Informacija

Kodėl E.coli formuoja lygiagrečius klasterius?

Kodėl E.coli formuoja lygiagrečius klasterius?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Discalimer: Aš nesu biologas. Modeliuoju E.Coli augimą ir Vikipedijos gif gali matyti kai kurias grupes, kur bakterijos yra viena šalia kitos, orientuotos maždaug tuo pačiu kampu. Atlikau keletą modeliavimų ir gavau panašius rezultatus. Ar yra kokia nors priežastis, kodėl taip nutinka?


Ląstelės dalijasi strypo viduryje, todėl gaunamos dvi dukterinės ląstelės, kurios yra beveik tuo pačiu kampu. Laikui bėgant, nesant maišymo, judančių ląstelių, tai sukels ląstelių grupes, kurios turi nepriklausomą ląstelių orientaciją.

Daugiau informacijos, įskaitant tai, kaip žmonės paskatino elgtis kitaip, rasite šiame dokumente.


Bakterijų ląstelės mieliau jungiasi viena su kita lygiagrečiai, kad jos turėtų maksimalų kontaktinį paviršių ir galėtų sudaryti bioplėvelių grupes.

Už šią orientaciją atsakingi tiek fiziniai veiksniai (pvz., Brauno judėjimas, elektrostatinė sąveika, gravitacija, van der Waalso jėgos ir hidrodinamika), tiek ląstelių funkcija bakterijų ląstelėse (bakterijų judrumas, polisacharidų gamyba ir struktūrų funkcijos išorinėje membranoje).

(Per: https://www.nature.com/articles/srep29516)


Neišnaudotas potencialas E. coli

E. coliDėl atsparumo, universalumo, plataus gomurio ir lengvo valdymo jis tapo intensyviausiai ištirtu ir geriausiai suprantamu organizmu planetoje. Tačiau tyrimai apie E.coli pirmiausia nagrinėjo jį kaip pavyzdinį organizmą, kuris yra abstrahuotas iš bet kokios gamtos istorijos. Bet E. coli yra kur kas daugiau nei tik mikrobinė laboratorinė žiurkė. Atvirkščiai, tai labai įvairus organizmas, turintis sudėtingą, daugialypę nišą laukinėje gamtoje. Naujausi ‘wild’ tyrimai E. coli Pavyzdžiui, atskleidė daug apie jo buvimą aplinkoje, jo įvairovę ir genomo evoliuciją, taip pat jo vaidmenį žmogaus mikrobiomui ir ligoms. Šios išvados atskleidė jo biologijos ir ekologijos aspektus, kurie kelia toli siekiančių klausimų ir parodo, kaip vertinama E. coligamtos istorija gali išplėsti jos, kaip pavyzdinio organizmo, vertę.


Straipsnio peržiūra

Arshpreet Bhatwa 1,2, Weijun Wang 1, Yousef I. Hassan 1 , Nadine Abraham 1,3, Xiu-Zhen Li 1 ir Ting Zhou 1*
  • 1 Guelph tyrimų ir plėtros centras, Kanados žemės ūkio ir žemės ūkio maisto produktai, Guelph, ON, Kanada
  • 2 Biologijos katedra, Vaterlo universitetas, Waterloo, ON, Kanada
  • 3 Molekulinės ir ląstelinės biologijos katedra, Guelph universitetas, Guelph, ON, Kanada

Rekombinantiniai baltymai tampa vis svarbesni pramonėje Escherichia coli yra plačiausiai naudojamas bakterinis šeimininkas jų gamybai. Tačiau inkliuzinių kūnų susidarymas yra dažnai sutinkamas iššūkis gaminant tirpius ir funkcinius rekombinantinius baltymus. Siekiant įveikti šią kliūtį, buvo sukurtos skirtingos strategijos, koreguojant augimo sąlygas, inžinieriaus šeimininkų padermes. E. coli, keičiantys ekspresijos vektorius ir modifikuojantys dominančius baltymus. Šie metodai bus išsamiai paryškinti kai kuriuose šios apžvalgos naujienose. Taip pat bus aptartos unikalios baltymų inkliuzinių kūnų savybės, jų susidarymo mechanizmas ir įtakos veiksniai bei galimi pranašumai.


Genominių salų svarba

Visos patogeninės padermės E. coli yra genominių regionų (salų), užpildytų virulentiškumo genų rinkiniu, koduojančiu pagrindinius prilipimo / kolonizacijos, invazijos, toksinių junginių sekrecijos ir transportavimo funkcijų, taip pat sideroforų gamybos bruožus (Touchon). ir kt., 2009). Kai kurie iš šių pajėgumų taip pat yra bendrai E. coli įtampa ir gali pagerinti aplinkos būklę, nors tai dažnai nepripažįstama. Patogeniškumui dažnai reikalingas visas saloje būdingų bruožų kompleksas, kuris kartu apibrėžia elgesį (Touchon). ir kt., 2009). Remiantis naujausiais genomo sekos nustatymo projektais, įvairovė E. coli genomai dabar suprantami geriau nei bet kada anksčiau (Kudva ir kt., 2002 Touchon ir kt., 2009). Akivaizdu, kad su virulentiškumu susijusių genominių salų plitimui įvairiose srityse buvo ypač svarbus horizontalus genų perkėlimas. E. coli padermės (Ochman ir Jones, 2000 Touchon ir kt., 2009). Taigi, be atviro pano genomo (šiuo metu apie 18� genų), šiai rūšiai būdingo maždaug 2000 genų branduolio genomo vaizdas neseniai atsirado (Touchon). ir kt., 2009), iliustruojantis didelį horizontalaus genų perdavimo poveikį rūšies genominiam plastiškumui (1 pav.). Svetainių, kuriose pirmiausia buvo įterpimai arba ištrynimai, analizė E. coli genomai neseniai nustatė 133 tokius taškus (Touchon ir kt., 2009). 2a paveikslas iliustruoja hipotetinį tokių vietų vaizdą kommensalinių, EHEC ir UPEC padermių genomuose. Vienas konkretus pavyzdys, parodytas 2b paveiksle, yra pateiktas pheV tRNR taškas, rodantis skirtingus intarpus tarp padermių K-12 MG1655, O157: H7 (Sakai) ir CTF073 (Touchon) ir kt., 2009). Stebėtina, kad visose keturiose tirtose tipinėse UPEC / ExPEC padermėse šioje vietoje buvo panašus įdėklas, kuris žymimas kaip pap operonas. Nustatyta, kad šis operonas turi tam tikrą vaidmenį E. coli tinkamumas šlapimo takų invazijai. Įdomu tai, kad kai kurie genų moduliai buvo bendri tarp pheV UPEC padermės CFT073 ir padermės K12 salos (2b pav.). Priešingai, pheV įterpimo taškas O157: H7 padermėje (Sakai) buvo sudarytas iš 32 padermei būdingų kodavimo regionų, apimančių hipotetinių baltymų genus šalia tariamo enterotoksino ir citotoksino.

Vidutinis E. coli genomą formuoja daugybė evoliucinių jėgų, kylančių iš jo pirminių (šeimininko) ir antrinių buveinių, kuriose tiek biotinės (plėšrūnai, konkurentai, sukčiai, šeimininko gynybos mechanizmai), tiek abiotinės (pH, temperatūra, UV, mineralų išeikvojimas ir pan.) yra spaudimų. E. coli padermės turi apie 2000 genų, kurie suteikia jiems universalų metabolizmą. The E. coli pan genomą sudaro apie 18� genų, iš kurių 11% priklauso branduoliui (tamsiai mėlyna), didelę dalį (62%, mėlyna) sudaro vadinamieji ‘persistentiniai genai ir 26 gali būti laikomi „lakiais“ genais (šviesiai mėlyna) (Touchon ir kt., 2009). Genų gavimo ir praradimo įvykiai yra nuosekliai susiję su įterpimo / ištrynimo taškais (raudona) ir bendradarbiauja formuojant E. coli genomas su selektyviai palaikomais šerdies/persistentiniais genais. Dėl šių įvykių gali išsivystyti specifiniai genų klasteriai E. coli fenotipai, tokie kaip pap operonas, dalyvaujantis UPEC padermių sukeltos šlapimo takų infekcijos patogenezėje (žr. 2 pav.). Rodyklė žymi hipotetinį gradientą, kuriame E. coli Rodomos genominės savybės, kurios greičiausiai yra susijusios su nepastoviais, nuolatiniais ir pagrindiniais genais.

Kai pilni genomai E. coli padermės yra sulygiuotos, tipinius įterpimo / ištrynimo taškus galima nustatyti atitinkamose vietose, kaip hipotetiškai parodyta (a). Šių regionų dydis ir genų sudėtis gali labai skirtis tarp padermių, kaip parodyta (b) už pheV tRNR įterpimo taškas. Čia, pheV Komensalinių (K-12 MG1655), enterohemoraginių (EHEC, O157:H7 Sakai) ir uropatogeninių (UPEC, CTF073) padermių židiniai lyginami pagal Touchon duomenis. ir kt. (2009). Skirtingais raštais / spalvomis paryškintos įterpimo taškų sekcijos atitinka skirtingus genų modulius (žr. Touchon ir kt., 2009, jei reikia daugiau informacijos). Pap operonas (raudonas) turi įtakos šlapimo takų infekcijai, yra UPEC/ExPEC padermių genominis požymis ir jį galima rasti pheV CFT073, APEC O1, S88, UMN026 ir IAI39 padermių įterpimo taškai. Juodos dalys žymi genus / genų modulius, būdingus atitinkamoms padermėms. The pheV Įterpimo taškas O157: H7 padermėje Sakai yra sudarytas iš 32 padermei būdingų kompaktinių diskų, koduojančių, be kita ko, 22 hipotetinius baltymus, 4 transpozazes, 1 tariamą enterotoksiną ir 1 spėjamą citotoksiną. Žalia spalva pažymėti genų moduliai yra bendri pheV K-12 ir CFT073 padermių salos. Šiuose moduliuose esantys genai, be kita ko, koduoja glikolato oksidazes, glikolato transporterį ir numanomas nukleozidų trifosfato hidrolazes. (Visą spalvotą šio paveikslo versiją rasite adresu ISME žurnalas prisijungęs).

Nepaisant to, kad šiuo metu turime tokią išsamią informaciją apie dažnai reikšmingąE. coli genominė variacija, mums trūksta bendro supratimo apie tai, kaip genomo struktūra virsta specifiniu elgesiu / išgyvenimu sudėtingoje atviroje aplinkoje. Viena iš realių galimybių yra tai, kad mes dažnai nepastebime tam tikrų salos bruožų, kurie laikomi svarbiais patogeniniam procesui, svarbą aplinkai. To pavyzdys yra mobilioji geležies įsisavinimo operono sistema ybt, iš pradžių pažymėta kaip vadinamoji didelio patogeniškumo sala, kuri dažnai randama E. coli adresu asn tRNR įterpimo vietos (Schubert ir kt., 2004). Internetinių genominių duomenų tyrimas parodė, kad šis operonas iš tikrųjų buvo paplitęs įvairiose šalyse E. coli pogrupių tiek patogeninės, tiek kommensalinės formos (3 pav.). Gali būti laikoma, kad operonas atstovauja aplinkai svarbią savybę, kurią galima perkelti horizontaliu genų perkėlimu, atsižvelgiant į jo atsiradimą daugelyje šeimos rūšių ir genčių. Enterobakterijos (Šubertas ir kt., 2009). Tačiau mes nežinome, ką tai prideda prie ir taip didelių geležies šalinimo galimybių E. coli.

Mobiliojo telefono atsiradimas ybt operonas, koduojantis jersiniabaktino (Ybt) geležies gavimo sistemą E. coli įvairių filogenetinių grupių ir gyvenimo būdo atmainos. Visų parodytų padermių, išskyrus ECOR 02 ir O6:K5:H1 DSM6601, genomai yra sekvenuoti. Saloje yra daug B2 ir D filotipų. Jo atsiradimas tarp B2 grupės atstovų rodo ekologinį reikšmingumą ir, galbūt, protėvių B2 tipų įgijimą. Vaidmuo iš ybt Operonas gali būti laikomas „saprofitine sala“, nes jis plačiai paplitęs skirtingo gyvenimo būdo bakterijose, įskaitant E. coli filogenetinių grupių A, B1, B2, D ir E padermių (Hacker ir Carniel, 2001). Bendras funkcinių ir „mobiliųjų“ salos dalių vaizdas yra pritaikytas pagal Schubertą ir kt. (2004) ir parodyta viršutiniame skydelyje. asn, asn tRNR genas tarpt, integrazę koduojantis genas. Funkcinio operono kodo genai irp, geležies reguliuojami baltymai, įskaitant irp2 (Ybt peptidų sintetazė) ir irp1 (Ybt peptido/poliketido sintetazė) ybtA, AraC tipo transkripcijos aktyvatorius ir fyuA, išorinės membranos baltymas. Genominėse salose dažnai yra kitų genų / genų grupių, kurios gali padėti E. coli Padermės, kurios klesti keliose nišose arba veikia kaip saprofitai, kommensalai ar patogenai, yra tie, kurie yra susiję su atsparumu daugeliui vaistų / antibiotikams ir gaminant adhezijos veiksnius (apžvelgta Hacker ir Carniel, 2001).


Katabolito aktyvatoriaus baltymas (CAP): aktyvatoriaus reguliatorius

Kaip ir trp operoną neigiamai reguliuoja triptofano molekulės, yra baltymų, kurie jungiasi prie operatorių sekų, kurios veikia kaip teigiamas reguliatorius įjungti ir suaktyvinti genus. Pavyzdžiui, kai trūksta gliukozės,. E. coli bakterijos gali kreiptis į kitus cukraus šaltinius kaip kurą. Norėdami tai padaryti, reikia transkribuoti naujus genus, skirtus šiems alternatyviems genams apdoroti. Kai gliukozės kiekis sumažėja, ląstelėje pradeda kauptis ciklinis AMP (cAMP). cAMP molekulė yra signalinė molekulė, dalyvaujanti gliukozės ir energijos apykaitoje E. coli. Kai ląstelėje sumažėja gliukozės kiekis, besikaupiantis cAMP prisijungia prie teigiamo reguliatoriaus katabolito aktyvatoriaus baltymas (CAP), baltymas, kuris jungiasi prie operonų promotorių, kurie kontroliuoja alternatyvių cukrų apdorojimą. Kai cAMP prisijungia prie CAP, kompleksas prisijungia prie genų, reikalingų naudoti alternatyvius cukraus šaltinius, promotoriaus srities (1 pav.). Šiuose operonuose CAP surišimo vieta yra prieš RNR polimerazės surišimo vietą promotoriuje. Tai padidina RNR polimerazės prisijungimą prie promotoriaus srities ir genų transkripciją.

1 pav. Kai gliukozės lygis krenta, E. coli gali naudoti kitus cukrus kurui, bet tam turi perrašyti naujus genus. Kadangi gliukozės atsargos tampa ribotos, cAMP lygis didėja. Šis cAMP prisijungia prie CAP baltymo, teigiamo reguliatoriaus, kuris jungiasi prie operatoriaus srities prieš genus, reikalingus naudoti kitus cukraus šaltinius.


4 Bioplėvelė kaip numatytasis augimo būdas

Laboratorijoje bakterijos dažniausiai auginamos planktoniniu būdu, tačiau utopiniai mikrokosmai, sukurti kultūros induose, yra skirti maksimaliai padidinti bakterijų augimo greitį, o ne atkartoti natūralias bakterijų augimo sąlygas. Tiesą sakant, kai kurios bakterijų rūšys iš esmės naudoja bioplėvelės režimą už laboratorijos ribų. Burnos streptokokai yra labai prisitaikę prie sėslaus augimo dantų paviršiuje. Daugumai burnos bakterijų rūšių trūksta aplinkos nišos ir jos aptinkamos beveik vien burnoje [24]. Dėl planktono augimo šios bakterijos greitai nuplaunamos seilėmis, nuryjamos ir sunaikinamos rūgštinėse skrandžio sultyse. Šios bakterijos greičiausiai praleidžia didžiąją dalį savo natūralios egzistencijos, augdamos kaip bioplėvelė. Ir vis dėlto jie dažnai auginami planktoniškai laboratorijoje.

Gali būti, kad norint pradėti susidaryti bioplėvelė, reikia tik tinkamo tvirtinimo pagrindo. Daugėja įrodymų, kad iškart po pirminio bakterijų prilipimo prie kieto paviršiaus pradeda atsirasti genų reguliavimo pokyčių [4, 44]. Tai rodo, kad ląstelės iš tikrųjų jaučia kietą paviršių, prie kurio jos yra pritvirtintos, ir kad ši jutimo sistema suaktyvina signalizacijos kaskadą, dėl kurios gali atsirasti kai kurių ankstyvųjų genų ekspresijos modelių, reikalingų biofilmų susidarymui. Pavyzdžiui, į P. aeruginosa, išraiška algC, genas, reikalingas alginato sintezei, padidėja per kelias minutes po prijungimo ir kada S. epidermidis susiliečia su kietu paviršiumi, paprastai sferinė ląstelė sudaro į koją panašią priedą [45, 46]. Šie radiniai rodo, kad, panašiai kaip eukariotinės ląstelės, bakterinės ląstelės turi paviršiaus jutimo sistemas, kurios sukelia pakankamai galingus tarpląstelinius signalus, kad sukeltų transkripcijos ir morfologinius pokyčius.

Jutimo mechanizmai, kuriuos naudoja bakterijos, kad nustatytų laikymąsi, nėra gerai suprantami. Suvokiamo osmoliariškumo pokyčiai, kuriuos sukelia krūviai ant kietų paviršių, gali būti svarbus signalas bakterijoms atpažinti paviršius [22]. Taip pat buvo įrodyta, kad EnvZ – OmpR dviejų komponentų sistema, kuri yra susijusi su aplinkos osmoliariškumu, reguliuoja garbanų ir kolano rūgšties ekspresiją [47, 48]. Fibrilinės paviršiaus struktūros garbanos vaidina svarbų vaidmenį sukibimui, o kolano rūgštis yra egzopolisacharidas, dalyvaujantis agregacijoje. Osmoliarumo vaidmuo reguliuojant bioplėvelę taip pat buvo pastebėtas stafilokokų [13] ir Pseudomonas fluorescens[49]. Apskritai, bioplėvelės augimo būdas gali būti numatytasis bent kai kurių bakterijų rūšių augimo būdas, o tai rodo, kad turėtume kelti klausimą, kas sukelia planktoninį augimo būdą, o ne tai, kas skatina bioplėvelės augimo būdą.


E. coli

Mūsų redaktoriai peržiūrės tai, ką pateikėte, ir nuspręs, ar pataisyti straipsnį.

E. coli, (Escherichia coli), bakterijų rūšis, kurios paprastai gyvena skrandyje ir žarnyne. Kada E. coli suvartotas su užterštu vandeniu, pienu ar maistu arba užsikrečiama per musės ar kito vabzdžio įkandimą, gali sukelti virškinimo trakto ligas. Dėl mutacijų gali atsirasti padermių, kurios sukelia viduriavimą, išskirdamos toksinus, įsiskverbdamos į žarnyno gleivinę arba prilipdamos prie žarnyno sienelių. Virškinimo trakto ligų gydymas daugiausia susideda iš skysčių pakeitimo, nors kai kuriais atvejais veiksmingi tam tikri vaistai. Liga paprastai praeina savaime, be ilgalaikio poveikio požymių. Tačiau pavojingos atmainos, pvz E. coli O157:H7 ir E. coli O104:H4, ekstremaliais atvejais gali sukelti kruviną viduriavimą, inkstų nepakankamumą ir mirtį. Tinkamas mėsos kepimas ir produktų plovimas gali užkirsti kelią infekcijai iš užteršto maisto šaltinių. E. coli taip pat gali sukelti moterų šlapimo takų infekcijas.


Gramo dėmės

E. coli apibūdinama kaip gramneigiama bakterija. Taip yra todėl, kad naudojant Gramo dėmę jie nusidažo neigiamai.

Gramo dažymas yra diferencinė technika, dažniausiai naudojama bakterijoms klasifikuoti. Dažymo technika išskiria du pagrindinius bakterijų tipus (gramteigiamus ir gramneigiamus), suteikdama ląstelėms spalvą.

Kadangi E. coli yra gramneigiamos bakterijos, ji turi papildomą išorinę membraną, kurią sudaro fosfolipidai ir lipopolisacharidai. Lipopolisacharidų buvimas ant išorinės bakterijų membranos suteikia jai bendrą neigiamą ląstelės sienelės krūvį. Dėl šių savybių E. coli neišsaugo krištolinio violetinio dažymo Gramo proceso metu.


Diskusija

Inžinerinio azoto fiksavimo pasėliuose galimybė įvedant nif genai į augalų ląsteles buvo pasiūlyti nuo pat pirmojo perkėlimo žingsnio nif genai iš diazotrofinės bakterijos į nediazotrofinę bakteriją buvo realizuoti daugiau nei prieš 45 metus (35). Tačiau tai nėra lengvas tikslas ir reikia susidurti su daugeliu gerai priimtų iššūkių, įskaitant daugybę susijusių genų, reikalavimą išlaikyti subalansuotą Nif komponentų ekspresiją, energijos poreikį ir mažinti galią bei deguonies jautrumą. azoto genazės. Sintetinės biologijos priemonių kūrimas leido nif klasterio pertvarkymas ir didelio našumo kombinatorinės genų dalių bibliotekos, skirtos išreikšti sudėtingus Nif baltymų derinius prokariotuose arba eukariotuose (15, 29). Norint pasiekti stechiometrinę Nif komponentų ekspresiją, buvo naudojama poliproteinų strategija, skirta sumažinti genų skaičių, todėl subalansuota baltymų komponentų, reikalingų azoto biosintezei ir aktyvumui, ekspresija (36). Norint ištirti, ar augalų elektronų transportavimo grandinės gali pakeisti savo prokariotines analogas kaip elektronų donores, kad palaikytų azoto katalizę, buvo atkurti iš augalų organelių gauti elektronų transportavimo moduliai. E. coli ir nustatyta, kad jie tarnauja kaip azotogenazės elektronų donorai (37). Kadangi augalai potencialiai gali tiekti energiją ir sumažinti galią, reikalingą azoto aktyvumui palaikyti, tai gali dar labiau sumažinti genų skaičių, reikalingą inžineriniam azoto fiksavimui pasėliuose.

Augalų organelės ilgą laiką buvo laikomos tinkamomis vietomis azotazei, atsižvelgiant į jų vaidmenį konvertuojant energiją, todėl jos gali užtikrinti didelę ATP koncentraciją ir sumažinti azoto aktyvumui reikalingą galią (10). Mitochondrijų kvėpavimo aktyvumas ir geležies-sieros klasterio surinkimo kelias šioje organelėje rodo, kad mitochondrijų matricoje greičiausiai trūksta deguonies ir todėl gali būti tinkama aplinka azotogenazei. Tai patvirtino sėklinis įrodymas, kad azoto baltymas Fe, jautriausias deguoniui azoto komponentas, gali būti visiškai aktyvus iš aerobiniu būdu auginamų mielių, kai jis ekspresuojamas mitochondrijose (12). Taigi deguonies problema buvo išspręsta, bent jau šiai organelei. Priešingai, kaip ir tikėtasi, iš chloroplastų galima susigrąžinti mažesnį Fe baltymų aktyvumą, ir šiuo atveju norint pasiekti aktyvumą aerobinėmis sąlygomis, reikėjo įtraukti Nif specifinius geležies ir sieros klasterio komponentus NifU ir NifS (16).

Nors aktyvaus Fe baltymo surinkimui reikia palyginti nedaug Nif komponentų, MoFe baltymo biosintezės reikalavimai yra daug sudėtingesni, apimantis bent minimalų devynių Nif baltymų genų rinkinį, o papildomas reikalavimas tiekti molibdeną, homocitratą ir S-adenozilo metioninas, skirtas palaikyti FeMo-co biosintezę. Nors daugelis Nif baltymų buvo išreikšti mielėse ir augalų mitochondrijose, siekiant tinkamos stechiometrinės komponentų ekspresijos, buvo susidurta su tirpumo ir stabilumo problemomis (13, 15). Kai kuriais atvejais buvo įmanoma pasinaudoti Nif baltymų, kilusių iš skirtingų diazotrofų, biologine įvairove. Naudojant šią strategiją, tirpus ir in vitro funkcinis NifB iš M. infernus buvo gautas, kai jis buvo išreikštas mielių mitochondrijose (14, 17). Tačiau NifDK tetramero ekspresija ir surinkimas buvo problemiškas, galbūt dėl ​​​​nenormalaus proteolitinio NifD apdorojimo. Tai sukuria didelę kliūtį aktyvaus MoFe baltymo ekspresijai mitochondrijose.

Kadangi daugelis baltymų organelėse yra užkoduoti branduoliniame genome, inžinerijos strategijose dažnai naudojamas tikslinis metodas, kai lyderio peptidai naudojami baltymams, ekspresuojamiems iš branduolinių transgenų, transportuoti į organelius. Baltymų taikymas yra ypač svarbus kuriant mitochondrijas, nes dar nėra sukurtas stabilus ir patogus šių organelių transformacijos metodas. Tai taip pat aktualu kuriant pasėlių augalų chloroplastus, nes nors plastidų transformacija yra įprasta dviskilčių augalų modeliuose, vienaląsčiuose augaluose ji nėra gerai įsitvirtinusi. Taikant organelių taikymo metodą, reikalingas efektyvus baltymo perkėlimas per abi mitochondrijų membranas ir tinkamas lyderio peptido apdorojimas bei skilimas, kai preproteinas patenka į mitochondrijų matricą. Paprastai šio proceso metu baltymas apdorojamas iki tinkamo dydžio, nors dažnai svarbu išbandyti skirtingus lyderio peptidus, kad būtų pasiektas tikslus apdorojimas. Nors manėme, kad daugelis endopeptidazių kandidatų gali būti atsakingos už NifD skaidymą mitochondrijų matricoje, kai tik nustatėme skilimui reikalingą regioną, mes sutelkėme dėmesį į galimybę, kad mitochondrijų apdorojimo peptidazė vykdo antrinį NifD apdorojimą. iki likučio R98. Nors MPP atpažįstamose aminorūgščių sekose yra reikšmingas degeneracija, R98 svarba ir aromatinės liekanos padėtis dviem liekanomis pasroviui (Y100) rodė, kad MPP suskaidė (38). Visiškas likučių, atitinkančių R98, išsaugojimas kartu su labai konservuotu Y100 likučiu NifD baltymuose iš įvairių šaltinių reiškia, kad skilimo problemos negalima išspręsti išnaudojant NifD baltymų biologinę įvairovę (38). Iš tiesų, mes nustatėme, kad taip yra, tirdami NifD stabilumą iš keturių skirtingų diazotrofų mielių mitochondrijose ir išsiaiškinome, kad kiekvienu atveju skilimo galima išvengti sukūrus ekvivalentišką R98K pakaitalą (1 pav.E).

Norėdami nedviprasmiškai patvirtinti, kad MPP buvo atsakingas už skilimą, mes atkūrėme mielių MPP E. coli ir parodė, kad baltymas atlieka NifD endoproteolitinį skilimą, kad sukurtų tuos pačius apdorotus fragmentus, pastebėtus mielėse. Šis aktyvumas nėra būdingas mielių MPP, nes jis taip pat buvo stebimas naudojant tris augalinės kilmės MPP, o apdorojimą kiekvienu atveju neleido NifD R98 variantas (2 pav.). Mielėse abu MPP subvienetai yra lokalizuoti matricoje (39), o augaluose abu MPPα ir MPPβ subvienetai yra visiškai integruoti į citochromą pr. Kr1 kvėpavimo grandinės kompleksą kaip Core1 ir Core2 baltymus, atitinkamai (40). Nuo E. coli neturi genų, koduojančių a cyt bc1 kompleksas (41), augalų tipo MPP atkūrimas šiame šeimininke gali turėti įtakos apdorojimo veiklai. Tačiau mes pastebėjome, kad augalų tipo MPP efektyviai apdorojo Su9 lyderio peptidą E. coli (3 pavB), patvirtinantis ankstesnius įrodymus, kad elektronų pernešimas viduje cyt bc1 apdorojimui nereikia komplekso (42).

Nors mes nustatėme vidinę MPP skilimo vietą NifD viduje, šios skilimo vietos prieinamumas po nukreipimo į mielių mitochondrijas lieka neaiškus. Perkėlimas per mitochondrijų membranas reikalauja, kad NifD būtų neišskleistos būsenos, ir per šį laikotarpį baltymas yra veikiamas MPP, kad būtų pašalintas signalinis peptidas. Įtariame, kad per šį laikotarpį MPP taip pat suskaido vidinę NifD vietą, kol baltymas sulankstomas į tinkamą formą. Šis antrinis skilimo įvykis gali įvykti prieš sąveiką su NifK, tokiu būdu paaiškindamas, kaip sunku surinkti stabilius NifDK heterotetramerus mielių mitochondrijose (15). Arba gali būti, kad MPP atpažįsta NifD, kuris yra neteisingai sulankstytas po perkėlimo į mitochondrijų matricą. Tačiau jei taip būtų, būtų sunku racionalizuoti, kaip R98P variantas skatina teisingą sulankstymą. Be to, proteazė yra aktyvi prieš laukinio tipo NifD nepažeistoje bakterijų sistemoje, o tai suteikia tvirtų įrodymų, kad netinkamas susilankstymas nėra pagrindinė skilimo priežastis. Nepaisant to, svarbu pažymėti, kad NifD skilimas bakterijų sistemoje nebūtinai reiškia, kad MPP atpažįsta brandžią MoFe baltymo formą, kupiną metalo lustų. MPP skilimas gali įvykti prieš azotogenazės MoFe baltymo brendimą, priklausomai nuo surinkimo kinetikos. Pavyzdžiui, apo-NifDK gali suskaldyti proteazė, tačiau holo NifDK tetrameras, kuriame gausu metalo klasterių, gali turėti konformaciją, kurioje skilimo vieta yra nepasiekiama. Apibendrinant, sunku atskirti, ar MPP skilimas vidinėje NifD vietoje vyksta mielių mitochondrijose prieš šio baltymo sulankstymą, ar skilimo vieta išlieka prieinama bręstant holo NifDK heterotetramerui.

Augalų organelės yra svarbūs taikiniai, siekiant įvesti heterologinius metabolizmo kelius arba sudėtingas biologines augalų genų inžinerijos sistemas. Mūsų rezultatai išryškina problemas, susijusias su teisingu svetimų baltymų, nukreiptų į organelius, apdorojimu ir tiksliai nurodo nenormalaus apdorojimo riziką, atsirandančią dėl pasąmonės signalo peptido skilimo vietų, esančių ne šeimininkų baltymų sekose. Nors tokių sekų atsiradimas tikriausiai yra nelaimingas, signalo peptidų skilimo proteazės gali būti laikomos svetimų baltymų „vartų saugotojais“. Kadangi aminorūgščių sekos, kurias atpažįsta perdirbančios peptidazės, yra labai degeneruotos, sunku tiksliai numatyti, ar pašaliniai baltymai bus suskaidyti po patekimo į organelius. Mūsų požiūris į MPP atkūrimą E. coli suteikia paprastą biologinį tyrimą, skirtą iš anksto įvertinti stabilumą prieš pradedant inžineriją eukariotuose ir, jei reikia, atlikti kryptingą evoliuciją, kad būtų užtikrinta stabili ekspresija mitochondrijose.


Vienmolekulės enzimologija: nanomechaninis manipuliavimas ir hibridiniai metodai

K. Manibogas, . S. Sivasankar, Enzymologijos metodai, 2017 m

3.2 Inžineriniai baltymai AFM jėgos matavimams

Rekombinantiniai baltymai gali būti generuojami AFM jėgos matavimams naudojant standartinius molekulinės biologijos metodus. Vienintelis reikalavimas yra tas, kad baltymai turi būti sukonstruoti su molekuline rankena, kuri gali būti naudojama baltymui imobilizuoti ant paviršiaus. Nors literatūroje aprašyta daugybė įvairių imobilizavimo cheminių medžiagų, tokių kaip imobilizavimas per Cys likučius (Dietz ir kt., 2006), mes naudojame streptavidino ir biotino chemiją, kad imobilizuotume Ecad savo eksperimentuose. Trumpai tariant, viso ilgio tarpląsteliniai Ecad domenai su C-galiniu Avi-žymu (biotinilinti), Tev seka (proteolitiniam skilimui) ir His-žyme (baltymų gryninimui) yra ekspresuojami HEK293T ląstelėse ir išgryninami. iš kondicionuotos terpės naudojant nikelio NTA dervą. Išvalius baltymus, Avi-tag seka yra biotinilinama naudojant BirA fermentą (BirA500 rinkinys Avidity). Kadangi šie protokolai buvo plačiai aprašyti mūsų ankstesniuose darbuose (Manibog ir kt., 2014 Rakshit ir kt., 2012 Zhang, Sivasankar, Nelson ir amp Chu, 2009) ir nėra pagrindinis šios apžvalgos akcentas, mes jų nenagrinėsime. metodus išsamiau.


Žiūrėti video įrašą: enterotoxigênica (Rugpjūtis 2022).