Informacija

Kaip įterpti cas9 į gyvūnų ląsteles?

Kaip įterpti cas9 į gyvūnų ląsteles?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kaip mokslininkai, norintys redaguoti genomą, galėtų cas9 įterpti į ląsteles? Įsivaizduoju, kad inžinerinėms bakterijų sistemoms galite tiesiog įdėti į cas9 koduojančią sritį ekspresijos vektoriuje, bet ar taip daroma ir eukariotų ląstelėms?


Jei kalbate apie Cas9 nukleazės funkcionalumą, tai jūs neįtraukiate Cas9 geno į genomą, o transfekuojate jį plazmidėje. Paprastai ląstelėms atliekama tam tikra pralaidumo forma, arba konstrukcija įterpiama į virusinį vektorių, siekiant transfekuoti ląsteles audinių kultūroje. Daugialąsčiams gyvūnams reikės naudoti viruso vektoriaus kelią, kaip tai reikėtų daryti naudojant bet kurią genų terapijos metodiką. Addgene yra ne pelno siekianti plazmidžių saugykla, kurioje yra daug sukurtų CRISPR/Cas9 konstrukcijų, o jų svetainėje yra puikus šaltinis.

Tikrai nenorėtumėte, kad Cas9 būtų aktyvus ląstelėje po to, kai jis atliks savo darbą, nes padidinate netikslinių pataikymų tikimybę. Taikinys vis tiek neturėtų būti genome, jei įvyko nukreipimo įvykis, nes jūs arba pakeitėte kitą DNR dalį, arba supjaustėte DNR, o DNR atkūrimo mechanizmai įvedė atsitiktinius nukleotidus, kad atitaisytų dvigrandę trūkį.

Eukariotinės ląstelės dažniausiai negali išlaikyti plazmidžių. Cas9 genas bus transkribuotas kartu su orientacine RNR. Gautas baltymo/RNR kompleksas nukreipia į dominančią seką ir padaro pjūvį. Kai ląstelė replikuojasi, plazmidė greičiausiai bus prarasta, tačiau dukterinės ląstelės paveldės genominį redagavimą, kurį atliko nukreipimo įvykis.

Jei norite įterpti kitą geną į tikslinę vietą, tarkime, reporteris, į genomą, tada kartu transfekuosite linijinę DNR dalį su homologinėmis rankomis aplink pjūvio vietą, kad donoras būtų įterptas atliekant homologinio pertrūkio taisymą.

Viena iš sukurtų Cas9 konstrukcijų išjungė nukleazės aktyvumą, todėl Cas9/RNR kompleksas veikia kaip surišantis baltymas, slopinantis aktyvumą, kurį norite ištirti, iš tikrųjų neištrinant ar nepakeičiant geno. Tokiu atveju galite įterpti Cas9 kasetę, tokiu atveju naudotumėte rekombinacijos įvykį, kaip ir bet kokio kito tipo įtraukimo į genomą atveju.


Kaip veikia CRISPR Cas9?

Jis gali būti naudojamas genetinėms sekoms įterpti į pasirinktą lokusą. Norėdami suprasti, kaip iš tikrųjų reikia suprasti taikymą į genus pagal homologinę rekombinaciją, ir kad tai suprastumėte, turite suprasti homologinę rekombinaciją. Internete galite rasti medžiagos, kurioje tai išsamiau aprašyta, bet pabandysiu paaiškinti kuo paprasčiau.

DNR pažeidimas yra gana blogas ląstelėms, ypač dvigubos grandinės pertraukos (DSB), kai suskaidomos abi dvigubos spiralės grandinės. Taigi ląstelėms tikrai reikia juos taisyti, ir iš tikrųjų yra du mechanizmai, kaip tai padaryti:

a) Nehomologinis galų sujungimas – kai jie tiesiog paima du sulaužytus bitus ir juos sujungia – tai nėra tikslus ir dažnai gali sukelti įterpimus / ištrynimus su galima kadrų poslinkio mutacija.

b) Homologinė rekombinantija – tai yra tada, kai ląstelė naudoja homologinę chromosomą kaip šabloną DSB fiksuoti. Išsami informacija apie tai, kaip ji veikia, nėra svarbi, bet tiesiog supraskite, kad ląstelė ieško homologinių sekų prieš ir pasroviui nuo DSB (atitinkamai 5' ir 3' homologinės rankos) ir sutampa su homologinėmis grupėmis DNR šablone ir kopijose. viskas tarp jų, kad užpildytų spragą ir pataisytų DSB.

Tai reiškia, kad mes galime išnaudoti šią sistemą, kad įterptume genus, tiesiog įdėdami netikrą DNR šabloną, kad sulaužyta DNR būtų naudojama kaip taisymo kopija. Viskas, ko mums reikia, yra 5' ir 3' homologinės rankos, bet tarp jų yra bet koks genas, kurio norime. Tai žinoma kaip genų taikymas:

Jei turite atrankos žymenį (pvz., atsparumą antibiotikams), galime atrinkti ląsteles, kurios toje vietoje paėmė geną. Tačiau iš tikrųjų tokia sistema, kokia ji yra, remiasi laukimu, kol DSB atsiras atsitiktinai.

Čia atsiranda CRISPR/Cas9 sistema. Kaip jūs sakote, iš esmės tai yra programuojama molekulinių žirklių pora, kuri gali sukurti DSB bet kur. Tai paprasčiausiai daroma sukuriant kreipiamąją RNR, kuri papildo vietą, kurioje norite atlikti pjūvį. Taigi apskritai, jei suleisite orientacinę RNR su fermentu cas9, gausite DSB ten, kur norite. Taip pat turite sušvirkšti homologinį rekombinacijos taisymo šabloną su homologinėmis rankomis, kad įterptumėte į jūsų geną, kai DSB bando pasitaisyti.


Beje, CRISPR/Cas9 sistemą taip pat galite naudoti išmušimo režimu, o ne genų įterpimo režimu. Čia atliekate tuos pačius veiksmus, bet neturite taisymo šablono. Vietoj to norite, kad taisymas vyktų nehomologiškai sujungus galus, kad būtų sukurtos indel, taigi ir kadrų poslinkio mutacijos. Tai sukurs priešlaikinį sustabdymo kodoną ir mRNR produktas bus suskaidytas, todėl jūs išmušate tą geną.


CRISPR-Cas9 geno redagavimas: patikrinkite tris kartus, iškirpkite vieną kartą

Bajeso spalvų žemėlapis, vaizduojantis Cas9 dalelių judėjimą skirtinguose žinduolių ląstelių branduolio regionuose. Raudona/oranžinė reiškia greitesnį judėjimą, o mėlyna – lėtesnį judėjimą. Cas9 judėjimas paprastai yra labiau apribotas nutildytuose / mažai išreikštuose genomo regionuose, žinomuose kaip heterochromatinas. Kreditas: UC Berkeley / HHMI

Du nauji Kalifornijos universiteto Berklyje tyrimai turėtų suteikti mokslininkams, kurie naudoja CRISPR-Cas9 genomo inžinerijai, daugiau pasitikėjimo, kad jie netyčia neredaguos netinkamos DNR.

UC Berkeley biochemikė Jennifer Doudna ir jos kolegė iš Europos Emmanuelle Charpentier sukūrė genų redagavimo metodą, kuris mokslininkų ir klinikų bendruomenes sukrėtė kaip lengvą ir pigų būdą atlikti tikslius DNR pakeitimus, siekiant išjungti genus, koreguoti genetinius sutrikimus ar įterpti mutavusius genus į gyvūnus, kad būtų sukurti žmonių ligų modeliai.

Dvi naujos Doudnos laboratorijos ir UC Berkeley kolegos Roberto Tjiano ataskaitos daug išsamiau parodo, kaip Cas9 baltymas ląstelėje ieško milijardų bazinių porų, kad surastų tinkamą DNR seką ir kaip Cas9 nustato, ar jungtis, ar surišti. ir supjaustyti, taip inicijuodami genų redagavimą. Remiantis šiais eksperimentais, atrodo, kad Cas9 turi mažiausiai tris būdus, kaip patikrinti, ar ji randa tinkamą tikslinę DNR, prieš imdamasi neatšaukiamo žingsnio pjūviui.

„CRISPR-Cas9 išsivystė taip, kad būtų galima tiksliai nustatyti DNR, ir dabar mes suprantame jo paieškos ir skilimo veiklos molekulinį pagrindą, o tai padeda apriboti netikslinį DNR redagavimą“, - sakė Doudna, Howardo Hugheso medicinos instituto tyrėjas iš Berklio universiteto ir Berklio universiteto. molekulinės ir ląstelių biologijos bei chemijos profesorius. Tjian yra Howardo Hugheso medicinos instituto prezidentas ir UC Berkeley molekulinės ir ląstelių biologijos profesorius.

Tyrimai taip pat iliustruoja, kaip gerai CRISPR/Cas9 veikia žmogaus ir gyvūnų ląstelėse – eukariotuose – nors „šią techniką išrado bakterijos, kad apsisaugotų nuo gripo“, – sakė Doudna.

CRISPR-Cas9 yra baltymų ir RNR – DNR pusbrolio – hibridas, kuris veikia kaip efektyvi bakterijų paieškos ir karpymo sistema. Jis atsirado kaip būdas atpažinti ir sunaikinti virusus, tačiau Doudna ir Charpentier suprato, kad jis taip pat gali gerai veikti kitose ląstelėse, įskaitant žmones, kad palengvintų genomo redagavimą. Cas9 baltymas, gautas iš Streptococcus pyogenes bakterijų, veikia kartu su "kreipiančiąja" RNR, kuri nukreipta į papildomą 20 nukleotidų DNR atkarpą. Kai RNR nustato seką, atitinkančią šiuos nukleotidus, Cas9 supjausto dvigrandę DNR spiralę.

Vienas tyrimas, paskelbtas lapkričio 13 d Mokslas, sekė Cas9-RNR molekules per žinduolių ląstelių branduolį, nes jos greitai ieškojo visame genome, kad surastų ir susietų tik tą sritį, į kurią buvo nukreipta, o ne kitą.

Cas9 fermentas turi lankstytis ir lenktis, kad prisijungtų prie kreipiančiosios RNR (oranžinės spalvos). Kai Cas9-RNR kompleksas suras savo tikslinę DNR (raudoną), Cas9 (geltona) pjovimo sritis pasisuks į vietą, palyginti su jo draugu (mėlyna), tik tada, kai RNR ir DNR tinkamai sutaps. Tik tada fermentas supjausto dvigrandę DNR. Šiuos išsamius judesius atskleidė fluorescencijos eksperimentai, aprašyti a Gamta popierius iš Doudna laboratorijos. Kreditas: Samas Sternbergas / UC Berkeley

„Beprotiška, kad Cas9 kompleksas sugeba nuskaityti didžiulę eukariotų genomų erdvę“, – sakė magistrantas Spenceris Knightas, pirmasis knygos autorius. Mokslas popierius.

Ankstesni tyrimai parodė, kad yra daug panašiai atrodančių DNR regionų, kuriuos Cas9 gali susieti ir supjaustyti, o tai gali apriboti jo naudingumą, jei svarbu tikslumas. Šie netiksliniai regionai gali turėti tik keturis ar penkis nukleotidus su 20 nukleotidų pradmeniu, tiek, kiek užtenka Cas9 atpažinti.

„Cas9 suriša daug ne pagal tikslą, tačiau mes nustatėme, kad šios sąveikos yra labai trumpos – nuo ​​milisekundžių iki sekundžių – prieš Cas9 pajudant“, – sakė jis.

Kadangi šie tiriamieji ryšiai – galbūt net 300 000 jų – dažnai yra labai trumpalaikiai, keli tūkstančiai CRISPR-Cas9 kompleksų gali apžiūrėti visą genomą, kad surastų vieną tikslinę DNR atkarpą. Cas9 taip pat turi atpažinti trumpą trijų bazių porų DNR seką iškart po pradmenų sekos, pavadintos PAM, kuri žmogaus genome pasitaiko apie 300 milijonų kartų.

„Jei Cas9 jungtųsi dešimtis sekundžių ar minučių kiekvienoje vietoje, kuri nėra tikslinė, ji niekada, niekada negalėtų rasti taikinio ir laiku nupjauti“, – sakė Knightas.

Cas9 paskutinis patikros punktas

Kitas tyrimas, paskelbtas internete spalio 28 d Gamta, parodė, kad kai Cas9 prisijungia prie DNR srities, ji atlieka dar vieną patikrinimą, kol susijungia dvi tolimos Cas9 baltymų komplekso dalys, kaip žirklių ašmenys, kad tiksliai sulygiuotų aktyviąsias vietas, perpjaunančias dvigrandę DNR.

"Mes nustatėme, kad RNR valdomas Cas9 gali labai stipriai surišti kai kurias netikslines DNR sekas, kurios nuo teisingo taikinio skiriasi tik keliomis mutacijomis. Tačiau stebėtina, kad Cas9 sritis, kuri atlieka pjovimą, yra slopinama dėl netobulumo. Tačiau kai randama teisingai atitinkanti DNR, Cas9 patiria didelį struktūrinį pokytį, kuris atpalaiduoja šį slopinimą ir sukelia DNR pjūvį“, – sakė pirmasis autorius Samuelis Sternbergas, neseniai gavęs daktaro laipsnį. UC Berkeley. Jis galėjo stebėti šiuos pokyčius naudodamas fluorescenciniu būdu pažymėtą Cas9 komplekso versiją.

„Manome, kad šis struktūrinis pokytis yra paskutinis DNR nukreipimo reakcijos kontrolinis taškas arba korektūros etapas“, – sakė jis. "Pirma, Cas9 atpažįsta trumpą DNR segmentą, esantį šalia taikinio - PAM, tada tikslinė DNR suderinama su vadovaujančia RNR per Watson-Crick bazių poravimą. Galiausiai, kai nustatoma tobula atitiktis, paskutinė baltymai svyruoja į vietą, kad būtų galima pjaustyti ir pradėti genomo redagavimą.

Mažesnis Cas9 baltymas iš skirtingų bakterijų rūšių, Staphylococcus aureus, greičiausiai naudoja tą pačią strategiją, kad pagerintų DNR nukreipimo tikslumą, o tai rodo, kad „ši svarbi savybė buvo išsaugota per visą evoliucijos laiką“, - pridūrė jis.

„Tai gera žinia, nes leidžia manyti, kad turite daugiau nei vieną patikros tašką, kad užtikrintumėte teisingą Cas9 surišimą“, - sakė Knight. „Yra ne tik sekos reguliavimas, bet ir laikinasis reguliavimas: jis turi susijungti su DNR ir stovėti pakankamai ilgai, kad galėtų iš tikrųjų pertvarkyti ir iškirpti.

Doudna, Tjian ir jų komandų atradimai atskleidė netikslinių efektų molekulinį pagrindą genomo redagavimo programų metu ir gali padėti ateityje kurti tikslesnius Cas9 variantus.


CRISPR/Cas9: BIOLOGIJA, VEIKSMŲ MECHANIZMAS IR IŠŠŪKIAI

CRISPR/Cas9 technika ne tik parodė didžiulį mokslinių tyrimų augimą, bet ir atkreipė daug dėmesio kaip perspektyvi vėžio, genetinių sutrikimų ir ligas sukeliančių bakterijų genų redagavimo priemonė. Iš 13 469 straipsnių, kuriuose žodis “CRISPR” rodomas kaip geriausias atitikmuo, maždaug 5665 straipsniai buvo paskelbti PubMed nuo 2018 m. iki dabar.

Ar jus domina rašyti straipsnį? Susisiekite su mumis adresu biochemadda [@] gmail.com arba spustelėkite pateikti straipsnį daugiau detalių.

Plečiantis CRISPR/Cas technologijos laukas pranoko kitus genų redagavimo įrankius dėl savo paprastumo ir mažos kainos.

CRISPR yra sutrumpinta pavadinimo „Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“ forma. CRISPR susijęs baltymas yra sutrumpintas kaip Cas baltymas. Todėl ši technika trumpai pavadinta CRISPR/Cas technologija.

CRISPR/Cas sistemos natūraliai atsiranda bakterijose ir archėjose (prokariotuose), kad įgytų imunitetą virusinėms infekcijoms ir plazmidėms. Vėliau mokslininkai pradėjo taikyti šią sistemą prokariotų ir eukariotų genams redaguoti.

Pirmąjį CRISPR/Cas sistemos požymį 1987 m. atrado Japonijos tyrimų grupė. Jie nustatė trumpų pasikartojančių sekų modelį, susimaišiusį su trumpais, nesikartojančiais „tarpikliais“. Escherichia coli genomo. 2012 m. du mokslininkai (Doudna ir Charpentier) užprogramavo CRISPR/Cas9 sistemą, kad suskaldytų specifines DNR sekas. Dėl to CRISPR / Cas9 atsirado kaip perspektyvus genų redagavimo įrankis.

CRISPR/Cas sistemą galima suskirstyti į dvi klases: Class1 ir Class2. 1 klasės CRISPR/Cas sistemose naudojamas kelių Cas baltymų kompleksas, o 2 klasės CRISPR/Cas sistemose – vienas Cas baltymas. Kitos dvi klasės yra suskirstytos į šešis tipus pagal specifinių parašo genų buvimą.

Plačiai naudojama CRISPR/Cas9 technika priklauso 2 klasės II tipo CRISPR/Cas sistemai. CRISPR/Cas9 sistema natūraliai atsiranda Streptococcus pyogenes bakterija kaip prisitaikanti imuninė sistema, suardanti virusą ir plazmidę, įsiveržiančią į bakterijas. Šioje sistemoje trumpa svetimos DNR (viruso arba plazmidės) seka yra integruota į bakterijos genomą, kad būtų sukurta „tapatybė“, kad būtų galima atpažinti panašias invazijas prieš jų infekciją ateityje. Panašiam virusui įsiveržus, bakterijos koduoja „tapatybės“ komplementarią ribonukleino rūgšties grandinę (RNR), kuri gali prisijungti prie komplementarios viruso DNR sekos ir ją suskaldyti.

CRISPR/Cas9 sistemą sudaro trys komponentai: crRNR (CRISPR RNR), tracrRNA (transaktyvuojanti CRISPR RNR) ir Cas9 baltymas. Šis Cas9 baltymas rodo helikazės aktyvumą (išvynioja DNR dvigubą grandinę), taip pat nukleazės aktyvumą (atskiria DNR grandinę). Bakterinėje CRISPR/Cas9 sistemoje vadovauja RNR (gRNAà crRNA). + tracrRNA) nukreipia Cas9 baltymą, kuris veikia kaip DNR endonukleazės fermentas, kad suskaldytų viruso DNR grandines.

1 pav. CRISPR/Cas sistemos klasifikacija

Vietoj dviejų atskirų RNR molekulių tyrėjai susintetino vieną RNR molekulę (sgRNR – vieno vadovo RNR), kuri gali būti naudojama kaip panaši į crRNR+tracrRNR molekulę. Tai supaprastino trijų komponentų CRISPR/Cas9 sistemą iki dviejų komponentų sistemos (sgRNR). +Cas9).

VEIKSMO MECHANIZMAS

CRISPR/Cas9 sistemos gynybos mechanizmą bakterijose galima suskirstyti į tris fazes:

Kiekviena fazė aprašyta žemiau su diagrama.

Po virusinės infekcijos cas operonas gamina (transkripcija ir transliacija) cas1-cas2 baltymų kompleksą, kuris gali identifikuoti virusinės DNR protospacer/spacer seką ("tapatybę") ir integruoti ją į CRISPR masyvą, kurį riboja pasikartojančios sekos.

Vėliau tracr genas ir CRISPR masyvo transkribuoja (konvertuoja geną į atitinkamą RNR molekulę) tracrRNR ir pre-crRNR atitinkamai, tuo tarpu cas9 genas transkribuoja ir paverčia (RNR molekulę paverčia atitinkamu baltymu) į cas9 baltymą.

2 pav. CRISPR/Cas9 sistemos tarpiklio įsigijimas

TracrRNR susijungia su išankstiniu crRNR kartojimu. Tada tracrRNR: pre-crRNR dupleksas prisijungia prie cas9 baltymo. Be to, kompleksas įdarbina fermentą RNaze III, kuris pakartojimo metu suskaido pre-crRNR. Galiausiai, nežinoma nukleazė apkarpo 5 'pakartotinai gautą crRNR dalį, palikdama 20 nukleotidų ilgio tarpiklio seką paskutinei fazei. Tai sudaro galutinį CRISPR / Cas9 kompleksą trukdžiams.

3 pav. CRISPR/Cas9 sistemos crRNR apdorojimas

Efektoriaus komplekso Cas9 identifikuoja tikslinę DNR seką per PAM (Protospacer Adjacent Motif) atpažinimą, kuris yra netikslinėje DNR grandinėje (PAM seka, kurią atpažino Streptococcus pyogenes yra 5’NGG 3′). 20 nukleotidų ilgio subrendusios crRNR tarpinė seka prisijungia prie viruso DNR tikslinės DNR grandinės. Tai leidžia cas9 baltymui suaktyvinti du savo nukleazės domenus – HNH ir RuvC. Šie du domenai HNH ir RuvC suskaldo atitinkamai viruso tikslinę DNR grandinę ir netikslinę DNR grandinę, sukurdami bukas, dvigubos grandinės pertrauką, 3 bazių porų priekyje PAM. Tai veda prie viruso genomo sunaikinimo.

4 pav. CRISPR/Cas9 sistemos trikdžiai

Bakterijos naudoja CRISPR/Cas9 sistemą, kad apsaugotų jas nuo invazijų. Nepaisant to, tą pačią sistemą galima panaudoti žinduolių, įskaitant žmones, genomui redaguoti. Skirtingai nuo bakterijų, jis sukelia DNR dvigubų grandinių pertraukas, kurios vėliau yra atstatomos nehomologiniu galų sujungimu arba žinduolių ląstelėse nukreiptu homologiniu taisymo mechanizmu. Tai sulaukė didelio mokslo bendruomenės dėmesio, kad būtų galima panaudoti šią moderniausią techniką, skirtą išnaikinti žmonių ligas, tokias kaip genetiniai kraujo sutrikimai, neurodegeneracinės ligos ir vėžys. Remiantis ClinicalTrials.gov duomenų baze, iki šiol buvo įdarbinti keli klinikiniai tyrimai, skirti naudoti CRISPR/Cas9 metodą vėžiui ir beta talasemijai gydyti.

IŠŠŪKIAI

Nors CRISPR/Cas9 sistema turi didžiulį pažadą gydyti žmonių ligas, ji susiduria su techniniais iššūkiais.

CRISPR/Cas9 sistema natūraliai atsiranda Streptococcus pyogene žmogaus sveikatai kenksminga bakterija. Kai jis patenka į žmogaus ląsteles, žmogaus kūnas gali sukurti imunogeniškumą (sukurti imuninį atsaką žmogaus organizme), dėl kurio CRISPR/Cas9 sistema organizme sugenda.

Tyrėjai dažnai naudoja su Adeno susijusius viruso vektorius (AAV), kad pristatytų CRISPR / Cas sistemą in vivo. Kadangi Cas9 baltymas yra didelio dydžio, pakavimas į AAV vektorių yra tikras iššūkis. Todėl mokslininkai turėtų atrasti alternatyvius vektorius, kurių imunogeniškumas yra mažas, arba mažesnio dydžio cas9 variantus.

Dar viena problema yra ta, kad CRISPR / Cas9 sistema sukelia netikslinius efektus, pjaunant netinkamą DNR dalį. Todėl norint išvengti šios kliūties, praktiška atrasti cas9 variantus, kurie turi platų PAM suderinamumą ir didelį DNR specifiškumą.

Be to, ši galinga technika turėtų būti naudojama atsakingai ir atsargiai ne tik siekiant naudos visai žmonijai, bet ir siekiant išvengti netinkamo elgesio, kuris gali sukelti rimtų etinių problemų žmonių visuomenėje.


CRISPR-Cas9 geno redagavimas: patikrinkite tris kartus, iškirpkite vieną kartą

Du nauji UC Berkeley tyrimai turėtų suteikti mokslininkams, kurie naudoja CRISPR-Cas9 genomo inžinerijai, daugiau pasitikėjimo, kad jie netyčia neredaguos neteisingos DNR.

Genų redagavimo technika, kurią sukūrė UC Berkeley biochemikė Jennifer Doudna ir jos kolegė Emmanuelle Charpentier, Maxo Plancko infekcijų biologijos instituto Berlyne direktorė, sukrėtė mokslinius tyrimus ir klinikines bendruomenes kaip lengvą ir pigų būdą atlikti tikslius pakeitimus. DNR, siekiant išjungti genus, ištaisyti genetinius sutrikimus arba įterpti mutavusius genus į gyvūnus, kad būtų sukurti žmonių ligų modeliai.

Dvi naujos Doudnos laboratorijos ir UC Berkeley kolegos Roberto Tjiano ataskaitos daug išsamiau parodo, kaip Cas9 baltymas ląstelėje ieško milijardų bazinių porų, kad surastų tinkamą DNR seką ir kaip Cas9 nustato, ar jungtis, ar surišti. ir supjaustyti, taip inicijuodami genų redagavimą. Remiantis šiais eksperimentais, atrodo, kad Cas9 turi mažiausiai tris būdus, kaip patikrinti, ar ji randa tinkamą tikslinę DNR, prieš imdamasi neatšaukiamo žingsnio pjūviui.

„CRISPR-Cas9 išsivystė taip, kad būtų galima tiksliai nustatyti DNR, ir dabar suprantame jo paieškos ir skilimo veiklos molekulinį pagrindą, o tai padeda apriboti netikslinį DNR redagavimą“, – sakė Doudna, Howardo Hugheso medicinos instituto tyrėjas iš Berklio universiteto ir Berklio universiteto. molekulinės ir ląstelių biologijos bei chemijos profesorius. Tjian yra Howardo Hugheso medicinos instituto prezidentas ir UC Berkeley molekulinės ir ląstelių biologijos profesorius.

Tyrimai taip pat iliustruoja, kaip gerai CRISPR/Cas9 veikia žmogaus ir gyvūnų ląstelėse – eukariotuose – nors „techniką išrado bakterijos, kad apsisaugotų nuo gripo“, – sakė Doudna.

CRISPR-Cas9 yra baltymų ir RNR – DNR pusbrolio – hibridas, kuris veikia kaip efektyvi bakterijų paieškos ir karpymo sistema. Jis atsirado kaip būdas atpažinti ir sunaikinti virusus, tačiau Doudna ir Charpentier suprato, kad jis taip pat gali gerai veikti kitose ląstelėse, įskaitant žmones, kad palengvintų genomo redagavimą. Cas9 baltymas, gaunamas iš bakterijų Streptococcus pyogenes, veikia kartu su „kreipiančiąja“ RNR, kuri nukreipta į papildomą 20 nukleotidų DNR ruožą. Kai RNR nustato seką, atitinkančią šiuos nukleotidus, Cas9 supjausto dvigrandę DNR spiralę.

Vienas tyrimas, paskelbtas lapkričio 13 d Mokslas, sekė Cas9-RNR molekules per žinduolių ląstelių branduolį, nes jos greitai ieškojo visame genome, kad surastų ir susietų tik tą sritį, į kurią buvo nukreipta, o ne kitą.

„Beprotiška, kad Cas9 kompleksui pavyksta nuskaityti didžiulę eukariotų genomų erdvę“, – sakė magistrantas Spenceris Knightas, pirmasis knygos autorius. Mokslas popierius.

Ankstesni tyrimai parodė, kad yra daug panašiai atrodančių DNR regionų, kuriuos Cas9 gali susieti ir supjaustyti, o tai gali apriboti jo naudingumą, jei svarbu tikslumas. Šie netiksliniai regionai gali turėti tik keturis ar penkis nukleotidus su 20 nukleotidų pradmeniu, tiek, kiek užtenka Cas9 atpažinti.

„Cas9 suriša daug ne pagal tikslą, tačiau mes nustatėme, kad šios sąveikos yra labai trumpos – nuo ​​milisekundžių iki sekundžių – prieš Cas9 judant“, – sakė jis.

Kadangi šie tiriamieji ryšiai – galbūt net 300 000 iš jų – dažnai yra labai trumpalaikiai, keli tūkstančiai CRISPR-Cas9 kompleksų gali ištirti visą genomą, kad surastų vieną tikslinę DNR atkarpą. Cas9 taip pat turi atpažinti trumpą trijų bazių porų DNR seką iškart po pradmenų sekos, pavadintos PAM, kuri žmogaus genome pasitaiko apie 300 milijonų kartų.

„Jei Cas9 keliasdešimt sekundžių ar minučių prisijungtų prie kiekvienos ne tikslinės vietos, ji niekada, niekada negalėtų rasti taikinio ir laiku nupjauti“, – sakė Knightas.

Cas9 paskutinis patikros taškas

Kitas tyrimas, paskelbtas internete spalio 28 d Gamta, parodė, kad kai Cas9 prisijungia prie DNR srities, ji atlieka dar vieną patikrinimą, kol susijungia dvi tolimos Cas9 baltymų komplekso dalys, kaip žirklių ašmenys, kad tiksliai sulygiuotų aktyviąsias vietas, perpjaunančias dvigrandę DNR.

„Mes nustatėme, kad RNR valdomas Cas9 gali labai stipriai surišti kai kurias netikslines DNR sekas, kurios nuo tinkamo tikslo skiriasi tik keliomis mutacijomis. Tačiau stebėtina, kad Cas9 sritis, kuri atlieka pjovimą, yra slopinama dėl netobulos atitikties. Tačiau kai randama tinkamai atitinkanti DNR, Cas9 patiria didelį struktūrinį pokytį, kuris atpalaiduoja šį slopinimą ir sukelia DNR pjovimą“, – sakė pirmasis autorius Samuelis Sternbergas, neseniai gavęs daktaro laipsnį. UC Berkeley. Jis galėjo stebėti šiuos pokyčius naudodamas fluorescenciniu būdu pažymėtą Cas9 komplekso versiją.

„Manome, kad šis struktūrinis pokytis yra paskutinis DNR nukreipimo reakcijos kontrolinis taškas arba korektūros etapas“, – sakė jis. „Pirma, Cas9 atpažįsta trumpą DNR segmentą, esantį šalia taikinio – PAM – tada tikslinė DNR suderinama su vadovaujančia RNR per Watson-Crick bazių poravimą. Galiausiai, kai nustatoma tobula atitiktis, paskutinė baltymo dalis pasisuka į vietą, kad būtų galima iškirpti ir pradėti genomo redagavimą.

Mažesnis Cas9 baltymas iš skirtingų bakterijų rūšių, Staphylococcus aureus, greičiausiai naudoja tą pačią strategiją, kad pagerintų DNR nukreipimo tikslumą, o tai rodo, kad „ši svarbi savybė buvo išsaugota per visą evoliucijos laiką“, pridūrė jis.

„Tai gera žinia, nes rodo, kad turite daugiau nei vieną patikros tašką, kad užtikrintumėte teisingą Cas9 surišimą“, - sakė Knight. „Yra ne tik sekos reguliavimas, bet ir laikinasis reguliavimas: jis turi susijungti su DNR ir stovėti pakankamai ilgai, kad galėtų iš tikrųjų pertvarkyti ir iškirpti.

Doudna, Tjian ir jų komandų atradimai atskleidė netikslinių efektų molekulinį pagrindą genomo redagavimo programų metu ir gali padėti ateityje kurti tikslesnius Cas9 variantus.

Tyrimus finansavo Nacionalinis mokslo fondas (MCB-1244557) ir Kalifornijos regeneracinės medicinos institutas (CIRM, RB4-06016).

Bendraautoriai su Knight, Doudna ir Tjian Mokslas yra Liangqi Xie, Benjaminas Guglielmi, Lea Witkowsky, Lana Bosanac ir Elisa Zhang iš UC Berkeley Wulan Deng, Jean-Baptiste Masson ir Zhe Liu iš Janelia tyrimų universiteto, esančio Ashburn, Virdžinijos valstijoje, iš Howardo Hugheso medicinos instituto ir Mohamedas El Beheiry ir Maxime'as Dahanas iš Laboratoire Physico-Chimie Curie instituto Paryžiuje, Prancūzijoje. Doudna ir Tjian yra Li Ka Shing Biomedicinos ir sveikatos mokslų centro UC Berkeley nariai.

Sternbergo ir Doudnos bendraautoriai Gamta yra Benjamin LaFrance ir Matias Kaplan iš UC Berkeley.

Doudna yra UC Berkeley naujoviškos genomikos iniciatyvos direktorius ir Lawrence'o Berkeley nacionalinės laboratorijos mokslininkas.

SUSIJUSI INFORMACIJA


1 pav.: CRISPR-Cas9 (www.stockadobe.com)

Nors biologinių vaistų vaidmuo gydant žmonių ligas per pastarąjį dešimtmetį labai pasikeitė, taip pat ir genų inžinerija. Racionali genų inžinerija, siekiant sustiprinti bioterapinius baltymus, tapo realybe, kurią katalizuoja daugelio Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląstelių linijų genomo sekos paskelbimas. Naujos "dizainerio" CHO ląstelės modifikuoja rekombinantinių baltymų posttransliacines modifikacijas (PTM) genomo redagavimo būdu, todėl dabar galima tiksliai (vienoje DNR bazių poroje), greitai ir išmušti mielių ir žinduolių ląstelių genus. efektyviai. Galiausiai tokie metodai bus naudojami kuriant ekonomiškus rekombinantinius terapinius baltymus.

Genų redagavimo įrankis, pagrįstas reguliariais intervalais išdėstytais trumpais palindrominiais pasikartojimais (CRISPR) – su CRISPR susijusiu baltymu 9 (Cas9), žymiai pagerino genomo redagavimą, todėl jis tapo greitesnis, lengvesnis, pigesnis ir efektyvesnis nei anksčiau. Šiai sistemai reikia tik vieno baltymo ir vienos RNR molekulės, kad būtų pasiektas RNR užprogramuotas DNR skilimas. Ši galimybė leido CHO tyrėjams išsiaiškinti dominančių aukšto lygio baltymų gamybos ir produktų kokybės savybių (PQA) mechaninį pagrindą. Šiuo metu CHO genų redagavimo dėmesys skiriamas produktų įvairovės didinimui, taip pat produktų kokybės ir derlingumo kontrolei ir gerinimui. Nors įprastas PTM optimizavimas ląstelės glikozilinimo „mašinoje“ dar nėra realybė, mokslininkai tikisi, kad galiausiai pavyks sujungti nežinduolių šeimininkų ekspresiją su į žmogų panašiu antikūnų glikozilinimu, atliekamu inžinerinėse mielėse ar net augaluose.

Tačiau netolimoje ateityje bus galima panaudoti promotoriaus inžineriją, kad būtų pasiekta tiksli CHO ląstelių sintetinės biotechnologijos transkripcijos kontrolė. Panašiai multipleksinis genomo redagavimas (vienu metu nukreipimas į kelis susijusius ar nesusijusius taikinius) galėtų leisti ištirti ir manipuliuoti visais genomais arba baltymų tinklais. Taigi jis sukėlė revoliuciją išmušimo ir išmušimo įvykiuose ir suvaidino lemiamą vaidmenį suprantant genomus. žinduolių ląstelės ir mielių naudojimas medžiagų apykaitos inžinerijai. Tokios redagavimo galimybės taip pat įgalino didelę, stabilią ir nuoseklią transgenų, koduojančių sudėtingus terapinius baltymus, tokius kaip monokloniniai antikūnai (MAb), ekspresiją.

Modifikacijos po vertimo
Pažangias genų redagavimo technologijas, tokias kaip CRISPR-Cas9, į transkripcijos aktyvatorių panašios efektorinės (TALE) nukleazės ir RNR trukdžių (RNAi) įrankius, papildo naujos kartos sekos derinimas su sistemų biotechnologijomis, kad būtų lengviau tobulinti ląstelių glikozilinimo procesą. Tokie įrankiai leis ląstelių inžinieriams atlikti labai patobulintus ir tikslingus pakeitimus, kad būtų paspartintas ląstelių apdorojimo pajėgumas. Tai leis nuosekliai pagerinti derlių ir ląstelių kokybę, taip pat padidinti proceso efektyvumą, todėl ateityje sveikatos priežiūros poreikiai bus įperkami.

Ląstelių inžinieriai stebi įgalinančių įrankių gausėjimą, nes molekuliniai ir ląstelių biologai ir toliau kuria sudėtingus metodus, kaip iššifruoti atributus, kurie yra labai svarbūs vaistų produktų kokybei. Biologinių medžiagų glikozilinimo profilių gerinimas padidina produktų biologinį aktyvumą ir kokybę, o N-sujungtas glikozilinimas vaidina lemiamą vaidmenį terapinių baltymų veiksmingumui. Įrodytas daugelio glikoinžinerijos būdu sukurtų baltymų terapinis veiksmingumas paskatino naujų optimizuotų ekspresijos sistemų (pvz., žinduolių ląstelių), skirtų nefukozilinti antikūnams gaminti, kūrimą.

Dabar tampa įmanoma greitai pagaminti medžiagą farmakologiniams, formulavimo ir toksikologijos tyrimams, nesukuriant stabilios ląstelių linijos. Toks pajėgumas gali sutrumpinti stabilios ląstelių linijos vystymosi terminus nuo daugiau nei šešių mėnesių iki maždaug trijų savaičių, todėl tyrimo etape galima sukurti stabilius klonus. Tuo pačiu metu jau buvo sukurtos skirtingos glikooptimizuotų baltymų (pvz., mielių) gamybos sistemos, kad būtų galima pagaminti pagrindinius žmogaus N-glikozilinimo kelio etapus ir taip įgalinti biologiškai geresnes terapinių MAb versijas.

CRISPR-Cas9 įrankių taikymas lėmė multipleksuojamo išmušimo fenotipus. Panašiai, būsimi pasiekimai su (mažomis) nekoduojančiomis RNR CHO ląstelėse taip pat galėtų paremti funkcinės genomikos pastangas sustiprinti gamintojų ląsteles. Tai žymiai išplėstų inžinerinių taikinių sąrašą (pvz., kaip pasiekta naudojant obinutuzumabą, humanizuotą ir glikoinžinerijos būdu sukurtą anti-CD20 MAb, su padalintais afukozilintais Fc regiono angliavandeniais ir GlycoMAb technologija iš GlycArt-Roche).

Neseniai CHO ląstelės buvo laikomos „juodosiomis dėžėmis“, nes mokslininkams trūko tų ląstelių genominės informacijos. Tai trukdė pastangoms suprasti aukštos kokybės rekombinantinių baltymų gamybos CHO ląstelėse molekulinį pagrindą. Pažymėtina, kad įspūdinga pažanga CHO ląstelių kultūros technologijoje buvo pasiekta taikant empirinius metodus, tokius kaip atranka ir proceso optimizavimas, todėl gaunamas didelis derlius (10 g/l ir daugiau). Tačiau tokį derlių dažnai pasiekia tik tam tikros rūšies ląstelių linijos, o dėl didelio rekombinantinių CHO ląstelių kintamumo laipsnio reikia daug pastangų reikalaujančių ir brangių procesų, kad būtų atrenkamas geriausias klonas kiekvieno naujo terapinio kandidato gamybai.

Tradicinės rekombinantinės ląstelės yra pagrįstos atsitiktine ekspresijos kasetės plazmidės integracija šeimininko genome. Transgenes are likely to be inserted in heterochromatin regions, which results in very weak gene-expression levels. So a substantial number of clones (generally multiple hundreds to a few thousand) must be screened to find those rare cells with a stably integrated plasmid in highly transcriptionally active chromatin regions (“hotspots”).

Sequencing efforts have resulted in availability of additional genomic sequence data for different CHO cell lines. Moreover, an active effort is underway in the CHO cell-line community to refine the genome assembly and annotation for the Chinese hamster. In the past 20 years, several molecular and cellular biology tools have been developed for targeted-site gene integration for eventually minimizing the randomness of gene insertion and increasing the predictability of high transgene expression.

Genomo redagavimas
First-Generation Genome-Editing Tools: Several recombinases have been used for targeted site approaches, with Cre–lox and Flp–FRT being the most commonly used. Recombination-mediated cassette exchange (RMCE) technology also is attracting interest for targeted gene insertion. That technology has increased success rates and reduced timelines for the generation of stable industrial-grade CHO cell lines expressing MAbs reliably.

Second-Generation Genome-Editing Tools: This group includes endonucleases such as zinc finger nucleases (ZFN), meganucleases, transcription activator-like effectors nucleases (TALEN), and CRISPR-Cas9. Both ZFN and TALEN technologies rely on the ability to customize a DNA-binding domain for a specific sequence (the targeted sequence for cleavage) combined to a nuclease effector domain. CRISPR-Cas9 technology already has been validated for use with CHO cells and has been implemented to reduce production variability among clones. However, ZFN, TALEN and CRISPR-Cas9 technologies are used mostly for gene-specific knockout.
One critical challenge is to identify hotspots in a host genome that enable good expression levels and stability. Such specific integration might not be a one-size-fits-all approach because some therapeutic proteins could require a particular level of expression to fold correctly or to present adequate quality attributes (e.g., glycosylation and proteolytic processing). The discovery of additional naturally occurring RNA-guided nucleases offers increased targeting flexibility.

Some researchers also have engineered Cas9 enzymes to exhibit relaxed protospacer-adjacent motif (PAM) specificities. Such crucial advances expand the number of target loci that are amenable to RNA-guided genome editing. Other scientists have engineered Cas9 nuclease and managed to increase its DNA specificity dramatically. Thanks to the fusion of dead Cas9 (dCas9) to a cytidine deaminase enzyme that operates on ssDNA, “base editing” now can be used to generate point mutations in genomes.

Remarkably, CHO cells showed increased resistance to apoptosis after successful simultaneous (multiplex) disruption of fucosyltransferase 8 (FUT8), Bcl-2 associated X-protein (BAX), and Bcl-2 homologous antagonist killer (BAK) genes by CRISPR-Cas9 (1). The ZFN knockout approach achieved specific deletion of the glutamine synthetase (GS) and the dihydrofolate reductase (DHFR) genes in CHO cells, thus improving the selection stringency of the generated cell lines. Finally, both ZFN and a CRISPR-Cas9 approaches also were used for FUT8 gene-specific knockout. The resulting cell lines completely abolished fucosylation on the Fc domain of immunoglobulin G (IgG).

A less commonly used tool is mammalian artificial chromosome expression (ACE). This minigenome serves as an autonomous genetic element that replicates with cells. Its DNA sequence is customizable with different regulating elements that could help its expression.

The PiggyBac transposon system (System Biosciences) uses an efficient transposase purified from the cabbage looper moth (Trichoplusia ni) to integrate the gene of interest into a host genome. It has shown to improve yields for stable production of antibodies in CHO cell lines (2).

Genome-Editing Achievements: Introduction of additional N-glycan target sites into desired positions on the protein backbone by genetic mutation has been used to create glycoproteins with enhanced levels of glycosylation (overexpression of sialyltransferases and other glycosyltransferases, inhibition of sialidases) and sialylation. That has extended serum halflives and improved in vivo activity (3). (N-glycans also can be crucial for protein folding.) Thanks to a comprehensive ZFN knockout screen of glycosyltransferase genes and the identification of key genes that control decisive steps in N-glycosylation in CHO cells, it is now possible to provide homogeneous glycoforms.

Overexpression of B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) or B-cell lymphoma-extra large (Bcl-xL) has shown precise and efficient inhibition of apoptosis in recombinant CHO cell cultures by enhancing the culture’s longevity, cell viability, and endurance under environmental stresses. Consequently, that renders greater yields of therapeutic protein, which is a definite economic advantage in the biopharmaceutical industry. Similarly, down-regulation of caspases (e.g., caspase-8 and -9) and knockouts of proapoptotic genes (e.g., BAX and BAK) enhance the viability of both batch and fed-batch cultures. (Down-regulation of such genes can be achieved with various genome-editing techniques such as ZFNs, TALENs, and Cas systems).

One group that helped bridge those two technologies is the research team at the Memorial Sloan Kettering Institute Center for Cell Engineering. Directed by Michel Sadelain, the group has been an integral part of CAR-T therapy research, particularly targeting the CD19 molecule on white blood cells. CD19 is expressed on cells found in B-cell leukemia and resides on the cell surface, thereby making it available for antibody access. In 2017, Sadelain’s group published a study showing that directing a CD19-specific CAR to the T-cell receptor alpha constant (TRAC) locus increased T-cell potency. The modified cells “vastly outperformed conventionally generated CAR T-cells in mouse models of acute lymphoma leukemia,” with human trials planned (1).

CAR T-cells typically are made using retroviruses, but they insert CAR genes into random loci in genomes. CRISPR can be used to deliver CAR genes to specified targets in genomes. And current research is exploring the use of CRISPR–Cas9 editing to create next-generation CAR T-cell products, including “universal” CAR T-cells, making these cells more potent and controllable (2).

Nuorodos
1 Eyquem J, et al. Targeting a CAR to the TRAC Locus with CRISPR/Cas9 Enhances Tumour Rejection. Gamta 543(7643) 2017: 113–117 https://doi.org/10.1038/nature21405.

Therapeutic Protein Expression Regulation By Smart Promoters and Epigenomic Reprogramming
In the near future, research laboratories will be able to design transcriptional control systems and synthetic promoters, control the timing of gene expression at will by trigger-inducible transcription factors (TF), and protect against chromatin silencing. Researchers already have begun to edit the epigenome to alter regulation of a target gene. Moreover, effector fusions can be used to expand the repertoire of genome engineering modalities achievable using Cas9. And nonediting CRISPR tools are helping researchers to screen engineered cells for phenotypes of interest quickly and precisely.

CRISPR Intellectual Property Landscape and the Gene-Editing Innovation Roadmap
There is some risk that patent filings by academic institutions claiming critical components of the CRISPR-Cas9 technology could deter or slow down the development and use of the technology. However, research organizations and universities can establish a workable balance between access and control for essential research tools through sound management of intellectual property (IP). (For example, when the Cohen–Boyer patents were granted, Stanford University created a pioneering licensing program that provided a predictable legal framework for using its inventions. Nonexclusive licenses were made available to both companies and academic institutions. In fact, patent protection has played a significant role in the development of the technology to produce recombinant DNA in bacteria).

It has been widely publicized that several organizations have been filing patents over fundamental parts of the CRISPR-Cas9 system. Commercial assignees Dow AgroSciences and DuPont Nutrition Science together hold 33 inventions, all of which are related to crop and animal agriculture (genome-editing crop and weeds) and food (dairy industry) applications of the technology. In addition, the French company Cellectis holds rights on a broad patent for gene editing of cells in vitro. Academic institutions, through their licensing and spinoffs, are primarily in control of medical applications of CRISPR-Cas (e.g., The Broad Institute of Harvard University and the Massachusetts Institute of Technology (MIT) to Editas) with commercial partners (University of California at Berkeley to Caribou Biosciences and sublicensed to Intellia and Novartis).

It’s interesting that most patent holders appear to be pursuing a strategy of keeping an international option open for their portfolios. Fortunately, signs indicate that the pace of discovery and development of CRISPR is likely to continue, with a high probability of further improvements. The Broad Institute and MIT are building a portfolio on those principles and diversifying it.

Other gene-editing technologies might emerge to compete with or possibly even displace CRISPR-Cas (see “Alternative Gene-Editing Methods” box). Follow-on breakthroughs are likely to take center stage. Current patent holders will have difficulty pursuing restricted access to CRISPR-Cas9 for research use because it already is widely used in academic laboratories. The Broad Institute, MIT, and UC Berkeley already offer free use of the technologies they control for academic research purposes through Addgene, a nonprofit organization. Addgene uses the general terms of the Uniform Biological Material Transfer Agreement (UBMTA), which indicates that discoveries are owned by the recipient of the biological material and can be licensed for commercial use.

Inevitably, some of those new commercial applications could fall within the broadly drafted claims of the original patent and therefore require a second, commercial license. Inventors of follow-on applications using a CRISPR-Cas technology are likely to need a commercial sublicense from the respective exclusive commercial licensee that controls that technology (e.g., Editas, Caribou, Intellia, CRISPR Therapeutics, and Cellectis/Calyxt) rather than from the originating university.

One group that helped bridge those two technologies is the research team at the Memorial Sloan Kettering Institute Center for Cell Engineering. Directed by Michel Sadelain, the group has been an integral part of CAR-T therapy research, particularly targeting the CD19 molecule on white blood cells. CD19 is expressed on cells found in B-cell leukemia and resides on the cell surface, thereby making it available for antibody access. In 2017, Sadelain’s group published a study showing that directing a CD19-specific CAR to the T-cell receptor alpha constant (TRAC) locus increased T-cell potency. The modified cells “vastly outperformed conventionally generated CAR T-cells in mouse models of acute lymphoma leukemia,” with human trials planned (1).

CAR T-cells typically are made using retroviruses, but they insert CAR genes into random loci in genomes. CRISPR can be used to deliver CAR genes to specified targets in genomes. And current research is exploring the use of CRISPR–Cas9 editing to create next-generation CAR T-cell products, including “universal” CAR T-cells, making these cells more potent and controllable (2).

Epigenetic Control of Therapeutic Proteins
Conferring an open chromatin state in targeted chromosome loci (DNA stretches composed of nucleosome-depleted regions) can benefit transgene expression. Indeed, cis-acting epigenetic regulatory elements can help to remodel the chromatin environment, maintaining an active transcriptional state around a transgene. One type of epigenetic regulatory element (ERE) is the scaffold/matrix attachment region (S/MAR), thanks to which recombinant proteins could improve their expression levels significantly. Another class of EREs is chromatin opening elements (UCOEs), which confer an unmethylated, open chromatin state for transgene expression. UCOEs also have helped to increase the productivity of cell line producers of recombinant proteins.

Nonetheless, S/MAR and UCOE decrease the variability of expression between the different clones. Some epigenetic elements not only can help to increase the expression level of biotherapeutics, but also can increase the number of clones that have integrated a transgene with a more defined copy number of transgenes per cell, thus accelerating the selection process.

Protein Folding and Secretion of Recombinant Cells
Secretory bottlenecks of CHO cells can be relieved by overexpressing soluble N-ethylmaleimide–sensitive factor attachment protein receptors (SNAREs). New targets for cell-engineering approaches also can be identified based on metabolomics profiling. A bottleneck at the malate dehydrogenase II (MDHII) level was characterized for the tricarboxylic acid (TCA) cycle in CHO cells, and pyruvate metabolism was shown to vary between high-producing and low-producing anti-CD20 CHO clones (2). Over the years, many cell engineering strategies have been used in attempts to increase such titers by optimizing selection markers, gene expression, cell growth, proliferation, protein folding, and secretion. Among those engineering tools, CRISPR-Cas9 and RMCE technologies will contribute significantly to the advance of glycoprotein production shortly.

With remarkable advances in genome editing, technologies such as the CRISPR-Cas9 tool as well as the combination of next-generation sequencing with systems biotechnology exhibit extraordinary potential for discovery and modulation of novel cell engineering targets. Such efforts might finally pave the way for development of rationally designed host cells. Efforts now are ongoing to engineer PTMs in microbial, insect, and plant cell systems to make those systems more suitable for therapeutic protein production.

Nuorodos
1 Baek E, Noh SM, Lee GM. Antiapoptosis Engineering for Improved Protein Production from CHO Cells. Heterologous Protein Production in CHO Cells. Humana Press: New York, NY, 2017: 71–85.

2 Lalonde ME, Durocher Y. Therapeutic Glycoprotein Production in Mammalian Cells. J. Biotechnol. 251, 2017: 128–140 https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.04.028.

3 Wang Q, et al. Glycoengineering of CHO Cells to Improve Product Quality. Heterologous Protein Production in CHO Cells. Humana Press: New York, NY, 2017, 25–44.


The future of CRISPR/Cas9

The rapid progress in developing Cas9 into a set of tools for cell and molecular biology research has been remarkable, likely due to the simplicity, high efficiency and versatility of the system. Of the designer nuclease systems currently available for precision genome engineering, the CRISPR/Cas system is by far the most user friendly. It is now also clear that Cas9&rsquos potential reaches beyond DNA cleavage, and its usefulness for genome locus-specific recruitment of proteins will likely only be limited by our imagination.


Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system

Animals carrying exogenous genes integrated at specific genomic loci are versatile tools for biological research 1 . Zebrafish (Danio Rerio), an emerging vertebrate animal model, is widely used in studies on genetics, developmental biology and neurobiology. Although loss-of-function genomic editing for zebrafish has been well developed 2,3,4 , lack of feasible methods for inserting a large exogenous DNA sequence into the zebrafish genome is becoming a bottleneck for zebrafish-relevant research. It was reported that the coding sequence of enhanced green fluorescent protein (EGFP) can be integrated at the zebrafish tyrosine hydroxylase (th) locus through TALEN-mediated double-stranded breaks and homologous recombination (HR) with a low efficiency 6 . However, the targeted gene was destroyed and EGFP failed to express 6 . Recently, by using the type II bacterial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system (CRISPR/Cas9), two non-HR-based knockin approaches were developed to insert Gal4 (a transcriptional transactivator) and EGFP into zebrafish genomic loci with a relatively high efficiency 7,8 . However, the coding sequence of targeted endogenous genes was disrupted or the expression pattern of inserted exogenous genes could not well recapitulate the endogenous ones as insertion occurred within either the exon 7 or cis-regulatory elements of targeted genes 8 . These disadvantages will limit their application in neuroscience research. Here, using the CRISPR/Cas9 system, we developed an intron targeting-mediated and HR-independent efficient knockin approach for zebrafish, with which the intactness of the coding sequence and regulatory elements of targeted endogenous genes are maintained.

The Th protein is a rate-limiting enzyme for synthesizing two important neuromodulators, dopamine and noradrenline. As dopamine and noradrenline are synthesized and released by dopaminergic and noradrenergic neurons, respectively, Th is a specific marker for these cells. We designed a short guide RNA (sgRNA) targeting the last intron of the zebrafish th and performed co-injection of sgRNA and mRNA of zebrafish codon-optimized Cas9 (zCas9) into one-cell-stage zebrafish embryo, which yielded a cleavage efficiency of ∼ 83% (Supplementary information, Table S1A and S1B). Next, we designed a donor plasmid th-P2A-EGFP consisting of three parts: a left arm, a P2A-EGFP coding sequence, and a right arm (Figure 1A). To retain the full coding sequence of th, the left arm begins from the upstream of the 5′ side of the sgRNA target site in the last intron, spans the whole last exon E13, and ends at the last base just before the stop codon of th. To keep the normal control of Th expression, the right arm includes the stop codon and 3′ regulatory elements of th. The P2A peptide is a linker for multicistronic expression 9 .

Intron targeting-mediated EGFP knockin at the zebrafish th lokusas. (A) Schematic of the intron targeting-mediated strategy for generating EGFP knockin at the zebrafish th locus by using the CRISPR/Cas9 system. The sgRNA target sequence is shown in red and the protospacer adjacent motif (PAM) sequence in green. The left and right arm sequences of the donor plasmid are indicated by the brown lines with double arrows. The left arm is 1 298 bp, and the right arm is 671 bp. The th-P2A-EGFP cassette was integrated into the th locus after co-injection of the donor with the sgRNA and zCas9 mRNA. The zebrafish th has 13 exons, and E12 and E13 represent the 12th and 13th exons, respectively. Right: the schematic of the mRNA and protein of the targeted th genas. (B) Representative projected in vivo confocal images (dorsal view) of th-P2A-EGFP knockin F1 larvae at 3 dpf, showing specific EGFP expression in various dopaminergic (OB, Pre, PT, and HI) and noradrenergic neurons (LC and MO). The white arrowheads mark non-specific signaling on the skin. A, anterior D, dorsal R, right. Scale bar, 50 μm. (C) PCR analysis of the 5′ and 3′ junctions of F1 progenies from the 7# founder. The F1, R1, F2 and R2 primers are shown in A. (D) 5′ and 3′ junction sequences of F1 progenies of three th-P2A-EGFP knockin F0 founders. The indel mutations are highlighted in yellow, and the PAM and sgRNA target sequences are shown in green and red, respectively. (E) Whole-mount savo vietoje double immunostaining of th-P2A-EGFP knockin F1 larvae, showing that EGFP signaling (green) co-localizes with Th signals (red). The white arrowheads mark non-specific signaling on the skin. Scale bar, 20 μm. (F) Western blot of the Th expression in WT and heterozygous th-P2A-EGFP knockin F1 embryos. (G) Dopamine (DA) immunostaining of th-P2A-EGFP knockin F1 (top) and WT larvae (bottom left). Bottom right: DA intensity of DA-positive neurons in WT and knockin F1 larvae. The numbers on the bars represent the numbers of cells examined. Scale bar, 10 μm. (H) Bright-field image showing in vivo whole-cell recording of EGFP-expressing LC neurons in a homozygous th-P2A-EGFP knockin F2 larvae. The black arrow indicates the recording microelectrode. Scale bar, 10 μm. (aš) Whole-cell currents of an EGFP-expressing LC neuron. Under voltage-clamp mode, the neuron was held at −60 mV and voltage pulses from −100 to 30 mV with an interval of 10 mV were applied. Action potential currents (arrow) appear near −30 mV.

We co-injected the donor plasmid, sgRNA and the zCas9 mRNA into one-cell-stage fertilized zebrafish egg. As both the donor plasmid DNA and the last intron of th contain sgRNA target site, concurrent cleavage by sgRNA/Cas9 would result in efficient and specific integration of the donor DNA into the th locus via non-HR. Indeed, we observed EGFP expression in the brain of injected larvae 3 days post fertilization (dpf) (33/139 Supplementary information, Figure S1A1 and Table S1B). Based on their location and morphology 10 , EGFP-expressing cells included dopaminergic neurons in the posterior tubercular (PT), intermediate hypothalamus (HI) and pretectum (Pre), and noradrenergic neurons in the locus coeruleus (LC) and medulla oblongata (MO) (Supplementary information, Figure S1A1). Successful non-HR-mediated insertion of the th-P2A-EGFP donor was then verified by PCR using target site- and donor-specific primers and junction sequencing analysis (Supplementary information, Figures S1A2 and S1A3). The specificity of knockin events was further confirmed by savo vietoje immunohistochemistry staining, which revealed that EGFP was co-localized with Th in 46 out of 48 Th-positive cells in three larvae examined (Supplementary information, Figures S1A4 and S1A5).

To examine the germline transmission of knockin events, 25 embryos showing mosaic expression of EGFP were raised to adulthood. Each of them was then outcrossed to wild-type (WT) zebrafish, and their F1 progenies were screened for EGFP signal. Three F0 founders were identified, and EGFP-positive F1 progenies were produced at rates ranging from 15.5% to 21.1% (Supplementary information, Table S1C). As expected, in comparison with F0 (Supplementary information, Figure S1A1), more EGFP-expressing dopaminergic and noradrenergic neurons were observed in F1 progenies (Figure 1B), including neurons in the olfactory bulb (OB), Pre, PT, HI, LC and MO. PCR and junction sequencing analysis of F1 progenies confirmed the inheritance of the genomic integration of their corresponding F0 founders (Figure 1C and 1D). Immunostaining was also performed in the F1 embryos of th-P2A-EGFP knockin fish, and EGFP signal was found to be well co-localized with the Th protein (98% ± 1%, mean ± SEM, in 5 larvae Figure 1E), suggesting the high specificity of EGFP expression in the stable knockin lines.

As the full reading frame and regulatory elements of th were maintained by using this knockin strategy, both the integrity and expression pattern of the gene product should be normal. To examine these points, we extracted the total protein from F1 embryos carrying EGFP knockin at th and performed western blot analysis. F1 embryos were heterozygous because they were generated by crossing knockin F0 founders with WT fish. By using a Th antibody, two bands for knockin embryos were detected (Figure 1F). The lower band at around 56 kDa represents the WT Th protein derived from a WT th alelis. The P2A peptide is about 2 kDa and cleaved between the last two amino acids. If knockin events did not affect the integrity of the Th protein, the cleavage of the Th-P2A-EGFP protein will result in two products: Th-P2A fusion protein (58 kDa) and EGFP protein (Figure 1A). Therefore, the upper band at around 58 kDa indicates the integrity of the Th protein produced from a knockin th alelis. Furthermore, the expression levels of the WT Th protein and the knockin Th-P2A fusion protein were almost equal (Figure 1F), further suggesting that our knockin strategy does not impair the expression level of the targeted endogenous gene. To examine whether knockin events affect Th functions, we then performed immunostaining of dopamine, the level of which can reflect the activity of Th. The intensities of dopamine signals in dopaminergic neurons were not significantly different between knockin F1 and WT embryos (P = 0.4 Figure 1G), suggesting that Th function is not affected by knockin events.

To examine the physiological normality of neurons carrying targeted integration, in vivo whole-cell recording was subsequently performed in homozygous th-P2A-EGFP knockin F2 larvae (Figure 1H). EGFP-expressing neurons exhibited a normal intrinsic membrane property, as reflected by outwardly rectifying whole-cell currents (Figure 1I).

To extend the application of our knockin strategy to other exogenous genes, we generated knockin fish carrying the transactivator protein Gal4 prie th locus by using the same strategy, in which only the EGFP coding sequence was replaced with the Gal4 sequence (th-P2A-Gal4 Supplementary information, Figure S1B1). After injection of Gal4 knockin-relevant elements into fertilized eggs of Tg(UAS:GCaMP5) transgenic zebrafish, integration events were visualized by the expression of GCaMP5 in dopaminergic or noradrenergic neurons (Supplementary information, Figure S1B2). As GCaMP5 is a genetically encoded calcium indicator, we could observe mechanical stimulus-induced calcium responses in neurons by puffing water to the fish tail through a micropipette. We also injected the Gal4 knockin-relevant elements into WT fish to screen for th-P2A-Gal4 knockin founders. As the Gal4 protein has no fluorescence, we raised the injected knockin embryos to adulthood without prior selection and crossed these adults with Tg(UAS:Kaede) transgenic fish. Two founders were identified among the total of 28 injected fish (Supplementary information, Table S1D), as evidenced by the fact that dopaminergic neurons were labeled by Kaede in their progenies, which were produced at a mean rate of ∼ 7% (Supplementary information, Figure S1B4 and Table S1D). Successful insertion of the th-P2A-Gal4 donor was then verified by PCR and junction sequencing analysis in F1 progenies (Supplementary information, Figures S1B5 and S1B6).

It was reported that the CRISPR/Cas9 system shows a high frequency of off-target (OT) cleavage in human cell lines, and the specificity of Cas9 targeting can tolerate up to three base pair (bp) mismatches between a sgRNA and its target DNA 11 . We therefore searched all zebrafish genomic loci containing up to 3-bp mismatches in comparison with the coding sequence of the th sgRNA, and found three potential OT sites. PCR and sequencing analysis of those potential OT sites in the genome of injected WT embryos or th-P2A-EGFP knockin F1 embryos did not reveal indels (Supplementary information, Table S1E), suggesting a low OT rate associated with our knockin strategy.

The applicability of our knockin strategy was further validated by targeting other endogenous genes specifically expressed in different types of cells, as exemplified by the integration of EGFP into the zebrafish tryptophan hydroxylase 2 (tph2), glial fibrillary acidic protein (gfap), and flk1 loci. Šie EGFP insertions resulted in the specific labeling of serotoninergic neurons, glia and vascular endothelial cells, respectively (Supplementary information, Figures S1C-S1E, and Table S1A and S1B). It is worth noticing that, in the case of the tph2 knockin, the second last intron was selected for targeting, indicating that the last intron is the first but not the only choice for targeting. Furthermore, by replacing the P2A viduje konors gfap-P2A-EGFP plasmid with a flexible serine-serine linker sequence, we succeeded in fusing an EGFP tag to endogenous Gfap (Supplementary information, Figure S1F), demonstrating that our knockin strategy can also be used to tag endogenous proteins.

Taking advantage of both the HR for donor design and the non-HR for donor integration, we developed a novel CRISPR/Cas9-mediated intron-targeting knockin strategy, by which knockin zebrafish can be efficiently generated without disruption of targeted endogenous genes. Compared with HR, error-prone non-homologous end joining (NHEJ)-involved non-HR knockin for zebrafish has two advantages. First, NHEJ is at least 10-fold more active than HR during early zebrafish development 12 . Second, unlike HR, NHEJ does not need the precise homology between the parent zebrafish and the targeting donor, avoiding time-consuming screening and genotyping of parent animals. More importantly, to maintain the integrity of targeted endogenous genes, we designed sgRNAs targeting introns, so that NHEJ-mediated indel mutations do not change the reading frame of targeted genes. In addition, intron targeting also theoretically increases the rate of in-frame insertion up to 3-fold in comparison with exon-based targeting. Furthermore, we artificially added the endogenous genome sequence spanning from the sgRNA target site to the 3′ intergenic region into donor plasmids. Therefore, the predicted forward ligation of the donor into the targeted locus retains the original reading frame and both 5′ and 3′ regulatory elements of targeted genes. Taken together, this strategy has two advantages: (1) inserted exogenous genes can faithfully recapitulate the expression pattern of targeted endogenous genes (2) the expression and function of targeted endogenous genes are maintained. Thus, the readiness, high efficiency and targeted gene integrity maintenance make our strategy an applicable knockin approach for zebrafish and even other organisms.


1. Įvadas

For many years, molecular biologists have sought ways to use cellular repair mechanisms to manipulate DNA through genome editing. In this way, they would have the power to change the genome by correcting a mutation or introducing a new function (Rodriguez, 2016). For this purpose, genome editing technologies were developed (Memi et al., 2018). In recent years, clustered regularly interspaced short palindromic repeats technology (CRISPR-Cas9) has become the most preferred method of gene editing. This technology has advantages such as high accuracy, easy handling, and relatively low cost compared to previous technologies, such as zinc-finger nuclease (ZFN) and transcription activator-like effector nuclease (TALEN). Thanks to these benefits, CRISPR-Cas9 technology can be easily applied in any molecular biology laboratory.

Genome editing technologies are used in the formation of human disease models in experimental animals and for the understanding of basic gene functions. They also have great therapeutic potential for future treatment of untreated diseases such as certain cancers, genetic disorders, and HIV/AIDS. Today, genome editing in somatic cells is one of the promising areas of therapeutic development (Otieno, 2015). However, various bioethical issues have arisen due to the potential impact of these technologies on the safety of food stocks and clinical applications (Hundleby and Harwood, 2018 Hirch et al., 2019). This review discusses the challenges, possible consequences, and bioethical issues of CRISPR-Cas9 in detail.


Chickens and pigs with integrated genetic scissors

Researchers at the TUM have demonstrated a way to efficiently study molecular mechanisms of disease resistance or biomedical issues in farm animals. Researchers are now able to introduce specific gene mutations into a desired organ or even correct existing genes without creating new animal models for each target gene. This reduces the number of animals required for research..

CRISPR/Cas9 enables desired gene manipulations

CRISPR/Cas9 is a tool to rewrite DNA information. Genes can be inactivated or specifically modified using this method. The CRISPR/Cas9 system consists of two components.

The gRNA (guide RNA) is a short sequence that binds specifically to the DNA segment of the gene that is to be modified. The Cas9 nuclease, the actual "gene scissors," binds to the gRNA and cuts the respective section of the target DNA. This cut activates repair mechanisms that can inactivate gene functions or incorporate specific mutations.

Healthy chickens and pigs with integrated gene scissors

"The generated animals provide the gene scissors, the Cas9 protein, right along with them. So all we have to do is to introduce the guide RNAs to get animals which have specific genetic characteristics," explains Benjamin Schusser, Professor of Reproductive Biotechnology at the TUM. "The initial generation of these animals took about three years. Cas9 can now be used at all stages of animal development, since every cell in the body permanently possesses the Cas9 protein. We have been successfully able to utilize this technique in chicken embryos as well as in living pigs."

The healthy chickens and pigs produced by the researchers thus possess the Cas9 nuclease in all organs studied. This is particularly useful in biomedical and agricultural research.

Analytical tool to fight viral or cancer diseases

Pigs are used as disease models for humans because their anatomy and physiology are much more similar to humans in comparison to mice (currently a common disease model). Thus, a modified pig may help to better understand the mechanism of carcinogenesis in humans. Potential new treatments for humans can also be tested in animal models.

"Due to the presence of Cas9 in the cells the processes are significantly accelerated and simplified," says Angelika Schnieke, Professor of Livestock Biotechnology at the TUM. "Cas9-equipped animals make it possible, for example, to specifically inactivate tumor-relevant genes and to simulate cancer development."

Cas9 pigs and chickens enable researchers to test which genes might be involved in the formation of traits, such as disease resistance, directly in the animal. "The mechanism of the CRISPR/Cas9 system may also be useful for combating infections using DNA viruses. Initial cell culture experiments showed that this already works for the avian herpes virus," says Prof. Schusser.

Important resource for biomedical and agricultural research

Prof. Schnieke notes, "Our Cas9-expressing chickens and pigs represent an innovative resource for genome editing in the biomedical and agricultural sciences, but beyond that, these animals are also available to other research groups. Hence, efficient genome editing in living animals has the potential to significantly advance biomedical and agricultural research."


Žiūrėti video įrašą: რჩევები, თუ როგორ გადავურჩეთ გარეული ცხოველების თავდასხმებს (Birželis 2022).