Informacija

Kodėl laktatas slopina augimą (arba padidina mirtingumą)?

Kodėl laktatas slopina augimą (arba padidina mirtingumą)?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ekstraląstelinis laktatas slopina ląstelių augimą arba padidina ląstelių mirtį. Tai atsitinka šalia navikų ir ląstelių kultūrose.

Pavyzdžiui, žr. šią nuorodą: Ozturk, Sadettin S., Mark R. Riley ir Bernhard O. Palsson. "Amoniako ir laktato poveikis hibridomos augimui, metabolizmui ir antikūnų gamybai." Biotechnology and bioengineering 39.4 (1992): 418-431 (galima rasti čia: https://www.researchgate.net/profile/Mark_Riley5/publication/227705703_Effects_of_ammonia_and_lactate_on_growth_metate_on_growth_metabolis0b7b6fc0b7b6fc0b6fc0b6fc.

Koks yra šio laktato poveikio mechanizmas? Kodėl laktatas turi tokį neigiamą poveikį?


Laktatas, nepaisytas diabeto ir vėžio sąveikos veiksnys

Vis daugiau įrodymų rodo, kad yra ryšys tarp diabeto ir vėžio. Nepaisant to, iki šiol galimos šios asociacijos priežastys vis dar menkai suprantamos ir šiuo metu nėra jokių klinikinių įrodymų, kurie leistų tinkamai gydyti pacientus, kurie kartu serga šiomis dviem ligomis. Tiek vėžys, tiek diabetas buvo siejami su nenormaliu laktato metabolizmu, o didelis laktato gamybos lygis yra pagrindinė šių ligų biologinė savybė. Ir atvirkščiai, didelis laktato kiekis prisideda prie aukštesnės atsparumo insulinui būsenos ir piktybiškesnio vėžio ląstelių fenotipo, skatinančio diabetą ir vėžio vystymąsi bei progresavimą. Atsižvelgiant į diabeto ir vėžio ryšį, nereikėtų pamiršti didelės laktato gamybos vaidmens sergant diabetu ir vėžio sąveika. Čia apžvelgiame turimus įrodymus apie laktato vaidmenį skirtingose ​​​​biologinėse diabeto ir vėžio charakteristikose ir interaktyvų ryšį tarp jų. Molekulinių mechanizmų, susijusių su diabetu ir vėžiu susijusių signalų pertvarkymo, supratimas galėtų suteikti naujų prevencinių ir terapinių metodų diabetui ir vėžio gydymui.

1. Įvadas

Pasaulyje cukrinis diabetas (DM) ir vėžys yra dvi labiausiai paplitusios ligos, o vėžys yra antroji, o diabetas – 12 pagrindinė mirties priežastis [1, 2]. Ryšys tarp šių dviejų ligų pirmą kartą buvo iškeltas daugiau nei prieš 75 metus. Vis daugiau įrodymų rodo, kad DM yra susijęs su padidėjusia vėžio rizika [3] ir didesniu vėžiu sergančių pacientų mirtingumu [4, 5]. Tiesą sakant, naujausi tyrimai parodė, kad 2 tipo cukrinis diabetas (T2DM) yra nepriklausomas įvairių vėžio tipų progresavimo rizikos veiksnys [6]. Nors šios dvi ligos turi daug bendrų rizikos veiksnių, biologinis ryšys tarp jų vis dar nėra gerai žinomas [6, 7], o tai yra iššūkis klinikiniam gydymui. Nors išsamus vaizdas dar turi susidaryti, buvo pasiūlyti keli mechanizmai, paaiškinantys šį ryšį, pavyzdžiui, pati hiperglikemija [3], oksidacinis stresas [8–11], diabeto gydymas, hormoniniai sutrikimai, atsparumas insulinui su antrine hiperinsulinemija [3]. ], medžiagų apykaitos pakitimai, lemiantys ligas [12], insulino padidintas IGF-I biologinis aktyvumas [13, 14], teigiamas insulino poveikis estrogenų biologiniam prieinamumui, lėtinio uždegimo būsena ir nutukimas [7]. Kita vertus, DM taip pat gali išsivystyti po naviko atsiradimo tam tikrose vėžio formose, kurios progresuoja labai greitai, pavyzdžiui, kasos ir kepenų vėžiui [15].

Laktatas (2-hidroksipropano rūgštis), anksčiau laikytas glikolizės atliekomis, atkreipė vis daugiau dėmesio kaip į lemiamą atsparumo insulinui, DM, vėžio vystymosi, palaikymo ir metastazių reguliatorių. Per pastarąjį pusšimtį metų atlikti dideli eksperimentai atskleidė, kad laktatas yra ir galinga kuro, ir signalizuojanti molekulė, kuri nuolat gaminama ir cirkuliuoja organizme [16]. Jo buvimas sergant diabetu ir vėžiu buvo pripažintas, o naujausi tyrimai rodo, kad po 50 atsisakymo metų jį slopinti gali būti gydoma. Pastaruoju metu vėžys ir DM buvo siejami su nenormaliu laktato metabolizmu. Laktatas palengvina vėžinėms ląstelėms būdingą poveikį metabolizmui ir turi papildomą nevėžinių ląstelių autonominį poveikį, kuris gali sukelti naviko atsiradimą. Be to, laktatas vaidina svarbų vaidmenį stimuliuojant naviko uždegimą ir skatinant naviko angiogenezę, veikdamas kaip signalinė molekulė [17]. Atsižvelgiant į tai, kad hiperlaktacidemija yra būtiniausias biologinis diabeto ir vėžio požymis, galima pagrįstai manyti, kad hiperlaktacidemija gali atlikti svarbų vaidmenį diabeto ir vėžio sąveikos metu. Čia apžvelgiame turimus įrodymus apie laktato vaidmenį skirtingose ​​​​biologinėse diabeto ir vėžio charakteristikose ir interaktyvų ryšį tarp jų. Atrodo, kad hiperlaktacidemija gali veikti kaip diabeto ir vėžio sąveikos centras ir prisidėti prie aukštesnės atsparumo insulinui būsenos bei piktybiškesnio vėžio ląstelių fenotipo.

2. Laktato gamyba ir metabolizmas

Laktatas, 3 anglies hidroksikarboksirūgštis, gaminamas citoplazmoje glikolizės būdu anaerobinėmis sąlygomis, redukuojant tarpinį metabolitą piruvatą, kartu oksiduojant NADH į NAD+. Šią reakciją katalizuoja laktatdehidrogenazė (LDH) [18]. LDH susideda iš keturių dviejų skirtingų tipų (H ir M) subvienetų, kurių kiekvienas subvieneto tipas yra skirtingai kontroliuojamas genetiškai, todėl susidaro penki skirtingi izofermentai, įskaitant LDH-1 (H4), LDH-2 (H3M1), LDH-3 (H2M2). , LDH-4 (H1M3) ir LDH-5 (M4) [19]. Aerobinėmis sąlygomis ir esant fermentui piruvato dehidrogenazei (PDH), piruvatas paverčiamas acetilo CoA, vėliau patenka į trikarboksirūgšties (TCA) ciklą arba Krebo ciklą.

Normali laktato koncentracija plazmoje yra 0,3–1,3 mM. Plazmoje laktatas yra buferizuotas NaHCO3. Laktatas gali turėti du stereoizomerus, būtent d-laktatą ir l-laktatą. Žmonių organizme laktatas daugiausia egzistuoja kairėn besisukančioje izoformoje. Dauguma žmogaus kūno audinių gamina laktatą, tačiau didžioji jo dalis yra raumenyse [18]. Laktatas per plazmos membraną pernešamas naudojant monokarboksilato transporterius (MCT), kurie palengvina su protonais susietų monokarboksilatų, pavyzdžiui, L-laktato, piruvato ir ketoninių kūnų, transportavimą [20, 21]. Iki šiol keturios izoformos, MCT1–4, buvo funkciškai pagrįstos šiai funkcijai įgyvendinti žinduoliams, kurių kiekviena turi skirtingą substrato ir inhibitorių afinitetą [20, 21] (1 pav.).

Laktato koncentracija plazmoje rodo pusiausvyrą tarp jo gamybos ir metabolizmo. Laktatą gali metabolizuoti įvairios ląstelės ir audiniai, pavyzdžiui, kepenys, lytinės ląstelės ir neuronai, per LDH virsta piruvatu, o vėliau – glikogenu arba anglies dioksidu [22]. Įprastomis fiziologinėmis sąlygomis laktatą pašalina kepenys ir inkstai [23, 24]. Šiuo metu laktatas taip pat laikomas energijos homeostazės reguliatoriumi [16, 25, 26]. Bendru lygiu laktatas gali būti perneštas į kepenis ir per Cori ciklą paverčiamas gliukoze, tarnaujančiu kaip energijos šaltinis [27].

3. Laktato gamyba didėja sergant diabetu

Laktato kiekis plazmoje nevalgius padidėja pacientams, sergantiems DM, įskaitant T1DM ir T2DM, palyginti su nesergančiais diabetu [28–36]. Nutukusių cukriniu diabetu sergančių pacientų plazmoje laktato kiekis nevalgius yra didesnis nei diabetu nesergančių nutukusių asmenų [37, 38]. Barnett ir kt. pasiūlė, kad su diabetu susijusi hiperlaktatemija gali būti ankstyvas ligos eigos pokytis [39]. Neseniai Berhane ir kt. [40] parodė, kad hiperinsulineminio euglikeminio spaustuko tyrimo metu laktato gamyba laipsniškai didėja, o tai yra hiperinsulinemijos būklė, panaši į ankstyvąsias T2DM vystymosi stadijas. Įdomu tai, kad panašūs ankstesni tyrimai taip pat praneša apie padidėjusią laktato koncentraciją ankstyvosiose diabeto, prediabeto ir hiperinsulinemijos stadijose. Be to, Brouwers ir kt. [41] pranešė apie padidėjusį laktato kiekį pacientams, sergantiems blogai kontroliuojamu T1DM ir glikogenine hepatopatija, o tai reiškia, kad padidėjusi laktato koncentracija plazmoje yra šių ligų klinikinio spektro dalis. Be to, buvo atskleista, kad laktatas gali numatyti diabeto atsiradimą ateityje [42, 43].

Su diabetu susijusios hiperlaktatemijos mechanizmai apima rimtus intraląstelinio gliukozės metabolizmo pokyčius insulinui jautriuose audiniuose, pavyzdžiui, susilpnėjusią glikogeno sintezę, sutrikusį gliukozės oksidacinį metabolizmą ir padidėjusį viso kūno neoksidacinės glikolizės greitį [28, 31, 44]. Svarbu tai, kad, palyginti su kontroline grupe, neoksidacinės glikolizės dažnis T2DM pacientams išlieka didesnis hiperglikemijos [31, 44, 45] ir hiperinsulinemijos [31, 44] būsenos metu. Be to, šiems pacientams po valgio neoksidacinė glikolizė yra didesnė, palyginti su sveikais kontroliniais pacientais, ir esant tokiai būklei padidėja laktato kiekis kraujyje [36]. Atsparumas insulinui vaidina gyvybiškai svarbų vaidmenį T2DM patogenezėje [46] ir gali būti naudojamas kaip ankstyvas ligos žymuo [40]. Esant atsparumui insulinui, didelis insulino kiekis skatina glikolizę aktyvuodamas du greitį ribojančius fermentus, būtent fosfofruktokinazę ir piruvato dehidrogenazę [47]. Taigi pacientams, sergantiems atsparumu insulinui / diabetu, padidėja glikolizės aktyvumas [31, 48]. Padidėjusi glikolizė padidina NADH ir piruvato susidarymą ir sumažina NAD+ lygį. Piruvatas LDH paverčiamas laktatu, kartu su NAD+ susidarymu iš NADH redokso reakcijos metu. Šią reakciją gali sustiprinti atsparumas insulinui, nes hiperinsulinemija sukelia sustiprintą glikolizę.

4. Laktato indėlis į atsparumą insulinui / diabetą

Kaip būtinas ląstelių metabolitas glikolitiniame kelyje, laktatas gali atspindėti ląstelių metabolizmo būklę. Kai kurie tyrimai rodo, kad padidėjęs laktato kiekis nutukimo atveju, kuris gali turėti reikšmingą vaidmenį gliukozės transportavimui ir metabolizmui, daro didelę įtaką jautrumui insulinui [49]. Aukštas jo lygis plazmoje gali būti ankstyvas atsparumo insulinui pradžios požymis ir gali būti naudojamas nustatyti atsparumo insulinui būseną [40]. Be to, ŽIV užsikrėtusiems pacientams, gydomiems nukleozidų atvirkštinės transkriptazės inhibitoriais, laktato lygis ramybės būsenoje ir po treniruotės yra susijęs su skeleto raumenų atsparumu insulinui [50]. Laktatas vienas arba kartu su kitais insulino sekreciją skatinančiais vaistais, pavyzdžiui, ketoniniais kūnais, skatina insulino išsiskyrimą INS-1 ląstelėse ir izoliuotose kasos salelėse [51], o tai rodo, kad padidėjęs plazmos laktatas skatina insulino sekreciją ir kasos atsaką į insulino sekreciją skatinančius vaistus. Taigi šie rezultatai rodo, kad laktatas ne tik padidina insulino sekreciją iš β-ląsteles, bet ir pagerina šių ląstelių reakciją į insuliną [51]. Šie duomenys gali paaiškinti, kad fizinių pratimų ir aerobinių/anaerobinių treniruočių metu gautas laikinai padidėjęs laktatas pagerina DM simptomus. Vietoj to, diabetu sergantiems pacientams, sergantiems nutukimu, laktato koncentracija nuolat didėja [52]. Lėtinė hiperlaktatemija, kurią palaiko padidėjęs laktato susidarymas iš adipocitų nutukusiems asmenims [53], randama prieš diabeto atsiradimą [52] ir gali dalyvauti šiame patologiniame procese. Kartu šie duomenys rodo, kad lėtinė hiperlaktatemija gali rodyti ankstyvas atsparumo insulinui stadijas ir prisidėti prie diabeto atsiradimo. Tiesą sakant, kai kurie epidemiologiniai tyrimai rodo, kad didelis laktato kiekis gali numatyti diabeto atsiradimą [42, 43]. Crawford ir kt. [43] savo skerspjūvio tyrime tarp baltaodžių pagyvenusių žmonių, sergančių sunkia miego arterijos ateromatoze, nustatytas ryšys tarp plazmos laktato kiekio ir vyraujančio T2DM, tačiau tarp afroamerikiečių ryšio nenustatyta.

Nors molekuliniai mechanizmai, lemiantys laktato sukeltą atsparumą insulinui / diabetą, dar neaiškūs, buvo pasiūlyta, kad slopinamas gebėjimas oksiduoti gliukozę, slopinamas gliukozės transportavimas ir insulino stimuliuojama glikolizė, taip pat sumažintas insulino sukeltas gliukozės įsisavinimas. yra susijęs su šiuo reiškiniu. Be to, buvo pasiūlyta, kad laktato sukeltas atsparumas insulinui yra susijęs su sutrikusia insulino signalizacija ir sumažėjusiu insulino sukeltu gliukozės transportavimu skeleto raumenyse [54].

5. Laktato gamyba didėja sergant vėžiu

Bendras pirminio ir metastazavusio vėžio požymis yra padidėjęs glikolizės greitis, dėl kurio padidėja gliukozės įsisavinimas ir laktato susidarymas, net esant normalioms deguonies sąlygoms. Tai taip pat žinoma kaip aerobinė glikolizė arba „Varburgo efektas“ [55], metabolinis vėžio požymis. Ją pirmą kartą aprašė XX amžiaus 20-ajame dešimtmetyje Warburg ir iškėlė hipotezę, kad vėžį sukelia sutrikusi mitochondrijų metabolizmas. Nors ši hipotezė buvo įrodyta klaidinga, eksperimentiniai stebėjimai dėl padidėjusios glikolizės vėžyje net ir esant normalioms sąlygoms buvo pakartotinai pagrįsti [56]. Skirtingai nuo anaerobinės glikolizės, kuri skatina energijos gamybą hipoksijos metu, Warburgo efektas suteikia dauginimosi pranašumą, nes paverčia angliavandenių srautus iš energijos generavimo į biosintetinius procesus. Kad būtų patenkinti vėžio ląstelių proliferacijos reikalavimai, glikolitinis jungiklis yra susijęs su padidėjusiu gliukozės vartojimu ir laktato kaupimu [57]. Šokiruoja tai, kad žmogaus vėžiu, pavyzdžiui, gimdos kaklelio vėžiu, nustatytas laktato kiekis gali svyruoti nuo 4 mM iki 40 mM [58], o fiziologinis laktato kiekis normaliuose audiniuose yra 1,8–2 mM [59].

Molekuliniai mechanizmai, kuriais grindžiamas glikolizės reguliavimas sergant vėžiu, nėra gerai apibrėžti. Paprastai manoma, kad šis reiškinys atsiranda dėl nepakankamo ląstelių kvėpavimo, onkogeninių pokyčių ir metabolitų pernešėjų bei glikolitinių fermentų, pavyzdžiui, gliukozės pernešėjų ir heksokinazių, kurios yra svarbiausios glikolitinį srautą reguliuojančios molekulės, ekspresijos [60]. Onkogenai ir naviką slopinantys genai, susiję su metaboliniais pokyčiais nuo oksidacinio fosforilinimo iki padidėjusios vėžio ląstelių glikolizės, apima hipoksijos sukeliamą faktorių-1α (HIF-1α) [60, 61], epidermio augimo faktorius (EGF), fosfoinozitolio 3-kinazė (PI3-K), myc, branduolinis Kappa Beta faktorius, baltymų kinazė B (PKB), į insuliną panašus augimo faktorius I, mTOR, Kirsten žiurkės sarkoma viruso onkogeno homologas (KRAS) ir 5′ adenozino monofosfatu aktyvuota proteinkinazė (AMPK). Dauguma šių onkogenų stimuliuoja genus, koduojančius baltymus, reguliuojančius glikolizę ir glutaminolizę [55].

Tarp minėtų onkogenų transkripcijos faktorius HIF-1α yra svarbiausias glikolitinio atsako ir ląstelių adaptacijos reguliatorius [62]. HIF-1 išraiškaα-reguliuojami genai lemia padidėjusį glikolitinį srautą vėžio ląstelėse, nepriklausomai nuo deguonies. HIF-1 taikiniai yra heksokinazė II [63], angiogeniniai augimo faktoriai (pvz., VEGF), hematopoetiniai faktoriai (pvz., eritropoetinas ir transferinas) [64] ir membranos pernešėjai, įskaitant gliukozės transporterį-1 (GLUT-1) ir monokarboksilatą. transporteris-4 (MCT-4). Šie membraniniai transporteriai prisideda prie pakankamo gliukozės transportavimo į ląstelę ir sukaupto laktato išlaisvinimo iš ląstelės. HIF-1α suaktyvina piruvatdehidrogenazės kinazę 1 (PDK-1) ir vėliau inaktyvuoja piruvatdehidrogenazės kompleksą (PDC), todėl sumažėja oksidacinio fosforilinimo srautas [55]. Be to, aktyvuotas HIF-1α yra susijęs su iš esmės dideliu gliukozės suvartojimu. Be to, hipoksijos-reoksigenacijos pažeidimas sergant vėžiu gali stabilizuoti HIF-1α [65], nurodant, kad jo konstitucinį padidėjimą gali sukelti cikliniai oksiniai-hipoksiniai ciklai, kurie vyksta sergant ikivėžiniais vėžiais.

Be glikolizės, glutaminolizė yra dar vienas pagrindinis energijos gamybos būdas ir sukelia padidėjusį laktato susidarymą vėžio ląstelėse. Be to, glutaminolizė palengvina makromolekulių sintezę proliferuojančiose naviko ląstelėse [61]. Piruvato kinazės (PK) M2 (PKM2) navikui būdinga izoforma yra papildomas laktato šaltinis, paverčiant fosfenolpiruvatą (PEP) piruvatu. Nepaisant to, PEP gali skatinti piruvato gamybą nepriklausomai nuo PKM2 aktyvumo, nes yra fosfoglicerato mutazės 1 (PGAM1) fosfodonoras [66].

6. Laktatas palengvina vėžio vystymąsi

Didelės laktato koncentracijos siejamos su nepalankiomis kai kurių žmogaus vėžio formų klinikinėmis baigtimis [57]. Padidėjęs intratumorinis laktato kiekis yra susijęs su padidėjusiu metastazių dažniu sergant gimdos kaklelio, krūties, galvos ir kaklo vėžiu [58, 67, 68]. Kadangi laktato koncentracija atvirkščiai koreliuoja su bendru ir be ligos pacientų išgyvenimu, naviko laktato susidarymas, laktato kiekis serume ir LDH kiekis jau seniai buvo pripažinti pacientų, sergančių įvairių tipų epitelio vėžiu, prognostiniais biomarkeriais [55, 69–79]. Padidėjęs laktato kiekis keičia mikroaplinką, maitina vėžines ląsteles ir sukelia acidozę, uždegimą, angiogenezę, imunosupresiją ir atsparumą radiacijai [80–83]. Kitose pastraipose apžvelgiame šiuos padidėjusio laktato biologinius veiksmus vėžio vystymuisi ir pažangai, aprašydami pagrindinius įrodymus.

Esminiai tyrimai parodė, kad vėžio ląstelės gali pasisavinti laktatą ir panaudoti jį energijos gamybai bei aminorūgščių susidarymui. Sukaupti įrodymai rodo, kad laktatas yra oksidacinio metabolizmo deguonies prisotintose vėžio ląstelėse kuras [68, 84–87] ir signalizacijos tarpininkas vėžio ir endotelio ląstelėse (EC) [88–90]. Neseniai Bonuccelli ir kt. [68] atskleidžia, kad ketonai ir laktatas skatina naviko augimą ir metastazes, o tai gali paaiškinti, kodėl cukriniu diabetu sergantiems pacientams dėl padidėjusios ketonų / laktato gamybos padidėja vėžio dažnis ir bloga prognozė. In vitro tyrimai rodo, kad gimdos kaklelio vėžio SiHa ląstelės ir krūties vėžio MDA-MB-231 ląstelės pasisavina laktatą priklausomai nuo pH [84, 91]. Dėl nepakankamo deguonies prisotinimo ar veiksmingo kraujagyslių tinklo mikroaplinkoje, vėžio pasisavinimas ir laktato išnaudojimas priklauso nuo deguonies koncentracijos, laktato kiekio, sveikų mitochondrijų kiekio ir tinkamos MCT ekspresijos [92, 93]. Dėl reikšmingų metastazę skatinančių laktato savybių galima manyti, kad vėžiu sergantiems pacientams neprotinga naudoti laktato turinčius intraveninius injekcinius tirpalus, pavyzdžiui, Ringerio arba Hartmanno laktato tirpalus [68].

Naviko mikroaplinka (TME) reiškia sudėtingą ekstraląstelinės matricos molekulių, tirpių faktorių, adipocitų ir stromos ląstelių tinklą, įskaitant naviko endotelio ląsteles (TEC), su naviku susijusius fibroblastus (TAF) ir makrofagus. Tarp tirpių TME faktorių didelis laktato kiekis yra svarbus dėl jo poveikio navikams ir stromos ląstelėms [18]. Be to, jis sumažina tarpląstelinį pH iki 6,0–6,5 [94–96]. Tiesą sakant, pieno rūgšties acidozė dažnai sukelia mirtį pacientams, sergantiems kai kuriais metastazavusiu vėžiu, pavyzdžiui, metastazavusiu krūties vėžiu [97–113]. Rūgštinė TME sukelia skausmą vėžiu sergantiems pacientams [114] ir sukelia kai kurių navikų metastazes [115]. Be to, acidozė pati savaime gali būti mutageninė [116], tikriausiai dėl DNR atstatymo slopinimo [95] ir gali sukelti spontanišką diploidinių fibroblastų transformaciją [117]. Tam tikromis aplinkybėmis žemas pH sukelia invaziją in vitro [118] ir metastazes in vivo [119], galbūt per metaloproteinazes/katepsinus, kurie skatina ekstraląstelinės matricos ir bazinių membranų irimą [120, 121]. Pieno rūgšties acidozė sukelia per didelę matricos metaloproteinazės-9 (MMP-9) [122], VEGF-A [123, 124] ekspresiją, transformuojančią augimo faktorių.β2 (TGF-β2) [125] ir IL-8 [126–128] įvairiose vėžio ląstelėse, todėl TME tampa dar sudėtingesnė. Pavlides ir kt. [129] rodo, kad vėžio ląstelės stimuliuoja aerobinę glikolizę CAF. CAF užtikrina naviko išgyvenimą ir didesnį proliferacinį pajėgumą dėl daugelio veiksnių, įskaitant laktato ir piruvato išskyrimą bei ląstelių metabolizmo pokyčius. Atitinkamai, vėžio ląstelės gali priprasti prie greitų TME pokyčių perprogramuodamos stromos ląsteles ir per metabolinius mainus tarp oksidacinių ir glikolitinių ląstelių [129, 130].

Naviko viduje TAF turi skirtingą laktato metabolizmo kelią nei vėžio ląstelės. TAF daugiausia yra mažai gliukozės importuotojo GLUT1, laktatdehidrogenazės-B ir piruvatdehidrogenazės, o vėžio ląstelėse yra daug GLUT1, laktatdehidrogenazės-A, piruvatdehidrogenazės kinazės ir hipoksijos sukeliamo faktoriaus-1α. Vėžio ląstelėse importuota gliukozė metabolizuojama į piruvatą, o piruvato dehidrogenazė yra neaktyvi, nes ją fosforilina piruvatdehidrogenazės kinazės fosforilatai. Todėl LDH-5 (sudarytas iš LDHA subvienetų) anaerobiniu būdu paverčia piruvatą laktatu, kuris pašalinamas iš ląstelės. Kita vertus, TAF importuoja laktatą ir savo LDH-1 (su LDHB subvienetais) aktyvumu paverčia jį atgal į piruvatą, kuris per piruvato dehidrogenazės aktyvumą nukreipiamas į aerobinius mitochondrijų kelius. Atrodo, kad šie du laktato metabolizmo keliai vėžio ląstelėse ir TAF papildo vienas kitą, nes vėžio ląstelės gamina didelį laktato kiekį ir rūgština mikroaplinką, o TAF vartoja laktatą aerobiniu būdu ir mažina mikroaplinkos rūgštingumą [131, 132 ].

Angiogenezės procesas palaiko naujų kraujagyslių vystymąsi ir atlieka svarbų vaidmenį atkuriant perfuziją, deguonies tiekimą ir maistinių medžiagų tiekimą. Laktatas yra būtinas žaizdų gijimo ir angiogenezės veiksnys [133–135]. Pats laktatas sukelia ląstelių migraciją [134], kraujagyslių morfogenezę [136], cirkuliuojančių kraujagyslių pirmtakų ląstelių prisitraukimą [137] ir vamzdelių formavimąsi bei skatina angiogenezę, aktyvuodamas VEGF/VEGFR2 kelią [136, 138] ir stimuliuodamas endotelio ląsteles per MCT1. skatina I fosforilinimą ir skaidymąκBα, suaktyvinantis NF-kB/IL-8 (CXCL8) signalizacijos kelią [90]. Laktato stimuliuojama angiogenezė priklauso nuo laktato oksidacijos LDH-1, naudojant fermentinės reakcijos produktus, pavyzdžiui, piruvatą ir NADH, ir laktato transporterius [136, 137]. Didėjanti piruvato gamyba oksiduojantis laktatui aktyvina NF-κB ir HIF-1, o tai lemia pernelyg didelę kai kurių angiogenezei reikalingų augimo faktorių, įskaitant VEGF, bazinį fibroblastų augimo faktorių (bFGF) ir stromos ląstelių kilmės faktorių-1 (SDF-1), ekspresiją [139, 140]. Be to, Vegran ir kt. [90] rodo, kad laktato stimuliuojamas NF-κB aktyvacija EC yra susijusi su IL-8 sukelta autokrinine angiogeneze ir kad šis kelias skatina EB migraciją ir vamzdelių susidarymą in vitro, taip pat laktato sukeltą naviko angiogenezę in vivo .

Naviko kraujagyslių endotelio ląstelės importuoja didelį gliukozės kiekį (aukštas GLUT1 lygis). Tačiau kadangi juose yra didelis LDH1 ir mažas HIF-1α ir mažasLDH5, panašiai kaip TAF, jie rodo aerobinį metabolizmą. Tuo tarpu dėl mažos laktato transporterių ekspresijos endotelio ląstelės galbūt neimportuoja daug laktato į naviką. Taigi, atrodo, kad pagrindinis endotelio ląstelių vaidmuo yra reaguoti į naviko mikroaplinką generuojant naujus kraujagysles, palaikančius vėžio ląsteles ir kitas su naviku susijusias ląsteles. Tačiau jie gali nedalyvauti naviko viduje įsisavinant ir suvartojus laktatą [132, 141].

Viena iš pagrindinių vėžio vystymosi priežasčių yra ta, kad imuninė sistema praranda gebėjimą veiksmingai išnaikinti aberantines ląsteles. Didelis laktato kiekis turi žalingą poveikį naviką infiltruojančioms imuninėms ląstelėms. Klinikiniai įrodymai rodo, kad laktatas riboja imuninių ląstelių infiltraciją sergant inkstų ląstelių karcinoma (RCC) ir pažeidžia T ląstelių metabolizmą bei citolitines funkcijas [80, 142]. Laktatas 95 % trukdo žmogaus citotoksinių T limfocitų (CTL) proliferacijai ir citokinų išsiskyrimui, o jų citotoksiniam aktyvumui – 50 %. Iš melanomos ląstelių išsiskiriantis laktatas trukdo TAA sukeltam IFN-γ specifinių CTL generavimas melanomos sferoidinėse kokultūrose [143]. Be to, kiti tyrimai patvirtino, kad didelis laktato kiekis slopina TCR stimuliuojamą citokinų išsiskyrimą (IFN-γ, TNF-αir IL-2) ir skatina dalinį lizinių granulių egzocitozės pažeidimą CTL, selektyviai sumažindamas MAPK p38 ir JNK/c-Jun signalizacijos kelius [81]. Be to, iš naviko gautas laktatas sustiprina arginazės-1 (ARG1) ekspresiją su naviku susijusiuose makrofaguose (TAM), trukdydamas T ląstelių aktyvumui ir proliferacijai [144], slopindamas priešnavikinį imuninį atsaką ir skatindamas naviko augimą [145, 146]. Pastaruoju metu Colegio ir kt. [145] parodė, kad normaliomis sąlygomis laktatas stabilizuoja HIF-1α, dėl ko ARG1 ir VEGF geno ekspresija makrofaguose. Be to, naviko kilmės laktatas keičia monocitų funkciją, trukdo jiems diferencijuotis į DC ir slopina citokinų gamybą iš diferencijuotų DC ir slopina NK ląstelių aktyvumą, taip prisidedant prie imuninės sistemos slopinimo navikuose [82, 147, 148].

Kai kurie eksperimentinių navikų tyrimai, įskaitant apie 1000 atskirų žmogaus galvos ir kaklo plokščialąstelinių ląstelių karcinomos ksenografų, rodo, kad laktato kiekis teigiamai koreliuoja su atsparumu spinduliuotei [149]. Šios koreliacijos mechanizmai yra bent iš dalies susiję su laktato antioksidacinėmis savybėmis [150]. Priešvėžinis gydymas, pavyzdžiui, jonizuojanti spinduliuotė ir daugelis chemoterapinių vaistų, skatina reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) perprodukciją tikslinėse vėžio ląstelėse, o tai sukelia DNR/RNR pažeidimus, genomo nestabilumą ir lipidų peroksidaciją. Taigi, laktato kaupimasis gali padidinti atsparumą radiacijai ir sukelti atsparumą cheminiam poveikiui [151]. Wagneris ir kt. atskleidžia, kad laktatas gali moduliuoti ląstelių DNR pažeidimų atstatymo procesus gimdos kaklelyje, todėl gimdos kaklelio vėžio ląstelės yra atsparios priešvėžiniam gydymui [152]. Kadangi gyvūnams, kuriems taikoma chemoterapija ar radioterapija, sumažėja laktato kiekis [153], šio metabolito patikrinimas sergant žmogaus vėžiu gali būti naudojamas terapiniam atsakui prognozuoti. Atitinkamai, neseniai atliktas tyrimas [154] siūlo, kad laktatas gali būti naudojamas kaip kiekybinis ūmaus radiacijos atsako biomarkeris.

Galiausiai, laktatas yra uždegimo tarpininkas [155, 156] ir gali būti naudojamas kaip uždegiminių procesų biomarkeris [157]. Laktatas ir uždegimas stimuliuoja vienas kitą kenksmingame cikle [83]. Jis skatina IL-4/IL-13 gamybą [158] ir stimuliuoja IL-23/IL-17 kelią [18]. Laktatas skatina IL-23p19 ekspresiją naviko infiltruojančiose imuninėse ląstelėse, stimuliuodamas į rinkliavą panašius receptorius. Be to, jis skatina splenocitus išskirti IL-17 priklausomai nuo IL-23. Šis poveikis skatina vietinius uždegiminius atsakus, skatina navikų atsiradimą ir vystymąsi [159]. Be to, laktatas skatina su uždegimu susijusių gaubtinės ir tiesiosios žarnos navikų augimą, nes skatina PGE2 sintezę ir gliukoneogenezę monocituose [160]. Kartu šie tyrimai rodo, kad laktatas vaidina svarbų priešuždegiminį vaidmenį auglio vystymuisi.

Manoma, kad diabetu sergantiems pacientams riebalinis audinys vaidina pagrindinį vaidmenį sukeliant metabolinį sindromą. Šiems pacientams būdingas lėtinis riebalinio audinio uždegimas ir bendras citokinų, pvz., TNF, kiekio padidėjimas.α, IL-1 ir IL-6 [161]. Nors šie išsiskyrę veiksniai vaidina svarbų vaidmenį vėžio biologijoje, yra įrodymų, rodančių galimą jų abipusį vaidmenį laktato lygyje. Pavyzdžiui, TNFα gali sukelti LDHA ir laktato gamybą per trumpą laiką [162], o laktatas skatina TNF išsiskyrimą.α ir IL-6 kai kuriose ląstelėse [163]. Atliekant tyrimą su žiurkėmis, lėtinė IL-1 infuzijaα sukelta hiperlaktacidemija [164] ir kitame tyrime su žiurkių kiaušidžių ląstelėmis IL-1β padidėjęs gliukozės įsisavinimas ir sukelta aerobinė glikolizė [165]. Be to, buvo įrodyta, kad didelis IL-6 kiekis koreliuoja su dideliu laktato kiekiu ir gali lemti prastą pacientų, sergančių metastazavusia melanoma, prognozę [166]. Šie atradimai rodo, kad išsiskyrimo citokinai gali turėti įtakos tiek vėžiui, tiek metaboliniam sindromui ir gali būti jungiamieji taškai tarp abiejų ligų vystymosi.

7. Baigiamosios pastabos ir ateities perspektyvos

Sukaupti įrodymai rodo didelį sergamumą ir mirtingumą nuo įvairių piktybinių navikų pacientams, sergantiems cukriniu diabetu. Cukrinis diabetas ir jo rizikos veiksniai yra susiję su vėžiu ir turi sudėtingą ir abipusį stiprinimą. Nepaisant to, pagrindiniai mechanizmai yra menkai suprantami ir šiuo metu nėra jokių klinikinių įrodymų, kad būtų galima tinkamai gydyti pacientus, kurie kartu serga šiomis dviem ligomis. Cukrinis diabetas ir vėžys sąveikauja vienas su kitu užburtame rate, kur laktatas vaidina pagrindinį vaidmenį šioje tarpusavio sąveikoje. Atsparumas insulinui / diabetas ir vėžio sąlygos gamina didelį laktato kiekį, o aukštas laktatas skatina diabeto ir vėžio vystymąsi bei progresavimą (2 pav.).


Rezultatai ir DISKUSIJA

LDHA sumažinimas sukelia oksidacinį stresą ir ląstelių mirtį.

Siekėme suprasti ląstelių mirties mechanizmus po LDHA sumažinimo naudojant trumpą trukdantį RNR (siLDHA), kuri, kaip įrodyta, slopina naviko atsiradimą. Pirma, mes nustatėme sumažėjusios LDHA ekspresijos poveikį žmogaus Panc (P) 493 B-limfoidinių ląstelių deguonies suvartojimui, nes LDHA sumažinimas paskatintų piruvato patekimą į mitochondrijas oksidaciniam fosforilinimui ir taip padidintų deguonies suvartojimą. Sumažėjus LDHA ekspresijai siRNR P493 ląstelėse, padidėjo deguonies suvartojimas (1 pav. A ir B). Deguonies suvartojimas taip pat padidėjo sergant žmogaus kasos vėžiu, gydytu siLDHA (S1 pav. A ir B).

LDHA ekspresijos sumažinimas siRNR padidina deguonies suvartojimą ir oksidacinio streso sukeltą P493 žmogaus limfomos B ląstelių mirtį. siRNR, nukreiptos į žmogaus LDHA (SMARTpool), buvo transfekuotos elektroporacijos būdu, kad laikinai sumažėtų LDHA ekspresija. (A) Imunoblotingas buvo atliktas su visų ląstelių lizatais, tirtas triušio monokloniniu anti-LDHA ir pakartotinai tiriamas anti-α-tubulinu kaip pakrovimo kontrolė. (B) P493 ląstelių deguonies suvartojimas buvo nustatytas naudojant Clark tipo deguonies elektrodą praėjus 72 valandoms po transfekcijos su siLDHA (nuolydis = -1,7) arba siControl (nuolydis = -0,7). (C) Intraląstelinė ROS gamyba buvo aptikta naudojant DCFDA fluorescenciją ir stebima srauto citometrija praėjus 72 valandoms po transfekcijos su siLDHA arba siControl, kai yra arba nėra NAC. (D) Ląstelių mirtis buvo nustatyta aneksinu V ir 7-AAD dažytų ląstelių srauto citometrija praėjus 96 valandoms po transfekcijos su siLDHA arba siControl, kai yra arba nėra NAC (20 mM pridėta praėjus 24 valandoms po transfekcijos). Skaičius kiekviename paveikslėlyje rodo vidutinį negyvų ląstelių procentą (± SEM). Negyvų ląstelių, apdorotų siLDHA, skaičius, palyginti su kontroline grupe, turi a P vertė 0,0002 naudojant Studento t Išbandykite tuos, kurie buvo gydomi siLDHA ir NAC, palyginti su siLDHA grupe, turi a P vertė 0,001. (E) siControl ląstelių populiacijos augimas, palyginti su ląstelėmis, apdorotomis siLDHA, išaugintomis, kai yra arba nėra 5 mM NAC, pridedama kasdien, pradedant 24 valandas po transfekcijos. Santykinis siControl ir siLDHA ir siLDHA ir siLDHA + NAC ląstelių skaičius 4 dieną turi P vertės atitinkamai 0,008 ir 0,004. Jei naudojate siControl ir siControl + NAC, P vertė yra 0,63.

Tikimasi, kad padidėjus deguonies suvartojimui, sumažinus siLDHA glikolizę, padidės mitochondrijų reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamyba, ypač todėl, kad glikolizė, kuri nukreipia piruvatą į laktatą, sumažina ląstelių oksidacinį stresą (20). Todėl nustatėme ROS susidarymą 5-(ir-6)-karboksi-2′,7'-dichlordihidrofluoresceino diacetato (DCFDA) fluorescencija, išmatuota srauto citometrija (1 pav.C). Mes nustatėme, kad ląstelių gydymas siLDHA sukėlė reikšmingą ROS. Taigi mes paveikėme ląsteles N-acetilcisteinas (NAC), gerai žinomas antioksidantas, ir pastebėtas reikšmingas ROS sumažėjimas iš siLDHA apdorotų ląstelių (1 pav.C).

Tada siekėme nustatyti, ar antioksidantas NAC gali sumažinti ląstelių mirtį, susijusią su padidėjusia ROS ir sumažėjusia LDHA ekspresija. Mes nustatėme, kad LDHA ekspresijos sumažinimas naudojant siRNR žymiai padidino nekrozę arba vėlyvą ląstelių mirtį, kuriai būdingas sustiprintas 7-amino-aktinomicino (7-AAD) ir aneksino V žymėjimas (1 pav.D). Gydymas NAC praėjus 24 valandoms po transfekcijos iš dalies sumažino ląstelių mirtį, kurią taip pat lydėjo dalinis ląstelių proliferacijos išgelbėjimas (1 pav.E). Pastebėjome, kad kasdien pridėjus 5 mM NAC, ląstelių dauginimasis buvo išgelbėtas geriau nei 20 mM NAC, pridėjus vieną kartą po transfekcijos, o tai atspindi trumpą aktyvaus NAC tarnavimo laiką (1 pav.E). Tačiau kasdienis 10 arba 20 mM NAC pridėjimas buvo toksiškas siRNR transfekuotoms ir kontrolinėms ląstelėms.

Pastebėję, kad LDHA sumažinimas siRNR gali sukelti oksidacinį stresą ir ląstelių mirtį, mes ieškojome mažos molekulės LDHA inhibitoriaus kaip į vaistus panašios priemonės naviko metabolizmui tirti. Mes įvertinome keletą junginių, kuriuos sukūrė Vander Jagt ir bendradarbiai (21, 22), kurie buvo ypač suinteresuoti maliarijos LDH (pLDH) nukreipimu, ir radome tarp gosipolio, kuris pats yra toksiškas LDHA inhibitorius, analogų. dihidroksinaptoatai: 11f (FX11 Pubchem ID: 10498042) ir 11e [E 2,3-dihidroksi-6-metil-7-(metil)-4-propilnaftalen-1-karboksirūgštis Pubchem ID: 10265351]. FX11 pasirinkome kaip mažą molekulę, skirtą žmogaus LDHA slopinimui, nes ji pirmiausia slopino LDHA, o ne LDHB ar pLDH (21, 22). Palyginimui buvo pasirinktas E junginys, nes jis turėjo daug mažesnį slopinamąjį aktyvumą nei FX11.

Mes iš naujo apibūdinome FX11 ir E naudodami išgrynintą žmogaus kepenų LDHA ir nustatėme Kis atitinkamai 8 ir >90 μM (S2 pav.). A ir B). FX11 yra konkurencinis LDHA inhibitorius NADH atžvilgiu, kai LDHA paverčia piruvatą į laktatą, todėl NADH paverčiamas NAD+. Norėdami toliau dokumentuoti selektyvų FX11 ir E prisijungimą prie LDHA, atlikome afinitetinę chromatografiją su P493 ląstelių lizatu, naudodami FX11 arba E, imobilizuotą ant sefarozės granulių. Ant FX11 arba E afiniteto granulių buvo įkelti vienodi kiekiai ląstelių lizato ir plačiai nuplauti, o surišta LDHA buvo išplauta 1 mM NADH. FX11 afiniteto granulės davė 4 kartus didesnį LDHA aktyvumą nei karoliukai su imobilizuotu E (S2 pav.C). Visi šie rezultatai rodo, kad FX11 gali susieti ir slopinti žmogaus LDHA fermentų aktyvumą. Kadangi GAPDH yra dar vienas pagrindinis glikolitinis fermentas, paverčiantis NAD + į NADH, mes taip pat siekėme nustatyti, ar FX11 gali slopinti nuo NAD + priklausomą gliceraldehido-3-fosfato virsmą bis-fosfogliceratu. Mes nustatėme, kad net esant 74 μM FX11, GAPDH aktyvumas nebuvo slopinamas. Per formalią Michaelis-Menten kinetiką apskaičiuota Ki yra >>300 μM GAPDH, o tai rodo, kad FX11 buvo selektyvus LDHA tarp glikolitinių fermentų, naudojančių kofaktorių NAD.

Kaip pastebėta siRNR sukelto LDHA mažinimo atveju, LDHA slopinimas FX11 padidino deguonies suvartojimą, ROS gamybą ir ląstelių mirtį (2 pav. A–C). Mes nustatėme, kad NAD + sintezės NAMPT inhibitorius FK866 taip pat padidino ROS gamybą (2 pav.B). Kadangi ROS lygis gali padidėti dėl sumažėjusios NADPH gamybos dėl galimo gliukozės transportavimo slopinimo (ir dėl to sumažėjusio heksozės monofosfato šunto aktyvumo, kuris gamina NADPH) dėl netiesioginio FX11 ir FK866 poveikio, išmatavome ir nustatėme, kad gliukozės įsisavinimas, išmatuotas NBD-gliukoze [2-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-il)amino)-2-deoksigliukoze], reikšmingai nesumažėjo ir kad NADPH lygis beveik nepakito. apdorojant FX11 arba FK866 (S3 pav.). NAC galėtų iš dalies išgelbėti sumažėjusį P493 ląstelių, apdorotų FX11 arba FK866, proliferaciją (2 pav. D ir E), rodantis, kad oksidacinis stresas iš dalies prisidėjo prie ląstelių proliferacijos slopinimo. Atsižvelgdami į reikšmingą FX11 poveikį P493 ląstelių, kurios priklauso nuo Myc, dauginimuisi, atmetėme trivialią galimybę, kad FX11 gali slopinti pačią Myc ekspresiją (S1 pav.C). Apskritai šie tyrimai patvirtina, kad LDHA lygio ar aktyvumo sumažėjimas sukelia oksidacinį stresą ir ląstelių mirtį.

LDHA slopinimas FX11 padidino deguonies suvartojimą, ROS gamybą ir ląstelių mirtį. (A) P493 ląstelių deguonies suvartojimas buvo nustatytas Clark tipo deguonies elektrodu, kai FX11 yra (nuolydis = -2,4) ir jo nėra (nuolydis = -1,7). Duomenys reprezentuoja pasikartojančius eksperimentus. (B) ROS lygiai buvo nustatyti DCFDA fluorescencija P493 ląstelėse, apdorotose FX11 arba FK866. Duomenys reprezentuoja tris dviejų atskirų eksperimentų mėginius. (C) Ląstelių mirtis buvo nustatyta aneksinu V ir 7-AAD dažytų ląstelių srauto citometrija po 24 valandų gydymo FX11, lyginant su kontrole. Skaičius kiekviename paveikslėlyje rodo vidutinį negyvų ląstelių procentą. FX11 apdorotos ląstelės, palyginti su kontroline grupe, turi a P 8,92e-06 vertės. (D ir E) Kontrolinių ląstelių ląstelių populiacijos augimas, palyginti su ląstelėmis, apdorotomis FX11 arba FK866, kai yra arba nėra 20 mM NAC. Visos ląstelės buvo auginamos 1 × 105 ląstelių / ml. Ląstelių skaičius buvo atliktas trimis egzemplioriais ir parodytas kaip vidurkis ± SD, o visas eksperimentas buvo pakartotas su panašiais rezultatais.

FX11 slopina glikolizę ir keičia ląstelių energijos apykaitą.

Be oksidacinio streso, kurį sukelia LDHA slopinimas, siekėme nustatyti, kaip FX11 veikia ląstelių bioenergetiką. Pirma, mes pastebėjome, kad tiek FX11, tiek FK866 sumažino mitochondrijų membranos potencialą ir kad derinys paryškino anomaliją (3 pav.A). Šiuo atžvilgiu FX11 ir FK866 derinys buvo toksiškesnis P493 ląstelėms nei bet kuris vienas atskirai, sukeldamas gilesnį ląstelių proliferacijos slopinimą (3 pav.B). Dozės ir atsako tyrimas, naudojant FX11 ir FK866 dozių derinį, parodė, kad derinio indeksas (CI-50) yra 0,78, o tai rodo šiek tiek sinergetinį derinio poveikį ląstelių proliferacijai (S4 pav.A). Po 20 valandų FX11 arba FK866 poveikio sumažėjus ATP lygiui, suaktyvėjo AMP kinazė ir fosforilinamas jos substratas acetil-CoA karboksilazė (3 pav. C ir D ir S1 pavD), o tai rodo, kad, be oksidacinio streso sukėlimo, šie agentai sumažino ląstelių energijos lygį. Sumažėjęs ATP lygis, nepaisant padidėjusio deguonies suvartojimo ląstelėje, rodo, kad gydymas FX11 padidino neproduktyvų mitochondrijų kvėpavimą, kaip buvo pranešta dėl shRNR sukelto LDHA numušimo (16). Kadangi LDHA slopinimas mažina NAD + perdirbimą, P493 ląstelių gydymas FX11 buvo susijęs su NADH/NAD + santykio padidėjimu (3 pav.E) ir ląstelių autofluorescencija, atspindinti padidėjusį ląstelių NADH lygį (S4 pav. B ir C). Priešingai nei FK866, FX11 žymiai sumažino, bet visiškai neslopino ląstelių laktato gamybos (3 pav.F). Šie stebėjimai rodo, kad FX11 nukreiptas į LDHA, slopina glikolizę ir šuntuoja piruvatą į mitochondrijas.

(A) FK866 padidina FX11 sukeltą mitochondrijų membranos potencialo praradimą. P493 ląstelės, apdorotos kontroliniu nešikliu, FK866, FX11 arba abiem inhibitoriais, buvo nudažytos JC-1 ir buvo atlikta srauto citometrinė analizė, o FL2 reiškia raudonos fluorescencijos intensyvumą, o FL1 - žalią fluorescencijos intensyvumą, kuris atspindi ląsteles su sumažėjusia mitochondrijų membrana. Kiekvienoje skydelyje nurodytas vidutinis procentas (± SEM) ląstelių, kurių membranos potencialas yra sumažėjęs. The P reikšmės buvo 0,03, 0,002 ir 0,0008, lyginant FX11 apdorotas ląsteles, FK866 apdorotas ląsteles arba ląsteles, apdorotas abiem, atitinkamai su kontroline grupe. (B) FK866 ir FX11 poveikis P493-6 ląstelių proliferacijai. Gyvos ląstelės buvo skaičiuojamos naudojant tripano mėlynojo dažo išskyrimą. Duomenys rodomi kaip trijų pakartojimų mėginių vidurkis ± SD. (C) FX11 arba FK866 poveikis ATP lygiui. P493 ląstelės buvo apdorotos 9 μM FX11 arba 0, 5 nM FK866 20 valandų ir suskaičiuotos. ATP lygiai (vidurkis ± SEM, n = 5 eksperimentai) buvo nustatyti naudojant liuciferino ir liuciferazės tyrimą su alikvotinėmis dalimis, kuriose yra vienodas gyvų ląstelių skaičius. *P = 0.008 **P = 0.003. (D) Fosforo-AMP kinazės (PAMPK) imunoblotas ląstelių, apdorotų FX11 arba FK866, lizatuose. Tubulinas tarnauja kaip pakrovimo kontrolė. AICAR, AMP analogas, aktyvuojantis AMPK, buvo naudojamas ląstelėms gydyti kaip teigiama kontrolė. (E) FX11 padidina NADH/NAD + santykį. NADH / NAD + santykis P493 ląstelėse, apdorotose 9 μM FX11 24 valandas, palyginti su nešiklio kontrole. *P = 0.028. (F) FX11 slopina laktato gamybą. Laktato kiekis P493 žmogaus B ląstelių terpėje, apdorotoje 9 μM FX11 arba 0,5 nM FK866 24 valandas, lyginant su kontrole. Kontroliniame RPMI buvo 10,7 mmol/l gliukozės ir nebuvo aptinkamo laktato. *P = 6.9E-06.

FX11 slopina ląsteles, kurios yra priklausomos nuo glikolizės.

Akivaizdu, kad jei FX11 nukreiptas į LDHA, ląstelės, kurios glikolizei priklauso nuo LDHA, būtų jautresnės FX11 slopinimui nei tos, kurios pirmiausia naudoja oksidacinį fosforilinimą. Šiuo atžvilgiu mes siekėme nustatyti, ar metaboliniai fenotipai gali turėti įtakos vėžio ląstelių jautrumui FX11. Mes naudojome žmogaus RCC4 inkstų ląstelių karcinomos ląstelių liniją ir RCC4 ląstelių liniją, atkurtą VHL (RCC4-VHL). VHL praradimas RCC4 padarė šias ląsteles iš esmės glikolitines dėl HIF-1 ir HIF-2 stabilizavimo ir ekspresijos. Rekonstravimas su VHL lėmė HIF-1α ir HIF-2α degradaciją ir padidino mitochondrijų biogenezę bei deguonies suvartojimą (23). Atsižvelgiant į šių izogeninių ląstelių linijų metabolinius skirtumus, tikimės, kad FX11 įtaka RCC4 ląstelėms, palyginti su RCC4-VHL ląstelėmis. Iš tiesų, dozės ir atsako tyrimas parodė, kad RCC4 yra jautresnis FX11, palyginti su RCC4-VHL (S5 pav. A ir B).

Norėdami toliau patvirtinti šias išvadas, ištyrėme glikolitinę MCF-7 ir oksidacinę MDA-MB-453 krūties karcinomos ląstelių linijas (24). Patvirtinome, kad MCF-7 labiau priklauso nuo gliukozės, o MDA-MB-453 labiau priklauso nuo glutamino oksidacijos (S6 pav. A ir B), todėl gliukozės trūkumas turi didesnį augimą slopinantį poveikį MCF-7. Nuo dozės priklausomas tyrimas taip pat atskleidė, kad MCF-7 yra jautresnis FX11 (S5 pav.). C ir D). Nors tarp šių ląstelių linijų yra daug kitų skirtumų, FX11 jautrumo ir MCF-7 priklausomybės nuo gliukozės koreliacija patvirtina mintį, kad glikolizė skatina vėžines ląsteles slopinti FX11.

Toliau išbandėme, ar žmogaus P493 B ląstelių slopinimas FX11 priklauso nuo gliukozės ar nuo LDHA. P493 augimas buvo slopinamas maždaug 60%, kai buvo išeikvota gliukozės, palyginti su augimu normalioje terpėje (S5 pav.E). FX11 pridėjimas negalėjo toliau slopinti P493 ląstelių, kai nėra gliukozės, o tai rodo, kad FX11 poveikis ląstelių proliferacijai priklausė nuo gliukozės. Be to, LDHA ekspresijos slopinimas dviem nuosekliomis elektroporacijomis su siRNR sukėlė žymiai sumažėjusį proliferacijos greitį, kurio FX11 nesulėtino (S5 pav.)F). Nors pastebėjome, kad siControl ląstelių proliferacijos greitis buvo šiek tiek sumažėjęs, palyginti su neapdorotomis ląstelėmis, gydymas siLDHA labai sumažino ląstelių dauginimąsi tuo pačiu metu, kai sumažėjo LDHA ekspresija (S6 pav. C ir D). Šie stebėjimai kartu rodo, kad FX11 augimą slopinantis poveikis atitinka jo gebėjimą slopinti LDHA.

Mes manėme, kad žmogaus P493 B limfomos ląstelės bus jautrios FX11, nes jos ekspresuoja LDHA (25), tačiau jautrumas padidėtų hipoksijos metu, kai yra palanki glikolizė. Tai ypač svarbu, nes P493 ląstelės priklauso ir nuo gliukozės, ir nuo glutamino metabolizmo, kai auginamos esant 20 % (tūrio/tūrio) O.2 (26). Kai P493 ląstelėms buvo atliktas dozės ir atsako tyrimas su FX11, mes nustatėme, kad 9 μM FX11 augimo slopinimas padidėjo, kai ląstelės buvo kultivuojamos 1% O.2 (S7 pav A ir B). Hipoksija taip pat padidino žmogaus P198 kasos vėžio ląstelių linijos jautrumą FX11 slopinimui (S7 pav. C ir D), o tai rodo, kad dėl hipoksinio metabolizmo priklausomybės nuo LDHA vėžio ląstelės tapo jautrios augimą slopinančiam FX11 slopinimo LDHA poveikiui.

FX11 slopina naviko atsiradimą in vivo.

Nors atnaujintą susidomėjimą Warburg efektu lydi geresnis jo molekulinio pagrindo supratimas, jo taikymas terapiniais tikslais tebėra pagrindinis iššūkis (27). Apibūdindami mažos molekulės LDHA inhibitorių, nustatėme, kad jis veiksmingai slopina ląstelių augimą ir sukelia ląstelių mirtį, nes skatina ROS gamybą ir mažina ATP. Pastebėjome, kad hipoksija dar labiau padidino žmogaus P493 limfomos ląstelių jautrumą LDHA slopinimui FX11. Šiuo atžvilgiu pervazinė hipoksinio naviko mikroaplinka, palyginti su normaliais audiniais, turėtų priversti šias limfomos ląsteles toliau priklausyti nuo glikolizės ir ypač nuo LDHA (4 pav.A ir S8 pavA). Pažymėtina, kad pirminės žmogaus limfomos turi padidėjusią LDHA ekspresiją, ypač hipoksiniuose regionuose (28). Taigi mes siekėme nustatyti, ar FX11 kaip LDHA inhibitorius gali būti įrodytas in vivo veiksmingumu. Apskaičiavome pageidaujamą 42 μg FX11 dozę kasdieniniam i.p. injekcija. Tikėjomės, kad pradinis serumo lygis bus ~ 100 μM, darant prielaidą, kad kraujagyslių sistemoje pasiskirstys tolygiai ir nedelsiant, neatsižvelgiant į vaisto pusinės eliminacijos periodą ar vaisto metabolizmą. Reikėtų pažymėti, kad tirpumas buvo reikšmingas dozę ribojantis veiksnys, nes galėjome tik padvigubinti dozę, kol nepasiekėme riboto FX11 tirpumo vandeniniame tirpale.

FX11, kaip priešnavikinės medžiagos, veiksmingumas in vivo. (A) Imunohistocheminis dažymas, siekiant nustatyti hipoksines blužnies, kepenų ir P493 limfomos sritis (tamsiai rudos spalvos), ženklinant pimonidazolu. (B) FX11 poveikis apčiuopiamų žmogaus P493 B ląstelių ksenografų augimui. Kontroliniai gyvūnai buvo gydomi kasdien i.p. nešiklio (2% (tūrio / tūrio) DMSO) injekcija ir doksiciklinas (0, 8 mg per dieną) buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė, nes jis slopina Myc ekspresiją ir navikogenezę P493 ląstelėse. (C) Kasdienio gydymo FX11 ir (arba) FK866 poveikis nustatytai žmogaus limfomos ksenografams, palyginti su kontroliniu arba junginiu E (silpnas LDHA inhibitorius). (Įdėklas) Reprezentatyvių gyvūnų, apdorotų kontroliniu nešikliu arba FX11, nuotraukos. (D) FX11 slopino P198 žmogaus kasos vėžio ksenografus, lyginant su junginiu E. Eksperimentams visose grupėse 2,0 × 107 P493 ląstelės arba 5 × 106 P198 ląstelės buvo sušvirkštos po oda. atitinkamai į SCID peles arba be užkrūčio nuogas peles. Kai auglio tūris pasiekė 200 mm 3 , į i.p. buvo suleista 42 μg FX11 ir (arba) 100 μg FK866. kasdien ir stebimas 10–14 dienų. Auglio tūriai buvo matuojami naudojant skaitmeninius suportus kas 4 dienas ir apskaičiuojami pagal šią formulę: [ilgis (mm) × plotis (mm) × plotis (mm) × 0, 52]. Rezultatai rodo vidurkį ± SEM.

Pirma, mes siekėme nustatyti, ar FX11 gali slopinti P493 naviko atsiradimą po to, kai išsivystė apčiuopiamas navikas. Kaip kontrolę, gyvūnams sušvirkštėme nešiklio (2% (tūrio / tūrio) DMSO) arba 0, 8 mg doksiciklino, kad slopintume MYC ekspresiją šiose transformuotose žmogaus B ląstelėse. Kaip ir tikėtasi, doksiciklinas stipriai slopino apčiuopiamo naviko ksenografo augimą, palyginti su kontroliniais gyvūnais, kuriems buvo švirkščiama nešiklio (4 pav.B). Įdomu tai, kad kasdien i.p. 42 μg FX11 injekcija taip pat žymiai sumažino naviko augimą. Pastebėtina, kad atmetėme trivialią galimybę, kad FX11 gali tiesiogiai slopinti Myc ekspresiją, kad tarpininkautų šiam giliam poveikiui (S1 pav.C). Šie stebėjimai rodo, kad LDHA yra būtina navikui pradėti.

Norėdami patikrinti, ar LDHA reikalinga naviko palaikymui ar progresavimui, mes ginčijome FX11 gebėjimą slopinti naviko ksenografo augimą, gydydami P493 limfomas arba žmogaus P198 kasos navikus, kurie prieš pradedant gydymą pasiekė 200 mm3 dydį. Palyginimui, gyvūnus gydėme nešiklio kontrole arba su FX11 susijusiu junginiu, vadinamu E, kuriame nėra benzilo grupės ir kuris turi Ki LDHA >90 μM arba daugiau nei 10 kartų didesnis nei FX11. Mes nustatėme, kad E neturėjo priešnavikinio aktyvumo, palyginti su nešikliu. Vartojant šią tirpumą ribojančią dozę, FX11 rodė statinį, bet reikšmingą poveikį per 10 dienų (4 pav.C). Įdomu tai, kad mes pastebėjome, kad hipoksiniai regionai, susiję su negydytais kontroliniais navikais, buvo palyginti sumažėję FX11 gydytų navikų atveju (S8 pav.B). Mes spėliojome, kad hipoksinės naviko ląstelės yra labiau priklausomos nuo glikolizės, todėl FX11 jas sumažina, palyginti su nehipoksinėmis naviko ląstelėmis. Taip pat stebėjome reikšmingą žmogaus P198 naviko ksenografų atsaką į FX11, lyginant su E (4 pav.D). Nors agresyvesnis žmogaus kasos naviko ksenografas LZ10.7 augo žymiai greičiau nei P198, jis taip pat buvo jautrus FX11 kaip vienam veiksniui (29) (S8 pav.C). FX11 ir E struktūra ir aktyvumo santykis in vivo koreliavo su šių junginių LDHA slopinimu ir surišimu in vitro, dar labiau patvirtindamas mintį, kad FX11 nukreiptas į LDHA. Šie rezultatai kartu rodo, kad LDHA vaidina svarbų vaidmenį auglio progresavime ir palaikyme.

Remiantis mūsų atliktais kultivuotų ląstelių tyrimais (3 pavB), iškėlėme hipotezę, kad FX11 gali sustiprinti FK866 poveikį gydant P493 žmogaus limfomas. Taigi, pasirinkome 100 μg FK866 dozę, kuri davė statinį rezultatą, ir iš tikrųjų nustatėme nepaprastą naviko regresiją, kai gyvūnai buvo gydomi ir FX11, ir FK866 (4 pav.C). Šios išvados pabrėžia faktą, kad vėžio metabolizmas yra įmanomas ir kad LDHA yra svarbus tolesnio vystymosi tikslas.

Atsižvelgdami į reikšmingą FX11, kaip LDHA inhibitoriaus, poveikį in vivo, mes ištyrėme gydytų gyvūnų grupę, kad pradėtume suprasti galimą FX11 šalutinį poveikį. Pastebėtina, kad žmonės, kuriems trūksta LDHA, vystosi normaliai, tačiau buvo įrodyta, kad jiems pasireiškia fizinio krūvio miopatija (30). Šiuo atžvilgiu, nors oficialiai nepratinome gyvūnų, kad ištirtume fizinio krūvio toleranciją, nepastebėjome vangumo ar negalėjimo valgyti ir gerti. Tiesą sakant, gyvūnai, gydyti FX11, nenumetė svorio. Pradiniuose hematologijos ir kraujo chemijos tyrimuose gyvūnams, gydytiems vien FX11, citopenijos nepastebėjome, tačiau dviem (iš penkių tirtų) FK866 gydytiems gyvūnams pasireiškė lengva trombocitopenija (S9 pav.). Vidutinis leukocitų skaičius kontrolinėje grupėje buvo pakreiptas dviejų gyvūnų, kurių leukocitozė buvo >15 K/μL (normalus diapazonas: 1,8–10,7 K/μL). Kraujo cheminiai tyrimai neatskleidė jokių toksiškumo inkstams [kraujo šlapalo azoto (BUN) arba kreatinino] arba kepenų (aspartato aminotransferazės, alanino aminotransferazės ir šarminės fosfatazės) toksiškumo gyvūnams, gydytiems vien FX11 arba FK866 dozėmis, kurios turėjo įtakos naviko augimui in vivo. (S9 pav.). Tačiau FX11 ir FK866 derinys, palyginti su kontrole, padidino BUN.


Įvadas

Ląstelių transformacija apima nereguliuojamą ląstelių proliferacijos kontrolę, atsparumą ląstelių mirčiai, imuninės sistemos vengimą ir augimą slopinančios veiklos apėjimą, o tai galiausiai leidžia vėžiui įsitvirtinti (1). Be to, buvo pastebėta, kad naviko ląstelės turi nepaprastą gebėjimą reguliuoti savo energetinį metabolizmą kaip dalį naviko išgyvenimo mechanizmų, o ši savybė dabar pripažįstama kaip vėžio požymis (2). 1926 m. Otto Warburgas pirmą kartą ištyrė padidėjusį medžiagų apykaitos greitį kai kuriose neoplazmose, parodydamas, kad naviko ląstelės pasisavina didelį kiekį gliukozės kaip pirminio energijos šaltinio, gamindamos per daug laktato, net ir esant deguoniui (3). 1972 m. Efraimas Rackeris pavadino tokį efektą kaip “Warburg Effect”, taip pat žinomas kaip �robinė glikolizė” (4). Iš pradžių buvo pasiūlyta, kad sustiprintą glikolizę naviko ląstelėse sukėlė negrįžtamas mitochondrijų funkcijos pažeidimas. Nors kai kurių vėžio tipų mitochondrijų funkcijos defektai buvo parodyti (5), vien šis procesas negali paaiškinti naviko ląstelių metabolinės pirmenybės.

Warburgo fenotipas būdingas kelioms neoplazmoms, įskaitant krūties, gaubtinės žarnos, gimdos kaklelio ir kepenų vėžį (6𠄹). Padidėjęs neoplastinių ląstelių gliukozės įsisavinimas ir metabolizmas yra pagrindas nustatant naviką naudojant pozitronų emisijos tomografiją (PET). PET vaizdavimui naudojamas radioizotopais pažymėtas gliukozės žymeklis, 18F-fluorodeoksigliukozė (18F-FDG), siekiant nustatyti didelio gliukozės įsisavinimo sritis. /metabolizmas organizme. Po 18 F-FDG pasiskirstymo radionuklidas į ląsteles pernešamas gliukozės pernešėjais ir dėl to fosforilinamas heksokinazės, kad susidarytų 18 F-FDG-6-fosfatas (18 F-FDG-6-p). Patekęs į ląstelę, 18 F-FDG-6-p kaupiasi citoplazmoje, nes ši molekulė negali būti toliau metabolizuojama glikolizės keliu, nes joje trūksta būtinos 2'hidroksilo grupės (10). Be to, dėl savo labai poliškumo 18 F-FDG-6-p yra įstrigęs ląstelėje, todėl sukaupti 18 F-FDG-6-p kiekiai naudojami kietų navikų buvimui ir veiksmingumui nustatyti. gydymo (10).

Warburgo efektas apima medžiagų apykaitos fermentų, įskaitant heksokinazę 2 (HK2), piruvato kinazę M2 (PKM2), gliukozės transporterį 1 (GLUT1), laktato dehidrogenazę (LDH) ir laktato pernešėjus (monokarboksilato transporterius [MCT]), pokyčius (11&#). x0201314). Svarbu tai, kad Warburgo fenotipas buvo siejamas ne tik su padidėjusiu energijos gavimu, bet ir su daugelio transkripcijos faktorių, tokių kaip c-Myc, NF-㮫 ir hipoksijos indukuojamas faktorius 1-α, aktyvavimu. HIF 1-α) (15�). Šie transkripcijos faktoriai gali reguliuoti medžiagų apykaitos fermentų ekspresiją, todėl gliukozės pavertimas laktatu nereguliuojamas (18), o tai skatina naviko laktagenezės būseną (19).

Glikolizė yra daug mažiau efektyvi nei oksidacinis fosforilinimas ATP gamybai, ir dėl šios priežasties vėžio ląstelės padidina gliukozės pasisavinimą ir glikolitinį greitį. Dėl didelio gliukozės panaudojimo vėžio ląstelėse kaupiasi tarpląstelinis laktatas, kuris veikia daugybę ląstelių tipų naviko mikroaplinkoje (TME), sudarytas iš įvairių ląstelių tipų, tokių kaip endotelio ląstelės, su vėžiu susiję fibroblastai (CAF), imuninės ląstelės ir ne vėžinės stromos ląstelės (20).

Ilgą laiką laktatas buvo pripažintas tik kaip „metabolinių atliekų produktas“, gautas aerobinės glikolizės metu, tačiau dabar buvo tvirtai įrodyta, kad laktatas gali būti įtrauktas į trikarboksirūgšties (TCA) ciklą ir būti energijos šaltiniu. ir netgi veikia kaip onkometabolitas, turintis signalinių savybių. Šioje apžvalgoje aprašome laktato vaidmenį naviko progresavime, pabrėždami jo gebėjimą skatinti invaziją ir metastazes. Taip pat parodome laktato, kaip naviko ląstelių metabolinio kuro, vaidmenį, taip pat jo dalyvavimą atsparumui vaistams (1 pav.). Taip pat pristatoma laktato sukeltos slopinančios rūgštinės naviko mikroaplinkos svarba. Galiausiai aptariame galimą laktato gamybos taikymą kaip naują terapinį metodą.

figūra 1. Laktato vaidmuo sergant vėžiu. Pernelyg didelė laktato gamyba tiek naviko, tiek stromos ląstelėse yra susijusi su padidėjusiu agresyvumu dėl ekstraląstelinio rūgštėjimo, kuris taip pat sukelia invaziją ir metastazes, slopina priešnavikinį imuninį atsaką ir atsparumą terapijai. Be to, šis laktatas gali būti naudojamas kaip alternatyvus kuro šaltinis naviko ląstelėse.


Nuorodos

Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, Jemal A.Pasaulinė vėžio statistika, 2012 m. CA Cancer J Clin. 201565:87–108.

Bentzien F, Zuzow M, Heald N ir kt. Kabozantinibo (XL184), RET, MET ir VEGFR2 inhibitoriaus, aktyvumas in vitro ir in vivo medulinio skydliaukės vėžio modelyje. Skydliaukė. 201323:1569–77.

Krajewska J, Jarzab B. Nauji skydliaukės vėžio gydymo būdai. „Opin Pharmacother“ ekspertas. 201415:2641–52.

Sveikas SM. Kabozantinibas: jo vartojimo pacientams, sergantiems meduliniu skydliaukės vėžiu, apžvalga. Narkotikai. 201474:1435–44.

Elisei R, Schlumberger MJ, Müller SP ir kt. Kabozantinibas sergant progresuojančiu meduliniu skydliaukės vėžiu. J Clin Oncol. 201331:3639–46.

Grüllich C. Kabozantinibas: MET, RET ir VEGFR2 tirozino kinazės inhibitorius. Naujausi rezultatai Cancer Res. 2014201:207–14.

Yakes FM, Chen J, Tan J ir kt. Kabozantinibas (XL184), naujas MET ir VEGFR2 inhibitorius, vienu metu slopina metastazes, angiogenezę ir naviko augimą. Mol Cancer Ther. 201110:2298–308.

Giunti S, Antonelli A, Amorosi A, Santarpia L. Cellular signaling pathway alterations and potencial targeted therapies for medullary thyroid carcinoma. Int J Endocrinol. 20132013:803171.

Bottsford-Miller JN, Coleman RL, Sood AK. Atsparumas ir pabėgimas nuo antiangiogenezės terapijos: klinikinės pasekmės ir ateities strategijos. J Clin Oncol. 201230:4026–34.

Murakami M, Zhao S, Zhao Y ir kt. Naviko mikroaplinkos pokyčių įvertinimas po gydymo sorafenibu nuoseklios histologijos ir 18F-fluoromizonidazolo hipoksijos vaizdavimu sergant inkstų ląstelių karcinoma. Int J Oncol. 201241:1593–600.

Keithas B, Johnsonas RS, Simonas MC. HIF1α ir HIF2α: brolių ir seserų konkurencija dėl hipoksinio naviko augimo ir progresavimo. Nat Rev vėžys. 201212:9–22.

Loboda A, Jozkowicz A, Dulak J. HIF-1 ir HIF-2 transkripcijos faktoriai – panašūs, bet ne identiški. Mol ląstelės. 201029:435–42.

Burrows N, Babur M, Resch J, Williams KJ, Brabant G. Hipoksijos sukeliamas skydliaukės karcinomos faktorius. J Thyroid Res. 20112011:762905.

Takacova M, Bullova P, Simko V ir kt. Karboanhidrazės IX ekspresijos modelis medulinėje skydliaukės karcinomoje palaiko RET tarpininkaujamo HIF kelio aktyvavimo vaidmenį. Esu J Pathol. 2014184:953–65.

Kitajima Y, Ide T, Ohtsuka T, Miyazaki K. Hepatocitų augimo faktoriaus aktyvatoriaus geno ekspresijos sukėlimas esant hipoksijai suaktyvina hepatocitų augimo faktorių/c-Met sistemą per hipoksijos indukuojamą faktorių-1 sergant kasos vėžiu. Cancer Sci. 200899:1341–7.

Yu F, Lin Y, Zhan T, Chen L, Guo S. HIF-1α sukelta HGF ekspresija skatina endotelio progenitorinių ląstelių proliferaciją ir vamzdelių formavimąsi. Cell Biol Int. 201539:310–7.

Pennacchietti S, Michieli P, Galluzzo M, Mazzone M, Giordano S, Comoglio PM. Hipoksija skatina invazinį augimą transkripcijos būdu aktyvindama met protoonkogeną. Vėžio ląstelė. 20033:347–61.

Mabjeesh NJ, Escuin D, LaVallee TM ir kt. 2ME2 slopina naviko augimą ir angiogenezę, sutrikdydamas mikrotubulus ir sutrikdydamas HIF reguliavimą. Vėžio ląstelė. 20033:363–75.

Roswall P, Bu S, Rubin K, Landström M, Heldin NE. 2-metoksiestradiolis sukelia apoptozę kultivuojamose žmogaus anaplastinėse skydliaukės karcinomos ląstelėse. Skydliaukė. 200616:143–50.

Ma L, Li G, Zhu H ir kt. 2-metoksiestradiolis sinergizuojasi su sorafenibu, kad slopintų kepenų ląstelių karcinomą, tuo pat metu sutrikdydamas hipoksijos sukeliamą faktorių-1 ir -2. Cancer Lett. 2014355:96–105.

Zhao D, Zhai B, He C ir kt. Sorafenibo sukeltas HIF-2α reguliavimas prisideda prie atsparumo suaktyvindamas TGF-α / EGFR kelią kepenų ląstelių karcinomos ląstelėse. Mobilusis signalas. 201426:1030–9.

Liu LP, Ho RL, Chen GG, Lai PB. Sorafenibas slopina hipoksijos sukeltą faktoriaus-1α sintezę: poveikis antiangiogeniniam aktyvumui sergant kepenų ląstelių karcinoma. Clin Cancer Res. 201218:5662–71.

Mai Z, Blackburn GL, Zhou JR. Sojų fitocheminės medžiagos sinergiškai sustiprina tamoksifeno prevencinį poveikį nuo estrogenų priklausomos žmogaus krūties karcinomos augimui pelėse. Kancerogenezė. 200728:1217–23.

Rankin EB, Giaccia AJ. Hipoksijos sukeltų veiksnių vaidmuo navikogenezėje. Ląstelių mirties skirtumas. 200815:678–85.

Wilsonas WR, Hay parlamento narys. Tikslinis hipoksijos gydymas vėžio terapijoje. Nat Rev vėžys. 201111:393–410.

Verenich S, Gerk PM. Terapiniai 2-metoksiestradiolio pažadai ir jo disponavimo vaistais iššūkiai. Mol Pharm. 20107:2030–9.

Xia Y, Choi HK, Lee K. Naujausi hipoksijos indukuojamo faktoriaus (HIF)-1 inhibitorių pasiekimai. Eur J Med Chem. 201249:24–40.

Cecchi F, Rabe DC, Bottaro DP. Nukreipimas į HGF / Met signalizacijos kelią vėžio terapijoje. Ekspertų nuomonė apie taikinius. 201216:553–72.

Olsson AK, Dimberg A, Kreuger J, Claesson-Welsh L. VEGF receptorių signalizacija – kraujagyslių funkcijos kontrolė. Nat Rev Mol Cell Biol. 20067:359–71.

Ivanas M, Kondo K, Yang H ir kt. HIFα, skirtas VHL sukeltam sunaikinimui prolino hidroksilinimu: poveikis O2 jutimui. Mokslas. 2001292:464–8.

Girgis H, Masui O, White NM ir kt. Laktato dehidrogenazė A yra galimas prognostinis aiškių ląstelių inkstų ląstelių karcinomos žymuo. Mol Vėžys. 201413:101.

Ganapathy M, Ghosh R, Jianping X ir kt. FLIP dalyvavimas 2-metoksiestradiolio sukeltame naviko regresijoje sergant pelės prostatos modelio transgenine adenokarcinoma. Clin Cancer Res. 200915:1601–11.

Rajkumar SV, Richardson PG, Lacy MQ ir kt. Naujas gydymas 2-metoksiestradioliu, skirtas atkryčio ir plato fazės daugybinei mielomai gydyti. Clin Cancer Res. 200713:6162–7.

Dahut WL, Lakhani NJ, Gulley JL ir kt. I fazės klinikinis geriamojo 2-metoksiestradiolio, antiangiogeninio ir apoptozinio agento, tyrimas pacientams, sergantiems solidiniais navikais. Cancer Biol Ther. 20065:22–7.

James J, Murry DJ, Treston AM ir kt. I fazės saugumo, farmakokinetikos ir farmakodinaminiai 2-metoksiestradiolio vien arba kartu su docetakseliu tyrimai pacientams, sergantiems lokaliai pasikartojančiu arba metastazavusiu krūties vėžiu. Naujų narkotikų tyrimas. 200625:41–8.


Laktatas skatina atsparumą gliukozės badui padidindamas Bcl-2 reguliavimą, kurį sukelia mTOR aktyvacija

Esminė navikų savybė yra greitas augimas, todėl augliai turi sukurti daug naujų kraujagyslių, kad aprūpintų maistinėmis medžiagomis. Nepaisant to, palyginti su normaliu audiniu, naviko angiogenezė yra netvarkinga ir blogai funkcionuoja (1). Spartus naviko augimas ir fiziologinės naviko kraujagyslių ypatybės reiškia, kad energetines medžiagas teikiančių kraujagyslių formavimosi greitis nepajėgia pasivyti auglio tūrio didėjimo greičio, todėl daug navikų egzistuoja žemoje gliukozės aplinkoje. Gliukozės koncentracija gaubtinės žarnos ir skrandžio naviko audiniuose yra atitinkamai tik 0,12 ir 0,4 mM (2). Navikai gali išgyventi atšiaurioje aplinkoje, pavyzdžiui, esant prastam gliukozės ir deguonies išeikvojimui (3). Gliukozės trūkumo atveju augliai in vivo prisitaiko prie savo būsenos, kad prisitaikytų prie aplinkos ir gautų daugiau mitybos. Priešingai, gliukozės trūkumas auginamose naviko ląstelėse in vitro nepalaiko naviko ląstelių išlikimo. Todėl svarbu ištirti, kaip navikai išgyvena gliukozės išeikvojimą in vivo.

Vėžio ląstelės pirmenybę teikia glikolizės keliams energijai gaminti, net ir esant deguoniui, vadinamąją „aerobinę glikolizę“, kaip pirmą kartą pasiūlė Warburg (4). Glikolizė yra daug mažiau efektyvi nei oksidacinis fosforilinimas ATP susidarymo požiūriu, todėl vėžio ląstelės pasižymi neįprastai dideliu glikolizės greičiu, kad išlaikytų energijos homeostazę (5). Toks sureguliuotas metabolizmas vėžio ląstelėse taip pat lemia glikolizės metabolinio produkto – pieno rūgšties – kaupimąsi kietuose navikuose. Buvo atlikta daug matavimų, siekiant nustatyti naviko laktato lygį, ir buvo nustatyti reikšmingi svyravimai, kurių vidurkis svyruoja nuo 7 iki 10 mM/g, o didžiausias – iki 25,9 mM/g (6,7). Priešingai nei naviko hipoksija, naviko glikolizė ir laktato biologija daugelį metų sulaukė mažai mokslinio dėmesio. Tačiau išvados apie pernelyg didelę glikolize susijusių genų ekspresiją 70 % visų žmonių vėžio atvejų visame pasaulyje ir padidėjusio vėžio ląstelių gliukozės įsisavinimo panaudojimas naviko diagnostikai taikant pozitronų emisijos tomografiją (PET) su 18 F-fluorodeoksigliukoze (FDG). į renesansą išgyvenančią temą. Tai gali pagerinti vėžio diagnozę ir terapinį stebėjimą klinikinėje aplinkoje.

Kaip svarbi auglio mikroaplinkos dalis, laktato tyrimai buvo pateisinami dėl šių priežasčių. Ekstraląstelinis laktatas slopina monocitų diferenciaciją į dendritines ląsteles (DC) ir inaktyvuoja citokinų išsiskyrimą iš DC (8) ir citotoksinių T ląstelių (9), pagrindinių priešnavikinio atsako dalyvių. Egzogeninio laktato pridėjimas lėmė nuo koncentracijos priklausomą įvairių vėžio ląstelių linijų atsitiktinės migracijos padidėjimą (10). Laktato koncentracijos teigiamai koreliuoja su radiorezistencija (11). Šis perprogramavimas yra būtinas auglių augimui ir išgyvenimui streso sąlygomis (12).

Šiame tyrime mes nustatėme, kad laktatas gali išgelbėti vėžio ląsteles nuo gliukozės bado sukeltos mirties. Be to, ištyrėme pieno rūgšties vaidmens naviko prisitaikymo prie gliukozės trūkumo procese mechanizmą. Mes nustatėme, kad laktatas išgelbėja vėžio ląsteles nuo gliukozės bado sukeltos ląstelių mirties, reguliuodamas rapamicino (mTOR) / B-ląstelių limfomos 2 (Bcl-2) signalizacijos kelią Akt / žinduolių taikinį. Šie duomenys rodo, kad laktatas yra svarbus navikų jautrumo gliukozės badui veiksnys, o laktato kiekio mažinimas arba Akt/mTOR/Bcl-2 signalizacijos kelio slopinimas gali turėti įtakos vėžio reakcijai į gliukozės badą.

Medžiagos ir metodai

Ląstelių linijos ir ląstelių kultūra

A549, H1299, PC3, DU145 ir U87-MG ląstelių linijos buvo įsigytos iš Kinijos mokslų akademijos tipų kultūros kolekcijos ląstelių banko. A549 ir ​​U87-MG buvo auginami pilnoje Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM, kat. Nr. 12430-054), su 10% galvijų vaisiaus serumo (kat. Nr. 10100-147) (abu iš Gibco, JAV), 100 V. /ml penicilino ir 100 μg/ml streptomicino. DU145 ir H1299 buvo auginami RPMI-1640 terpėje (kat. Nr. 11875-093 Gibco), papildytoje kaip nurodyta aukščiau. PC3 ląstelės buvo kultivuojamos F-12 terpėje (kat. Nr. 21700-075 Gibco), papildytoje kaip nurodyta aukščiau. Gliukozės koncentracija terpėje buvo 25 mM, jei nenurodyta kitaip. Gliukozės bado eksperimentui sumaišėme begliukozę DMEM (kat. Nr. 11966-025) arba RPMI-1640 (kat. Nr. 11879-020) (abi iš Gibco) su visa pirmiau minėta terpe tam tikra dalimi. kad gliukozės koncentracija būtų 5 mM. Į terpę įdėjome natrio L-laktato (kat. Nr. 71718) arba L-pieno rūgšties (kat. Nr. L1750) (abi iš Sigma-Aldrich, JAV) arba HCl, kad sukurtume skirtingą auginimo aplinką su skirtinga laktato koncentracija ir pH. .

Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Ląstelės (10 4 duobutėje) buvo pasėtos į 24 šulinėlių plokšteles pilnoje terpėje su 25 mM gliukozės 24 valandas prieš eksperimentą. Kitą dieną terpę pakeitėme į tokią, kurioje nėra gliukozės. Tuo tarpu eksperimento pradžioje į terpę įdėjome skirtingos koncentracijos laktato. Nuo 2 iki 12 dienos mes skaičiavome gyvas ląsteles kas 2 dienas po 3 duobutes per dieną kiekvienai kultūros aplinkai.

Transfekcija

Maža trukdanti RNR (siRNR), nukreipta į Bcl-2 (kat. Nr. GS596 Qiagen, Vokietija), buvo transfekuota į ląsteles, kad blokuotų jo funkciją. Mes naudojome Lipofectamine 2000 (kat. Nr. 11668019 Invitrogen, JAV) kaip transfekcijos reagentą ir neigiamą kontrolinę siRNR (kat. Nr. SI03650318 Qiagen). Praėjus keturiasdešimt aštuonioms valandoms po transfekcijos, surinkome transfekuotų ląstelių mRNR ir baltymus. Norėdami įvertinti numušimo efektyvumą, išanalizavome mRNR lygį naudodami realaus laiko PGR (LightCycler 480 Roche, Šveicarija) ir baltymų lygį Western blot metodu (Mini-PROTEAN ® 165–8004 Bio-Rad, JAV). Abi vertės buvo normalizuotos pagal β-aktino ekspresiją. Eksperimentai buvo atlikti nuo 24 iki 72 valandų po transfekcijos.

Ląstelių metabolizmo analizė naudojant Seahorse Bioscience XF24 instrumentą

Ląstelių deguonies suvartojimo greičio (OCR) matavimai buvo atlikti naudojant Seahorse Bioscience XF24 prietaisą (Seahorse Bioscience, Billerica, MD, JAV). Prieš pradedant eksperimentą, auginimo terpė buvo pašalinta, o ląstelės plaunamos PBS, turinčiu Ca 2+ /Mg 2+ (pH 7,4), kuris po to išsiurbtas ir pakeistas 700 ml redukuoto serumo (RS) buferio [CaCl 2 ( 1,8 mM), MgCl2 (0,6 mM), KH2PO4 (0,5 mM), KCl (5,33 mM), Na2HPO4 (0,5 mM), NaCl (130 mM), gliukozės (5,6 mM)], glutamax, minimalios esminės terpės (MEM) aminorūgščių tirpalas, MEM neesminės aminorūgštys, MEM vitamino tirpalas, penicilinas/streptomicinas, 1 % galvijų serumo albumino (BSA, be V faktoriaus riebalų rūgščių), 1 % FBS ir insulino (100 nM). Visi komponentai, išskyrus FBS ir insuliną, buvo sujungti prieš sterilizuojant filtrą. Pridėjus FBS ir insulino (paprastai 24–48 val. prieš eksperimentą), RS buferis buvo pašildytas iki 37 °C, o pH pakoreguotas iki 7,4. Bandymo šablonas buvo nustatytas taip. Matavimai buvo atliekami kas 5 minutes, kartojant metabolinius matavimus 3–4 kartus pagal statistinę analizę. 5 minučių ciklas apėmė 2 minučių maišymo laikotarpį, 1 minutės laukimą ir 2 minučių matavimo laiką. Išmatavus pradinį aktyvumą, buvo sušvirkštas oligomicinas (ATP jungtis), išmatuotas greitis, karbonilcianido p-trifluormetoksifenilhidrazonas (FCCP) (elektronų pernešimo grandinės greitintuvas) ir galiausiai rotenonas ir antimicinas (mitochondrijų inhibitoriai), po to galutinis greičio matavimas.

Tarpląstelinio laktato kiekio matavimas

Ląstelės buvo pasėtos ant plokštelių ir joms buvo leista augti terpėje su 25 mM gliukoze, kad būtų galima pritvirtinti per naktį. Kitą dieną terpę pakeitėme šviežia terpe su 0 mM gliukozės nuliniu laiku. Nuo nulio laiko, kas 24 valandas, rinkome terpės mėginius ir suskaičiavome ląstelių skaičių toje pačioje plokštelėje. Laktato koncentracijos terpės mėginiuose buvo matuojamos laktato reagentu (kat. Nr. P0000024 CMA Microdialysis, Švedija). Rezultatai buvo normalizuoti pagal ląstelių skaičių kiekviename mėginyje.

Gliukozės bado sukeltos apoptozės matavimas

Ląstelės buvo dedamos į 6 šulinėlių plokšteles ir prieš eksperimentą inkubuojamos 24 valandas. Kontrolinės grupės ląstelės buvo auginamos pilnoje terpėje, turinčioje 25 mM gliukozės. Gydytos grupės ląstelės buvo kultivuojamos pilnoje terpėje, turinčioje 0 mM gliukozės su skirtingu laktato kiekiu. Po 48 valandų apdorojimo ląstelės buvo tripsinizuojamos, centrifuguojamos ir resuspenduojamos surišimo buferyje su anneksinu V-FITC ir propidžio jodidu (PI) iš Dead Cell Apoptosis Kit Nr. 2 (kat. Nr. V13241 Life Technologies, JAV). Dažytos ląstelės buvo inkubuojamos 15 minučių kambario temperatūroje tamsoje. Srauto citometrija buvo naudojama nudažytoms ląstelėms analizuoti, matuojant fluorescencijos emisiją ties 530 ir 575 nm, naudojant 488 nm sužadinimą.

Western blot tyrimas ir antikūnai

Apdorotos ląstelės buvo lizuojamos naudojant RIPA lizės buferį su 1% fenilmetansulfonilfluoridu (PMSF). Ląstelių lizatai buvo atskirti per 10% SDS gelį ir užpilami ant nitroceliuliozės membranų. Membranos buvo blokuojamos 5% neriebiu sausu pienu PBST kambario temperatūroje 1 val. ir inkubuojamos atskirai su pirminiais antikūnais prieš Akt (kat. Nr. 4685), fosfo-Akt (Thr308, kat. Nr. 13038) (abiejų). iš Cell Signaling Technology, JAV), phospho-Akt (Ser473, kat. Nr. ab66138), PTEN (kat. Nr. ab32199), Mcl-1 (kat. Nr. ab114016), Bcl-2 (kat. Nr. ab117115) ), Bcl-xL (kat. Nr. ab32370), fosfo-mTOR (Ser2448, kat. Nr. ab84400) (visi iš Abcam, JK) arba β-aktiną (kat. Nr. A1978 Sigma-Aldrich) per naktį 4° temperatūroje C. Kitą dieną membranos 3 kartus plaunamos PBST ir inkubuojamos su antriniais antikūnais 1 valandą kambario temperatūroje. 3 kartus nuplovus membranas PBST, membranos buvo nuskaitytos naudojant Odyssey Infrared Imaging System (Li-COR Biosciences, JAV).

Reagentai

LY294002, perifozinas ir rapamicinas buvo įsigyti iš Selleck Chemicals, JAV (kat. Nr. S1105, S1037 ir S1039). Insulinas ir resveratrolis buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich (kat. Nr. R5010). Į insuliną panašus augimo faktorius-1 (IGF-1) buvo įsigytas iš Invitrogen (kat. Nr. PHG0071).

Statistinė analizė

Statistinė analizė atlikta naudojant GraphPad Prism 5.0 ir Instat 3.1 paketus (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± standartinė paklaida (SE). Statistiniai skirtumai tarp grupių buvo lyginami naudojant t-testus. Buvo laikoma, kad P vertės <0,05 rodo statistiškai reikšmingus rezultatus.

Rezultatai

Laktatas gelbsti vėžines ląsteles nuo gliukozės bado sukeltos ląstelių mirties

Norėdami nustatyti laktato poveikį gliukozės badui, A549 ląsteles paveikėme skirtingomis auginimo sąlygomis: pilną DMEM, turintį skirtingas natrio laktato koncentracijas ir be gliukozės. Mes nustatėme, kad be gliukozės sąlygomis natrio laktato pridėjimas į terpę veiksmingai pailgino A549 ląstelių linijos išgyvenimo laiką (1A pav.). Vartojant mažas dozes, didėjant natrio laktato koncentracijai, pailgėjo ląstelių proliferacija ir išgyvenimo laikas. A549 ląstelių išgyvenimo laikas, kai yra 20 mM natrio laktato, buvo ilgesnis nei bet kurios kitos koncentracijos natrio laktato. Iš tiesų, A549 ląstelės, auginamos natrio laktatu be gliukozės, išgyveno ilgiau nei 2 savaites, net po 1 mėnesio vis dar buvo gyvybingų ląstelių. Kai natrio laktato koncentracija didesnė kaip 20 mM, sumažėjo ląstelių proliferacija ir išgyvenimo laikas. Be natrio laktato, A549 ląstelėse ląstelių mirtis prasidėjo po 1–2 dienų, o visos ląstelės mirė po 4 dienų. Tačiau didelės natrio laktato koncentracijos (pvz., 80 mM) sukėlė greitą A549 ląstelių mirtį (1B pav.).

Figūra 1

Laktatas skatina vėžio ląstelių atsparumą gliukozės badui. (A) A549 ląstelių augimo kreivės, kurios buvo kultivuojamos terpėje be gliukozės su skirtingomis laktato koncentracijomis. (B) A549 ląstelių skaičius buvo skaičiuojamas praėjus 3 dienoms po kultivavimo terpėje be gliukozės su skirtingomis laktato koncentracijomis. (C) H1299, DU145, A549, PC3 ir U87-MG ląstelių skaičius skaičiuojamas praėjus 3 dienoms po kultivavimo terpėje be gliukozės su skirtingomis laktato koncentracijomis. (D) H1299, DU145, A549, PC3 ir U87-MG ląstelių išgyvenimas po kultivavimo terpėje be gliukozės su skirtingomis laktato koncentracijomis. (E) A549 ląstelių su laktatu arba be jo deguonies suvartojimo greitis (OCR) buvo matuojamas pradžioje ir nuolat per visą eksperimentinį laikotarpį ir esant nurodytiems vaistams: oligomicinui (1 μg/ml), karbonilcianido p-trifluormetoksifenilhidrazonui (FCCP). ) (1 μM), rotenonas (1 μM) ir antimicinas A (1 μM). (F) Laktato koncentracija terpėje buvo nustatyta tomis pačiomis eksperimentinėmis sąlygomis kaip ir A. (G) A549 ląstelių skaičius buvo skaičiuojamas praėjus 3 dienoms po kultivavimo skirtingose ​​aplinkose: be gliukozės, be gliukozės + 20 mM natrio laktato (pH). 7,4), be gliukozės + 5 mM pieno rūgšties (pH 6,8) ir be gliukozės + 5 mM druskos rūgšties (pH 6,8). Duomenys yra vidurkis ± standartinė paklaida (SE), n=3.

Mes taip pat patvirtinome minėtus reiškinius kitų tipų naviko ląstelių linijose. Mes auginome keturias žmogaus vėžio ląstelių linijas, gautas iš smegenų (U87-MG), prostatos (PC3 ir DU145) ir plaučių (H1299), auginimo be gliukozės sąlygomis su įvairiomis laktato koncentracijomis. Natrio laktato (20 mM) pridėjimas veiksmingai pailgino visų 5 tipų navikų ląstelių išgyvenimo laiką. Tada palyginome proliferacijos ir išgyvenimo laiką tarp visų 5 vėžio ląstelių tipų, kai yra natrio laktatas. Mes nustatėme, kad DU145, A549 ir ​​H1299 ląstelių proliferacijos aktyvumas buvo stipresnis nei PC3 ir U87-MG ląstelių (1C pav.), o jų išgyvenimo laikas buvo ilgesnis nei PC3 ir U87-MG ląstelių linijų (1D pav.).

Kai kurie tyrimai parodė, kad naviko ląstelės gali absorbuoti laktatą ir panaudoti jį kaip energijos šaltinį per oksidacinį fosforilinimą. Seahorse Bioscience XF24 prietaisu stebimų ląstelių kultūroje ištirpusio deguonies nustatymas parodė, kad, pridėjus laktato, oksidacinio fosforilinimo lygiai reikšmingai nepasikeitė (1E pav.). Be to, mes ištyrėme laktato koncentraciją ląstelių kultūroje. Eksperimento metu ekstraląstelinio laktato koncentracija reikšmingai nepasikeitė (1F pav.). Šie rezultatai rodo, kad trūkstant gliukozės, laktatas nebuvo naudojamas kaip energijos apykaitos substratas.

Ląstelių pieno rūgšties sekrecija paveiktų pH vertę ekstraląstelinėje aplinkoje. Norėdami patvirtinti, ar rūgštinė aplinka turi įtakos naviko ląstelių išgyvenimui aplinkoje, kurioje nėra gliukozės, A549 ląsteles kultivavome atskirai šiose 4 aplinkose: be gliukozės, be gliukozės + 20 mM natrio laktato (pH 7,4), be gliukozės. + 20 mM pieno rūgšties (pH 6,8), be gliukozės + 20 mM druskos rūgšties (pH 6,8). Po 72 valandų kultivavimo nustatėme, kad druskos rūgšties pridėjimas į naviko ląsteles gliukozės neturinčioje aplinkoje reikšmingos įtakos išgyvenamumui neturėjo, pieno rūgšties pridėjimas turėjo tam tikrą poveikį, o laktato pridėjimas turėjo didžiausią poveikį (1G pav.). Padarėme išvadą, kad naviko ląstelių išgyvenimas aplinkoje be gliukozės daugiausia buvo paties laktato funkcija ir turėjo mažai ką bendro su rūgštine aplinka.

Akt signalizacijos aktyvavimo įtaka laktato vaidmeniui naviko ląstelių išgyvenimui be gliukozės sąlygomis

Pirmiau minėtuose eksperimentuose mes nustatėme, kad natrio laktatas turėjo skirtingą poveikį skirtingų ląstelių linijų išgyvenimui be gliukozės sąlygomis. Atitinkamai, mes suskirstėme penkias vėžio ląstelių linijas į 2 grupes: laktatui jautrią grupę, įskaitant DU145, A549 ir ​​H1299, ir laktatui nejautrią grupę, įskaitant PC3 ir U87-MG. Norėdami išsiaiškinti, kodėl laktatas turėjo skirtingą poveikį 2 ląstelių grupių išgyvenimui be gliukozės, palyginome 2 ląstelių grupių genetinį foną. Mes nustatėme, kad 2 laktatui nejautrios ląstelių linijos, PC3 ir U87-MG, prarado PTEN aktyvumą (10 chromosomoje išbraukta fosfatazė ir tenzino homologas) (2A pav.). PTEN yra naviką slopinantis genas, turintis fosfatazės aktyvumą, dalyvaujantis neigiamai reguliuojant Akt signalizacijos kelią, kur blokuoja Akt ir jo pasroviui esančių efektorių molekulių aktyvavimą (13). Akt signalizacijos kelias vaidina svarbų vaidmenį ląstelių proliferacijoje ir išgyvenime (14). Todėl, norėdami patvirtinti Akt signalizacijos kelio aktyvavimą PC3 ir U87-MG ląstelių linijose su PTEN delecija, ištyrėme Akt fosforilinimo būseną 2 ląstelių linijose (2B pav.). Rezultatai parodė, kad, palyginti su laktatui jautria grupe, Akt fosforilinimas laktatui nejautrioje grupėje padidėjo, o tai sukeltų Akt signalizacijos kelio aktyvavimą. Taip pat palyginome 2 ląstelių grupių reakcijas su insulinu, Akt signalizacijos kelio aktyvatoriumi (2C pav.). Insulinas sukėlė nuo dozės priklausomą ląstelių skaičiaus padidėjimą laktatui jautrios grupės ląstelėse. Priešingai, insulinas neturėjo įtakos laktatui nejautrios grupės ląstelių augimui. Aukščiau pateikti rezultatai rodo, kad Akt signalizacijos kelio būsena buvo pagrindinis veiksnys, išskiriantis laktato vaidmenį vėžio ląstelių proliferacijoje ir išgyvenamumo trukmei be gliukozės.

2 pav

Akt signalizacijos aktyvinimas koreliuoja su laktato vaidmeniu gliukozės badui. (A) PTEN baltymų ekspresija penkiose ląstelių linijose (H1299, DU145, A549, PC3 ir U87-MG) buvo ištirta Western blot metodu. (B) Fosfo-S473 Akt ir bendro Akt baltymų ekspresija penkiose ląstelių linijose (H1299, DU145, A549, PC3 ir U87-MG) buvo ištirta Western blot metodu. β-aktinas buvo naudojamas kaip normalizavimo kontrolė. (C) Vėžinių ląstelių proliferacijos kreivės iš penkių ląstelių linijų, auginamų didėjant insulino koncentracijai. Duomenys yra vidurkis ± standartinė paklaida (SE), n=3.

Laktatas sukelia Akt fosforilinimą per PI3K

Norint analizuoti laktato sukeltą Akt signalizaciją, A549 ląstelės buvo kultivuojamos per naktį DMEM be serumo, o ląstelės buvo stimuliuojamos natrio laktatu 30 min. Šių ląstelių lizatai buvo analizuojami Western blot metodu, o Akt aktyvacija buvo matuojama aptikus Thr308 ir Ser473 fosforilintas Akt formas. Mes naudojome insuliną, kad paskatintume serumo neturinčias ląsteles kaip teigiamą Akt aktyvavimo kontrolę. Esant tokiai aplinkai, mes pastebėjome, kad Akt Thr308 ir Ser473 fosforilinimas padidėjo esant laktatui panašiai kaip ir su insulinu (3A ir C pav.). Tada mes panaudojome perifoziną (Akt inhibitorių), kad slopintume Akt aktyvavimą. Mes nustatėme, kad Akt Thr308 ir Ser473 fosforilinimas laktatu arba insulinu buvo slopinamas perifozinu (3C pav.). Gavome tą patį rezultatą, kai naudojome skirtingas ląstelių linijas, tokias kaip H1299 ir DU145, o tai rodo, kad Akt fosforilinimo skirtumai nebuvo būdingi A549 ląstelių linijai (3B pav.). Laiko eigos eksperimentai parodė, kad Akt fosforilinimas Thr308 ir Ser473 fosforilinimo vietose buvo greitas (1–5 min. po inkubacijos su laktatu), o didžiausias lygis buvo pasiektas per 10–30 minučių (3D pav.). Norėdami įvertinti, ar laktatas sukėlė Akt fosforilinimą pasroviui nuo PI3K, naudojome LY294002 (PI3K inhibitorių). Akt Thr308 ir Ser473 fosforilinimas esant laktatui buvo iš esmės sumažintas esant LY294002 (3E pav.). Šie rezultatai rodo, kad laktatas reikšmingai ir greitai sukėlė Akt aktyvavimą per Thr308 ir Ser473 fosforilinimą, kurį tarpininkauja PI3K.

3 pav

Akt yra fosforilinamas Thr308 ir Ser473, reaguodamas į laktatą, tarpininkaujant PI3K. (A) Fosfo-Thr308 Akt, fosfo-Ser473 Akt ir bendro Akt baltymų ekspresija A549 ląstelių linijoje su skirtingomis laktato koncentracijomis buvo ištirta Western blot metodu. (B) Fosfo-Thr308 Akt, phospho-Ser473 Akt baltymų ekspresija H1299 ir DU145 ląstelių linijose su laktatu (20 mM) arba insulinu (100 nM) buvo ištirta Western blot metodu. (C) Fosfo-Thr308 Akt, phospho-Ser473 Akt baltymų ekspresija A549 ląstelių linijoje, apdorotoje laktatu (20 mM) arba insulinu (100 nM) arba perifozinu (1 μM), buvo ištirta Western blot metodu. (D) Fosfo-Thr308 Akt baltymų ekspresija A549 ląstelių linijoje, stimuliuotoje laktatu (20 mM) 30 minučių, buvo ištirta Western blot metodu. (E) Fospho-Thr308 Akt, phospho-Ser473 Akt baltymų ekspresija A549 ląstelių linijoje, apdorotoje laktatu (20 mM) arba LY294002 (5 μM), buvo ištirta Western blot metodu. β-aktinas buvo naudojamas kaip normalizavimo kontrolė.

Laktatas aktyvuoja Akt/mTOR/Bcl-2 signalizacijos kelią, kad moduliuotų apoptotinį vėžio ląstelių atsaką į gliukozės badą.

Akt vaidina svarbų vaidmenį ląstelių apoptozėje ir išgyvenime, reaguojant į tarpląstelinius dirgiklius, tokius kaip insulinas arba augimo faktoriai. Mūsų ankstesni eksperimentai parodė, kad PI3K / Akt signalizacijos kelio būsena buvo pagrindinis veiksnys, leidžiantis atskirti laktato poveikį vėžio ląstelių dauginimuisi ir išgyvenimui be gliukozės sąlygomis, kai laktatas sukelia Akt aktyvavimą Thr308 ir Ser473 fosforilinimu. Iškėlėme hipotezę, kad laktatas padeda naviko ląstelėms išgyventi aktyvuodamas Akt be gliukozės. Norėdami patikrinti hipotezę, mes auginome A549 ląsteles su perifozinu, Akt inhibitoriumi. Mes nustatėme, kad gydymas perifozinu slopino ląstelių išgyvenimą, kurį sukelia laktatas, kai nėra gliukozės. Be to, gydymas Akt aktyvatoriumi IGF-1 padidino A549 ląstelių išgyvenamumą be gliukozės, bet mažiau efektyviai, palyginti su laktatu (4A pav.). Šie rezultatai parodė, kad laktatas padidino naviko ląstelių išgyvenimą be gliukozės, aktyvuodamas Akt.

4 pav

Sumažėjusi laktato apoptozė gliukozės bado metu yra tarpininkaujama aktyvuojant PI3K/Akt/žinduolių taikinį rapamicino (mTOR)/B-ląstelių limfomos (Bcl-2) signalizacijos keliu. (A) A549 ląstelių skaičius buvo skaičiuojamas praėjus 3 dienoms po kultivavimo terpėje be gliukozės, apdorotoje laktatu (20 mM) arba laktatu (20 mM) + LY294002 (1 nM) arba laktatu (20 mM) + LY294002 (5 nM). . (B) A549 ląstelės buvo kultivuojamos 25 mM gliukozės terpėje arba be gliukozės terpėje su laktatu 48 valandas prieš dažymą anneksinu V-FITC ir propidžio jodidu (PI). Srauto citometrija, skirta išmatuoti fluorescencijos intensyvumą esant 530 ir 575 nm, naudojant 488 nm sužadinimą, leido apskaičiuoti ankstyvą ir vėlyvą ląstelių apoptozės greitį. (C) A549 ląstelių ankstyvos ir vėlyvosios apoptozės greitis buvo apskaičiuotas po to, kai jos buvo kultivuojamos 25 mM gliukozės terpėje, be gliukozės terpės su laktatu (20 mM), laktatu (20 mM) + perifozinu (1 μM) arba IGF-1 ( 100 nM) 48 val. (D) Mcl-1, Bcl-2 ir Bcl-xL baltymų ekspresija A549 ląstelių linijoje, apdorotoje laktatu (20 mM) arba be jo, terpėje be gliukozės, buvo ištirta Western blot metodu. (E) A549 ląstelių ankstyvosios ir vėlyvosios apoptozės greitis buvo apskaičiuotas po to, kai jos buvo kultivuojamos 25 mM gliukozės terpėje, be gliukozės terpės su laktatu (20 mM) + kontroline maža trukdančia RNR (siRNR), laktatu (20 mM) + siBcl- 2 arba resveratrolis (100 μM) 48 val. (F) Fospho-Thr308 Akt, Bcl-2 ir phospho-Ser2448 mTOR baltymų ekspresija A549 ląstelių linijoje, apdorotoje laktatu (20 mM) arba be jo, terpėje be gliukozės buvo ištirta Western blot metodu. (G) Fospho-Ser2448 mTOR ir Bcl-2 baltymų ekspresija A549 ląstelių linijoje, apdorotoje laktatu (20 mM), laktatu (20 mM) + perifozinu (1 μM) arba IGF-1 (100 nM). Vakarų blotingas. (H) Fospho-Ser2448 mTOR ir Bcl-2 baltymų ekspresija A549 ląstelių linijoje, apdorotoje rapamicinu, buvo ištirta Western blot metodu. β-aktinas buvo naudojamas kaip normalizavimo kontrolė.

Daugelis tyrimų parodė, kad esant metaboliniam stresui, kai nėra gliukozės, naviko ląstelės patiria reikšmingą apoptozę. Taigi, mes ištyrėme naviko ląstelių, inkubuotų su laktatu, metabolinio streso atsparumą apoptozei (4B pav.). Mes auginome A549 ląsteles, kuriose yra daug gliukozės (25 mM gliukozės), be gliukozės ir be gliukozės, pridėjus laktato sąlygas. Po dvidešimt keturių valandų ląstelės buvo tripsinizuojamos, centrifuguojamos ir resuspenduojamos surišimo buferyje su anneksinu V-FITC ir PI. Dažytos ląstelės buvo analizuojamos srauto citometrija. Mes nustatėme, kad, palyginti su didelėmis gliukozės sąlygomis, aplinkoje be gliukozės buvo daug apoptozinių ląstelių. Ten buvo an

10,1 karto (P<0,001) padidėjo ankstyva apoptozė ir an

12 kartų (P<0,001) padidėjo vėlyvoji apoptozė ląstelių be gliukozės populiacijoje, palyginti su ląstelėmis, kuriose yra daug gliukozės. Apoptozės greitis kultūroje su pridėta laktato kultūra buvo labai sumažintas ir buvo artimas auginant daug gliukozės. Aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad be gliukozės sąlygomis daug A549 patyrė apoptozę, o laktato pridėjimas gali užkirsti kelią šiai apoptozei, kurios mechanizmas bus toliau nagrinėjamas toliau.

Mes patikrinome A549 ląstelių apoptozės greitį ir tada pridėjome perifoziną arba IGF-1. Mes nustatėme, kad gydymas perifozinu apsaugojo nuo laktato sukeltos apoptozės sumažėjimo, kai gliukozės nėra, ir kad IGF-1 sumažino ląstelių apoptozę, kurią sukelia gliukozės trūkumas (4C pav.). Padarėme išvadą, kad laktatas užkirto kelią apoptozei be gliukozės sąlygomis aktyvuodamas Akt.

Keli tyrimai parodė, kad anti-apoptotinė Bcl-2 šeima yra labai svarbi ląstelių išgyvenimui esant metaboliniam stresui. Mes nustatėme, kad laktatas gali sumažinti naviko ląstelių apoptozę, kurią sukelia gliukozės trūkumas. Todėl mes ištyrėme, ar laktatas paveikė anti-apoptotinių Bcl-2 šeimos baltymų, tokių kaip Mcl-1, Bcl-2 ir Bcl-xL, ekspresijos lygius. A549 ląstelės buvo kultivuojamos su pridėtu laktatu be gliukozės sąlygomis. Po 48 valandų šių ląstelių lizatai buvo analizuojami Western blot metodu. Gydymas laktatu padidino Bcl-2 koncentraciją, o Mcl-1 ar Bcl-xL lygių gydymas laktatu nepaveikė (4D pav.). Norėdami patvirtinti, ar Bcl-2 vaidina svarbų vaidmenį ląstelių išgyvenime, mes panaudojome Bcl-2 nukreiptą siRNR, kad sumažintume jo baltymų ekspresiją. Rezultatai parodė, kad gydymas siBcl-2 užkirto kelią atsparumui laktato sukeltai apoptozei sąlygomis be gliukozės. Be to, mes pastebėjome, kad resveratrolis, Bcl-2 aktyvatorius, sumažino A549 ląstelių apoptozę be gliukozės sąlygomis, panašiai kaip laktatas (4E pav.). Šie atradimai atskleidė, kad Bcl-2 reguliavimas laktatu yra svarbus naviko ląstelių atsparumui apoptozei sąlygomis, kai nėra gliukozės.

Akt vaidina pagrindinį vaidmenį skatinant ląstelių išgyvenimą, aktyvinant anti-apoptotines medžiagas. Todėl mes siekėme patvirtinti, ar Bcl-2 reguliavimas yra tarpininkaujamas aktyvuojant Akt / mTOR signalizacijos kelią, kai buvo gydomas laktatu be gliukozės. Pirma, mes nustatėme, kad A549 ląstelėse, apdorotose laktatu, Akt buvo suaktyvintas ir Bcl-2 baltymo ekspresija padidėjo, kartu su mTOR aktyvacija (4F pav.). Norėdami parodyti, kad Bcl-2 ir mTOR ekspresijos lygių padidėjimas priklausė nuo Akt aktyvacijos, pridėjome perifozino ir nustatėme, kad Bcl-2 ir mTOR ekspresijos lygiai buvo atstatyti į pradinį lygį. Be to, esant IGF-1, Bcl-2 ir mTOR ekspresijos lygiai buvo sureguliuoti (4G pav.). Rapamicino, mTOR inhibitoriaus, pridėjimas blokavo padidėjusią Bcl-2 ekspresiją (4H pav.). Šie rezultatai parodė, kad Akt aktyvinimas ir mTOR padidinimas laktatu sąlygomis, kuriose nėra gliukozės, padidino Bcl-2 reguliavimą.

Atsižvelgdami į visus aukščiau pateiktus rezultatus, darome išvadą, kad laktatas, aktyvuodamas Akt PI3K tarpininkaujant fosforilinimui, suaktyvina mTOR ir toliau padidina anti-apoptotinio baltymo Bcl-2 ekspresiją, kad padėtų naviko ląstelėms atsispirti apoptozei, kurią sukelia gliukozės badas.

Diskusija

Energijos apykaitos perprogramavimas yra vėžio požymis (5). Warburgas (4) pirmą kartą pastebėjo, kad net ir esant pakankamam deguonies tiekimui, augliai vis tiek mieliau naudojo gliukozę glikolizės būdu. Palyginti su oksidaciniu fosforilinimu, glikolizė yra mažai efektyvus energijos gamybos būdas, todėl, palyginti su normaliais audiniais, navikams dažnai reikia daugiau gliukozės. Klinikinė vėžio diagnozė naudojant PET, naudojant radioaktyviai pažymėtą gliukozės analogą (FDG) kaip reporterį, yra plačiai naudojamas metodas, nes naviko ląstelės padidino gliukozės pasisavinimą (15). Šie naviko metabolizmo modelių pokyčiai, padidėjęs gliukozės įsisavinimas ir glikolizė, kaip pagrindinis gamybos būdas, galiausiai lemia laktato, galutinio glikolizės produkto, kaupimąsi navikuose. Keli tyrimai parodė padidėjusį laktato kiekį navikuose, o tai rodo didelį metastazių skaičių ir prastą prognozę sergant žmogaus gimdos kaklelio vėžiu (16), žmogaus galvos ir kaklo vėžiu (17), žmogaus tiesiosios žarnos adenokarcinoma (18), žmogaus kepenų ląstelių karcinoma (19) ir nesmulkialąstelinis plaučių vėžys (20). Kai kurie tyrimai rodo, kad laktatas gali būti naudojamas kaip energijos šaltinis oksidacinio fosforilinimo būdu, kad susidarytų ATP (21, 22). Laktatas taip pat gali būti naudojamas kaip signalinė molekulė naviko ląstelėse (23). Laktatas gali skatinti VEGF žaizdų gijimą (24), o laktato taip pat pakanka angiogenezės signalams sukelti (25).

Kietųjų navikų atveju, kartu su sparčiu auglio augimu, kraujagyslės vystosi nepilnai, todėl tam tikrose naviko vietose trūksta gliukozės. Regionuose, kuriuose gausu kraujo, aerobinės glikolizės metu sunaudojamas didelis kiekis gliukozės, kad susidarytų laktatas, o laktatas, esantis neturtinguose kraujo naviko ląstelių regionuose, vaidina svarbų vaidmenį. Šiame tyrime, nesant gliukozės, į kultūrą pridėtas laktatas žymiai pailgino A549 ląstelių išgyvenimą priklausomai nuo koncentracijos. Šis rezultatas atitiko Wu ir kt. (26) rezultatus. Vėlesni eksperimentai su skirtingomis ląstelių linijomis patvirtino laktato vaidmenį. Kai kuriuose tyrimuose buvo pranešta, kad laktatas gali būti naudojamas kaip energijos substratas, kad auglio ląstelės gamintų ATP oksidacinio fosforilinimo būdu, mes nustatėme, ar be gliukozės sąlygų laktatas gali būti naudojamas kaip energijos substratas. Rezultatai neparodė reikšmingų deguonies suvartojimo ir laktato suvartojimo pokyčių. Taigi, kai gliukozės nėra, laktatas nėra energijos substratas. Mes taip pat atmetėme rūgštinę aplinką be gliukozės, nes ji gali turėti įtakos auglio ląstelių augimui.

Pažymėtina, kad laktatas turėjo skirtingą poveikį skirtingoms ląstelių linijoms, todėl ląstelių linijas galima suskirstyti į jautrias ir nejautrias laktato grupes. Palyginome penkių ląstelių linijų genetinį foną ir nustatėme, kad ląstelių linijos, nejautrios laktatui, neturėjo PTEN funkcijos. Insulino sukeltas augimo stimuliavimas patvirtino Akt signalizacijos kelio aktyvavimą nejautriose ląstelių linijose. Todėl norėdami toliau tirti laktato mechanizmą, mes sutelkėme dėmesį į Akt signalizacijos kelią. Akt signalizacijos kelias yra svarbus signalizacijos kelias auglio ląstelių išgyvenimui ir vystymuisi. Jį aktyvuoja prieš srovę nukreipiančios signalinės molekulės, pvz., augimo faktoriai, o vėliau jį toliau reguliuoja pasroviui esančios molekulės, kad dalyvautų auglių atsiradime ir vystyme (14). PI3K/Akt kelio suaktyvinimas gali padėti naviko atsparumui esant mitybos trūkumo sąlygoms (27). Western blot tyrimas parodė, kad laktatas aktyvavo Akt per greitą fosforilinimą Thr308 ir Ser473, tarpininkaujant PI3K. Laktatas gali būti naudojamas kaip signalinė molekulė reguliuojant tam tikrus signalizacijos kelius. Pavyzdžiui, buvo nustatyta, kad laktatas padidina 673 genų transkripciją L6 ląstelėse ir toliau dalyvauja mitochondrijų biogenezėje (28). Sergant augliais, laktatas, esant deguoniui, stimuliavo HIF-1α ekspresiją ir padidino įvairių nuo hipoksijos sukeltų priklausomų genų reguliavimą (29). Laktatas gali padidinti TLR4 signalizaciją ir NF-κB kelio sukeltą genų transkripciją makrofaguose (30). Laktatas padidino TGF-β2 lygį sergant glioma (31).Įdomu tai, kad tolesni eksperimentai parodė, kad laktatas padėjo naviko ląstelėms išgyventi be gliukozės, aktyvuodamas Akt fosforilinant.

Apoptozė dažniausiai atsiranda, kai ląstelės patiria metabolinį stresą dėl gliukozės trūkumo. Mes nustatėme reikšmingą A549 ląstelių apoptozę aplinkoje, kurioje nėra gliukozės, ir laktato pridėjimas užkirto kelią šiai apoptozei. Bcl-2 antiapoptotinių baltymų šeima yra pagrindiniai ląstelių apoptozės reguliatoriai (32). Mes nustatėme, kad laktatas padidino Bcl-2 ekspresiją, o sumažėjęs Bcl-2 baltymo ekspresijos reguliavimas naudojant siRNR sumažino atsparumą laktato sukeltai apoptozei be gliukozės sąlygomis.

PI3K / Akt signalizacijos kelias vaidina pagrindinį vaidmenį slopinant apoptozę ir taip skatinant ląstelių proliferaciją. Akt aktyvinimas gali tiesiogiai veikti su apoptoze susijusius baltymus, kad reguliuotų apoptozę. Akt aktyvinimas sukelia kaspazės-9 fosforilinimą Ser196 vietoje, o tai slopina apoptozę (33). PI3K / Akt signalizacijos kelias gali tiesiogiai arba netiesiogiai paveikti transkripcijos faktorių funkcijas, reguliuojančias ląstelių išgyvenimą. Akt gali slopinti fermentą IκBα, kuris fosforilina NF-κB, o nefosforilintas NF-κB branduolyje reguliuoja anti-apoptotinio geno transkripciją (34). Akt gali užkirsti kelią mitochondrijų citochromo c ir apoptozę sukeliančių veiksnių išsiskyrimui, prisidedant prie atsparumo apoptozei (35). Šiame tyrime patvirtinome, kad laktatas veikia per PI3K / Akt kelią, kad reguliuotų Bcl-2, slopindamas apoptozę, kurią sukelia gliukozės trūkumas.

Apibendrinant galima pasakyti, kad laktatas padeda naviko ląstelėms atsispirti apoptozei, kurią sukelia gliukozės badas. Laktatas per PI3K aktyvina Akt fosforilinimo būdu, kuris aktyvuoja mTOR ir dar labiau padidina anti-apoptotinio baltymo Bcl-2 ekspresiją. Šis tyrimas rodo, kad gydymas, nukreiptas į laktatą, gali veiksmingiau slopinti navikų išgyvenimą.

Padėkos

Šis tyrimas buvo paremtas Kinijos nacionalinės pagrindinių tyrimų programos (973 programa, 2012 CB932600), reikšmingo naujų vaistų kūrimo penkerių metų plano specialusis mokslo ir technologijų skyrius (2012ZX09506001-005), Kinijos nacionalinio gamtos mokslų fondo (2012 ZX09506001-005). Nr. 30830038, 81071180 ir 30970842), Šanchajaus savivaldybės pagrindinis mokslo ir technologijų komisijos projektas (nr. 10JC1410000) ir Šanchajaus pirmaujantis akademinės disciplinos projektas (projekto Nr. S30203).

Nuorodos

Vaupel P: naviko mikroaplinkos fiziologija ir jos įtaka spinduliuotės onkologijai. Semin Radiat Oncol. 14:198–206. 2004. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Hirayama A, Kami K, Sugimoto M, Sugawara M, Tok N, Onozuka H, ​​Kinoshita T, Saito N, Ochiai A, Tomita M, Esumi H ir Soga T: Kiekybinis gaubtinės žarnos ir skrandžio vėžio mikroaplinkos metabolomų profiliavimas kapiliarinės elektroforezės metu skrydžio masių spektrometrija. Cancer Res. 69:4918–4925. 2009. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Hahnfeldt P, Panigrahy D, Folkman J ir Hlatky L: Naviko vystymasis naudojant angiogeninį signalizavimą: dinaminė naviko augimo, gydymo atsako ir pokraujagyslinio ramybės teorija. Cancer Res. 59:4770–4775. 1999.PubMed/NCBI

Warburg O: apie kvėpavimo sutrikimą vėžio ląstelėse. Mokslas. 124:269–270. 1956.PubMed/NCBI

Hanahan D ir Weinberg RA: Vėžio požymiai: kita karta. Ląstelė. 144:646–674. 2011. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Quennet V, Yaromina A, Zips D, Rosner A, Walenta S, Baumann M ir Mueller-Klieser W: Naviko laktato kiekis numato atsaką į frakcionuotą žmogaus plokščiųjų ląstelių karcinomų švitinimą nuogoms pelėms. Radiother Oncol. 81:130–135. 2006. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Brizel DM, Schroeder T, Scher RL, Walenta S, Clough RW, Dewhirst MW ir Mueller-Klieser W: Padidėjusi naviko laktato koncentracija numato didesnę galvos ir kaklo vėžio metastazių riziką. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 51:349–353. 2001. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Gottfriedas E, Kunz-Schughartas LA, Ebner S, Mueller-Klieser W, Hoves S, Andreesen R, Mackensen A ir Kreutz M: iš naviko gauta pieno rūgštis moduliuoja dendritinių ląstelių aktyvaciją ir antigeno ekspresiją. Kraujas. 107:2013–2021. 2006. Žiūrėti straipsnį: Google Scholar

Fischer K, Hoffmann P, Voelkl S, Meidenbauer N, Ammer J, Edinger M, Gottfried E, Schwarz S, Rothe G, Hoves S, Renner K, Timischl B, Mackensen A, Kunz-Schughart L, Andreesen R, Krause SW ir Kreutz M: Slopinamasis naviko ląstelių gautos pieno rūgšties poveikis žmogaus T ląstelėms. Kraujas. 109:3812–3819. 2007. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Goetze K, Walenta S, Ksiazkiewicz M, Kunz-Schughart LA ir Mueller-Klieser W: Laktatas padidina naviko ląstelių judrumą ir slopina monocitų migraciją bei citokinų išsiskyrimą. Int J Oncol. 39:453–463. 2011.PubMed/NCBI

Sattler UG, Meyer SS, Quennet V, Hoerner C, Knoerzer H, Fabian C, Yaromina A, Zips D, Walenta S, Baumann M ir Mueller-Klieser W: glikolitinis metabolizmas ir naviko atsakas į frakcionuotą švitinimą. Radiother Oncol. 94:102–109. 2010. Žiūrėti straipsnį: Google Scholar

Le A, Cooper CR, Gouw AM, Dinavahi R, Maitra A, Deck LM, Royer RE, Vander Jagt DL, Semenza GL ir Dang CV: Laktato dehidrogenazės A slopinimas sukelia oksidacinį stresą ir slopina naviko progresavimą. Proc Natl Acad Sci USA. 107:2037–2042. 2010. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Sharrard RM ir Maitland NJ: PTEN ir SHIP2 baltymų kinazės B aktyvumo reguliavimas žmogaus prostatos ląstelių linijose. Mobilusis signalas. 19:129–138. 2007. Žiūrėti straipsnį: Google Scholar

Osaki M, Oshimura M ir Ito H: PI3K-Akt kelias: jo funkcijos ir pokyčiai sergant žmogaus vėžiu. Apoptozė. 9:667–676. 2004. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Gambhir SS, Czernin J, Schwimmer J, Silverman DH, Coleman RE ir Phelps ME: FDG PET literatūros santrauka lentelėje. J Nucl Med. 42 (5 priedas): 1S–93S. 2001.PubMed/NCBI

Walenta S, Wetterling M, Lehrke M, Schwickert G, Sundfør K, Rofstad EK ir Mueller-Klieser W: Aukštas laktato kiekis numato metastazių, naviko pasikartojimo tikimybę ir ribotą paciento išgyvenamumą sergant žmogaus gimdos kaklelio vėžiu. Cancer Res. 60:916–921. 2000.PubMed/NCBI

Brizel DM, Schroeder T, Scher RL, Walenta S, Clough RW, Dewhirst MW ir Mueller-Klieser W: Padidėjusi naviko laktato koncentracija numato didesnę galvos ir kaklo vėžio metastazių riziką. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 51:349–353. 2001. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Walenta S, Chau TV, Schroeder T, Lehr HA, Kunz-Schughart LA, Fuerst A ir Mueller-Klieser W: Žmogaus tiesiosios žarnos adenokarcinomų metabolinė klasifikacija: naujos gairės klinikiniams onkologams? J Cancer Res Clin Oncol. 129:321–326. 2003. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Sheng SL, Liu JJ, Dai YH, Sun XG, Xiong XP ir Huang G: laktato dehidrogenazės A slopinimas slopina naviko augimą ir žmogaus kepenų ląstelių karcinomos metastazes. FEBS J. 279:3898–3910. 2012. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Yokota H, Guo J, Matoba M, Higashi K, Tonami H ir Nagao Y: Laktato, cholino ir kreatino kiekis, išmatuotas 1H-MRS, kaip prognoziniai parametrai pacientams, sergantiems nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu. J Magn Reson vaizdavimas. 25:992–999. 2007. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Semenza GL: naviko metabolizmas: vėžio ląstelės duoda ir paima laktatą. J Clin Invest. 118:3835–3837. 2008.PubMed/NCBI

Bonuccelli G, Tsirigos A, Whitaker-Menezes D, Pavlides S, Pestell RG, Chiavarina B, Frank PG, Flomenberg N, Howell A, Martinez-Outschoorn UE, Sotgia F ir Lisanti MP: ketonai ir laktatas „kuro“ naviko augimas ir metastazės : Įrodymai, kad epitelio vėžio ląstelės naudoja oksidacinį mitochondrijų metabolizmą. Ląstelių ciklas. 9:3506–3514. 2010. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Vegran F, Boidot R, Michiels C, Sonveaux P ir Feron O: Laktato antplūdis per endotelio ląstelių monokarboksilato transporterį MCT1 palaiko NF-κB/IL-8 kelią, kuris skatina naviko angiogenezę. Cancer Res. 71:2550–2560. 2011. Žiūrėti straipsnį: Google Scholar

Trabold O, Wagner S, Wicke C, Scheuenstuhl H, Hussain MZ, Rosen N, Seremetiev A, Becker HD ir Hunt TK: Laktatas ir deguonis yra pagrindinis žaizdų gijimo reguliavimo mechanizmas. Žaizdų taisymas Regen. 11:504–509. 2003. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Hunt TK, Aslam R, Hussain Z ir Beckert S: Laktatas su deguonimi skatina angiogenezę. Adv Exp Med Biol. 614:73–80. 2008. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Wu H, Ding Z, Hu D, Sun F, Dai C, Xie J ir Hu X: pagrindinis pieno rūgšties acidozės vaidmuo vėžio ląstelių atsparumui gliukozės trūkumo sukeltai ląstelių mirčiai. J Pathol. 227:189–199. 2012. Žiūrėti straipsnį: Google Scholar

Kalaany NY ir Sabatini DM: navikai su PI3K aktyvinimu yra atsparūs mitybos apribojimams. Gamta. 458:725–731. 2009. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Hashimoto T, Hussien R, Oommen S, Gohil K ir Brooks GA: Laktatui jautrus transkripcijos faktoriaus tinklas L6 ląstelėse: MCT1 aktyvinimas ir mitochondrijų biogenezė. FASEB J. 21:2602–2612. 2007. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Lu H, Forbes RA ir Verma A: Hipoksijos sukeliamo faktoriaus 1 aktyvinimas aerobinės glikolizės būdu įtakoja Warburgo efektą kancerogenezėje. J Biol Chem. 277:23111–23115. 2002. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Samuvel DJ, Sundararaj KP, Nareika A, Lopes-Virella MF ir Huang Y: Laktatas padidina TLR4 signalizaciją ir NF-kappaB keliu sukeltą geno transkripciją makrofaguose per monokarboksilato transporterius ir MD-2 reguliavimą. J Immunol. 182:2476–2484. 2009. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Baumann F, Leukel P, Doerfelt A, Beier CP, Dettmer K, Oefner PJ, Kastenberger M, Kreutz M, Nickl-Jockschat T, Bogdahn U, Bosserhoff AK ir Hau P: Laktatas skatina gliomų migraciją reguliuodamas nuo TGF-beta2 priklausomą matricos metaloproteinazė-2. Neuro Oncol. 11:368–380. 2009. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar :

Cory S ir Adams JM: Bcl2 šeima: ląstelių gyvybės ar mirties jungiklio reguliatoriai. Nat Rev vėžys. 2:647–656. 2002. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

G daina, Ouyang GL ir Bao SD: Akt / PKB signalizacijos kelio ir ląstelių išlikimo aktyvinimas. J Cell Mol Med. 9:59–71. 2005. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Jeong SJ, Pise-Masison CA, Radonovich MF, Park HU ir Brady JN: Activated Akt reguliuoja NF-kappaB aktyvaciją, p53 slopinimą ir ląstelių išlikimą HTLV-1 transformuotose ląstelėse. Onkogenas. 24:6719–6728. 2005. Žiūrėti straipsnį : Google Scholar : PubMed/NCBI

Kim EC, Yun BS, Ryoo IJ, Min JK, Won MH, Lee KS, Kim YM, Yoo I ir Kwon YG: Komplestatinas apsaugo nuo apoptotinės ląstelių mirties: slopina mitochondrijų kaspazės kelią per AKT / PKB aktyvavimą. Biochem Biophys Res Commun. 313:193–204. 2004. Žiūrėti straipsnį: Google Scholar


5. LAKTATAS: INTEGRATYVUS VĖŽIO METODOLIZMO VEIDROLIS, TURIANTIS KLINIKINIŲ POVEIKIŲ

Pastovios metabolitų koncentracijos gali atspindėti gyvų audinių metabolinę būklę. Skirtingai nuo daugelio sveikų organų, piktybiniai navikai yra labai nevienalyčiai, atsižvelgiant į erdvinį kraujagyslių išsidėstymą, įvairias ląstelių subpopuliacijas ir lokalizuotas metabolitų koncentracijas (Aly ir kt., 2015, Jeng ir kt., 2015). Yra įrodymų, kad šis būdingas naviko nevienalytiškumas yra viena iš pagrindinių medicininės onkologijos gydymo nesėkmės priežasčių (Walther ir kt., 2015). Vadinasi, norint biologiškai ir kliniškai reikšmingu būdu vaizduoti metabolitus vėžiniame audinyje, reikia kiekybiškai aptikti metabolines medžiagas mikroskopiniais matmenimis, atsižvelgiant į histologinę audinio struktūrą.

Klinikoje patohistologinei diagnozei atlikti reguliariai atliekamos metabolinės analizės, pagrįstos naviko biopsijomis. Atsarginės šios procedūros medžiagos dažnai yra prieinamos moksliniams tikslams, atsižvelgiant į etinius sumetimus ir paciento sutikimą. Įrodėme, kad klinikinėje aplinkoje galima tinkamai pašalinti tokias biopsijas ir greitai užšaldyti skystu azotu ir kad šie mėginiai leidžia analizuoti trumpalaikę audinių metabolinę būklę (metabolizmo momentinį vaizdą) (Walenta ir kt., 2000, 2016). Įrodėme, kad daugeliu atvejų viena naviko biopsija iš patologinės rutinos gali atspindėti viso naviko metabolinius požymius, palyginti su matavimais iš dviejų ar trijų to paties vėžio biopsijų (Walenta ir kt., 2016). Be to, mes nustatėme, kad laktato koncentracijos audiniuose nesikeičia, kai biopsijos buvo laikomos skystame azote dešimt metų (Walenta ir kt., 2016), o tai suteikia galimybę ilgalaikiam metabolinių audinių bankų saugojimui.

Vis daugiau signalizacijos būdų buvo glaudžiai susiję su vėžio metabolizmu. Dėl to navikų metabolinis reguliavimo panaikinimas gali būti pripažintas sudėtingu tarpusavyje susijusių kelių tinklu, kurio funkcionalumas atskiruose navikuose yra nenuspėjamas (Carroll ir kt., 2015). Priešingai, yra įprastas vėžio ląstelių metabolizmo rodmuo, kuris integruojasi į įvairias signalizacijos veiklas, ty laktato ištekėjimą iš ląstelių į naviko mikroaplinką (Dhup ir kt., 2012, Hirschhaeuser ir kt., 2011, Luc ir kt., 2015). Labai kintamų laktato koncentracijų solidiniuose navikuose klinikinę reikšmę ir pasekmes mūsų grupė pirmą kartą nustatė 2000 m. (Walenta ir kt., 2000), naudodama indukuotos metabolinės bioliuminescencijos vaizdą (imBI). ImBI metodas leidžia kiekybiškai įvertinti įvairius metabolitus, tokius kaip gliukozė, laktatas, piruvatas, ATP, gliukozės-6-fosfatas arba D2-hidroksigluturatas, ir įvertinti šių metabolitų regioninį pasiskirstymą dominančiuose audiniuose. Šis metodas buvo sukurtas mūsų laboratorijoje, remiantis biocheminiais pirmtakų tyrimais, daugiausia smegenų metabolizmo tyrimais (Kim ir kt., 1993, Kricka 2000, Paschen 1985, Paschen ir kt., 1981). Dabartinė imBI būsena ir jos pranašumai bei apribojimai buvo apžvelgti anksčiau (daugiau metodologinės informacijos žr. Walenta ir kt., 2014).

Naudojant imBI buvo gauta daug duomenų apie įvairius eksperimentinius ir klinikinius navikus. Visuose tirtuose navikuose laktato koncentracijos audiniuose buvo didžiausios, palyginti su visais kitais tirtais metabolitais. Laktato koncentracija augliuose svyravo nuo 0 iki 50 μmol/g audinio, o tai atitinka maždaug 0–50 mM skystoje fazėje. Atsižvelgiant į tai, kad fiziologinis laktato diapazonas žmogaus kraujyje yra 0–2 mM, vėžinės ląstelės išgyvena susidūrusios su pernelyg didelėmis laktato koncentracijomis kartu su sunkia metaboline acidoze (kaip aptarta kitur). Net atsižvelgiant į tai, kad varginančio fizinio darbo metu laktato koncentracija kraujyje pasiekia trumpalaikes 10–15 mM reikšmes, šis metabolitas gali būti pašalintas iš kraujo per 30 minučių po treniruotės. Priešingai, vėžio ląstelės yra nuolat veikiamos padidėjusios laktato koncentracijos, rūgštinio pHe, ir anglies dioksido įtampą iki 80 mmHg, kurios gali būti laikomos chroniškomis patofiziologinėmis sąlygomis (apibendrinti Walenta & Mueller-Klieser 2004 ir Walenta et al. 2000).

5.1. Laktato kaupimosi naviko mikroaplinkoje klinikinė reikšmė

Kiekybiškai vertinant naviko laktato koncentracijas ir jų klinikinę reikšmę, pasirodė naudinga navikus suskirstyti į didelio ir mažai laktato turinčius vėžius, atskiriant duomenų reikšmes, naudojant vidutinę laktato koncentraciją kaip ribą tarp dviejų klasių. Kadangi skirtumas tarp dviejų laktato klasių greičiausiai atsiranda dėl skirtingo naviko audinio glikolizės aktyvumo, terminai „didelio“ ir „mažo glikolizės navikai“ galiausiai buvo panaudoti literatūroje kaip „didelio“ ir „mažo“ sinonimai. -laktato navikai“, atitinkamai. Įdomu tai, kad atskyrimo riba tarp didelio ir mažai laktato turinčių navikų visuose tirtuose navikuose, ty skirtinguose nepriklausomuose tyrimuose, eksperimentinėse ir klinikinėse situacijose bei navikų subjektuose, buvo 10 ± 2 mM.

Daugumos tirtų vėžio atvejų daug laktato turinčių navikų buvo siejami su sumažėjusiu ilgalaikiu išgyvenimu arba išgyvenimu be ligos, palyginti su mažo laktato kiekio analogais (Walenta ir Mueller-Klieser, 2004, Walenta ir kt., 2000, 2004). Kai kurių navikų subjektų, tokių kaip galvos ir kaklo vėžys, statistinė naviko pasikartojimo tikimybė buvo žymiai didesnė, kai augliai turi daug, palyginti su mažu laktato kiekiu (Brizel ir kt., 2001). Kaip ir daug laktato turinčių navikų, hipoksijos sukeliamo H +/laktato simporterio MCT4 ekspresija parodė didžiausią žalingą poveikį išgyvenamumui dviejose atskirose 770 mazgų neigiamų krūties navikų grupėse (Doyen ir kt., 2014).

Metastazių atsiradimas yra pagrindinis klinikinis veiksnys, ribojantis paciento išgyvenimą. Ankstyvųjų tolimų metastazių dažnis pirmą kartą diagnozavus naviką buvo žymiai didesnis sergant pirminiu vėžiu, kurio sudėtyje yra daug laktato, palyginti su mažo laktato kiekio pirminiu vėžiu (apibendrinta Walenta ir Mueller-Klieser 2004). Įrodyta, kad laktatas pats savaime stimuliuoja angiogenezę aktyvuodamas VEGF/VEGFR2 kelią, kuris gali palaikyti metastazavimo procesą (Dhup ir kt., 2012, Porporato ir kt., 2012). Kitas patofiziologinis mechanizmas, skatinantis metastazių susidarymą, yra naviko ląstelių judrumo stimuliavimas laktatu (Baumann ir kt., 2009, Goetze ir kt., 2011). Šiuo metu kai kurie su G baltymu susieti receptoriai (GPCR), GPR4, GPR65, GPR68, GPR81 ir GPR132, yra nustatyti kaip galimi laktato arba protonų jutikliai (Justus ir kt., 2013). Nors iš pradžių GPR81 buvo aptiktas ir klasifikuojamas kaip retasis receptorius adipocituose (Cai ir kt., 2008), jo, kaip ne tik ląstelės paviršiaus l-laktato receptorių, bet ir hidroksikarboksilo receptorių, funkcija buvo ištirta kelių tipų ląstelėse, įskaitant piktybines ląsteles (žr. Romero-Garcia ir kt., 2016). Tačiau auglio rūgštinės mikroaplinkos kontekste didžiausio dėmesio sulaukė protonus jautrūs GPR4, GPR65, GPR68 ir GPR132 (Weiss ir kt., 2017). Jie aktyvuojami protonuojant keletą histidino liekanų, reaguojant į ekstraląstelinio pH kritimą. Auglio rūgštingumas, susidarantis iš pieno ir anglies rūgščių (Newell ir kt., 1993), perduoda tarpląstelinius signalus per G baltymus, susietus su adenilato ciklaze (GPR4, GPR65), fosfolipaze C (GPR68) arba šiuo metu nenustatytu efektoriumi (GPR132) (Justus). ir kt., 2013, Seuwen ir kt., 2006).

Dabar buvo pripažinta, kad du rūgštims jautrūs GPCR, GPR132 ir GPR65, ekspresuojami su naviku susijusiuose makrofaguose (TAM), turi abipusę vėžio ląstelių ir makrofagų sąveiką krūties vėžiui gydyti (Chen ir kt., 2017) ir melanoma (Bohn ir kt., 2018).Nors rūgštimi aktyvuoto GPR132 signalizacijos pobūdžio trūksta, GPR132 aktyvuoja į M2 panašų makrofagų fenotipą, kuris palengvina vėžio ląstelių migraciją, invaziją ir metastazes (Chen ir kt., 2017). Priešingai, rūgštimi suaktyvintas GPR65 per ciklinį AMP indukuoja transkripcijos represorių ICER (indukuojamą ciklinį AMP ankstyvąjį represorių) su naviku susijusiuose makrofaguose, o tai lemia jų funkcinę poliarizaciją į neuždegiminį fenotipą ir skatina naviko augimą (Bohn ir kt., 2018).

2010 m. paskelbėme bendradarbiaujant su Michaelo Baumanno grupe atliktą tyrimą dėl radiorezistencijos didelėje žmonių galvos ir kaklo vėžio ksenografų grupėje (Sattler ir kt., 2010), vadovaudamiesi standartiniais klinikiniais švitinimo dozės ir frakcionavimo schemos protokolais. Skirtingai nuo daugelio tirtų metabolinių parametrų, laktato koncentracija buvo dominuojantis naviko atsako į švitinimą moduliatorius, o didžiausio laktato turintys navikai buvo atspariausi gydymui. Be kitų veiksnių, tai gali būti paaiškinta tuo, kad tokiomis sąlygomis susidaro redukcinė aplinka dėl didelio glikolizės apykaitos greičio, piruvatas gali veikti kaip antioksidantas, nes neenzimatiškai susidaro acetatas ir kartu pašalinamas vandenilio peroksidas (Salahudeen ir kt., 1991). Be to, buvo įrodyta, kad išorinio laktato pridėjimas prie endotelio ląstelių kultūrų padidina NAD(P)H:NAD(P) santykį ir kelių genų transkripcijos kontrolę, kurią sąlygoja redokso reguliuojamo transkripcijos faktoriaus kompleksas. AP-1 (Hoffmann ir kt. 2001). Analogiškai su redukcinių aplinkos sąlygų sukeltam radiorezistencijai, cheminis atsparumas gali atsirasti vartojant tuos vaistus, kurie tokiomis sąlygomis yra inaktyvuojami, pavyzdžiui, doksorubicinu (Velaei ir kt., 2016).

Atsižvelgdami į naviko redokso būsenos reikšmę vėžio terapijai, su struktūra susijusiam kiekybiniam redokso vaizdavimui panaudojome imBI technologiją (Sattler ir kt., 2007). Tai iliustruota 4 pav, kuriame parodyta žmogaus galvos ir kaklo plokščialąstelinės karcinomos histologija šalia dryžuoto raumens (4 pava) ir laktato ir piruvato santykio spalvomis pažymėtą žemėlapį (4 pavb). Užkoduotos spalvos aiškiai atspindi intensyviai sumažintą piktybinio ir normalaus audinio redokso būseną.

5.2. Neinvazinis laktato ir susijusių metabolitų aptikimas

Nors imBI technologija yra invazinė, ji turi unikalų savybių derinį, įskaitant erdvinę skiriamąją gebą mikroskopiniu lygmeniu, kiekybinius metabolitų matavimus absoliučiais vienetais (mikromoliai viename audinio grame), biocheminį universalumą, atsižvelgiant į platų galbūt aptinkamų metabolitų spektrą. tiesioginė metabolitų kolokalizacija ir histologinė struktūra bei klinikinis pritaikymas. Šiuo metu šių imBI bruožų negali patenkinti jokie naujausi metabolinio vaizdo gavimo metodai, šiuo metu naudojami eksperimentiškai ar įprastai klinikoje. Nepaisant to, vizualizavimo metodai yra skubiai reikalingi ir turi būti tobulinami, kad pagerintume žinias apie žmogaus piktybines ligas, išsamią diagnozę ir įvairiapusius, pritaikytus gydymo būdus. Naujausioje literatūroje buvo pranešta apie daugybę pastangų ir pažangos neinvazinio metabolinio vaizdo gavimo srityje, tačiau čia galima trumpai paminėti tik keletą pasirinktų su laktato vaizdavimu susijusių tyrimų pavyzdžių. Skirtingai nuo gliukozės, audinių laktato srautai dar buvo aptikti pozitronų emisijos tomografija (PET). Tačiau neseniai paskelbta ataskaita parodė, kad [18F]-3-fluor-2-hidroksipropionatas gali būti laktato analogas, leidžiantis stebėti MCT1 laktato įsisavinimą ląstelėse atliekant PET tyrimus (Van Hee ir kt., 2017). Taikant modifikuotų PET ir magnetinio rezonanso spektroskopijos (MRS) metodų derinį, gliukozė ir laktatas buvo nustatyti kaip TCA ciklo anglies šaltiniai sergant pacientų plaučių navikais (Faubert ir kt., 2017). Neseniai H1-MRS tyrime, kuriame dalyvavo pacientai, sergantys neuroepiteliniais navikais, Nakamura ir kt. (2018) sugebėjo santykinai įvertinti naviko laktato kiekį ir įrodyti, kad šis kiekybinis įvertinimas palaiko naviko klasifikavimą. Todėl atrodo, kad navikų profiliavimas laktatu klinikoje yra esminis parametras progresuojant link patobulintos priešvėžinės terapijos.


Metodai

Ląstelių kultūra ir karčiųjų melionų ekstrakto (BME) paruošimas

HNSCC ląstelių linija Cal27 buvo nupirkta iš ATCC. JHU022 ląstelių linija buvo įsigyta iš Johns Hopkins universiteto. Cal27 ir JHU022 ląstelės buvo laikomos RPMI1640 terpėje, papildytoje 10% FBS ir 1% penicilino / streptomicino, drėgnoje CO.2 inkubatorius. Ląstelių linijos yra reguliariai tikrinamos mūsų laboratorijoje, kad būtų išvengta užteršimo mikoplazmomis, naudojant komercinį Lonza MycoAlert™ mikoplazmos aptikimo rinkinį. Karčiųjų melionų ekstraktas (BME) buvo paruoštas iš kiniškų jaunų karčiųjų melionų (žaliavų ir žalių), kaip aptarta anksčiau [13]. Trumpai tariant, BME buvo išgaunamas iš nesmulkintų vaisių be sėklų, naudojant buitinę sulčiaspaudę kambario temperatūroje ir centrifuguojamas 15000x g 4 ° C temperatūroje 30 min. BME buvo laikomas -80 ° C temperatūroje tolesnei analizei. Cal27 ląstelės buvo apdorotos 2% BME, o JHU022 ląstelės buvo apdorotos 3% BME ir buvo atlikta skirtinga analizė. Visi eksperimentai buvo atlikti bent trimis egzemplioriais.

RNR išskyrimas ir ekspresijos analizė

Cal27 ir JHU022 ląstelės buvo apdorotos BME arba be jo 30 valandų. Bendra RNR buvo ekstrahuota TRIzol reagentu, po to cDNR sintezė su SuperScript III atvirkštine transkriptaze (Life Technology, JAV). Realaus laiko PGR buvo atlikta genų ekspresijos kiekybiniam įvertinimui naudojant specifinius pradmenis (1 lentelė), naudojant SYBR žalią aptikimo sistemą. 18 s rRNR buvo naudojama kaip endogeninė kontrolė. Santykinė genų ekspresija buvo analizuojama 2 -∆∆CT metodu. Kiekvienas mėginys buvo įkeltas trimis egzemplioriais.

Baltymų išskyrimas ir Western blot analizė

Buvo paruošti kontroliniai arba BME apdoroti ląstelių lizatai, o Western blot analizė atlikta naudojant specifinius antikūnus prieš GLUT-1, PFKP, LDHA, PDK3, ACLY, FASN ir Flot-1 (Santa Cruz Biotechnology), ACC1 ir CHOP (ląstelių signalizacijos technologiją). ). Antriniai antikūnai prieš pelę arba triušius buvo įsigyti iš BIO-RAD. Blotas buvo pakartotinai patikrintas su aktino-HRP antikūnu, kad būtų galima palyginti baltymų kiekį kiekvienoje juostoje. Densitometrijos analizė buvo atlikta naudojant Image J programinę įrangą (NIH).

Laktato ir piruvato lygio nustatymas GC/MS metodu

Cal27 ir JHU022 ląstelės buvo apdorotos BME arba be jo 30 valandų. Ląstelės buvo plaunamos lediniu PBS ir greitai gesinamos 80% metanoliu. [13 C3] laktatas ir [13 C3] piruvatas (Cambridge Isotope Labs, Tewksbury, MA) buvo įdėtas į mėginius kaip vidiniai kiekybinės analizės standartai. Tada ekstraktai buvo apdoroti ultragarsu ir centrifuguojami 14 000 × g 15 minučių 4 ° C temperatūroje. Skaidrus supernatantas buvo džiovinamas azoto dujų srove iki visiško išdžiūvimo, kad būtų pašalintos nuosėdos, ir buvo atliktas dujų chromatografijos / masės spektrometrijos (GC/MS) eksperimentas, kaip aprašyta anksčiau [20].

Ekstraląstelinio rūgštėjimo ir glikolitinio greičio nustatymas

Cal27 ir JHU022 ląstelės (2 × 10 4 ląstelės / duobutėje) buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokštelę (Seahorse XF96 Cell Culture Microplates, Agilent) ir apdorotos BME arba be jos 24–36 valandas. Ląstelių ekstraląstelinio rūgštėjimo greitis (ECAR) ir deguonies suvartojimo greitis (OCR) buvo vertinami, kad būtų galima suprasti glikolizės greitį (ECAR / OCR), naudojant Seahorse XF analizatorių (Agilent), kaip aprašyta anksčiau [21].

Lipidomika

Kontrolinės arba BME apdorotos Cal27 ir JHU022 ląstelių suspensijos vėliau buvo modifikuotos Bligh-Dyer ekstrakcijos, naudojant lipidų klasės vidinius standartus, įskaitant heptadekano rūgštį, 1,2-ditetradekanoilą.sn-glicero-3-fosfoetanolaminas, heptadekanoilo cholesterolio esteris, N-heptadekanoilo keramidas ir 1,2-dieicosanoil-sn-glicero-3-fosfocholinas [22]. Fosfolipidams lipidų ekstraktai buvo skiedžiami metanoliu/chloroformu (4/1, v/v), o molekulinės rūšys buvo kiekybiškai įvertintos elektropurškimo jonizacijos-tandemo masės spektrometrija (ESI-MS/MS) naudojant trigubą kvadrupolio prietaisą (Thermo Fisher Quantum Ultra). ) naudojant šautuvų lipidomiką. Fosfatidilcholino molekulinės rūšys buvo kiekybiškai įvertintos kaip sodiuoti aduktai teigiamų jonų režimu, naudojant neutralių nuostolių nuskaitymą 59,1 amu (susidūrimo energija = -28 eV). Cholesterilo esterio molekulinės rūšys buvo kiekybiškai įvertintos kaip sodiuoti aduktai teigiamų jonų režimu, naudojant neutralių nuostolių nuskaitymą 368, 5 amu (susidūrimo energija = -25 eV). Keramido molekulinės rūšys buvo kiekybiškai įvertintos neigiamų jonų režimu, naudojant neutralių nuostolių nuskaitymą 256, 2 amu (susidūrimo energija = 32 eV). Fosfatidiletanolamino ir plazmeniletanolamino molekulinės rūšys pirmiausia buvo išvestinės į jų fMOC rūšis, o po to analizuojamos neutralių nuostolių skenavimu 222, 2 amu (susidūrimo energija = 30 eV) neigiamų jonų režimu (HAN). Atskiros molekulinės rūšys buvo kiekybiškai įvertintos lyginant atskirų molekulinių rūšių jonų intensyvumą su lipidų klasės vidinio standarto jonų intensyvumu, papildomai pataisant I ir II tipo [13C] izotopų poveikį.

Nuo kalcio nepriklausoma fosfolipazė A2 (iPLA2) aktyvumo tyrimas

Kontrolinė arba BME apdorota Cal27 ir JHU022 ląstelė buvo paveikta iPLA2 aktyvumas buvo matuojamas taip, kaip aprašyta anksčiau [23]. Trumpai tariant, ląstelės buvo plaunamos lediniu PBS, o po to PLA2 tyrimo buferis ir PLA2 aktyvumas supernatante buvo matuojamas 37 °C temperatūroje 5 minutes, kaip substratą naudojant 100 μM (16:0, [3H] 18:1) plazmenilcholiną.

Reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) analizė

Cal27 ir JHU022 ląstelės buvo apdorotos BME arba be jo 30 valandų. Mitochondrijų ROS matavimui ląstelės buvo dažytos MitoSOX (Molecular Probes, Invitrogen) esant 5 μM 40 minučių 37 ° C temperatūroje, o srauto citometrijos analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau [24].

Imunofluorescencinė analizė

Kontrolinės ir BME apdorotos ląstelės buvo fiksuotos atšaldytu metanoliu 5 minutes -20 ° C temperatūroje. Užblokavus 5% BSA, pirminis antikūnas prieš Flotilliną buvo pridėtas nakčiai 4 ° C temperatūroje, o anti-pelės imunoglobulinas, konjuguotas su Alexa Fluor 647 (Molecular Probes), 1 valandą kambario temperatūroje. Branduoliniam dažymui ląstelės buvo prieš dažytos DAPI (4',6'-diamidino-2-fenilindolu). Dviejų kanalų optiniai vaizdai (raudona ir mėlyna) buvo renkami naudojant konfokalinės sistemos Olympus FV1000 nuoseklų nuskaitymo režimą. Vaizdai buvo sujungti skaitmeniniu būdu, kad būtų galima stebėti bendrą lokalizaciją, kai dvi skirtingos spalvos sukuria skirtingą spalvą, o fiziškai atskiri signalai išlaiko savo individualias spalvas.

Statistinė analizė

Rezultatai išreiškiami vidurkiais ± standartinėmis vidurkių paklaidomis. Studento t testas buvo naudojamas dviejų grupių (kontrolinės ir BME gydytų) palyginimui. P-reikšmės, mažesnės nei 0,05, buvo laikomos statistiškai reikšmingomis. Visi eksperimentai buvo kartojami mažiausiai tris kartus ir rodomi reprezentatyvūs duomenys.


PKM2 reglamentas

PKM2 raiškos reguliavimas

PKM2 ekspresija reguliuojama keliais lygiais, reguliuojant DNR metilinimą, transkripcijos faktorius, pre-mRNR susijungimą. PKM, PKM2 specifinės mikroRNR (miRNR) ir PKM2 baltymo modifikacijos po transliacijos (žr. plakatą).

Vėžio genomo atlaso DNR metilinimo duomenų analizė parodė, kad padidėjusi PKM2 ekspresija gerai koreliuoja su 1-ojo introno hipometilinimo būsena. PKM genas daugelyje vėžio tipų, o tai rodo, kad epigenetinis reguliavimas DNR metilinimo būdu yra svarbus kontrolės mechanizmas PKM transkripcija navikuose (Desai ir kt., 2014).

Buvo pranešta, kad keli transkripcijos veiksniai reguliuoja jo veiklą PKM promotorius, kuriame yra penkios SP1 ir SP3 surišimo vietos. Tiek SP1, tiek SP3 sąveikauja su branduolinio faktoriaus (NF)-YA transkripcijos faktoriumi (žr. plakatą). Iš tiesų, per didelė SP1 arba SP3 ir NF-YA ekspresija sinergiškai stimuliuoja distalinio promotoriaus aktyvumą. PKM genas (Discher ir kt., 1998 Yamada ir kt., 2000). Taip pat įrodyta, kad fosfoinozitido 3-kinazė (PI3K) ir žinduolių rapamicino (mTOR) aktyvacijos taikinys, kurį gali sukelti insulino stimuliacija, padidina PKM2 ekspresiją dėl hipoksijos sukeliamo faktoriaus 1α (HIF1α) reguliuojamo transkripcijos. PKM genas (Iqbal ir kt., 2013 Sun ir kt., 2011). Peroksisomų proliferatoriaus aktyvuotas receptorius γ (PPARγ), branduolinio hormono receptorius, taip pat gali specifiškai ir transkripcijos būdu reguliuoti PKM2 ekspresiją. AKT aktyvinimas PTEN‐ suriebėjusios kepenys lemia, kad PPARγ prisijungia prie PPAR atsako elementų (PPRE) abiejų promotorių srityje. PKM ir heksokinazė-2 (HK2) geną ir prisideda prie kepenų steatozės, hipertrofijos ir hiperplazijos (Panasyuk ir kt., 2012). Šie rezultatai rodo, kad PI3K – AKT – mTOR kelio aktyvavimas kartu su kitais aktyvuotais signalizacijos moduliatoriais reguliuoja PKM2 ekspresiją tokiu būdu, kuris priklauso nuo signalizacijos konteksto ir yra specifinis audiniams. Reaguodama į epidermio augimo faktoriaus receptorių (EGFR) aktyvavimą, kuris pasireiškia daugeliui žmogaus vėžio tipų, PKM transkripciją reguliuoja signalizacijos kaskada, apimanti EGFR, fosfolipazę C γ1 (PLCγ1), proteinkinazę C ε (PKCε) ir NF‐κB. Suaktyvinus EGFR, suaktyvinamas PLCγ1, o vėliau gaminasi diacilglicerolis, o tai savo ruožtu suaktyvina PKCε, kurį vėliau monoubikvitiliuoja E3 ligazė RINCK1 (taip pat žinomas kaip TRIM41) prie K321, todėl jis gali sąveikauti su ubikvitiną surišančiu motiku. NF‐κB esminio moduliatoriaus (NEMO, taip pat žinomo kaip IKKγ) cinko piršto srityje. Ši sąveika įdarbina citozolinį IKB kinazės (IKK) kompleksą, kurį sudaro NEMO, IKKα ir IKKβ, į plazmos membraną, kur PKCε fosforilina IKKβ ties S177 ir aktyvuoja IKKβ. Aktyvuotas IKKβ fosforilina branduolinio faktoriaus κB (IκB) inhibitorių ir panaikina jo represinį poveikį RelA (NF-κB p65 subvienetui), todėl jis gali persikelti į branduolį, kur jis tiesiogiai jungiasi su PKM promotorius ir sustiprina PKM2 ekspresiją, todėl atsiranda Warburg efektas ir naviko atsiradimas (Yang ir kt., 2012a) (žr. plakatą).

PKM2 ekspresija taip pat gali būti reguliuojama transkribavimo lygiu PKM pre-mRNR splaisingo faktoriais. Heterogeniniai branduoliniai ribonukleoproteinai (hnRNP), įskaitant PTB (taip pat žinomus kaip hnRNP1), hnRNPA1 ir hnRNPA2, yra reguliuojami onkogeninio transkripcijos faktoriaus c‐Myc ir vėliau prisijungia prie susiliejimo signalų. PKM 9 egzoną, slopinantį 9 egzono įtraukimą ir taip skatinantį sustiprintą PKM2 izoformos ekspresiją (David ir kt., 2010 Sun ir kt., 2011).

miRNR, nekoduojančios RNR, kurios jungiasi prie specifinių tikslinių mRNR ir skatina jų skaidymą ir (arba) trukdo jų transliacijai, yra dar viena reguliavimo priemonė. PKM2 mRNR. Tiek miR‐133a, tiek miR‐133b nukreipti į PKM nuorašas, ir buvo nustatyta, kad šių miRNR labai sumažėja liežuvio plokščiųjų ląstelių karcinomos ląstelėse, todėl PKM2 ekspresija yra per didelė (Wong ir kt., 2008). miR‐122, kuris yra labai ekspresuojamas normaliame kepenų audinyje, sumažėja sergant kepenų ląstelių karcinoma ir yra tiesiogiai nukreiptas. PKM2 mRNR (Liu ir kt., 2014), o miR‐326 reguliuoja PKM2 ekspresija žmogaus gliomoje (Kefas ir kt., 2010), o tai rodo, kad skirtingos miRNR dalyvauja specifiniame PKM2 ekspresijos reguliavime. Be to, miR‐124, miR‐137 ir miR‐340 nukreiptos į mRNR, koduojančias sujungimo faktorius PTB, hnRNPA1 ir hnRNPA2. Todėl šios miRNR tarpininkauja keičiant ekspresiją PKM genas iš PKM2 izoformos į PKM1, dėl kurio sumažėja glikolizės greitis ir skatinamas gliukozės srautas į oksidacinį fosforilinimą, dėl to sutrinka vėžio ląstelių augimas (Sun ir kt., 2012).

Galiausiai, PKM2 baltymų lygis taip pat reguliuojamas potransliacinių modifikacijų lygiu. Pavyzdžiui, PKM2 acetilinimas prie K305 skatina jo skaidymą esant didelei gliukozės koncentracijai. Acetilintas PKM2 sąveikauja su karščio šoko baltymu HSC70 (taip pat žinomas kaip HSPA8), dėl kurio PKM2 skaidosi nuo lizosomų, veikiant chaperono sukeltai autofagijai (žr. plakatą). Atitinkamai, dėl acetilinimo imituojančio PKM2 K305Q mutanto, kuris skaidomas esant didelėms gliukozės koncentracijoms, ekspresija lemia glikolitinių tarpinių produktų kaupimąsi prieš PKM2 biosintezei, o tai skatina ląstelių proliferaciją ir naviko atsiradimą (Lv ir kt., 20111).

PKM2 fermentinio aktyvumo ir metabolinių funkcijų reguliavimas

PKM2 katalizuoja paskutinį glikolizės etapą, o jo aktyvumą galima reguliuoti glikolitiniais tarpiniais produktais. Fruktozė 1,6-bisfosfatas (FBP), alosterinis PKM2 aktyvatorius, jungiasi su PKM2 ir skatina jo tetramerizaciją. Tetramerinis PKM2 yra aktyvesnis nei dimerinis PKM2, o konversija tarp šių dviejų formų yra dinamiškai reguliuojama (Dombrauckas ir kt., 2005) (žr. plakatą). PKM2 prisijungimas prie fosforilinto tirozino atpalaiduoja FBP ir suardo tetramerinį PKM2 į PKM2 dimerį (Christofk ir kt., 2008b). Žmogaus PKM2 mutantai su heterozigotinėmis missense mutacijomis H391Y ir K422R, kurie buvo nustatyti Bloom sindromu sergančių pacientų ląstelėse, heterooligomerizuojasi su laukinio tipo PKM2 ir sumažina bendrą PKM2 aktyvumą, todėl padidėja glikolitinių tarpinių produktų ir NADPH kaupimasis, ląstelių proliferacija. , poliploidija ir naviko augimas (Gupta ir kt., 2010 Iqbal ir kt., 2014a Iqbal ir kt., 2014b). JMJD5, dioksigenazė, turinti Jumonji C domeną, sąveikauja su PKM2 sritimi tarpsubvienetų sąsajoje, o tai trukdo PKM2 tetramerizacijai ir blokuoja piruvatkinazės aktyvumą (Wang ir kt., 2014a). Nustatyta, kad sumažėjęs PKM2 piruvatkinazės aktyvumas lemia nuo PEP priklausomą histidino fosforilinimą ir fosfoglicerato mutazės (PGAM1) aktyvavimą, taip pat sumažėjusį nuo PEP priklausomos ATP gamybos lygį, šis metabolinis jungiklis gali suteikti alternatyvų glikolitinį kelią, kuris atskiria ATP. PEP tarpininkaujamas fosforo pernešimas, todėl didelis glikolizės greitis palaiko anabolinį metabolizmą (Vander Heiden ir kt., 2010b). Be to, pirminiuose pelių embrioniniuose fibroblastuose, kuriuose buvo pašalintas PKM2, PKM1 ekspresija yra sureguliuota ir pablogina nukleotidų gamybą bei ląstelių gebėjimą sintetinti DNR ir progresuoti ląstelių ciklą, o tai rodo, kad tinkamas PKM2 ekspresijos lygis yra svarbus normaliai ląstelių proliferacijai. Lunt ir kt., 2015).

Serinas yra dar vienas allosterinis PKM2 aktyvatorius (Chaneton ir kt., 2012) (žr. plakatą). Jis jungiasi ir aktyvuoja PKM2 panašiai kaip, bet nepriklauso nuo FBP. Kai serino yra daug, PKM2 yra visiškai aktyvus, todėl glikolizės metu galima maksimaliai panaudoti gliukozę. Tačiau kai serinas yra ribotas, PKM2 aktyvumas iš karto sumažinamas, todėl iš gliukozės gaunama anglis greitai nukreipiama į serino biosintezę ir taip kompensuojamas serino trūkumas (Chaneton ir kt., 2012). Sukcinil-5-aminoimidazolo-4-karboksamido-1-ribozės-5-fosfatas (SAICAR), tarpinis de novo purino nukleotidų sintezės kelias, taip pat reguliuoja PKM2 aktyvumą allosteriškai ir nepriklausomai nuo FBP. Ląstelių SAICAR koncentracija padidėja esant gliukozės badui, o tai stimuliuoja PKM2 aktyvumą, kad padidintų gliukozės ir glutamino suvartojimą, ir skatina vėžinių ląstelių išgyvenimą (Keller ir kt., 2012). Taigi, alosterinis PKM2 reguliavimas gali leisti vėžio ląstelėms koordinuoti skirtingus metabolizmo kelius, kad būtų palaikomas vėžio ląstelių augimas dažnai maistinių medžiagų ribotoje naviko mikroaplinkoje.

PKM2 aktyvumą taip pat galima reguliuoti potransliacinėmis modifikacijomis (žr. plakatą). Fibroblastų augimo faktoriaus 1 tipo receptorius (FGFR1) fosforilina PKM2 ties Y105, o tai sutrikdo FBP prisijungimą prie PKM2 (Hitosugi ir kt., 2009) (žr. plakatą). Šis fosforilinimas, skatinantis PKM2 tetramero virsmą dimeru, slopina jo piruvatkinazės aktyvumą ir padidina jo baltymų kinazės aktyvumą link STAT3 fosforilinimo (Gao ir kt., 2013). PKM2 Y105F mutanto ekspresija pablogina ląstelių proliferaciją ir naviko atsiradimą (Hitosugi ir kt., 2009). Be to, ūmus tarpląstelinės reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) koncentracijos padidėjimas, kurį sukelia H2O2, diamidas (tiolį oksiduojantis junginys) arba hipoksija slopina PKM2 aktyvumą oksiduodamas PKM2 C358, todėl gliukozės srautas nukreipiamas į pentozės fosfato kelią, kad būtų sumažintas ROS detoksikacijos ir naviko augimo potencialas (Anastasiou et al. , 2011). Taip pat buvo pranešta apie PKM2 aktyvumo sumažėjimą dėl ROS sukeltos PKM2 oksidacijos, reaguojant į insulino stimuliaciją (Iqbal ir kt., 2013).

PKM2 tarpląstelinės lokalizacijos reguliavimas

Kaip glikolitinis fermentas, PKM2 daugiausia lokalizuojasi citozolyje. Tačiau PKM2 persikelia į branduolį, kad skatintų ląstelių dauginimąsi (žr. plakatą). Mūsų grupė parodė esminį mechanizmą, kuriuo grindžiamas PKM2 branduolinis perkėlimas. Suaktyvinus EGFR, aktyvuota ekstraląstelinio signalo reguliuojama kinazė 1 ir 2 (ERK1/2) prisijungia prie srities, kurią koduoja PKM2 10 egzonas, per prijungimo griovelį ERK1/2, todėl PKM2 S37 fosforilinamas, bet ne. . Fosforilintas PKM2 tada įdarbina peptidil-prolilo cis-trans izomerazę NIMA sąveikaujančią 1 (PIN1), kuri specifiškai katalizuoja peptidinių ryšių tarp fosforilintų serino arba treonino liekanų ir prolino liekanų (L,20 ir4nter) cis-trans izomerizaciją. Ši PKM2 izomerizacija atskleidžia jo branduolinės lokalizacijos seką (NLS) ir skatina jos prisijungimą prie importino α5, o tai palengvina jo branduolinį perkėlimą (Yang ir kt., 2012c). Be to, PKM2 sumoilinimas, tarpininkaujantis SUMO-E3 ligazės PIAS3, ir PKM2 acetilinimas K433, tarpininkaujant p300 acetiltransferazei (taip pat žinomas kaip EP300), neleidžia FBP prisijungti prie PKM2 ir taip sustiprina jo branduolio translokaciją (Lv et al. , 2013 Spoden ir kt., 2009).


Biofilmai

Gamtoje mikroorganizmai daugiausia auga bioplėvelėse, sudėtingose ​​ir dinamiškose ekosistemose, kurios susidaro įvairiuose aplinkos paviršiuose – nuo ​​pramoninių kanalų ir vandens valymo vamzdynų iki uolienų upių vagose. Tačiau bioplėvelės neapsiriboja kieto paviršiaus substratais. Beveik bet koks paviršius skystoje aplinkoje, kuriame yra minimalių maistinių medžiagų, ilgainiui sukurs bioplėvelę. Pavyzdžiui, ant vandens plūduriuojantys mikrobiniai kilimėliai yra bioplėvelės, kuriose yra didelės fotosintetinių mikroorganizmų populiacijos. Žmogaus burnoje esančiose bioplėvelėse gali būti šimtai bakterijų rūšių. Nepriklausomai nuo aplinkos, kurioje jie atsiranda, bioplėvelės nėra atsitiktinės mikroorganizmų kolekcijos, o labai struktūrizuotos bendruomenės, kurios suteikia selektyvų pranašumą juos sudarančius mikroorganizmus.

Bioplėvelės struktūra

Stebėjimai naudojant konfokalinę mikroskopiją parodė, kad aplinkos sąlygos turi įtakos bendrai bioplėvelių struktūrai. Filamentinės bioplėvelės, vadinamos srovėmis, susidaro greitai tekančiame vandenyje, pvz., gėlo vandens srautuose, sūkuriuose ir specialiai sukurtose laboratorinėse srauto ląstelėse, kurios atkartoja augimo sąlygas greitai judančiame skysčiuose. Juostos yra pritvirtintos prie pagrindo “head”, o “uodega” plūduriuoja pasroviui srovėje. Nejudančiame arba lėtai judančiame vandenyje bioplėvelės dažniausiai įgauna į grybą panašią formą. Bioplėvelių struktūra taip pat gali keistis dėl kitų aplinkos sąlygų, tokių kaip maistinių medžiagų prieinamumas.

Išsamūs bioplėvelių stebėjimai konfokaliniu lazeriu ir skenuojančiais elektroniniais mikroskopais atskleidžia mikroorganizmų grupes, įterptas į matricą, įsiterpusią į atvirus vandens kanalus. Ekstraląstelinė matrica susideda iš ekstraląstelinių polimerinių medžiagų (EPS), kurias išskiria bioplėvelėje esantys organizmai. Tarpląstelinė matrica sudaro didelę bioplėvelės dalį, kuri sudaro 50–90% visos sausos masės. EPS savybės skiriasi priklausomai nuo organizmų ir aplinkos sąlygų.

EPS yra hidratuotas gelis, sudarytas daugiausia iš polisacharidų ir turintis kitų makromolekulių, tokių kaip baltymai, nukleino rūgštys ir lipidai. Ji atlieka pagrindinį vaidmenį išlaikant bioplėvelės vientisumą ir funkciją. EPS kanalai leidžia maistinėms medžiagoms, atliekoms ir dujoms judėti visoje bioplėvelėje. Tai palaiko ląstelių hidrataciją ir neleidžia išdžiūti. EPS taip pat apsaugo bioplėvelėje esančius organizmus nuo kitų mikrobų ar ląstelių (pvz., pirmuonių, baltųjų kraujo kūnelių žmogaus organizme) plėšrūnų.

Bioplėvelės susidarymas

Laisvai plūduriuojančios mikrobinės ląstelės, gyvenančios vandens aplinkoje, vadinamos planktoninėmis ląstelėmis. Bioplėvelės susidarymas iš esmės apima planktoninių ląstelių prijungimą prie substrato, kur jos tampa sėslios (prisijungiančios prie paviršiaus). Tai vyksta etapais, kaip parodyta 16 paveiksle. Pirmajame etape planktoninės ląstelės pritvirtinamos prie paviršiaus, padengto kondicionuojančia organinės medžiagos plėvele. Šiuo metu prisirišimas prie substrato yra grįžtamas, tačiau kadangi ląstelės išreiškia naujus fenotipus, kurie palengvina EPS susidarymą, jos pereina iš planktoninio į sėslų gyvenimo būdą. Bioplėvelė sukuria būdingas struktūras, įskaitant plačią matricą ir vandens kanalus. Priedai, tokie kaip fimbriae, pili ir flagellas, sąveikauja su EPS, o mikroskopija ir genetinė analizė rodo, kad tokios struktūros reikalingos brandžiai bioplėvelei sukurti. Paskutiniame bioplėvelės gyvavimo ciklo etape ląstelės, esančios bioplėvelės pakraštyje, grįžta prie planktoninio gyvenimo būdo, pašalindamos subrendusią bioplėvelę, kad kolonizuotų naujas vietas. Šis etapas vadinamas pasklidimu.

16 pav. Bioplėvelės susidarymo ir gyvavimo ciklo etapai. (kreditas: Viešosios mokslo bibliotekos ir Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo pakeitimas)

Bioplėvelėje skirtingų rūšių mikroorganizmai sukuria metabolinį bendradarbiavimą, kurio metu vieno organizmo atliekos tampa kito organizmo maistine medžiaga. Pavyzdžiui, aerobiniai mikroorganizmai suvartoja deguonį, sukurdami anaerobinius regionus, skatinančius anaerobų augimą. Tai pasireiškia daugeliu polimikrobinių infekcijų, kuriose dalyvauja ir aerobiniai, ir anaerobiniai patogenai.

Mechanizmas, kuriuo bioplėvelėje esančios ląstelės koordinuoja savo veiklą, reaguodamos į aplinkos dirgiklius, vadinamas kvorumo jutimu. Kvorumo jutimas, kuris gali atsirasti tarp skirtingų rūšių ląstelių bioplėvelėje, leidžia mikroorganizmams aptikti jų ląstelių tankį, atpalaiduojant ir surišant mažas difuzuojančias molekules, vadinamas autoinduktoriais. Kai ląstelių populiacija pasiekia kritinę ribą (kvorumą), šie autoinduktoriai inicijuoja reakcijų kaskadą, kuri suaktyvina genus, susijusius su ląstelių funkcijomis, kurios naudingos tik tada, kai populiacija pasiekia kritinį tankį. Pavyzdžiui, kai kuriuose patogenuose virulentiškumo faktorių sintezė prasideda tik tada, kai yra pakankamai ląstelių, kad būtų galima įveikti šeimininko imuninę apsaugą. Nors daugiausia tiriama bakterijų populiacijose, kvorumo jutimas vyksta tarp bakterijų ir eukariotų bei tarp eukariotinių ląstelių, tokių kaip grybelis. Candida albicans, dažnas žmogaus mikrobiotos narys, galintis sukelti infekcijas asmenims, kurių imunitetas nusilpęs.

17 pav. Trumpi peptidai gramteigiamose bakterijose ir N-acetilinti homoserino laktonai gramneigiamose bakterijose veikia kaip autoinduktoriai nustatant kvorumą ir tarpininkauja koordinuotam bakterijų ląstelių atsakui. N-acetilinto homoserino laktono R šoninė grandinė yra specifinė gramneigiamų bakterijų rūšims. Kai kuriuos išskiriamus homoserino laktonus atpažįsta daugiau nei viena rūšis.

Kvorumo jutimo signalinės molekulės priklauso dviem pagrindinėms klasėms. Gramneigiamos bakterijos bendrauja daugiausia naudodamos N-acilintus homoserino laktonus, o gramteigiamos bakterijos dažniausiai naudoja mažus peptidus (17 pav.). Visais atvejais pirmasis kvorumo nustatymo žingsnis susideda iš autoinduktoriaus prisijungimo prie specifinio receptoriaus tik tada, kai pasiekiama signalinių molekulių slenkstinė koncentracija. Kai prisijungia prie receptoriaus, signalizacijos įvykių kaskada lemia genų ekspresijos pokyčius. Dėl to suaktyvėja biologiniai atsakai, susiję su kvorumo nustatymu, ypač padidėja pačių signalinių molekulių gamyba, todėl terminas autoinduktorius.

Biofilmai ir žmogaus sveikata

Žmogaus kūne yra daug rūšių bioplėvelių, kai kurios naudingos, o kitos – kenksmingos. Pavyzdžiui, normalios mikrobiotos sluoksniai, išklojantys žarnyno ir kvėpavimo takų gleivinę, atlieka svarbų vaidmenį apsisaugodami nuo patogenų sukeliamų infekcijų. Tačiau kitos bioplėvelės organizme gali turėti neigiamos įtakos sveikatai. Pavyzdžiui, ant dantų susidarančios apnašos yra bioplėvelė, galinti prisidėti prie dantų ir periodonto ligų. Bioplėvelės taip pat gali susidaryti žaizdose, kartais sukeldamos rimtas infekcijas, kurios gali plisti. Bakterija Pseudomonas aeruginosa dažnai kolonizuoja bioplėveles pacientų, sergančių cistine fibroze, kvėpavimo takuose, sukeldamas lėtines ir kartais mirtinas plaučių infekcijas. Bioplėvelės taip pat gali susidaryti ant kūno ar ant kūno naudojamų medicinos prietaisų, sukeldamos infekcijas pacientams, turintiems kateterius, dirbtinius sąnarius ar kontaktinius lęšius.

Patogenai, įterpti į bioplėveles, pasižymi didesniu atsparumu antibiotikams nei jų laisvai plaukiojantys analogai. Buvo pasiūlyta keletas hipotezių, paaiškinančių kodėl. Giliuose bioplėvelės sluoksniuose esančios ląstelės yra metaboliškai neaktyvios ir gali būti mažiau jautrios antibiotikų, kurie sutrikdo medžiagų apykaitos veiklą, poveikiui. EPS taip pat gali sulėtinti antibiotikų ir antiseptikų sklaidą, neleisdamas jiems pasiekti ląstelių gilesniuose bioplėvelės sluoksniuose. Fenotipiniai pokyčiai taip pat gali prisidėti prie padidėjusio bakterijų ląstelių atsparumo bioplėvelėse. Pavyzdžiui, įrodyta, kad padidėjusi ištekėjimo siurblių, į membraną įterptų baltymų, kurie aktyviai išstumia antibiotikus iš bakterijų ląstelių, gamyba yra svarbus su bioplėvele susijusių bakterijų atsparumo antibiotikams mechanizmas. Galiausiai, bioplėvelės yra ideali aplinka keistis ekstrachromosomine DNR, kuri dažnai apima genus, suteikiančius atsparumą antibiotikams.

Pagalvok apie tai

  • Iš ko susideda bioplėvelės matrica?
  • Koks yra kvorumo nustatymo vaidmuo biofilme?

Pagrindinės sąvokos ir santrauka

  • Dauguma bakterijų ląstelių dalijasi dvejetainis dalijimasis. Kartos laikas bakterijų augime apibrėžiamas kaip padvigubėjimo laikas gyventojų.
  • Ląstelės uždaroje sistemoje auga pagal keturias fazes: atsilikimas, logaritminis (eksponentinis), stacionarus, ir mirtis.
  • Ląstelės gali būti suskaičiuotos pagal tiesioginis gyvybingų ląstelių skaičius. The supilti lėkštę ir paskleisti lėkštę dengimui naudojami metodai serijiniai skiedimai į agarą arba ant jo, kad būtų galima suskaičiuoti gyvybingas ląsteles, kurios sukelia kolonijas formuojančių vienetų. Membraninis filtravimas naudojamas gyvoms ląstelėms skaičiuoti praskiestuose tirpaluose. The labiausiai tikėtinas ląstelių skaičius (MPN) metodas leidžia įvertinti ląstelių skaičių kultūrose nenaudojant kietosios terpės.
  • Įvertinimui gali būti naudojami netiesioginiai metodai kultūros tankis matuojant drumstumas kultūrą arba gyvų ląstelių tankį, matuojant metabolinį aktyvumą.
  • Kiti ląstelių dalijimosi modeliai apima daugybinį nukleoidų susidarymą ląstelėse asimetrinio dalijimosi metu, kaip nurodyta pumpuriuojantis ir hifų bei galinių sporų susidarymas.
  • Biofilmai yra mikroorganizmų bendrijos, susipynusios į matricą ekstraląstelinė polimerinė medžiaga. Bioplėvelė susidaro tada, kai planktoninis ląstelės prisitvirtina prie substrato ir tampa sėdimas. Bioplėvelėse esančios ląstelės koordinuoja savo veiklą bendraudamos per kvorumo jutimas.
  • Bioplėvelės dažniausiai randamos ant paviršių gamtoje ir žmogaus kūne, kur jos gali būti naudingos arba sukelti sunkias infekcijas. Su bioplėvelėmis susiję patogenai dažnai yra atsparesni antibiotikams ir dezinfekavimo priemonėms.

Keli pasirinkimai

Kuris iš šių metodų būtų naudojamas bakterinio užterštumo koncentracijai apdorotame žemės riešutų svieste išmatuoti?

  1. drumstumo matavimas
  2. bendras plokštelių skaičius
  3. sauso svorio matavimas
  4. tiesioginis bakterijų skaičiavimas ant kalibruoto stiklelio po mikroskopu

Kurioje fazėje tikitės stebėti daugiausia endosporų a Bacila ląstelių kultūros?

  1. mirties fazė
  2. vėlavimo fazė
  3. log fazė
  4. log, lag ir mirties fazės turėtų maždaug tiek pat endosporų.

Kurioje fazėje penicilinas, antibiotikas, slopinantis ląstelių sienelių sintezę, būtų veiksmingiausias?

Kuris iš šių yra geriausias bakterijos generavimo laiko apibrėžimas?

  1. laikas, per kurį pasiekiama žurnalo fazė
  2. laiko, kurio reikia, kad ląstelių populiacija padvigubėtų
  3. laikas, reikalingas stacionariai fazei pasiekti
  4. eksponentinės fazės trukmė

Kokia yra Z žiedo funkcija dvejetainio dalijimosi metu?

  1. Jis kontroliuoja DNR replikaciją.
  2. Jis sudaro susitraukiantį žiedą pertvaroje.
  3. Jis atskiria naujai susintetintas DNR molekules.
  4. Jis skatina naujų peptidoglikano subvienetų pridėjimą.

Jei kultūra prasideda nuo 50 ląstelių, kiek ląstelių bus po penkių kartų be ląstelių mirties?

Siūlinės cianobakterijos dažnai dalijasi iš kurių iš šių dalykų?

Dėl kokios priežasties atsparumas antimikrobinėms medžiagoms yra didesnis bioplėvelėje nei laisvai plaukiojančiose bakterijų ląstelėse?

  1. EPS leidžia greičiau skleisti chemines medžiagas bioplėvelėje.
  2. Ląstelės yra metaboliškai aktyvesnės bioplėvelės pagrindu.
  3. Ląstelės yra metaboliškai neaktyvios bioplėvelės pagrindu.
  4. Bioplėvelės struktūra skatina antibiotikams atsparių ląstelių išlikimą.

Bakterijų ląstelės naudoja kvorumo nustatymą, kad nustatytų, kuri iš šių dalykų?

  1. gyventojų skaičiaus
  2. maistinių medžiagų prieinamumas
  3. vandens tekėjimo greitis
  4. gyventojų tankumo

Kuris iš šių teiginių apie autoinduktorius yra neteisingas?

  1. Jie tiesiogiai jungiasi su DNR, kad suaktyvintų transkripciją.
  2. Jie gali suaktyvinti ląstelę, kuri juos išskyrė.
  3. N-acilinti homoserino laktonai yra autoinduktoriai gramneigiamose ląstelėse.
  4. Autoinduktoriai gali skatinti virulentiškumo faktorių gamybą.

Užpildyti lapą

Tiesioginis visų ląstelių skaičius gali būti atliktas naudojant ________ arba ________.

________ metodas leidžia tiesiogiai suskaičiuoti visų ląstelių, augančių kietoje terpėje, skaičių.

Statistinį gyvų ląstelių skaičių skystyje paprastai įvertina ________.

Taikant šį netiesioginį kultūros augimo įvertinimo metodą, išmatuojate ________ naudodami spektrofotometrą.

Aktyvų kultūros augimą galima įvertinti netiesiogiai, matuojant šiuos ląstelių metabolizmo produktus: ________ arba ________.

Atitikimas

Suderinkite apibrėžimą su augimo fazės pavadinimu augimo kreivėje.

___Mirstančių ląstelių skaičius yra didesnis nei besidalijančių ląstelių skaičius A. Vėlavimo fazė
___Naujų ląstelių skaičius lygus mirštančių ląstelių skaičiui B. Rąsto fazė
___Sukeliami nauji fermentai, skirti naudoti turimas maistines medžiagas C. Stacionari fazė
___Dvejetainis dalijimasis vyksta maksimaliu greičiu D. Mirties fazė

  1. Mirties fazėje mirštančių ląstelių skaičius yra didesnis nei besidalijančių ląstelių skaičius. (D)
  2. Stacionarioje fazėje naujų ląstelių skaičius lygus mirštančių ląstelių skaičiui. (C)
  3. Vėlavimo fazėje indukuojami nauji fermentai, skirti naudoti turimas maistines medžiagas. (A)
  4. Log fazėje dvejetainis dalijimasis vyksta didžiausiu greičiu. (B)

Pagalvok apie tai

  1. Kodėl, matuojant bakterijų kultūrų drumstumą, svarbu išmatuoti šviesos pralaidumą per kontrolinį vamzdelį, kuriame yra tik sultinio?
  2. Kalbant apie ląstelių skaičiavimą, ką galima pasiekti naudojant dengimo metodą, ko nepadaro elektroninis ląstelių skaičiavimo metodas?
  3. Užsakykite šiuos bioplėvelės kūrimo etapus nuo ankstyviausio iki paskutinio.
    1. EPS sekrecija
    2. apverčiamas tvirtinimas
    3. išsklaidymas
    4. vandens kanalų susidarymas
    5. negrįžtamas prisirišimas

    Kritinis mąstymas

    Ligoninėje pacientui įkišamas intraveninis kateteris, leidžiantis tiekti vaistus, skysčius ir elektrolitus. Praėjus keturioms dienoms po kateterio įvedimo, pacientas pradeda karščiuoti ir odoje aplink kateterį atsiranda infekcija. Kraujo pasėliai atskleidžia, kad pacientas serga per kraują plintančia infekcija. Klinikinėje laboratorijoje atlikti tyrimai nustato per kraują plintantį patogeną kaip Staphylococcus epidermidis, o atliekami jautrumo antibiotikams tyrimai, kad gydytojai gautų esminę informaciją renkantis geriausią vaistą infekcijai gydyti. Antibakterinė chemoterapija pradedama ir atliekama per intraveninį kateterį, kuris iš pradžių buvo įvestas į pacientą. Per 7 dienas odos infekcija išnyksta, kraujo pasėliai neigiami S. epidermidiso antibakterinė chemoterapija nutraukiama. Tačiau praėjus 2 dienoms po antibakterinės chemoterapijos nutraukimo, pacientui pasireiškia dar vienas karščiavimas ir odos infekcija, o kraujo pasėliai yra teigiami dėl tos pačios padermės. S. epidermidis kuris buvo izoliuotas praėjusią savaitę. Šį kartą gydytojai pašalina intraveninį kateterį ir skiria geriamųjų antibiotikų, kurie sėkmingai gydo tiek odos, tiek per kraują plintančią infekciją, kurią sukelia S. epidermidis. Be to, nutraukus geriamąją antibakterinę chemoterapiją, infekcija neatsinaujina. Kokios galimos priežastys, kodėl intraveninė chemoterapija nepadėjo visiškai išgydyti paciento, nepaisant laboratorinių tyrimų, rodančių, kad bakterijų padermė buvo jautri paskirtam antibiotikui? Kodėl antrasis antibiotikų terapijos etapas galėjo būti sėkmingesnis? Pagrįskite savo atsakymus.


    Tarp mirties ir išgyvenimo: retinoinė rūgštis reguliuojant apoptozę

    Vitamino A metabolitas visasvert-retinoinė rūgštis (RA) reguliuoja daugybę biologinių procesų dėl savo gebėjimo reguliuoti genų ekspresiją. Taigi jis atlieka svarbų vaidmenį embriono vystymesi ir dalyvauja reguliuojant suaugusiųjų audinių augimą, remodeliavimą ir metabolinius atsakus. RA taip pat gali slopinti karcinomos ląstelių augimą ir šiuo metu naudojamas kai kurioms vėžio formoms gydyti. RA augimo slopinimą gali sukelti diferenciacijos indukcija, ląstelių ciklo sustabdymas arba apoptozė, arba šių veiklų derinys.Paradoksalu, bet kai kurių ląstelių kontekste RA ne tik neslopina augimo, bet ir padidina proliferaciją ir išgyvenimą. Šioje apžvalgoje pagrindinis dėmesys skiriamas RA dalyvavimui reguliuojant apoptotinius atsakus. Jame pateikiamos trumpos RA transkripcijos signalizacijos ir apoptotinių kelių apžvalgos, o tada pateikiama informacija apie mechanizmus, kuriais RA sukelia apoptozę arba, priešingai, slopina ląstelių mirtį ir padidina išgyvenimą.