltymų likimus, vystymosi linijas ir genų ekspresijos lygius. Paprasčiausias būdas pakeisti GFP emisijos spalvą yra tiroziną chromofore pakeisti histidinu arba triptofanu, tačiau tokie mėlynai pasislinkę taškiniai mutantai yra tik silpnai fluorescuojantys. Ilgiausi anksčiau nurodyti GFP mutantų sužadinimo ir emisijos smailių bangos ilgiai yra atitinkamai 488 ir 511 nm.

Rezultatai Papildomi pakeitimai, daugiausia 145–163 liekanose, pagerino mėlynai pasislinkusių GFP mutantų ryškumą su histidinu ir triptofanu vietoj tirozino 66. Dėl atskirų mutacijų labiausiai raudonai pasislinkusio mutanto sužadinimo ir emisijos smailės buvo padidintos iki 504 ir 514 nm, atitinkamai. Dabar mikroskopu galima aiškiai atskirti bent tris skirtingas GFP mutantų spalvas, naudojant atitinkamus filtrų rinkinius. Sulietas baltymas, susidedantis iš susietų mėlynai ir žaliai fluorescencinių baltymų, pasižymi fluorescencinės rezonanso energijos perdavimu, kurį sutrikdo proteolitinis jungties tarp dviejų domenų skilimas.

Išvada Mūsų rezultatai rodo, kad gaminti daugiau ir geresnių GFP variantų yra įmanoma ir verta. Tokių variantų gamyba palengvina diferencinės genų ekspresijos, baltymų lokalizacijos ar ląstelių likimo daugiaspalvį vaizdą. Susiliejimas tarp skirtingų spalvų mutantų gali būti naudingi substratai tęstiniam procesui savo vietoje proteazių tyrimas. Energijos perdavimo tarp GFP variantų demonstravimas yra svarbus žingsnis kuriant bendrą sulietų baltymų abipusio susiejimo stebėjimo metodą.

Roger Heim ir Roger Y. Tsien (autorius atitinkantis), Howard Hughes medicinos institutas 0647 ir Farmakologijos katedra, Kalifornijos universitetas, San Diegas, La Jolla, Kalifornija 92093-0647, JAV.


GFP ekstinkcijos koeficiento apskaičiavimas - Biologija

Ištyrėme penkių žalių fluorescencinių baltymų (GFP) variantų, kurie buvo plačiai naudojami arba gali būti naudingi, savybes, svarbias kiekybiniam vaizdavimui gyvose ląstelėse. Išmatavome wtGFP, alfaGFP (F99S/M153T/V163A), S65T, EGFP (F64L/S65T) ir mėlynos spalvos poslinkio varianto EBFP ekstinkcijos koeficientus, kvantinį derlių, pH efektus, fotobalinimo efektus ir nuo temperatūros priklausomą chromoforų susidarymą. (F64L/S65T/Y66H/Y145F). Absorbcijos ir fluorescencijos spektroskopija parodė nedidelį skirtumą tarp wtGFP ir alfaGFP ekstinkcijos koeficientų ir kvantinių derlių. Priešingai, dėl S65T ir EGFP ekstinkcijos koeficientų jie abu buvo maždaug 6 kartus ryškesni nei wtGFP, kai sužadinami esant 488 nm, o EBFP absorbavo stipriau nei wtGFP, kai buvo sužadintas beveik UV bangos ilgio srityje, nors jo kvantinis efektyvumas buvo daug mažesnis. . Kai GFP buvo sužadintas esant 488 nm, visi jie buvo atsparesni fotobalinimui nei fluoresceinas. Tačiau wtGFP ir alfaGFP fotobalinimo modeliai parodė pradinį fluorescencijos emisijos padidėjimą, kurį sukėlė baltymo chromoforo fotokonversija. WtGFP fluorescencija sumažėjo greičiau, kai buvo sužadinta 395 nm, nei 488 nm, tačiau ji vis tiek buvo stabilesnė nei EBFP, kai buvo sužadinta tokiu bangos ilgiu. WtGFP ir alfaGFP buvo gana stabilūs plačiame pH diapazone, tačiau kitų variantų fluorescencija greitai sumažėjo žemiau pH 7. Nustatyta, kad bakterijose chromoforų susidarymas wtGFP ir S65T buvo mažiau efektyvus esant 37 laipsnių C nei 28 laipsnių temperatūrai. C, tačiau kiti trys variantai parodė nedidelius skirtumus tarp 37 laipsnių C ir 28 laipsnių C. Apibendrinant galima pasakyti, kad nė vienas GFP variantas nėra idealus kiekvienam pritaikymui, tačiau kiekvienas iš jų turi privalumų ir trūkumų kiekybiniam vaizdavimui gyvose ląstelėse.


Monomerinis raudonas fluorescencinis baltymas

Visi iki šiol klonuoti koelenteratiniai fluorescenciniai baltymai turi tam tikrą ketvirtinę struktūrą, įskaitant silpną Aequorea žalio fluorescencinio baltymo (GFP) polinkį dimerizuoti, privalomą Renilla GFP dimerizaciją ir privalomą raudonai fluorescencinio baltymo iš Discosoma (DsRed) tetramerizaciją. . Nors silpna Aequorea GFP dimerizacija nesutrukdė jo pripažinti nepakeičiama ląstelių biologijos priemone, privaloma DsRed tetramerizacija labai trukdė jį naudoti kaip genetiškai užkoduotą sintezės žymą. Pateikiame laipsnišką DsRed evoliuciją iki dimero, o vėliau arba į genetinį dviejų baltymo kopijų susiliejimą, ty tandeminį dimerą, arba į tikrą monomerą, pavadintą mRFP1 (monomerinis raudonas fluorescencinis baltymas). Kiekviena subvieneto sąsaja buvo sutrikdyta įterpus argininus, kurie iš pradžių sugadino gautą baltymą, tačiau raudoną fluorescenciją buvo galima išgelbėti atsitiktine ir nukreipta mutageneze, iš viso 17 pakaitalų dimeryje ir 33 mRFP1. Tarpo jungties baltymo connexin43 susiliejimas su mRFP1 sudarė visiškai veikiančias jungtis, o analogiški suliejimai su tetrameru ir dimeru nepavyko. Nors mRFP1 ekstinkcijos koeficientas, kvantinis derlius ir fotostabilumas yra šiek tiek mažesnis nei DsRed, mRFP1 subręsta >10 kartų greičiau, todėl gyvose ląstelėse jis rodo panašų ryškumą. Be to, mRFP1, 584 ir 607 nm, sužadinimo ir emisijos smailės yra maždaug 25 nm raudonai pasislinkusios nuo DsRed, o tai turėtų užtikrinti didesnį audinių įsiskverbimą ir spektrinį atskyrimą nuo autofluorescencijos ir kitų fluorescencinių baltymų.

Figūros

Grafinis tetramero vaizdas,…

Grafinis DsRed tetramero, dimero ir monomero vaizdas, pagrįstas…

Analitinė DsRed ultracentrifugavimo analizė,…

DsRed, dimer2 ir mRFP0.5a analitinė ultracentrifugavimo analizė. Pusiausvyros radialinės absorbcijos profiliai…

Fluorescencijos ir sugerties spektrai…

DsRed fluorescencijos ir sugerties spektrai ( A ), T1 ( B ),…

Raudonos fluorescencijos brendimas…

DsRed, T1, dimer2, tdimer2(12) ir mRFP1 raudonos fluorescencijos brandinimas. Loginės fazės kultūros…

HeLa ląstelės, ekspresuojančios Cx43, susiliejo…

HeLa ląstelės, ekspresuojančios Cx43, susiliejusios su T1, dimer2 arba mRFP1. ( A ,…


GFP ekstinkcijos koeficiento apskaičiavimas - Biologija

Geografijos, Žemės ir aplinkos mokslų mokykla, Birmingamo universitetas, Edgbaston, Birmingemas, JK
El. paštas: [email protected]

b Chemijos katedra, Kembridžo universitetas, Lensfield Road, Kembridžas, JK

c Centrinė lazerinė įranga, Rutherford Appleton laboratorija, Harvelas, Oksfordas, JK

d Chemijos katedra, Imperial College London, South Kensington Campus, London, JK

Abstraktus

Žalias fluorescencinis baltymas (GFP) yra plačiai naudojamas fluorescencinis zondas gyvosios gamtos ir biomoksluose dėl didelio kvantinio derlingumo ir išnykimo koeficiento bei gebėjimo prisijungti prie dominančių biologinių sistemų. Šis tyrimas matuoja GFP fluorescencijos trukmę žinomo moliškumo sacharozės/vandens tirpaluose, siekiant nustatyti nuo lūžio rodiklio priklausomą GFP gyvavimo trukmę. Lūžio rodiklių diapazonas nuo 1, 43 iki 1, 53 buvo ištirtas levituojant mikrono dydžio lašelius, sudarytus iš vandens / sacharozės / GFP, optinėje gaudyklėje gerai apribotomis santykinės drėgmės sąlygomis. Ši sąranka leidžia pirmą kartą išmatuoti GFP fluorescencijos trukmę, kai lūžio rodikliai yra didesni nei 1,46. Rezultatai, gauti esant mažesniems nei 1,46 lūžio rodikliams, gerai sutampa su ankstesniais tyrimais. Kiti eksperimentai, kurie sulaikė dejonizuoto vandens, turinčio GFP, lašelius, leido išmatuoti GFP higroskopines savybes. Nustatyta, kad GFP pagal masę yra šiek tiek higroskopiškas, tačiau didelis GFP molekulinės masės ir vandens santykis (apytiksliai 1500 : 1) reiškia, kad vandens pasisavinimas yra didelis, skaičiuojant vienam moliui. Higroskopinės savybės tikrinamos naudojant šviesaus lauko mikroskopinį vaizdą, GFP lašelių esant žemai ir aukštai santykinei oro drėgmei, matuojant nuo drėgmės priklausomą lašelių dydį. Be to, šis eksperimentas leido pirmą kartą įvertinti gryno GFP lūžio rodiklį (1,72 ± 0,07). Šiame darbe pateikiami informaciniai duomenys būsimiems eksperimentams, kuriuose dalyvauja GFP, ypač tiems, kurie atliekami didelio lūžio rodiklio terpėse. Darbas taip pat rodo, kad GFP gali būti naudojamas kaip zondas aerozolių tyrimams, kuriems reikia nustatyti bet kokios formos aerozolio lūžio rodiklį.


Superaplankas GFP

Superfolder GFP ištraukų nepridėta
Ištraukos yra ištraukos iš publikacijų, kuriose užfiksuota pagrindinė informacija apie šį baltymą, kuri nelengva tilpti į vieną iš esamų laukų (pvz., santrauka, motyvacija ar pastebėjimas).

Pirminė nuoroda

Superfolder žalio fluorescencinio baltymo inžinerija ir apibūdinimas

(2005). Gamtos biotechnologijos, 24(1), 79-88. doi: 10.1038/nbt1172. Straipsnis paskelbtas

Papildomos nuorodos

Naujas itin stabilus monomerinis žalias fluorescencinis baltymas, skirtas tiesioginiam visų organų tūriniam vaizdavimui naudojant CLARITY

(2018). Mokslinės ataskaitos, 8(1), 667. doi: 10.1038/s41598-017-18045-y. Straipsnis paskelbtas

Sistemingas fluorescencinių baltymų brendimo laiko apibūdinimas gyvose ląstelėse

(2017). Gamtos metodai, 15(1), 47-51. doi: 10.1038/nmeth.4509. Straipsnis paskelbtas

Skirtingi genetiškai užkoduoto fenilazido fotocheminiai įvykiai apibrėžia ir moduliuoja GFP fluorescenciją

(2013). Angewandte Chemie International Edition, 52(23), 5974-5977. doi: 10.1002/anie.201301490. Straipsnis paskelbtas

Sintetinė baltymų biologija: GFP lankstymo ir stabilumo derinimas naudojant fluoroproliną

(2008). PLoS ONE, 3(2) , e1680. doi: 10.1371/journal.pone.0001680. Straipsnis paskelbtas

Žaliojo fluorescencinio baltymo atskirų molekulių fluorescencijos dinamikos palyginimas: vieno ir dviejų fotonų sužadinimas

(2006). ChemPhysChem, 7(1), 250–260. doi: 10.1002/cphc.200500247. Straipsnis paskelbtas

Išoriniai ištekliai

Pridėkite ištrauką

Jei norite pridėti ištraukų į FPbase, turite būti prisijungę

Pridėkite nuorodą

Turite būti prisijungę, kad galėtumėte pridėti nuorodas į FPbase

Pridėkite Superfolder GFP prie savo kolekcijos

Norėdami kurti baltymų kolekcijas, turite būti prisijungę

Spektro vaizdo URL kūrimo priemonė

Dinamiškai generuojamus įvairių formatų spektrinius vaizdus galima atsisiųsti arba įterpti kitur. Ši forma padeda sukurti URL parametrus, kad būtų galima gauti norimą spektrinį vaizdą.


Gamillus

Gamillus, išreikštas HeLa ląstelėse, taip pat parodė fotochrominį fluorescencijos sumažėjimą iki ~60% arba ~10% pradinio intensyvumo, sužadinant 457–487 nm (GFP sužadinimo diapazonas, 470 mW/cm2 40 s) arba 488–512 nm. YFP sužadinimo diapazonas, atitinkamai 360 mW/cm2 40 s) gyvsidabrio lanko šviesa. Sumažėjęs intensyvumas buvo atkurtas vėliau švitinant 352–388 nm šviesa (770 mW/cm2 10 s). Priešingai, tokie nuo laiko priklausomi fluorescencijos intensyvumo pokyčiai buvo nereikšmingi naudojant 440–480 nm sužadinimo šviesą, nes tikėtina, kad ji sukuria fotochrominę pusiausvyrą. Gamillus dominuoja joninėje būsenoje.

Shinoda ir kt. (2018 m.)

Viena iš galimų nereikšmingo fotochromizmo priežasčių yra daug didesnis įjungimo dažnis, palyginti su išjungimo dažniu. Mūsų vertinimu, įjungimo greitis yra

200 kartų didesnis nei išjungimas naudojant 405 nm ir 488 nm lazerinį apšvietimą, esant tokiam pat galios tankiui. Todėl norėdami supaprastinti vaizdavimą, pasirinkome 440–480 nm apšvietimą, kad apribotume fotochrominius reiškinius. Pagal šį sužadinimo bangos ilgio diapazoną in vitro ryškumas Gamillus (apskaičiuotas kaip vidutinių ekstinkcijos koeficientų per 440–480 nm [ɛ440-480] ir kvantinės išeigos sandauga) yra 98 % EGFP (ɛ440-480 Gamillus ir EGFP buvo atitinkamai 28,8 ir 35,4 mM-1 cm-1)


[. ] Siekiant nustatyti įvairių baltymų koncentracijas, šiame tyrime buvo naudojami keli tyrimai, kaip baltymų mėginių paruošimo ir analizės metodas. Coomassie Blue tyrimas remiasi kolorimetrine sąveika tarp papildomų junginių ir baltymų analitės. Naudojant šį metodą, mėginiai, kurių absorbcija yra maža arba visai nėra, gali tapti „matomais“ arba chemiškai pakeičiant komponentą, arba proporcingais kiekiais gaminant alternatyvius junginius. (Congdon, et.al, 1993) Šis plačiai naudojamas metodas dažnai naudojamas dėl jo naudojimo paprastumo ir didelio jautrumo analitei. [. ]

[. ] Šis neatitikimas gali būti paaiškintas tiesiog prabėgusiu reakcijos laiku. Kolorimetriniai tyrimai naudoja komponentų reaktyvumą, kad iš esmės atskleistų junginį tirpale. Jei ši reakcija nesibaigė, gautos reikšmės gali būti netikslios, nes mažesnėms koncentracijoms sureaguoti reikia daug daugiau laiko. (Gore, 2000) Ši sąlyga gali lemti pastebėtą neveiksmingumą, bet taip pat gali būti konkrečiai susijusi su netinkama mėginių ėmimo praktika ir pašalinių junginių įtraukimu. Atrodė, kad kelio ilgio svyravimai atitiko panašią tendenciją, nes padidinus kelio ilgį turėtų padidėti molinė absorbcija. [. ]

[. ] Apskaičiuoti BSA ir gama globulino baltymų ekstinkcijos koeficientai UV absorbcijos spektrofotometrijos metodu Baltymų koncentracija Sugerties kelias Išnykimo bangos ilgis Vidutinis n (ug/ml) Ilgis E-Coef. Koeficientas t bulin bulin bulin Mėginio apskaičiavimas: išnykimo koeficientas Beer Lambert: absorbcija = (išnykimo koeficientas) (koncentracija) (kelio ilgis) 0,608 = E (600 ug/ml) (1 cm) E = 0,608 / 600 ug/ml = 0 0 pav. Standartinės BSA ir gama globulino baltymų kreivės, gautos taikant Lowry tyrimo spektrofotometrinę analizę. 04 lentelė. Interpoliuotos baltymų koncentracijos vertės, taikant BSA standartizaciją Baltymų praskiedimo tyrimas Absorbcija Praskiestas Vid. Koncentracija Koncentracija Koncentracija (ug/ml) faktorius n (ug/ml) n (ug/ml) Mėlyna mėlyna linija Mėlyna linija Mėlyna mėlyna linija linija linija Lentelė Interpoliuotos baltymų koncentracijos vertės taikant gama globulino standartizaciją Baltymų skiedimo tyrimas Absorbcija Atskiestas žaliavos vid. n Koncentracija Koncentracija Koncentracijos faktorius n (ug/ml) n (ug /ml) (ug/ml) Mėlyna Mėlyna linija Mėlyna linija Mėlyna Mėlyna Mėlyna linija Linija 06 lentelė. [. ]

[. ] (Harris, 2007) Taikant atstumą ir sugertį, absorbcija gali būti proporcinga įvairių junginių koncentracijai tirpale. Šis Beer-Lambert įstatymu apibrėžtas santykis remiasi dviem pagrindiniais principais. Kai šviesa praeina pro mėginį, ji proporcingai absorbuojama visoje terpėje, todėl nepriklauso nuo eksperimentinio spektro. Antra, mėginio sugertos šviesos kiekis yra tiesiogiai susijęs su tirpale esančių analitės molekulių kiekiu. (Gore, 2000) Ši reakcija reiškia, kad didėjant molekulių skaičiui mėginyje (koncentracijai), didėja ir bendra šviesos absorbcija. [. ]

[. ] Kiekvieno baltymo koncentracija svyravo daugiau nei 1000 ug/ml, o tai rodo didelį analizės dizaino trūkumą. Gama-globulino standartas lėmė bendrą mažesnį kintamumą, nors vis tiek neviršijo priimtino lygio. 500 ug/ml) (05 lentelė) Hemoglobino baltymas taip pat ypač aiškiai nukrypo nuo kitų baltymų. Kaip minėta anksčiau, UV spektrofotometrija yra jautri trukdančių molekulių įtraukimui. Molekulės, tokios kaip deguonis, lengvai sugeria UV spinduliuotę ir gali iškreipti rezultatus. (Aitken & Learmonth, 2002) Hemoglobino sudėtyje yra geležies komponentų, todėl jis reaguoja surišdamas deguonį kraujyje. [. ]


Nuorodos

Zorman, S., Botte, M., Jiang, Q., Collinson, I. & amp Schaffitzel, C. Membranų ir baltymų komplekso gamybos pažanga ir iššūkiai. Curr. Nuomonė. Struktūra. Biol. 32, 123–130 (2015).

Abdelrasoul, A., Doan, H. ir Lohi, A. in Biomimetinės ir biologiškai įkvėptos membranos naujoms tvaraus vandens valymo technologijos sienoms (IntechOpen, 2017).

Caffrey, M. Išsami lipidų kubinės fazės arba in mezo metodo, skirto membranos ir tirpių baltymų bei kompleksų kristalizavimui, apžvalga. Acta Crystallogr. F. Struktūra. Biol. Komun. 71, 3–18 (2015).

Parker, J. L. & Newstead, S. Membraninių baltymų kristalizacija: dabartinės tendencijos ir ateities perspektyvos. Adv. Exp. Med. Biol. 922, 61–72 (2016).

Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D. ir Iwata, S. Membraninių baltymų kristalografijos iššūkių įveikimas. Curr. Nuomonė. Struktūra. Biol. 18, 581–586 (2008).

Danev, R., Yanagisawa, H. & Kikkawa, M. Krioelektroninės mikroskopijos metodika: dabarties aspektai ir ateities kryptys. Tendencijos Biochem. Sci. 44, 837–848 (2019).

Garcia-Nafria, J. & Tate, C. G. Krioelektroninė mikroskopija: perėjimas prie rentgeno kristalų struktūrų, skirtų vaistų receptoriams ir vaistų kūrimui. Annu. Rev. Pharmacol. Toksikolis. 60, 51–71 (2020).

Cheng, Y. Membraninių baltymų struktūrinė biologija vienos dalelės krio-EM eroje. Curr. Nuomonė. Struktūra. Biol. 52, 58–63 (2018).

Sjostrand, D., Diamanti, R., Lundgren, C. A. K., Wiseman, B. & Hogbom, M. Greitos ekspresijos ir gryninimo sąlygų atrankos protokolas membranos baltymų struktūrinei biologijai. Protein Sci. 26, 1653–1666 (2017).

Ma, P. ir kt. Veiksminga strategija, skirta nedidelio masto archealinių membranų transportavimo baltymų atrankai ir gamybai Escherichia coli. PLoS ONE 8, e76913 (2013).

Lluis, M. W., Godfroy, J. I. 3rd & amp Yin, H. Baltymų inžinerijos metodai, taikomi membranos baltymų taikiniams. Baltymų inž. Des. Sel. 26, 91–100 (2013).

Schutz, M. ir kt. Nukreipta su G baltymu susietų receptorių evoliucija mielėse, siekiant didesnės funkcinės gamybos eukariotų ekspresijos šeimininkuose. Sci. Rep. 6, 21508 (2016).

Eshaghi, S. ir kt. Veiksminga rekombinantinių integruotų membraninių baltymų didelio našumo ekspresijos atrankos strategija. Protein Sci. 14, 676–683 (2005).

Cai, H., Yao, H., Li, T., Tang, Y. ir Li, D. Aukšto lygio heterologinė žmogaus transmembraninės sterolio Δ8, Δ7-izomerazės ekspresija Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 164, 105463 (2019).

Jensen, H. M., Eng, T., Chubukov, V., Herbert, R. A. & Mukhopadhyay, A. Membraninių baltymų ekspresijos ir funkcijos gerinimas naudojant genominius pakeitimus. Sci. Rep. 7, 13030 (2017).

Bernaudit, F. ir kt. Heterologinė membraninių baltymų ekspresija: tinkamo šeimininko pasirinkimas. PLoS ONE 6, e29191 (2011).

Freigassner, M., Pichler, H. & Glieder, A. Mikrobų šeimininkų derinimas membraninių baltymų gamybai. Mikrob. Ląstelės faktas. 8, 69 (2009).

Billas, R. M. Žaisti pasivyti Escherichia coli: mielių naudojimas siekiant padidinti rekombinantinių baltymų gamybos eksperimentų sėkmės rodiklius. Priekyje. Microbiol. 5, 85 (2014).

Parker, J. L. ir Newstead, S. Metodas, kaip padidinti eukariotų membranos baltymų ekspresiją Saccharomyces cerevisiae struktūriniams ir funkciniams tyrimams. Protein Sci. 23, 1309–1314 (2014).

Schlegel, S. ir kt. Pernelyg didelė membranos baltymų ekspresija bakterijose. Mikrob. Biotechnol. 3, 403–411 (2010).

Dilworth, M. V. ir kt. Mikrobų ekspresijos sistemos membraniniams baltymams. Metodai 147, 3–39 (2018).

Wagner, S. ir kt. Derinimas Escherichia coli dėl membranos baltymų pertekliaus. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 105, 14371–14376 (2008).

Zhang, Z. ir kt. Aukšto lygio membraninių baltymų gamyba E. coli BL21(DE3), praleidžiant induktorių IPTG. Mikrob. Ląstelės faktas. 14, 142 (2015).

Jia, B. ir Jeon, C. O. Didelio našumo rekombinantinio baltymo ekspresija Escherichia coli: dabartinė padėtis ir ateities perspektyvos. Atidarykite Biol. 6, 160196 (2016).

Routledge, S. J. ir kt. Rekombinantinių membraninių baltymų sintezė mielėse struktūriniams tyrimams. Metodai 95, 26–37 (2016).

Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D. ir Fox, M. Baltymų ekspresijos optimizavimas žinduolių ląstelėse. Curr. Protok. Protein Sci. 95, e77 (2019).

Drew, D. ir kt. GFP pagrindu sukurta optimizavimo schema, skirta eukariotinių membranų baltymų perdėtai ekspresijai ir gryninimui Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protok. 3, 784–798 (2008).

Shibata, Y. ir kt. Neurotenzino receptoriaus NTS1 termostabilizacija. J. Mol. Biol. 390, 262–277 (2009).

Magnani, F., Shibata, Y., Serrano-Vega, M. J. & Tate, C. G. Žmogaus adenozino A stabilumas ir konformacinis homogeniškumas kartu vystosi2a receptorius. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 105, 10744–10749 (2008).

Robertsonas, N. ir kt. Termostabilizuotų su G baltymu sujungtų receptorių (StaR) savybės ir jų panaudojimas ieškant vaistų. Neurofarmakologija 60, 36–44 (2011).

Heydenreich, F. M., Vuckovic, Z., Matkovic, M. & amp Veprintsev, D. B. Su G baltymu sujungtų receptorių stabilizavimas taškinėmis mutacijomis. Priekyje. Pharmacol. 6, 82 (2015).

Shao, Z. ir kt. Didelės skiriamosios gebos žmogaus CB1 kanabinoidų receptoriaus kristalinė struktūra. Gamta 540, 602–606 (2016).

Hua, T. ir kt. Žmogaus kanabinoidų receptoriaus CB1 kristalinė struktūra. Ląstelė 167, 750–762 (2016).

Stauch, B. ir kt. Struktūrinis ligando atpažinimo žmogaus MT1 melatonino receptoriuose pagrindas. Gamta 569, 284–288 (2019).

Johansson, L. C. ir kt. Žmogaus MT2 melatonino receptoriaus XFEL struktūros atskleidžia potipio selektyvumo pagrindą. Gamta 569, 289–292 (2019).

Eshaghi, S. Integruotų membranų baltymų didelio našumo ekspresija ir ploviklio atranka. Metodai Mol. Biol. 498, 265–271 (2009).

Kotovas, V. ir kt. Didelio našumo stabilumo patikra, skirta plovikliuose ištirpintam membranos baltymams. Sci. Rep. 9, 10379 (2019).

Desuzinges Mandon, E., Agez, M., Pellegrin, R., Igonet, S. & amp Jawhari, A. Novel systematic detergent screening method for membran proteins solubilisization. Anal. Biochem. 517, 40–49 (2017).

Shimizu, H. ir kt. Membraninių baltymų tirpinimo, gryninimo ir kristalizacijos ploviklių atranka: sukcinato: ubichinono oksidoreduktazės atvejo tyrimas Escherichia coli. Acta Crystallogr. Sekta. F. Struktūra. Biol. Cryst. Komun. 64, 858–862 (2008).

Lenoir, G. ir kt. Plovimo priemonių patikra funkciniams membranos baltymams stabilizuoti. Curr. Protok. Protein Sci. 93, e59 (2018).

Urner, L. H. ir kt. Moduliniai plovikliai pritaikyti membraninių baltymų, įskaitant su G baltymu susietus receptorius, valymui ir struktūrinei analizei. Nat. Komun. 11, 564 (2020).

Henrich, E., Dotsch, V. ir Bernhard, F. Membraninių baltymų lipidų poreikio atranka, derinant ekspresiją be ląstelių su nanodiskais. Metodai Enzymol. 556, 351–369 (2015).

Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M. & Drew, D. Inžinerinis šiluminio poslinkio ekranas atskleidžia specifinius eukariotinių ir prokariotinių membranų baltymų lipidų pasirinkimus. Nat. Komun. 9, 4253 (2018).

Pollock, N. L. ir kt. Išgrynintų ABCB1 ir ABCA4 stabilumo ir veikimo gerinimas: membranos lipidų įtaka. Biochim. Biofizė. Acta 1838, 134–147 (2014).

Reyes-Alcaraz, A., Martinez-Archundia, M., Ramon, E. & amp Garriga, P. Druskos poveikis regos G-baltymų susieto receptoriaus rodopsino konformaciniam stabilumui. Biofizė. J. 101, 2798–2806 (2011).

Hattori, M., Hibbs, R. E. ir Gouaux, E. Fluorescencijos aptikimo dydžio išskyrimo chromatografija pagrįstas termostabilumo tyrimas, skirtas membranos baltymų išankstinio kristalizacijos atrankai. Struktūra 20, 1293–1299 (2012).

Newby, Z. E. ir kt. Bendras membraninių baltymų kristalizacijos protokolas rentgeno struktūriniam tyrimui. Nat. Protok. 4, 619–637 (2009).

Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K. & Wang, D. N. Paprastas atrankos metodas, skirtas pagerinti membranos baltymų termostabilumą. Metodai 55, 324–329 (2011).

Carlson, M. L. ir kt. „Peptidisc“ – paprastas būdas stabilizuoti membranos baltymus tirpale be ploviklio. eGyvenimas 7, pii: e34085 (2018).

Drew, D. ir kt. Keičiamas GFP pagrindu sukurtas vamzdynas, skirtas membraninių baltymų perteklinės ekspresijos atrankai ir gryninimui. Protein Sci. 14, 2011–2017 (2005).

Lee, C. H. ir kt. NMDA receptorių struktūros atskleidžia subvienetų išdėstymą ir porų architektūrą. Gamta 511, 191–197 (2014).

Chen, L., Durr, K. L. ir Gouaux, E. AMPA receptorių kūgio sraigių toksino kompleksų rentgeno struktūros apšviečia aktyvacijos mechanizmą. Mokslas 345, 1021–1026 (2014).

Shihoya, W. ir kt. Endotelino ETB receptoriaus aktyvinimo mechanizmas endotelinu-1. Gamta 537, 363–368 (2016).

Kean, J., Bortolato, A., Hollenstein, K., Marshall, F. H. ir Jazayeri, A. Kortikotropino atpalaiduojančio faktoriaus receptoriaus 1 konformacinis termostabilizavimas. Sci. Rep. 5, 11954 (2015).

I. Kurganov, B. Terminės denatūracijos ir agregacijos tyrimai analitinėje biochemijoje. Biochem. Anal. Biochem. 2, e143 (2013).

Karasawa, S., Araki, T., Yamamoto-Hino, M. & Miyawaki, A. Žalia spalva skleidžiantis fluorescencinis baltymas iš Galaxeidae koralas ir jo monomerinė versija, skirta naudoti fluorescenciniam ženklinimui. J. Biol. Chem. 278, 34167–34171 (2003).

Kiss, C., Temirov, J., Chasteen, L., Waldo, G. S. & Bradbury, A. R. Directed evolution of an very stabil fluorescent protein. Baltymų inž. Des. Sel. 22, 313–323 (2009).

Close, D. W. ir kt. Terminis žalias baltymas, ypač stabilus, nesikaupiantis fluorescencinis baltymas, sukurtas naudojant paviršiaus inžineriją pagal struktūrą. Baltymai 83, 1225–1237 (2015).

Zimmermann, I. ir kt. Sintetiniai vieno domeno antikūnai, skirti membraninių baltymų konformaciniam gaudymui. ellife 7, pii: e34317 (2018).

Kawate, T. & Gouaux, E. Fluorescencinė aptikimo dydžio išskyrimo chromatografija, skirta integruotų membranų baltymų ikikristalizacinei atrankai. Struktūra 14, 673–681 (2006).

Kato, H. E. ir kt. Neurotenzino receptoriaus 1-Gi1 komplekso konformaciniai perėjimai. Gamta 572, 80–85 (2019).

Hu, N. J. ir kt. GFP pagrįstas membraninių baltymų ekspresijos patikrinimas vabzdžių ląstelėse naudojant bakuloviruso sistemą. Metodai Mol. Biol. 1261, 197–209 (2015).

Goehring, A. ir kt. Membraninių baltymų atranka ir didelio masto ekspresija žinduolių ląstelėse struktūriniams tyrimams. Nat. Protok. 9, 2574–2585 (2014).

Yao, H., Cai, H. ir Li, D. Membranų baltymų termostabilizavimas konsensuso mutacija: grybelinės delta8-7 sterolio izomerazės atvejo tyrimas. J. Mol. Biol. 432, 5162–5183 (2020).

Li, Z. ir kt. Struktūrinės įžvalgos apie bakterijų fosfolipidų biosintezės etapą. Nat. Komun. 8, 1691 (2017).

Rana, M. S., Wang, X. ir Banerjee, A. Patobulinta membraninių baltymų fluorescencinio žymėjimo strategija žinduolių ląstelių perteklinei ekspresijai ir gryninimui. Biochemija 57, 6741–6751 (2018).

Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K. & Collins, B. M. GFP:GFP-nanokūno komplekso struktūrinė ir termodinaminė analizė. Protein Sci. 19, 2389–2401 (2010).

Kirchhofer, A. ir kt. Baltymų savybių moduliavimas gyvose ląstelėse naudojant nanokūnus. Nat. Struktūra. Mol. Biol. 17, 133–138 (2010).

Hansen, S. ir kt. Žaliojo fluorescencinio baltymo su pikomoliniu afinitetu spaustuko dizainas ir pritaikymas. Sci. Rep. 7, 16292 (2017).

Whoer, J. R. & Mackinnon, R. Įtampos valdomo K + kanalo Eag1 struktūra atskleidžia alternatyvų įtampos jutimo mechanizmą. Mokslas 353, 664–669 (2016).

Park, E., Campbell, E. B. ir MacKinnon, R. CLC chlorido jonų kanalo struktūra krioelektronine mikroskopija. Gamta 541, 500–505 (2017).

Tao, X., Hite, R. K. ir MacKinnon, R. Atviro didelio laidumo Ca 2+ aktyvuoto K+ kanalo krio-EM struktūra. Gamta 541, 46–51 (2017).

Dang, S. ir kt. TMEM16A kalcio aktyvinto chlorido kanalo krio-EM struktūros. Gamta 552, 426–429 (2017).

Lee, C. H. ir MacKinnon, R. Žmogaus HCN1 hiperpoliarizacijos suaktyvinto kanalo struktūros. Ląstelė 168, 111–120 (2017).

Jojoa-Cruz, S. ir kt. Mechaniškai aktyvuojamo jonų kanalo OSCA krio-EM struktūra1.2. eGyvenimas 7, pii: e41845 (2018).

Fridy, P. C. ir kt. Tvirtas vamzdynas, skirtas greitai sukurti universalius nanokūnų repertuarus. Nat. Metodai 11, 1253–1260 (2014).

Zhang, Z., Wang, Y., Ding, Y. ir Hattori, M. Anti-GFP nanokūnų tandemų, kaip itin didelio afiniteto reagentų, skirtų valymui, struktūra. Sci. Rep. 10, 6239 (2020).

Hutter, C. A. J. ir kt. Tarpląsteliniai vartai formuoja ABC eksportuotojo energijos profilį. Nat. Komun. 10, 2260 (2019).

Krissinel, E. ir Henrick, K. Makromolekulinių mazgų išvados iš kristalinės būsenos. J. Mol. Biol. 372, 774–797 (2007).

Moreau, M. J. J. ir kt. Greitas baltymų stabilumo ir ligandų surišimo nustatymas naudojant diferencinę GFP pažymėtų baltymų skenavimo fluorimetriją. RSC Adv. 2, 11892–11900 (2012).

Jin, F., Wang, Y., Wang, M., Sun, M. ir Hattori, M. Fluorescencijos aptikimo dydžio išskyrimo chromatografija, naudojant nanokūnų technologiją membraninių baltymų ekspresijos atrankai. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.09.28.316307 (2020).

Gao, Y. ir kt. Vieno atkurto neuronų SNARE komplekso užtrauktukas trimis skirtingais etapais. Mokslas 337, 1340–1343 (2012).

Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. ir Webb, M. R. Tiesioginis, realiu laiku greito neorganinio fosfato išsiskyrimo matavimas naudojant naują fluorescencinį zondą ir jo taikymas aktomiozino subfragmentui 1 ATPazei. Biochemija 33, 8262–8271 (1994).

Tang, Y. ir Li, D. Didelės našumo tyrimo kūrimas integruotos membranos glicerolio 3-fosfato aciltransferazei. Analizė. Narkotikų kūrėjas. Techn. 17, 267–274 (2019).

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 125–132 (2010).

Evans, P. R. & Murshudov, G. N. Kokie geri mano duomenys ir kokia skiriamoji geba? Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69, 1204–1214 (2013).

McCoy, A. J. ir kt. Fazinės kristalografijos programinė įranga. J. Appl. Crystallogr. 40, 658–674 (2007).

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, W. G. & Cowtan, K. Coot savybės ir plėtra. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 486–501 (2010).

Adams, P. D. ir kt. PHENIX: išsami Python pagrindu sukurta sistema, skirta makromolekulinės struktūros sprendimui. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 213–221 (2010).

Schrödingeris, L. L. C. PyMOL molekulinės grafikos sistema, 1.8 versija. https://pymol.org (2015).

Hanner, M. ir kt. Fenilalkilamino Ca2+ antagonistą jungiantis baltymas. Molekulinis klonavimas, audinių pasiskirstymas ir heterologinė ekspresija. J. Biol. Chem. 270, 7551–7557 (1995).


Žalias fluorescencinis baltymas – esė pavyzdys

Taip susidaro daugybė cheminių virsmų, kai glicinas sudaro cheminį ryšį su serinu, dėl to susidaro naujas uždaras žiedas, o po šio proceso vyksta dehidratacija. Kitą valandą aplinkos deguonis reaguoja su tirozino ryšiu, todėl susidaro dviguba jungtis ir susidaro naujas fluorescencinis chromoforas. GFP idealiai tinka genų inžinerijai, nes turi savo chromoforą. Genetinės instrukcijos pateikiamos tiriamai ląstelei, kuri galiausiai sukuria GFP baltymą, GFP tam tikru būdu susilanksto ir šviečia.

Įvairūs tyrimai apima GFP kaip reporterio molekulę, kad būtų galima aiškiai suprasti genų ar molekulių veikimą. Žaliasis fluorescencinis baltymas (GFP) yra baltymo molekulė, kurią gamina medūza Aequorea victoria. Organizmas rodo savo fluorescencinį baltymą palei skėčio kraštą kaip švytinčius šviesos taškus. Šviesa generuojama iš geltonų audinių masių, apimančių maždaug 6000–7000 fotogeninių ląstelių. Šios fotogeninės ląstelės gamina šviesą bioliuminescencijos būdu, apimančią kalciu aktyvintą fotoproteiną, liaudiškai žinomą kaip "aequorin", kuris gamina žalią fluorescencinį baltymą (GFP) ir mėlynai žalią šviesą.

GFP priima energiją iš baltymo molekulės aequorin ir skleidžia žalią šviesą (žalias fluorescencinis baltymas, n.d.). GFP baltymuose yra 238 aminorūgštys. Baltymai išlieka labai stabilūs neutraliuose buferiuose net esant 65ºC temperatūrai. GFP taip pat stabilus esant platesniam pH diapazonui nuo 5,5 iki 12. GFP baltymų molekulė stipriai fluorescuoja, jos kvantinis efektyvumas yra apie 80 proc., o molinis išnykimo koeficientas yra 2,2 x 104 cm-1 M-1. Didžiausia GFP rodoma fluorescencija yra 400 nm, o mažesnė smailė rodoma 475 nm, o fluorescencijos emisijos smailė rodoma ties 509 nm.

GFP vidinė fluorescencija priskiriama išskirtiniam kovalentiškai surištam chromoforui, kuris yra