Informacija

In vitro fermentų gamyba

In vitro fermentų gamyba


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Man reikia išreikšti baltymą in vitro, bet nežinau, nuo ko pradėti. Tikriausiai atliksiu T7 transkripcijos protokolą, bet nesu tikras, ką daryti dėl vertimo. Ar yra gerų komplektų?


„New England Biolabs“, kuri turi puikią reputaciją dėl gerai patikrintų, gerai dokumentuotų ir tvirtų produktų, turi baltymų ekspresijos ir valymo produktų liniją, kurią aš tikrai norėčiau apžvelgti. Sulietų baltymų ekspresijai naudojau pMAL sistemą E. coli, o PURExpress sistema atrodo taip, kaip ieškote. Turiu su jais asmeninių (bet ne finansinių) ryšių ir galiu garantuoti jų kokybę bei techninę pagalbą.

„Pierce“ / „Thermo“ paprastai yra gera vieta, kur reikia ieškoti, kai kalbama apie baltyminius daiktus. Su daugeliu jų dalykų pasiekiau gerų rezultatų, bet to nepadariau in vitro išraiška amžiumi, todėl nepamenu, ką naudojau. (BTW, aš neturiu su jais ryšio, man tiesiog patinka jų produktai.)

Kaip minėjo Alanas Boydas, daugelis įmonių, tokių kaip Life Technologies, Promega, Qiagen ir Sigma in vitro išraiškos rinkiniai. Galų gale, kurį iš jų pasirinksite, priklausys nuo to, ką tiksliai jums reikia jūsų baltymui, norimas išraiškos mastas, žymės (-ių), kurią (-es) norite dėti, tipas, kokią įrangą ir patirtį turite savo laboratorijoje ir kaip daug laiko ir pinigų, kuriuos norite investuoti.


Substrato kolonizacija, deformacijų konkurencija, fermentų gamyba In vitro, ir biokontrolė Pythium ultimum pateikė Trichoderma spp. Izoliuoja P1 ir T3

Antagonistas Trichoderma spp. izoliatai P1 ir T3 skyrėsi savo gebėjimu kolonizuotis ir konkuruoti sfagninėse durpių samanose ir ant medžio drožlių. Durpėse, papildytose šiaudais, izoliatas T3 pagamino dvigubai daugiau kolonijas formuojančių vienetų (CFU) nei izoliatas P1. Ant medžio drožlių du izoliatai sudarė panašų skaičių cfu. Kai du Trichoderma izoliatai buvo auginami kartu, maždaug 85–90% cfu buvo iš T3 abiejuose substratuose. Buvimas Pythium ultimum durpėse, pakeistose šiaudais, skaičiui įtakos neturėjo Trichoderma susidarė cfu. Du Trichoderma izoliatai gamino skirtingą kiekį hidrolizinių fermentų tiek skystose kultūrose, tiek durpėse. Buvo išbandyti septyni skirtingi fermentų aktyvumai. Fermentų gamyba pagal T. harzianum izoliatui T3 anglies šaltinio pakeitimo tipas įtakos turėjo mažiau nei izoliatui T. atroviridas P1. Izoliato P1 kultūriniai filtratai, išauginti ant sudėtingų anglies šaltinių, turėjo didelį endochitinazės aktyvumą, o celiuliozės ir endo-1,3-β-gliukanazės aktyvumas buvo ryškesnis izoliato T3 filtratuose. Nebuvo reikšmingo skirtumo tarp dviejų izoliatų gebėjimo apsaugoti agurkų sodinukus P. ultimumas tuo tarpu dviejų grybų derinys lėmė žymiai mažesnę biokontrolę nei kiekvienas izoliatas atskirai.

Tai prenumeruojamo turinio peržiūra, prieiga per jūsų įstaigą.


In vitro ir in vivo kai kurių fitopatogeninių grybų pektolizinių fermentų gamyba

Buvo ištirti penki grybelinių augalų patogenai in vitro ir in vivo gebėjimas gaminti pektolizinius fermentus. Tik Fusarium solani nesukūrė jokio pastebimo fermentų kiekio in vivo ir in vitro. Alternaria solani, Collectotrichum truncatum, Colletotrichum capsici ir Curvularia pallescens gaminami pektoliziniai fermentai in vitro kurie buvo aptikti dešimt kartų sukoncentravus kultūras nusodinant amonio sulfatu. Tie patys keturi grybai gamino pektolitinius fermentus in vivo kurios buvo aptiktos dvidešimt kartų padidinus mišraus užkrėsto šeimininko audinio koncentraciją. Didžiausio fermento aktyvumo pH vertės 3,0 ir 5,0 rodo, kad pagaminti fermentai buvo poligalakturanai. Galutinis natrio polipektato monogalakturonido produktas ir ląstelės sienelės skilimas rodo, kad egzopoligalakturonazes gamino patogenai. Maža šių fermentų koncentracija užkrėstuose augalo šeimininko audiniuose ir lėtas gaminamų egzopoligalakturonazių pektatų skaidymas gali lemti lėtą šių grybų sukeliamos ligos vystymąsi ir sausą nekrozinį pobūdį.


Krakmolo struktūra ir metabolizmas

Krakmolo granulės susideda iš linijinių α-1,4-gliukanų su periodinėmis α-1,6-šakomis, kurios sudaro ilgas grandines, galinčias apsivynioti viena aplink kitą ir sudaryti dvigubas spiralines struktūras, kurios susikaupia viena šalia kitos ir sudaro kintamus labai tvarkinga skystųjų kristalų lamelė, susimaišiusi su amorfinėmis sritimis (​ pav. (1 pav.) 1 ) (Waigh ir kt., 1998). Dėl šios savaime besiorganizuojančios nanostruktūros krakmolo granulės paviršius yra labai atsparus fermentiniam poveikiui, todėl norint pradėti skaidymą, reikalingi specializuoti fermentai.

Krakmolo granulių struktūra. Krakmolo granulės sudarytos iš α-1,4-gliukanų su tam tikromis α-1,6-šakomis, dedamos jas lygiagrečiai viena kitai, todėl susidaro dviguba spiralė. Šakos yra specialiai išdėstytos, suteikiant išsišakojusias sritis, žinomas kaip amorfines lameles, ir išskirtinai linijinių grandinių sritis, kurios sudaro kristalinę lamelę, ir šios lamelės sudaro apibrėžtus augimo žiedus. Norint susintetinti ir skaidyti šią labai tvarkingą netirpią struktūrą, reikalingi specifiniai fermentai. Coultate (2002) – Atkurta gavus Karališkosios chemijos draugijos leidimą.

Norėdami sukurti tiksliai apibrėžtas krakmolo struktūras, turime suprasti dalyvaujančius medžiagų apykaitos fermentus, kurių įžvalgos pateikia nuolatiniai modelio gamyklos tyrimai. Arabidopsis thaliana (Santelia ir Zeeman, 2011). Norint sukurti teisingą krakmolo granulių morfologiją, reikia kelių fermentų, o specifinis atskirų fermentų izoformų vaidmuo nėra gerai suprantamas (Ball ir Morell, 2003 Tetlow, 2011). Pavyzdžiui, teisingas sintezė granuliuoto krakmolo prieš intuityviai reikia dviejų degraduojantis izoamilazės (Bustos ir kt., 2004). Sandėliavimo krakmolas susidaro specialių saugojimo organų, tokių kaip grūdai ar gumbai, amiloplastuose, o laikinas krakmolas kaupiamas lapų chloroplastuose, kaip anglies šaltinis fotosintezės ląstelėms naktį. Du plastidai naudoja skirtingus fermentų rinkinius, kad atakuotų krakmolo granules (Smith ir kt., 2005 Smirnova ir kt., 2015). Sandėliavimo organuose granulė yra fermentiškai hidrolizuojama (Radchuk ir kt., 2009), galiausiai išskiriant gliukozę fotosintezės organuose, laikinos krakmolo granulės iš pradžių fosforilinamos specifinių gliukankinazių, o po to suskaidomos į trumpus maltooligosacharidus (Fettkeke ir kt.). , 2009). Yra keletas kiekvienos fermentų klasės izoformų, dalyvaujančių krakmolo sintezėje ir skaidyme, tačiau jų veikimo skirtumai paprastai aiškinami atsižvelgiant į atitinkamo geno ir baltymo ekspresiją, o ne į fermento aktyvumą. per se. Fermentinių reakcijų, vykstančių netirpiame krakmolo substrate, komplikacija lemia šiuos neapdorotus aproksimacijas – situaciją, kurią reikia išspręsti, norint informuoti apie augalų inžinerijos / sintetinės biologijos tyrimus.


Diskusija

Didėjant susirūpinimui dėl pasaulinės energijos ir antropogeninės klimato kaitos, manoma, kad biokuras yra perspektyvi alternatyva pakeisti tradicinį iškastinį kurą 29 . Sparčią biokuro pramonės plėtrą lydi glicerolio, pagrindinio biokuro gamybos šalutinio produkto, perteklius30. Dėl žemos glicerolio kainos ir didelio kiekio prieinamumo jis tapo idealia žaliava įvairių cheminių medžiagų gamybai 30,31,32. Čia mes sukūrėme in vitro biosistemą, skirtą gliceroliui biotransformuoti į pridėtinės vertės chemines medžiagas, turinčias skirtingą redukcijos laipsnį.

Glicerolis gali būti paverstas piruvatu dirbtinės fermentinės reakcijos kaskados, sudarytos iš ALDO, DHAD ir katalazės, pagalba. Vykstant reakcijoms, kuriose nedalyvauja NAD + /NADH, piruvatas gali būti tiesiogiai naudojamas kaip substratas gaminant įvairias chemines medžiagas, tokias kaip N-acetilneuraminatas, acetoinas ir l-tirozinas, pastarasis parodytas šiame tyrime (1 pav.). 1 ir 2). Glicerolio oksidacija O2 nesuteikia redukcinės galios, reikalingos didesnio redukcijos laipsnio cheminėms medžiagoms, tokioms kaip laktatas, alaninas, 2,3-butandiolis ir etanolis, gaminti. Taigi buvo manoma, kad fermentinio kelio sujungimas su NADH regeneravimo sistema, naudojant formiatą ir formato dehidrogenazę, yra galimas šios problemos sprendimas. Tiek l-laktato, tiek d-laktato gamyba dideliu derlingumu ir optiniu grynumu patvirtino šią prielaidą (1 ir 3 pav.). Gaminant piruvatą iš glicerolio, gliceratas būtų gaminamas kaip tarpinis produktas. Be dehidratacijos, kad susidarytų piruvatas, gliceratas taip pat gali būti dehidrogenuojamas, kad susidarytų 3-hidroksipiruvatas ir NADH, kurie gali būti naudingi cheminių gamybos procesų, apimančių savarankišką NADH perdirbimą, procesuose. Čia l-serino gamyba iš glicerolio ir amonio pasiekiama taikant šią koncepciją (1 ir 4 pav.).

Tiek l-tirozinas, tiek l-serinas yra vertingi pirmtakai, naudojami daug kartų maisto, chemijos, farmacijos ir kosmetikos pramonėje33,34. Tačiau fermentacinę l-tirozino ir l-serino sintezę riboja reikalingos daugiapakopės reakcijos ir sudėtingi reguliavimo procesai. Pavyzdžiui, l-serino sintezei ląstelėse iš glicerolio reikia mažiausiai aštuonių fermentų. Sudėtingi fosforilinimo ir slopinimo grįžtamojo ryšio mechanizmai taip pat dalyvauja medžiagų apykaitos procesuose (papildomas 9 pav.). Šiame tyrime buvo sukonstruotos dvi dirbtinai suprojektuotos fermentinės kaskados, gaminančios l-tiroziną ir l-seriną iš glicerolio, naudojant minimalų fermentų skaičių. l -Tirozinas, su an ee didesnis nei 99,9%, buvo pagamintas 77,1% išeiga. Be to, l -serinas, su an ee didesnis nei 99,9 %, buvo pagamintas iš glicerolio 71,3 % išeiga, o tai yra didesnis nei bet kuris iki šiol aprašytas mikrobinės fermentacijos procesas35.

Optiškai grynas laktatas yra platforminė cheminė medžiaga, kurią galima panaudoti daugelyje pramonės sričių 36,37 . Šiais laikais laktato izomerai gali būti pagaminti naudojant mikrobinius procesus su dideliu optiniu grynumu. Tačiau vis dar pageidautina nauja technologija, kuri gali gaminti laktatą iš nebrangių žaliavų ir didelio optinio grynumo, kad būtų galima panaudoti optiškai gryną laktatą. Šiame tyrime optiškai grynas l-laktatas ir d-laktatas (ee 100%) buvo gaminami iš glicerolio dideliu derliumi. NADH regeneracija buvo pasiekta sujungiant sistemą su termostabilia formato dehidrogenaze, kuri išvengė nepageidaujamų šalutinių produktų susidarymo.

Šiame tyrime sukurtų sistemų derlius ir gamybos greitis dar turi būti patobulinti prieš jas naudojant pramonėje. Kai į reakcijos sistemą l-laktatui gaminti buvo pridėta 50 g L-1 glicerolio, per 72 valandas buvo pagaminta tik 34,4 mM l-laktato, kurio produktyvumas buvo 0,48 mM h-1 (papildomas 10 pav.). Mažas kai kurių pagrindinių fermentų, tokių kaip ALDO (0,26 U mg - 1 ) ir DHAD (0, 011 U mg - 1 ), aktyvumas gali būti ribojantys veiksniai, kuriuos reikia atlikti ateityje. Norint išplėsti galimą in vitro sintetinių sistemų taikymą, reikės naujų didelio aktyvumo biokatalizatorių, gautų sistemingai tikrinant arba nukreipus evoliuciją. Atsižvelgiant į NAD + nestabilumą aukštoje temperatūroje, fermentai, galintys naudoti termostabilius ir pigius NAD + analogus, gali paskatinti in vitro biosistemos taikymą. Sistemingas reakcijos sąlygų optimizavimas taip pat gali pagerinti šių sistemų veikimą 14 .

Apibendrinant galima pasakyti, kad didelis glicerolio perteklius, susidaręs dėl dramatiško biokuro pramonės augimo, sukėlė ekonominių ir aplinkosaugos problemų dėl jo šalinimo. Naudodami pasirinktus termostabilius fermentus, sukūrėme visiškai dirbtinę in vitro biosistemą, apimančią skirtingas fermentines kaskadas, kad glicerolis būtų biotransformuojamas į pridėtinės vertės chemines medžiagas, turinčias skirtingą redukcijos laipsnį. L-tirozino gamyba buvo pasiekta kondensuojant glicerolį, amonią ir fenolį be NAD + /NADH susijusių redokso reakcijų pagalbos. Optiškai grynas l-laktatas ir d-laktatas buvo gaminami sujungiant su NADH regeneravimo sistema. L-serino gamyba iš glicerolio ir amonio buvo pasiekta naudojant keturių fermentų kaskadą. In vitro fermentinė sistema gali būti universali ir naudinga platforma pridėtinės vertės cheminėms medžiagoms iš glicerolio gaminti.


Laikymo lipidų biosintezės transkripcijos faktorių ir fermentų ekspresija Jatropha curcas L. ląstelių suspensijos kultūros ir sėklos

Biotechnologijos laboratorijos nariai Universidad de Antioquia, Kolumbija, įskaitant autorius. Pirmoje eilėje iš kairės į dešinę: Laura Michell Carmona (pirmoji autorė), dr. Aura Urrea, dr. Natalia Pabón (Evo-Devo in Plants), dr. Lucia Atehortua (režisierė). Antroje eilutėje iš kairės į dešinę: Ana Maria Henao . Tatiana Osorio, Liliana Monsalve, Juanas Felipe Tamayo. Trečioje eilėje iš kairės į dešinę: Catalina Botero, Sandra Macias, Maria Isabel Quintero, Anngy Amaya. Ketvirta eilė iš kairės į dešinę: Erika Obando, daktarė Adriana Gallego, Liuda Sepulveda, Monica Arias.

Aliejinis augalas Jatropha curcas buvo pasiūlytas kaip perspektyvus biodyzelino gamybos šaltinis, naudojant jo sėklas arba in vitro gamybą ląstelių kultūrose. Šiame darbe parodėme naują požiūrį, kaip suprasti lipidų saugojimo reguliavimą. Palyginome genų ekspresiją tarp endospermo ląstelių plantatuose ir iš endospermo gautų ląstelių suspensijų kultūrose (EDCC). Mes nustatėme unikalią kai kurių transkripcijos veiksnių, galinčių dalyvauti reguliuojant skirtingus procesus, išraišką, įskaitant LEC1, FUS3, ABI3 ir WRI1. Jie galėtų atlikti pagrindinį vaidmenį reguliuojant ankstyvąsias sėklų vystymosi stadijas ir kontroliuojant saugojimo junginių kaupimąsi J. curcas sėklų brendimo metu. Atvirkščiai, šie genai parodė mažesnę genetinę ekspresiją ląstelių suspensijose ir mažiau bendro lipidų kiekio, išskyrus WRI1, kurio ekspresijos lygiai buvo panašūs abiejose sistemose. Puikūs skirtumai tarp abiejų tipų ląstelių leido mums nustatyti svarbų šių genų vaidmenį reguliuojant saugojimo lipidų biosintezę. Mūsų rezultatai suteikia vertingos informacijos, leidžiančios suprasti reguliavimo procesus, atliekamus sėklų vystymosi metu. Be to, pasirodė, kad augalų suspensijos kultūros yra neįkainojama sistema, skirta atlikti biocheminio ir molekulinio lygio lipidų ir kitų metabolitų bei būsimų biotechnologinių pritaikymų tyrimus. Šiame tyrime mes išbandome Jatropha ląstelių suspensijas kaip naftos gamybos platformą in vitro ir pateikiame įrodymų apie pokyčius reaguojant į anglies ir azoto santykį. Padedame pagrindą būsimiems anglies srauto tyrimams, siekiant abiejų būdų, krakmolo ir aliejaus biosintezės šiame aliejingame augale. Pagrindinės Biotechnologijos laboratorijos sritys – biologinė įvairovė, augalų, mikrodumblių, grybų biotechnologijos. Šiuo metu mūsų laboratorija dirba su keliais projektais, pavyzdžiui, embriogeninių Theobroma cacao suspensijų kultūrų kūrimas kaip modelis, skirtas tirti transkripcijos faktorių genų ekspresiją, susijusią su embriogeninio potencialo įgijimu ir saugojimo junginių kaupimosi somatiniuose embrionuose optimizavimui. pagerinti augalų konversijos rodiklius.

Laura Carmona-Rojas, Aura Urrea-Trujillo, Daniel Gil-Arrendondo, Lucia Atehortúa-Garcés, Natalia Pabón-Mora. Sandėliavimo lipidų biosintezės transkripcijos faktorių ir fermentų ekspresija Jatropha curcas L. ląstelių suspensijos kultūros ir sėklos. In vitro ląstelių ir vystymosi biologija – augalas, 57, 164-177, 2021.


Pagrindinės išvados

Programuojamas DNR tinklas pagrįstas suskirstytas savarankiškas replikavimas:

Dramė-Maigné ir kt. sukūrė DNR pagrįstą molekulinį tinklą, skirtą susieti DNR nikuojančio fermento aktyvumą su jį koduojančio geno replikacija per užprogramuotą grįžtamojo ryšio kilpą. Nt.BstNBI (NBI) buvo pasirinktas kaip taikinys, nes jis plačiai naudojamas biotechnologijų pramonėje natūralia forma. Bakterijos, ekspresuojančios mutagenizuotų NBI variantų biblioteką, yra kapsuliuojamos į emulsijos lašelius. Molekulinė programa susideda iš trijų modulių. Pirmasis modulis suvokia NBI varianto aktyvumą ir laikui bėgant tiesiškai generuoja trumpus oligos. Antrasis modulis sustiprina įeinantį signalą iš pirmojo modulio ir eksponentiškai generuoja DNR grandinių kiekį, reikalingą trečiajam moduliui suaktyvinti. Trečiasis ir paskutinis pradmenis generuojantis modulis generuoja tiesioginius ir atvirkštinius pradmenis, skirtus koduojančio geno amplifikacijai, o pradmenų, sukurtų naudojant šią molekulinę programą, kiekis koreliuoja su nikuojančio fermento aktyvumu. Genai, koduojantys aktyvius nikazės variantus, yra praturtinami atrankos telkinyje dėl to, kad yra pakankamai pradmenų, skirtų koduojančios genų sekos PGR amplifikacijai. Autoriai tai įvardija in vitro, be atrankos metodas Programuojamas išorinis tinklas pagrįstas suskirstytas savireprodukcija (PEN CSR).

Šis didelio našumo metodas vienu metu tikrina iki dešimties milijonų genų variantų, o atrankos procedūros atrankos efektyvumas yra labai artimas teoriniam maksimumui.

Gilus mutacijų nuskaitymas, skirtas atskleisti baltymų kūno rengybos kraštovaizdį

Dabartinis NBI naudojimas molekulinėje diagnostikoje ir kitose biotechnologijose yra natūralios formos. Norint pagerinti NBI pritaikymą, pageidautina turėti NBI variantus su padidintu kataliziniu greičiu ir didesniu terminiu stabilumu. Autoriai paveikė baltymą dviejų skirtingų rūšių selektyviu slėgiu: kinetinį stresą, sumažindamas pradmenų amplifikacijos inkubacijos laiką, ir šiluminį stresą, taikydami šilumos šoką 65 ° C temperatūroje. Jie sugebėjo nustatyti palankias mutacijas, būtinas optimaliam kūno funkcionavimui. baltymai veikiant atrankiniam slėgiui. Dauguma mutacijų, kurios veikė geriau esant kinetiniam stresui, pirmiausia buvo susitelkusios aplink nikazės DNR surišimo kišenę. Nors šias mutacijas galima racionalizuoti remiantis turimomis kristalų struktūromis, kitos nustatytos palankios mutacijos buvo paskirstytos ant paviršiaus veikiamų liekanų. Tai rodo, kad baltymų struktūrinių tyrimų ne visada pakanka, kad būtų galima nustatyti likučius, kurie neišvengiamai funkcionuoja, o norint išsamiai suprasti baltymų tinkamumo kraštovaizdį, būtina atlikti gilų baltymų mutacijos nuskaitymą.


Straipsnio informacija

Pigios biogamybos link in vitro sintetinė biologija: dizainas iš apačios į viršų

Y.-H. P. Zhang, S. Myung, C. You, Z. Zhu ir J. A. Rollin, J. Mater. Chem., 2011, 21, 18877 DOI: 10.1039/C1JM12078F

Norėdami paprašyti leidimo atgaminti šio straipsnio medžiagą, eikite į Autorių teisių gynimo centro užklausų puslapį.

Jei esate autorius, prisidedantis prie RSC publikacijos, jums nereikia prašyti leidimo jei bus pateiktas teisingas patvirtinimas.

Jei esate šio straipsnio autorius, jums nereikia prašyti leidimo atgaminti paveikslus ir diagramas jei bus pateiktas teisingas patvirtinimas. Jei norite atkurti visą straipsnį trečiosios šalies leidinyje (išskyrus jūsų disertaciją / disertaciją, kuriai leidimas nereikalingas), eikite į Autorių teisių gynimo centro užklausų puslapį.


In vitro fermentų gamyba – Biologija

Visi MDPI paskelbti straipsniai yra nedelsiant prieinami visame pasaulyje pagal atviros prieigos licenciją. Norint pakartotinai naudoti visą ar dalį MDPI paskelbto straipsnio, įskaitant paveikslus ir lenteles, specialaus leidimo nereikia. Straipsniams, paskelbtiems pagal atviros prieigos Creative Common CC BY licenciją, bet kuri straipsnio dalis gali būti pakartotinai naudojama be leidimo, jei originalus straipsnis yra aiškiai cituojamas.

Pagrindiniai dokumentai yra pažangiausi moksliniai tyrimai, turintys didelį potencialą turėti didelį poveikį šioje srityje. Pagrindiniai straipsniai pateikiami gavus individualų mokslinių redaktorių kvietimą arba rekomendaciją ir prieš paskelbiant juos peržiūrimi.

Pagrindinis dokumentas gali būti originalus mokslinis straipsnis, esminis naujas mokslinis tyrimas, kuris dažnai apima keletą metodų ar požiūrių, arba išsamus apžvalginis dokumentas su glaustais ir tiksliais naujausios pažangos atnaujinimais šioje srityje, kuriame sistemingai apžvelgiami įdomiausi mokslo pasiekimai. literatūra. Šio tipo popieriuje pateikiama ateities tyrimų krypčių ar galimų pritaikymų perspektyva.

„Editor’s Choice“ straipsniai yra pagrįsti MDPI žurnalų iš viso pasaulio mokslinių redaktorių rekomendacijomis. Redaktoriai atrenka nedidelį skaičių neseniai žurnale paskelbtų straipsnių, kurie, jų nuomone, bus ypač įdomūs autoriams arba svarbūs šioje srityje. Tikslas yra pateikti kai kurių įdomiausių darbų, paskelbtų įvairiose žurnalo tyrimų srityse, vaizdą.


Rezultatai

Prekorino-2 sintezėje dalyvaujančių fermentų ekspresija ir gryninimas

Gimtoji PBGS, PBGD, UROS, SUMT ir prekorino-2 dehidrogenazė iš Sinorhizobium meliloti arba Bacillus megatherium sujungti su N-galo His-žyme, buvo gaminami rekombinantiniu būdu E. coli po inkubacijos 30°C per naktį. Išgryninti baltymai buvo analizuojami naudojant SDS-PAGE (S1 pav.). Fermentų molekulinė masė svyravo nuo 25 iki 36 kDa.

Kelių fermentų sistemos sukūrimas prekorinui-2 gaminti

Iš pradžių ALA, NAD ir visų fermentų koncentracijos buvo nustatytos 1 μM. Norėdami patikrinti, ar reakcijos mišinyje buvo sėkmingai pagamintas prekorinas-2, atlikome tyrimą, naudodami prekorin-2 dehidrogenazę. Sirohidrochlorinas, gaminamas iš prekorino-2, naudojant prekorino-2 dehidrogenazę, turi žinomą 376 nm absorbcijos smailę [24, 25]. Kai į reakcijos mišinį buvo pridėta prekorino-2 dehidrogenazės, atsirado absorbcijos smailė ties 376 nm, o tai rodo, kad prekorinas-2 buvo paverstas sirohidrochlorinu (2 pav.). Norėdami įsitikinti, kad visas prekorinas-2 buvo paverstas sirohidrochlorinu, mes ištyrėme tinkamą reakcijai prekorrin-2 dehidrogenazės koncentraciją. Į reakcijos mišinį buvo pridėta įvairių koncentracijų prekorrin-2 dehidrogenazės. Pradinis reakcijos greitis nesiskyrė, kai prekorrin-2 dehidrogenazės koncentracija buvo nuo 0, 5 μM iki 10 μM. Todėl tolesniems eksperimentams pasirinkome naudoti 1 μM prekorrin-2 dehidrogenazę.

Prekorinas-2 buvo pagamintas iš ALA tandeminės fermentinės reakcijos sistema, kurioje yra išgrynintas, rekombinantinis PBGS, PBGD, UROS, SUMT ir SAM (punktyrinė linija), tada prekorinas-2 buvo paverstas sirohidrochlorinu prekorin-2 dehidrogenaze dalyvaujant NAD. (Ištisinė linija).

SAM kofaktorių koncentracijos optimizavimas

SAM yra prekorino-2 sintezės kofaktorius. SUMT yra jautrus SAH slopinimui ir rodo konkurencinį ryšį su SAM [26]. Norint nustatyti optimalią SAM koncentraciją, palengvinančią tiesioginę reakciją, SAM buvo titruojamas į reakcijos mišinį. Pradiniame eksperimente ALA, NAD ir visų fermentų koncentracijos buvo nustatytos 1 μM. Norėdami nustatyti optimalią SAM koncentraciją, reakciją atlikome naudodami 20 μM, 50 μM, 200 μM, 500 μM ir 2 mM SAM. SAM koncentracijai padidėjus nuo 20 μM iki 200 μM, precorrin-2 produktyvumas smarkiai išaugo. Tačiau SAM koncentracijai pakilus virš 200 μM, precorrin-2 produktyvumas pradėjo palaipsniui mažėti (3A pav.).

(A), SAM koncentracijos optimizavimas. Reakcijos mišinyje buvo: 1 mM ALA, 200 μM NAD, 1 μM kiekvieno fermento ir įvairios SAM koncentracijos (20 μM, 50 μM, 200 μM, 500 μM ir 2 mM SAM) (B), ALA koncentracijos optimizavimas. Reakcijos mišinyje buvo: 200 μM SAM, 200 μM NAD, 1 μM kiekvieno fermento ir įvairių koncentracijų ALA (0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 20 mM ir 100 mM). Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SD. Klaidų juostos rodo standartinius trijų biologinių pakartojimų nuokrypius.

ALA ir NAD koncentracijų optimizavimas

SUMT slopinamas, kai uroporfirinogeno III koncentracija viršija 2 μM [26]. Kadangi ALA koncentracija turi tiesioginį poveikį uroporfirinogeno III koncentracijai, siekėme optimalios ALA koncentracijos. Šiam eksperimentui visos fermentų koncentracijos buvo 1 μM, SAM koncentracija buvo 200 μM, o NAD koncentracija buvo 200 μM. Ištirtos ALA koncentracijos buvo 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 20 mM ir 100 mM. Panašiai kaip ir esant skirtingoms SAM koncentracijoms, precorrin-2 produktyvumas iš pradžių padidėjo didėjant ALA ir pasiekė aukščiausią tašką, kai ALA koncentracija pasiekė 5 mM. Precorrin-2 produktyvumas sumažėjo, nes ALA koncentracija toliau didėjo. Pažymėtina, kad kai ALA koncentracija pasiekė 100 mM, nebuvo aptikta prekorino-2. Be to, nustatėme, kad precorrin-2 produktyvumas, kai NAD koncentracija yra 1 μM, viršijo produktyvumą esant 200 μM NAD (visų kitų komponentų koncentracijos buvo pastovios). Taigi vėlesniuose tyrimuose NAD koncentracija buvo fiksuota 1 μM.

Fermentų koncentracijų optimizavimas

Norėdami nustatyti optimalias fermentų koncentracijas kiekvienam iš keturių fermentų, mes titravome kiekvieną fermentą įvairiomis koncentracijomis, po vieną fermentą, pagal jų funkciją kelyje. Tiksliau, PBGS, PBGD, UROS ir SUMT buvo tiriami esant atitinkamai 0,02–3 μM, 0,1–6 μM, 0,1–10 μM ir 0,1–35 μM koncentracijoms. SAM ir ALA koncentracijos buvo fiksuotos atitinkamai 200 μM ir 5 mM. Pirmojo fermento, PBGS, visų kitų fermentų koncentracijos buvo nustatytos 1 μM. Nustačius kiekvieno fermento optimalią koncentraciją, optimali reikšmė buvo naudojama reakcijos mišinyje optimizuojant tolesnius fermentus. Visi fermentai parodė panašų varpelio kreivės modelį (4 pav.). Nustatyta, kad optimalios koncentracijos yra: 0,1 μM PBGS, 1 μM PBGD, 1 μM UROS ir 10 μM SUMT.

Reakcijos mišinyje buvo: 5 mM ALA, 200 μM SAM, 1 mM NAD, 1 μM prekorrin-2 dehidrogenazės ir įvairios koncentracijos titruotų fermentų. (A), PBGS koncentracijos optimizavimas. Reakcijos mišinyje buvo 1 μM PBGD, 1 μM UROS, 1 μM SUMT ir įvairios PBGS koncentracijos nuo 0, 02 iki 3 μM. (B), PBGD koncentracijos optimizavimas. Reakcijos mišinyje buvo 0,1 μM PBGS, 1 μM UROS, 1 μM SUMT ir įvairios koncentracijos PBGD nuo 0,1 iki 6 μM. (C), UROS koncentracijos optimizavimas. Reakcijos mišinyje buvo 0,1 μM PBGS, 1 μM PBGD, 1 μM SUMT ir įvairios UROS koncentracijos nuo 0,1 iki 10 μM. (D), SUMT koncentracijos optimizavimas. Reakcijos mišinyje buvo 0,1 μM PBGS, 1 μM PBGD, 1 μM UROS ir įvairios SUMT koncentracijos nuo 0,1 iki 35 μM. Rezultatai pateikiami kaip 3 pakartojimų vidurkis. Klaidų juostos rodo SD.

Modelių pritaikymas ir statistinė analizė

Nors aukščiau atliktas eksperimentas nustatė kiekvieno fermento optimalią koncentraciją, kai visos kitos reakcijos sudedamosios dalys buvo pastovios, galimybė keisti tik vieno fermento koncentraciją vienu metu riboja mūsų galimybes iš tikrųjų optimizuoti precorrin-2 produktyvumą. Todėl mes taikėme atsako paviršiaus metodiką (RSM), siekdami toliau optimizuoti keturis nepriklausomus kintamuosius. Naudojant aukščiau pateiktą preliminarų eksperimentą optimaliems koncentracijos diapazonams nustatyti, buvo sukurti eksperimentiniai planai su keturiais nepriklausomais kintamaisiais (1 lentelė). Kiekvienas kintamasis buvo įvertintas trimis lygiais: -1 (koncentracija prieš pat optimalią vertę ankstesniame eksperimente), +1 (koncentracija iškart po optimalios vertės ankstesniame eksperimente) ir 0 (-1 ir +1 koncentracija). Stebėti ir numatyti pradiniai greičiai taip pat buvo nustatyti kiekvienam modelio paleidimui. Didžiausias precorrin-2 produktyvumas buvo 23 paleidimas, o visi kintamieji buvo 0 lygyje. Šios koncentracijos yra labai panašios į individualias optimalias koncentracijas, nustatytas ankstesniame eksperimente.

Pagal nuoseklią kvadratų sumą kvadratinis modelis geriausiai tiko tarp tiesinių, 2FI, kvadratinių ir kubinių modelių (P<0,0001). Kadangi šis modelis taip pat buvo nustatytas kaip tinkamiausias pagal tinkamumo testų trūkumą (P = 0,1474) ir R 2 apibendrintą statistiką (pakoreguotas R 2 = 0,8638, prognozuojamas R 2 = 0,6410), toliau pasirinkome taikyti kvadratinį modelį. duomenų analizės. Įvertinome savo RSM modelio svarbą atlikdami visų nepriklausomų kintamųjų ir sąveikų dispersijos analizę (ANOVA) (2 lentelė). Mes nustatėme, kad visi tiesiniai ir kvadratiniai PBGS, PBGD, UROS efektai ir kvadratinis SUMT poveikis yra reikšmingi (P<0,05). Nė vienas šių fermentų sąveikos poveikis nebuvo reikšmingas. Mes taip pat ištyrėme sąveiką tarp precorrin-2 produktyvumo ir įvairių skirtingų fermentų koncentracijų derinių, kai du kintamieji buvo pastovūs 0 koncentracijos lygiu, o kiti du kintamieji buvo keičiami jų eksperimentiniuose diapazonuose. Šios sąveikos buvo pavaizduotos naudojant trimačius atsako paviršiaus diagramas (5 pav.). Pavyzdžiui, kai PBGS koncentracija svyruoja nuo 0,02 μM iki 0,5 μM, precorrin-2 produktyvumas pirmiausia padidėja, o paskui mažėja (5A pav.). PBGD taip pat stipriai veikia precorrin-2 produktyvumą. Tačiau UROS ir SUMT turi mažesnį poveikį precorrin-2 produktyvumui (5B–5D pav.), kaip nurodyta ANOVA analizėje (2 lentelė).

(A), PBGS ir PBGD koncentracijų poveikis. (B), PBGD ir UROS koncentracijų poveikis. (C), UROS ir SUMT koncentracijų poveikis. (D), PBGS ir SUMT koncentracijų poveikis.


Žiūrėti video įrašą: CRE특강-26 신뢰성시험계획. (Birželis 2022).