Informacija

Šilumos šokas vs elektroporacija

Šilumos šokas vs elektroporacija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aš transformavau E. coli per šilumos šoką, kad įterpčiau oligonukleotidus (apie 50 nt); tačiau nė vienas mano eksperimentas iki šiol nedavė teigiamų rezultatų. Pradedu abejoti cheminės transformacijos efektyvumu, ypač trumpų DNR fragmentų atveju. Ar yra toks didelis skirtumas tarp cheminės ir elektros transformacijos?

REDAGUOTI: Aš tikrinu, ar nėra CRISPR masyvo išplėtimo, todėl mano oligos turi protospacer ilgį ir struktūrą. Aš naudoju BL21(DE3) ląsteles, turinčias IPTG indukuojamą T7, kurią pirmiausia transformuoju su Cas1-Cas2 plazmide. Tada aš indukuoju ląsteles, kad išreikštų tuos baltymus, paversčiau jas kompetentingomis ir vėl transformuoju, bet naudodamas oligos ir eGFP plazmidę (tam tikram atrankai). Norėdami patikrinti teigiamus rezultatus, sustiprinu CRISPR masyvo lyderio ir kartojimo sankryžą ir palyginu jos ilgį (elektroforezės būdu) su įprastu masyvu, kuriame nėra integrandų.


Kaip nustatyti potencialiai teigiamą transfekciją? Trumpi fragmentai gali turėti tinkamas teriarines struktūras, dėl kurių jie gali elgtis kitaip, nei tikitės. Be to, necirkuliacinė DNR ir RNR yra nukreipiamos daug greičiau, kad suyra daugumoje ląstelių, jei trūksta tinkamų galvos ar uodegos signalų.

Į jūsų klausimą: impulsinė elektroporacija su gerai paruoštomis bakterijomis (būkle, buferiu,... ) paprastai yra 5-100 kartų efektyvesnė už chemiškai kompetentingas bakterijas.


Praskieskite ligavimo reakciją elektroporacijai - (2008-06-18)

Aš tiek kartų elektroporaciją atlieku BL21 E.coli 1 ul tiesioginiu perrišimu, bet elektroporatoriuje visada blyksteli, todėl svarbu praskiesti ligavimo reakciją ir koks geriausias būdas ją praskiesti.

Taip, praskieskite ddH20 10 kartų ir naudokite 1 ul.

Elektroporacija yra labai efektyvus metodas (palyginti su šilumos šoku), todėl naudojant praskiestą ligavimo reakciją nebus problemų. Tiesą sakant, mano patirtis rodo, kad tai padidina efektyvumą.

Taip, praskieskite ddH20 10 kartų ir naudokite 1 ul.

Elektroporacija yra labai efektyvus metodas (palyginti su šilumos šoku), todėl naudojant praskiestą ligavimo reakciją nebus problemų. Tiesą sakant, mano patirtis rodo, kad tai padidina efektyvumą.

ačiū už idėją šiandien aš pakeičiau praskiestu mišinį ir be blykstės, o rytoj patikrinsiu ne. kolonijos ačiū

Taip, praskieskite ddH20 10 kartų ir naudokite 1 ul.

Elektroporacija yra labai efektyvus metodas (palyginti su šilumos šoku), todėl naudojant praskiestą ligavimo reakciją nebus problemų. Tiesą sakant, mano patirtis rodo, kad tai padidina efektyvumą.

ačiū už idėją šiandien aš pakeičiau praskiestu mišinį ir be blykstės, o rytoj patikrinsiu ne. kolonijos ačiū

daer ląstelių skaitiklis
Nesu laimingas, nes net kontrolinėje plokštelėje nėra kolonijos, ką aš galiu padaryti

Pasiūlymas. Plūduriuokite mažą miliporinį filtravimo popierių ant dd-vandens Petri lėkštelėje ir tiesiog valandai uždėkite 5–10 uL perrišimo mišinio. Po to sugrąžinkite perrišimo mišinį pipete. ir eik į transformaciją. Principas, kaip jau galėjote atspėti, yra „mikro“ dializė druskų šalinimui. Tikimės, kad ji veiks. duok man žinoti..

1. Yra keletas kitų dalykų, kurie gali būti ne taip, todėl turite pašalinti ir kitus aspektus. Pradedant nuo bakterijų padermės, terpės, antibiotikų, elektroporatoriaus, kiuvečių, inkubacijos laiko ir tt Kadangi jau atliekate kontrolinę plazmidės elektroporaciją, jums gali būti gerai ir nešalinant klonavimo dalies (ligavimo ir t. t.), tačiau įsitikinkite, kad valdikliai, kuriuos darote, apima kiekviena galimybė.

Labai bloga mintis bandyti transformuoti BL21 padermes tiesiogiai ligavimo produktu. Sutaupysite laiko ir sielvarto, pirmiausia transformuodami į DH5a, DH10B ar kitą klonavimo padermę, atlikdami mini paruošimą ir transformuodami BL21 plazmidine DNR. BL21 transformacijos efektyvumas yra labai prastas.


Biologinis elektros smūgio ir šilumos denatūracijos bei molekulių, membranų ir ląstelių funkcijų oksidacijos poveikis

Yra žinoma, kad tiesioginis suspensijos ląstelių poveikis intensyviems elektros impulsams gali pakenkti ląstelių membranoms ir supramolekulinėms ląstelių organizacijoms bei denatūruoti makromolekules, panašiai kaip sužeidimai ir įplyšimai, pastebėti pacientams, sergantiems elektros trauma. Taigi sistema buvo naudojama kaip laboratorinis modelis tiriant elektrinio sužalojimo biocheminį pagrindą. Intensyvus elektros impulsas gali sukelti du pagrindinius poveikius ląstelėms – vieną sukelia laukas arba elektrinis potencialas, o kitą – srovė arba elektros energija. Lauko sukeltas transmembraninis potencialas gali sukelti jonų kanalų ir jonų siurblių elektrokonformacinius pokyčius ir, kai potencialas viršija ląstelės membranos dielektrinį stiprumą (apie 500 mV, kai impulso plotis yra kelios ms), elektrokonformacinius pažeidimus ir membraninių baltymų ir lipidų dvisluoksnių elektroporacijos. Dėl šių įvykių elektros srovė praeina per membranas turinčias ląsteles ir įkaista ląstelių membranos bei citoplazminis turinys. Vėlesnis ląstelių membranų ir citoplazminių makromolekulių denatūravimas sukelia daug sudėtingų biocheminių reakcijų, įskaitant baltymų ir lipidų oksidaciją. Bendras poveikis gali suluošinti ląsteles nepataisomai. Šiame pranešime pagrindinis dėmesys bus skiriamas elektros smūgio šiluminiam poveikiui. Trumpai apžvelgus esamas žinias apie tirpių fermentų ir raumenų baltymų terminį denatūravimą, šiame darbe bus aprašyti ląstelių komponentų ir funkcijų, tokių kaip nukleozomos, ir elektronų transportavimo grandinės bei sintetinių ATP fermentų terminio denatūravimo eksperimentai. mitochondrijų vidinės membranos. Duomenys parodys, kad lipidų peroksidacija ir vėlesnis ląstelių energijos perdavimo gebėjimas gali įvykti net esant vidutinei temperatūrai nuo 40 °C iki 45 °C. Tačiau lipidų peroksidacijos galima išvengti naudojant redukuojančius reagentus, tokius kaip merkaptoetanolis, ditiotreitolis, ir askorbo rūgšties. Taip pat gali būti įmanoma pakartotinai suaktyvinti denatūruotus ląstelių baltymus ir funkcijas, ir aptariama strategija, kaip tai padaryti.


Plazmidinės DNR transformacija į E. coli taikant šilumos šoko metodą

Plazmidinės DNR transformacija į E. coli naudojant šilumos šoko metodą yra pagrindinė molekulinės biologijos technika. Jį sudaro svetimos plazmidės arba ligavimo produkto įterpimas į bakterijas. Šiame vaizdo įrašo protokole aprašomas tradicinis transformacijos metodas, naudojant komerciškai prieinamas chemiškai kompetentingas Genlantis bakterijas. Po trumpo inkubavimo lede, chemiškai kompetentingų bakterijų ir DNR mišinys 45 sekundėms dedamas 42 laipsnių C temperatūroje (šilumos šokas), o po to vėl dedamas į ledą. Pridedama SOC terpės ir transformuotos ląstelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje 30 min., maišant. Siekiant užtikrinti, kad kolonijos bus išskirtos, neatsižvelgiant į transformacijos efektyvumą, du transformuotų bakterijų kiekiai yra padengiami. Šis tradicinis protokolas gali būti sėkmingai naudojamas transformuojant daugumą komerciškai prieinamų kompetentingų bakterijų. Genlantis turboelementai taip pat gali būti naudojami naujame 3 minučių transformacijos protokole, aprašytame naudojimo vadove.


Plazmidinės DNR transformacija į E. coli, naudojant šilumos šoko metodą

Plazmidinės DNR transformacija į E. coli naudojant šilumos šoko metodą yra pagrindinė molekulinės biologijos technika. Jį sudaro svetimos plazmidės arba ligavimo produkto įterpimas į bakterijas. Šiame vaizdo įrašo protokole aprašomas tradicinis transformacijos metodas, naudojant komerciškai prieinamas chemiškai kompetentingas Genlantis bakterijas. Po trumpo inkubavimo lede chemiškai kompetentingų bakterijų ir DNR mišinys 45 sekundėms dedamas 42 °C temperatūroje (šilumos šokas), o po to vėl dedamas į ledą. Pridedama SOC terpės ir transformuotos ląstelės inkubuojamos 37 ± 000 °C temperatūroje 30 min., maišant. Siekiant užtikrinti, kad kolonijos bus išskirtos, neatsižvelgiant į transformacijos efektyvumą, du transformuotų bakterijų kiekiai yra padengiami. Šis tradicinis protokolas gali būti sėkmingai naudojamas transformuojant daugumą komerciškai prieinamų kompetentingų bakterijų. Genlantis turboelementai taip pat gali būti naudojami naujame 3 minučių transformacijos protokole, aprašytame naudojimo vadove.


Genų perkėlimo metodai: 6 metodai

Šiame straipsnyje apžvelgiami šeši genų perdavimo būdai. Šeši metodai yra šie: (1) Transformacija (2) Konjugacija (3) Elektroporacija (4) Liposomų sukeltas genų perkėlimas (5) Transdukcija ir (6) Tiesioginis DNR perkėlimas.

Metodas # 1. Transformacija:

Transformacija yra svetimos DNR įvedimo į bakterijų ląsteles (pvz., E. coli) būdas. Plazmidinės DNR įsisavinimas E.coli vykdomas lediniame CaCl2 (0–5 °C), o vėliau – šilumos šoką (37–45 °C apie 90 sek.). Taikant šį metodą, transformacijos dažnis, nurodantis ląstelių populiacijos dalį, kurią galima perkelti, yra pakankamai geras, pvz. maždaug viena ląstelė 1000 (10 -3) ląstelių.

Transformacijos efektyvumas:

Tai reiškia transformantų skaičių viename mikrograme pridėtos DNR. E.coli, transformacijos plazmide, transformacijos efektyvumas yra apie 10 7–10 8 ląstelių viename mikrograme nepažeistos plazmidės DNR. Bakterijų ląstelės, galinčios perimti DNR, laikomos kompetentingomis. Kompetenciją galima sustiprinti keičiant augimo sąlygas.

Transformacijos proceso mechanizmas nėra visiškai suprantamas. Manoma, kad CaCI2 veikia ląstelės sienelę, lūžta lokalizuotose srityse, taip pat yra atsakingas už DNR prisijungimą prie ląstelės paviršiaus. Trumpas šilumos šokas (ty staigus temperatūros padidėjimas nuo 5°C iki 40°C) skatina DNR įsisavinimą. Apskritai, didelio dydžio DNR yra mažiau veiksmingos transformuojant.

Kiti cheminiai transformavimo būdai:

Kalcio fosfatas (vietoj CaCI2) yra pageidaujamas DNR perkėlimui į kultivuojamas ląsteles. Kartais kalcio fosfatas gali sukelti nuosėdų ir toksiškumo ląstelėms. Kai kurie darbuotojai DNR perkėlimui naudoja dietilaminoetildekstraną (DEAE-dekstraną).

2 metodas. Konjugacija:

Konjugacija yra natūralus mikrobų rekombinacijos procesas. Konjugacijos metu dvi gyvos bakterijos (donoras ir recipientas) susijungia, susijungia citoplazminiais tiltais ir perneša vienos grandinės DNR (nuo donoro recipientui). Ląstelės gavėjos viduje naujoji DNR gali integruotis su chromosoma (gana reta) arba gali likti laisva (kaip ir plazmidžių atveju).

Konjugacija gali įvykti tarp skirtingų bakterijų genčių ląstelių (pvz., Salmonella ir Shigella ląstelių). Tai prieštarauja transformacijai, kuri vyksta tarp bakterijų genties ląstelių. Taigi konjugacijos būdu galimas dviejų skirtingų ir nesusijusių bakterijų genų perkėlimas.

Natūralus konjugacijos reiškinys išnaudojamas genų perdavimui. Tai pasiekiama perkeliant plazmidės įterptą DNR iš vienos ląstelės į kitą. Apskritai, plazmidės neturi konjugacinių funkcijų, todėl jos pačios negali perkelti DNR į recipiento ląsteles. Tačiau kai kurias konjugacinių savybių turinčias plazmides galima paruošti ir naudoti.

3 metodas. Elektroporacija:

Elektroporacija grindžiama principu, kad aukštos įtampos elektros impulsai gali sukelti ląstelių plazmos membranų susiliejimą. Taigi elektroporacija yra metodas, apimantis elektrinio lauko sukeltą membranos pralaidumą. Elektros smūgiai taip pat gali paskatinti išorinės DNR (manoma, kad per poras, suformuotas elektros impulsais) įsisavinimą iš suspenduojančio tirpalo.

Elektroporacija yra paprastas ir greitas būdas genams iš įvairių organizmų (mikroorganizmų, augalų ir gyvūnų) įvesti į ląsteles.

Pagrindinė elektroporacijos technika, skirta genams perkelti į žinduolių ląsteles, pavaizduota 6.11 pav. Ląstelės dedamos į tirpalą, kuriame yra DNR, ir veikiamos elektros smūgio, kad membranose atsirastų skylių. Svetimi DNR fragmentai per skylutes patenka į citoplazmą, o po to į branduolį.

Elektroporacija yra veiksmingas būdas transformuoti E.coli ląsteles, kuriose yra plazmidžių, kurių DNR yra ilgesnės nei 100 kb. Transformacijos efektyvumas yra maždaug 10 9 transformantai viename mikrograme DNR mažoms plazmidėms (apie 3 kb) ir apie 10 6 didelėms plazmidėms (apie 130 kb).

4 metodas. Liposomų sukeltas genų perkėlimas:

Liposomos yra žiedinės lipidų molekulės, kurių vandeninis vidus gali pernešti nukleino rūgštis. Buvo sukurti keli metodai, skirti DNR inkapsuliuoti į liposomas. Liposomų sukeltas genų perdavimas, vadinamas lipofekcija, pavaizduotas 6.12 pav.

Apdorojant DNR fragmentą liposomomis, DNR gabalai patenka į liposomų vidų. Šios liposomos gali prilipti prie ląstelių membranų ir susilieti su jomis, kad perneštų DNR fragmentus. Taigi DNR patenka į ląstelę, o po to į branduolį. Teigiamo krūvio liposomos labai efektyviai kompleksuoja su DNR, jungiasi prie ląstelių ir greitai perneša DNR.

Lipofekcija yra labai efektyvi technika ir naudojama genų perkėlimui į bakterijų, gyvūnų ir augalų ląsteles. T

5 metodas. Transdukcija:

Kartais svetima DNR gali būti supakuota į gyvūnų virusus. Šie virusai gali natūraliai užkrėsti ląsteles ir įvesti DNR į šeimininko ląsteles. DNR perkėlimas šiuo metodu vadinamas transdukcija.

6 metodas. Tiesioginis DNR perkėlimas:

Galima tiesiogiai perkelti DNR į ląstelės branduolį. Mikroįpurškimas ir dalelių bombardavimas yra du dažniausiai naudojami metodai.

DNR perkėlimas mikroinjekcijomis paprastai naudojamas kultivuotoms ląstelėms. Šis metodas taip pat naudingas įvedant DNR į dideles ląsteles, tokias kaip oocitai, kiaušinėliai ir ankstyvųjų embrionų ląstelės. Terminas transfekcija vartojamas DNR perkėlimui į eukariotų ląsteles įvairiomis fizinėmis ar cheminėmis priemonėmis.


Šilumos šokas prieš elektroporaciją – biologija

Jūs paprašėte automatinio pasirinkto turinio vertimo iš mūsų duomenų bazių. Ši funkcija teikiama tik jūsų patogumui ir jokiu būdu nėra skirta pakeisti žmogaus atliekamo vertimo. Nei BioOne, nei turinio savininkai ir leidėjai neteikia ir aiškiai atsisako jokių tiesioginių ar numanomų pareiškimų ar garantijų, įskaitant, bet neapsiribojant, pareiškimus ir garantijas dėl vertimo funkcijos funkcionalumo arba vertimo tikslumo ar išsamumo. vertimus.

Vertimai mūsų sistemoje nesaugomi. Naudojantis šia funkcija ir vertimais taikomi visi naudojimo apribojimai, nurodyti BioOne svetainės naudojimo sąlygose.

SALdžiųjų apelsinų (CITRUS SINENSIS (L.) OSBECK) EMBRIOGENINIŲ PROTOPLASTŲ ELEKTROPORACIJA IR TRANSFORMUOTŲ AUGALŲ REGENERACIJA

RANDALL P. NIEDZ, 1,2 W. L. McKENDREE, 1 R. G. SHATTERS Jr. 1

1 Žemės ūkio tyrimų tarnyba, JAV sodininkystės tyrimų laboratorija, 2001 South Rock Road, Ft. Pierce, FL 34945-3030
2 Autorius, kuriam turėtų būti adresuojama korespondencija: [email protected]

Apima PDF ir HTML, jei įmanoma

Šis straipsnis pasiekiamas tik prenumeratorių.
Jo negalima parduoti individualiai.

Elektroporacijos sąlygos buvo optimizuotos protoplastų, išskirtų iš saldžiųjų apelsinų embriogeninių ląstelių linijos, transfekcijai [ Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Hamlinas]. Elektrinio lauko stiprumas (375–450 V cm -1 ), vektorinės DNR koncentracija (100 μg ml -1 ), nešiklio DNR koncentracija (100 μg ml -1 ), elektroporacijos buferis (pH 8) ir protoplastų karščio šokas prieš elektroporaciją (5 min. 45 °C temperatūroje) buvo optimizuoti. Buvo naudojamas plazmidinis vektorius pBI221, turintis β-gliukuronidazę (GUS) koduojančią seką, kontroliuojamą CaMV 35S promotoriumi, ir GUS aktyvumas buvo matuojamas praėjus 24 valandoms po elektroporacijos. Visi kintamieji reikšmingai paveikė transfekcijos efektyvumą ir sujungus optimalias sąlygas kiekvienam, GUS aktyvumas buvo 7714 pmol 4-metilumbelliferono (MU) mg -1 (baltymas) min -1. Tada protoplastai buvo elektroporuoti, dalyvaujant žalio fluorescencinio baltymo (GFP) ekspresijos vektoriams pARS101 arba pARS108. Buvo atrinkti žali fluorescenciniai embrionai, augalai regeneruoti, o transgeno integracija patvirtinta Southern blot analize. Abi plazmidės buvo sukurtos naudojant EGFP, GFP variantą, 35 kartus ryškesnį nei wtGFP, turintį vieną raudonai poslinkį sužadinimo smailę ir optimizuotą žmogaus kodono naudojimui. pARS101 buvo sukurtas EGFP kontroliuojant 35S–35S promotorių, turintį 33 bp neišverstos liucernos mozaikos viruso lyderio sekos. pARS108 buvo sukurtas panašiai, išskyrus tuos atvejus, kai buvo pridėtos sekos, skirtos EGFP transportavimui ir sulaikymui endoplazminio tinklo spindyje.

RANDALL P. NIEDZ, WL McKENDREE ir RG SHATTERS Jr. „SALDŽIŲJŲ Apelsinų (CITRUS SINENSIS (L.) OSBECK) EMBRIOGENINIŲ PROTOPLASTŲ ELEKTROPORACIJA IR TRANSFORMUOTŲ AUGALŲ REGENERAVIMAS“, „In Vitro Cellular“ (6) 586-594, (2003 m. lapkričio 1 d.). https://doi.org/10.1079/IVP2003463

Gauta: 2003 m. vasario 4 d. Priimta: 2003 m. gegužės 1 d. Paskelbta: 2003 m. lapkričio 1 d.

Šis straipsnis pasiekiamas tik prenumeratorių.
Jo negalima parduoti individualiai.


Esė: Genų perdavimo būdai ir privalumai ir trūkumai

Genų perkėlimas yra būdas stabiliai ir efektyviai įvesti funkcinius genus (kurie dažniausiai klonuojami) į tikslines ląsteles. Genetinis perdavimas yra mechanizmas, kuriuo DNR perduodama iš donoro recipientui. Kai donoro DNR yra recipiento viduje, gali įvykti perėjimas. Rezultatas yra rekombinantinė ląstelė, kurios genomas skiriasi nuo donoro ar recipiento. Po perdavimo turi įvykti rekombinacijos įvykis, kad genomo pokytis būtų paveldimas (perduotas kitai kartai). Genai yra esminiai planai, būtini generuojant visus mūsų kūno baltymus, kurie galiausiai atlieka visas biologines funkcijas. Todėl, kai genas efektyviai įvedamas į tikslinę šeimininko ląstelę, gaminamas to geno koduotas baltymas.
Genų perdavimo technologijos iš pradžių buvo sukurtos kaip tyrimo priemonė genų ekspresijai ir jos funkcijoms tirti. Genų perdavimui naudojama daugybė metodų ir natūraliai vykstančių procesų.
Yra būdų, kaip DNR įterpti į daugybę skirtingų ląstelių tipų kultūroje, siekiant ištirti genų funkciją ir reguliavimą arba gaminti didelius kiekius rekombinantinio baltymo.
Todėl ląstelių kultūros buvo naudojamos komerciniu mastu, siekiant susintetinti tokius produktus kaip antikūnai, hormonai, augimo faktoriai, citokinai ir viruso apvalkalo baltymai imunizavimui. Svarbiausias šios technologijos pritaikymas yra in vivo genų terapija, ty DNR įvedimas į gyvų gyvūnų ląsteles ligai gydyti. Nepaprastas pakitusios DNR molekulės potencialas yra sukurti naujas gyvybės formas, kurios yra geriau pritaikytos išgyvenimui. DNR bazinės sekos pasikeitimas lemia baltymų pokyčius, sukeliančius ligą, kurią galima ištaisyti manipuliuojant genu. Daug dėmesio skirta genų manipuliacijai sergant širdies ir kraujagyslių ligomis, Parkinsono liga, lizosominiais sutrikimais, akių genų terapija ir osteoartritu.
Genų perdavimo strategijų apžvalga:
Genų perkėlimas iš esmės gali būti pasiektas trimis būdais. Paprasčiausias yra tiesioginis DNR perkėlimas, fizinis svetimos DNR įvedimas tiesiai į ląstelę. Pavyzdžiui, kultivuojamose ląstelėse tai galima padaryti mikroinjekcija, o ląsteles in vivo tiesioginis perkėlimas dažnai pasiekiamas bombarduojant mažytėmis DNR dengtomis metalo dalelėmis. Antrasis būdas vadinamas transfekcija, ir tai apima daugybę metodų, kai kuriuos cheminius ir kai kuriuos fizinius, kurie gali būti naudojami įtikinant ląsteles paimti DNR iš savo aplinkos. Trečia – supakuoti DNR viduje
gyvūnų virusas, nes virusai sukūrė mechanizmus natūraliai užkrėsti ląsteles ir įvesti savo nukleino rūgštį. Svetimos DNR perkėlimas į ląstelę šiuo būdu vadinamas transdukcija.
DNR perdavimo metodų pasirinkimas priklauso nuo tikslinių ląstelių, kuriose bus atlikta transformacija. Tai taip pat priklauso nuo genų manipuliavimo tikslų. Transfekcija gali būti stabili arba laikina. Nors DNR perdavimo metodo pasirinkimas yra labai svarbus, kiti svarbūs žingsniai yra geno atranka, geno išskyrimas, rekombinantinės DNR paruošimas ir transformuotų ląstelių atranka. Ne mažiau svarbus ir organizmo atsinaujinimas su naujomis savybėmis. Genų pristatymas in vitro gali būti atliekamas apdorojant ląsteles virusais, tokiais kaip retrovirusas arba adenovirusas, kalcio fosfatas, liposomos, dalelių bombardavimas, smulkia adata atvira DNR injekcija, elektroporacija arba bet koks šių metodų derinys. Tai yra galingi tyrimo įrankiai ir gali būti pritaikyti genų terapijoje.
VEIKSNIAI, Į KURIĄ ATKREIPKITE DĖMESĮ PASIRENKANT GENŲ PRISTATYMO BŪDĄ
Dėl naujų technologijų pažangos genų pristatymas tapo efektyvesnis, bet ir painesnis, atsižvelgiant į dabar prieinamą didžiulę reagentų ir metodų įvairovę. Norint nustatyti geriausią genų pristatymo metodą bet kuriam konkrečiam eksperimentui, reikia atidžiai apsvarstyti daugybę skirtingų veiksnių, kaip nurodyta toliau.
1. Ląstelių kontekstas arba aplinka – Ląstelių kontekstas arba aplinka (t. y. in vivo, palyginti su
vitro ir ex vivo), į kurią bus tiekiamos nukleorūgštys, yra pirmas veiksnys, į kurį reikia atsižvelgti
sprendžiant dėl ​​genų perdavimo metodo. Kliūtys ir iššūkiai, kuriuos sukelia pristatymas į
In vitro ląstelių kultūros labai skiriasi nuo in vivo arba ex vivo ląstelių kultūros, todėl reikia
įvairių priemonių ir technikų jiems įveikti. Pavyzdžiui, nukreipiant nukleino rūgštis į
tam tikroms ląstelėms, vengiant kitų ląstelių, paprastai yra pagrindinis susirūpinimas dėl genų perdavimo in vivo
kai kuriais atvejais tai susiję su ex vivo taikymu, bet paprastai nerūpi in vitro
programos.
Kitas svarbus klausimas, kuris turi būti sprendžiamas planuojant in vivo (bet ne in vitro) geną
pristatymo tyrimai yra genų perdavimo sistemos imunogeniškumas. Tai ypač svarbu svarstant tam tikrų anksčiau aptartų virusinių vektorių, kurie gali būti labai imunogeniški, naudojimą. Taip pat su imunogeniškumu susijęs ir bendrojo saugumo klausimas tiek eksperimentuotojui, tiek bet kokio tyrimo, kuriame naudojama transfekcija, subjektui. Beveik visada, naudojant virusinius vektorius, reikia imtis labai didelių saugos priemonių nei naudojant sintetinius transfekcijos metodus.
2. Ląstelės arba audinio tipas – Ląstelių arba audinių, į kuriuos bus nukreiptos nukleino rūgštys, kilmė
perkeltas paprastai yra antrasis parametras, į kurį atsižvelgiama renkantis geno pristatymą
metodas. Dėl daugelio skirtingų priežasčių ląstelių nukleorūgščių tiekimo sunkumai skiriasi
nuo ląstelės tipo iki ląstelės tipo. Dėl šios priežasties visada svarbu peržiūrėti literatūrą
nustatyti, ar dominanti ląstelės rūšis anksčiau buvo panaudota genų perdavimo eksperimentams,
kokie tikslūs metodai buvo naudojami ir koks pristatymo efektyvumas buvo pasiektas, t. y. koks
faktiškai transfekuotų arba transdukuotų ląstelių procentas, naudojant kiekvieną metodą.
Tam tikri ląstelių tipai dažnai apibūdinami kaip „nepaprastai sunkiai transfekuojami“.
Tai apima daugelio veislių pirmines ląstelių kultūras. Sėkmingas genų perkėlimas į tokias ląsteles
prieš pasirenkant bet kurį konkretų genų pristatymo būdą, paprastai reikia atlikti daug tyrimų.
3. Pristatymo efektyvumas – Daugumoje programų transfekuoti arba transdukuoti tiek ląstelių, kiek
galima, ypač kai būtina nustatyti reto transgeno buvimą
Produktai. Taigi svarbu nustatyti tam tikro pristatymo efektyvumo lygį
prieš priimdami sprendimą dėl konkretaus genų perdavimo metodo. Daugeliu atvejų nustatoma, kad
Virusiniai vektoriai užtikrina didžiausią pristatymo efektyvumą. Kai kuriose dažniausiai naudojamose ir lengvai transfekuojamose ląstelių linijose katijoniniai lipidai savo genų perdavimo efektyvumu beveik atitinka virusinius vektorius, tuo pačiu užtikrinant saugesnes ir daug greitesnes procedūras.
4. Stabilus ir trumpalaikis genų pristatymas – Genų perdavimo procedūros dažnai skirstomos į kategorijas
pagal tai, ar pristatytas genas lieka atskirtas nuo ląstelės-šeimininkės chromosomos, ar yra integruotas į šeimininko ląstelės chromosomą. Pirmuoju atveju, vadinamu trumpalaikiu genų pristatymu, transgeno ekspresija paprastai išsisklaido praėjus tam tikram laikotarpiui –
kelias dienas –, nes ekspresijos vektorius yra suardytas arba pašalintas iš ląstelės-šeimininkės.
Antruoju atveju, žinomu kaip stabilus genų pristatymas, perkelto geno ekspresija yra
pailgėjęs arba stabilus, nes vektorius yra integruotas į šeimininko ląstelės chromosomą. Akivaizdu,
skirtingoms programoms reikalingi skirtingi transgeno ekspresijos laikotarpiai. Taigi, atsargus
skirtingų genų pristatymo metodų palyginimas leis tinkamai pasirinkti
generuojant norimą trumpalaikę arba stabilią išraišką.
Virusinių vektorių atveju nustatant, ar konkretus virusas yra tinkamas stabiliam ar trumpalaikiam
transdukcija yra tiesiog bendrųjų vektoriaus charakteristikų išmokimo dalykas. Byloje
cheminio ar fizinio/mechaninio genų perdavimo, nustatant, ar tam tikras metodas yra
tinka trumpalaikiam arba stabiliam pristatymui gali būti taip pat paprasta, kaip skaityti pardavimų literatūrą iš
gamintojo arba tikrinant pirminę mokslinių tyrimų literatūrą.
5. Pateiktos molekulės tipas – Kitas veiksnys, į kurį reikia atsižvelgti renkantis geno pristatymą
metodas yra tai, kokio tipo nukleorūgštis ar kita molekulė yra transfekuojama arba transdukuojama. Dėl
Pavyzdžiui, reagentas, kuris efektyviai tiekia plazmides, gali neefektyviai pristatyti DNR
oligonukleotidai. Dažnai lengviausia tiesiog peržiūrėti literatūrą, kad sužinotumėte, kokie metodai buvo sėkmingai naudojami, ir susisiekti su kitais tyrinėtojais, turinčiais dominančios molekulės pristatymo patirties.
6. Citotoksiškumas – Kita problema, kuri dažnai iškyla renkantis vieną iš skirtingų genų
pristatymo metodai yra įvairių metodų ir reagentų citotoksiškumas. Kai kurie metodai, pvz
kaip elektroporacija ir genų ginklai, gali būti itin atšiaurūs ląstelėms ir dažnai baigiasi mirtimi
daugumos ląstelių. Be to, DEAE-dekstranas gali būti gana griežtas kai kurių tipų ląstelėms, ypač
kai DMSO arba glicerolio šoko etapas naudojamas kaip procedūros dalis. Kai kuriose programose
pavyzdžiui, kai reikalingas nedidelis transfektantų skaičius iš nepaklusnios ląstelės tipo, tai yra
ne bėda. Tačiau daugeliu atvejų didelis ląstelių mirties procentas yra tiesiog
nepriimtina. Turimų katijoninių lipidų ir polimerų reagentų gausa skiriasi
toksiškumo laipsniai su skirtingais ląstelių tipais, o jų koncentracija transfekcijos metu gali būti
optimizuotas, kai reikia, siekiant sumažinti ląstelių mirtį.
7. Suspensija prieš prilipusias ląsteles – Dažniausiai transfekuotos ląstelės auga – ir yra
transfekuota –, kai yra pritvirtinta prie tam tikros rūšies atramos, nesvarbu, ar ta atrama yra iš audinio
iš kurių jie yra gauti, kokia nors inertiška membrana ar pastoliai arba audinių kultūros paviršius
plokštelė. Mažiau paplitusios ląstelės, kurios auga suspenduotos terpėje, pavyzdžiui, gautos iš
kraujas ir kiti kūno skysčiai. Suspensijos ląsteles paprastai sunkiau transfekuoti
todėl gali tekti pasikliauti griežtesniais genų pristatymo būdais, pvz
elektroporacija, genų pistoletai, mikroinjekcija arba virusiniai vektoriai priimtinam transfekcijos lygiui.
Be to, kai kurie katijoniniai lipidai gali veiksmingai transfekuoti suspensijos ląsteles, todėl juos reikia išbandyti
dėl jų paprastumo ir ekonomiškumo.
8. Patirtis – Sunkumo laipsnis atliekant įvairius transfekcijos būdus gali
labai skiriasi, todėl tyrėjo kompetencija ir patirtis paprastai yra a
svarbus veiksnys, į kurį reikia atsižvelgti. Pavyzdžiui, tokie metodai kaip mikroinjekcija ir virusų transfekcijos metodai visada yra sudėtingesni nei katijoniniai lipidai ir polimeriniai reagentai. Be to, iš cheminių metodų kalcio fosfato bendras nusodinimas gali būti gana sudėtingas dėl jo jautrumo nedideliems eksperimentinių sąlygų pokyčiams.
9. Laikas – Kitas svarbus veiksnys, į kurį reikia atsižvelgti, yra laikas, reikalingas genų pristatymui. Virusinis
Metodai, nors ir labai veiksmingi, gali užtrukti gana daug laiko ir paprastai užtrunka nuo dviejų savaičių iki vieno mėnesio. Priešingai, cheminiai ir fiziniai / mechaniniai metodai paprastai gali būti baigti per kelias dienas, tačiau dažnai jie užtikrina mažesnį transfekcijos efektyvumą. Taigi neretai tenka palyginti greitesnių rezultatų ir mažesnio darbo naudą su didesnio efektyvumo nauda.
10 Kaina – Galiausiai kaina gali būti pagrindinis veiksnys sprendžiant dėl ​​geriausio geno pristatymo
metodas tam tikrai programai. Brangiausi metodai paprastai yra
fiziniai / mechaniniai metodai, tokie kaip elektroporacija ir genų ginklai, dėl specializuotų
įranga, kurios jiems reikia. Viruso genų pristatymas yra bene antras brangiausias būdas, nes norint atlikti ilgas vektorių paruošimo procedūras, taip pat tinkamai šalinti virusines atliekas, reikia naudoti vektorinius reagentus, daug laiko ir darbo.
Trečiasis brangiausias genų pristatymo būdas naudoja polimerus ir katijoninius lipidus, kuriems nereikia jokios specializuotos įrangos ar ilgų virusinio vektoriaus paruošimo etapų. Tokie reagentai paprastai kainuoja šimtus dolerių, priklausomai nuo atliekamų transfekcijų skaičiaus. Galiausiai, pigiausiuose metoduose naudojamas kalcio fosfatas, kuris yra pigus ir gausus mineralas, ir plika DNR, kuriai akivaizdžiai nereikia transfekcijos reagento išlaidų, tačiau ji gali būti labai neefektyvi.
GENŲ PERDAVIMO TECHNIKA
TRANSFORMACIJA
Transformacija yra natūraliai vykstantis genų perdavimo procesas, kurio metu ląstelė absorbuoja genetinę medžiagą per ląstelės membraną, sukeldama svetimos DNR susiliejimą su natūralia DNR, o tai lemia gautos DNR genetinę ekspresiją. Transformacija apima „plikos“ DNR (DNR, neįtrauktos į tokias struktūras kaip chromosomos) pasisavinimą kompetentingų bakterijų ląstelių. Ląstelės yra kompetentingos (gali paimti DNR) tik tam tikru savo gyvavimo ciklo etapu, matyt, iki ląstelės sienelės sintezės pabaigos.
Transformacija paprastai yra natūralus genų perdavimo būdas, tačiau dėl technologinės pažangos atsirado dirbtinė arba sukelta transformacija. Taigi yra du tipai, vadinami natūralia transformacija ir dirbtine arba sukelta transformacija. Natūralios transformacijos metu svetima DNR prisitvirtina prie šeimininko ląstelės DNR receptoriaus ir baltyminės DNR translokazės pagalba patenka į šeimininko ląstelę. Nukleazių buvimas riboja dviejų DNR grandinių patekimą, sunaikina vieną grandinę, todėl tik viena grandinė gali patekti į ląstelę šeimininką. Bet kuri DNR, kuri nėra integruota į chromosomą, bus suskaidyta. Ši vienos grandinės DNR sėkmingai susimaišo su šeimininko genetine medžiaga.
Dirbtinis arba indukuotas transformacijos metodas atliekamas laboratorinėmis sąlygomis, kurios yra arba cheminis tarpininkaujantis genų perkėlimas, arba elektroporacija. Genetikos inžinieriai gali paskatinti kompetenciją įdėdami ląsteles į tam tikrus tirpalus, kuriuose paprastai yra kalcio druskų. Įvedimo vietoje endonukleazės supjausto DNR į 7 000–10 000 nukleotidų fragmentus, o dvigrandė DNR atsiskiria į vieną grandinę. Vienos grandinės DNR gali rekombinuotis su šeimininko chromosoma, patekusi į ląstelę. Ši rekombinacija pakeičia šeimininko geną varianto –, nors ir homologiniu – genu.
Trūkumai:
DNR iš glaudžiai susijusios genties gali būti įgyta, tačiau paprastai DNR nesikeičia tarp toli giminingų mikrobų.
Ne visos bakterijos gali tapti kompetentingos.
KONJUGAVIMAS
Konjugacija yra daugelio rūšių bakterijų genų perdavimo priemonė. Ląstelių kontaktas naudojant specializuotą priedą, žinomą kaip F-pilus (arba lytinis pilus), leidžia F-plazmidės (vaisingumo plazmidės) kopijai perkelti į ląstelę, kurioje nėra plazmidės. Retais atvejais F-plazmidė gali integruotis į savo bakterinio šeimininko chromosomą ir generuoti vadinamąją Hfr (didelio rekombinacijos dažnio) ląstelę. Tokia ląstelė taip pat gali nukreipti sekso pilo sintezę. Kai Hfr ląstelės chromosoma replikuojasi, ji gali pradėti kirsti pilusą, kad plazmidė ir chromosominė DNR pereina į ląstelę recipientą. Tokia DNR gali rekombinuotis su savo naujojo šeimininko DNR, įvedant naujus genų variantus. Plazmidės, koduojančios virulentiškumo faktorių ir atsparumo antibiotikams genus, perduodamos per bakterijų populiacijas ir tarp kelių rūšių bakterijų konjugacijos būdu.
Laboratorijoje konjugacija gali būti naudojama perkeliant sutrikusius genus į savaime perduodamą plazmidę, sukurti mutantinę padermę. Dominantis genas iš recipiento E. coli padermės klonuojamas į savaime perduodamą vektorių ir palaikomas donoro kamiene genetinei manipuliacijai. Tada ištrinta geno konstrukcija konjugacijos būdu perkeliama iš donoro padermės atgal į recipiento padermę.
PERDAVIMAS
Transdukcija yra kitas būdas perkelti genus iš vienos bakterijos į kitą. Perkėlimą tarpininkauja bakteriofagai. Bakteriofago infekcija prasideda, kai virusas suleidžia savo DNR į bakterijos ląstelę. Tada bakteriofago DNR gali nukreipti naujų viruso komponentų, surinktų bakterijoje, sintezę. Bakteriofago DNR yra replikuojama ir supakuota į fago daleles. Infekcinio ciklo pradžioje fagas koduoja fermentą, kuris skaido ląstelės šeimininkės DNR. Kai kurie iš šių bakterijų DNR fragmentų yra supakuoti į bakteriofago daleles, užimdami fago DNR vietą. Didėjant fagų skaičiui, ląstelė atidaroma (lizuojama). Išleistas iš užkrėstos ląstelės, fagas, kuriame yra bakterijų genų, gali ir toliau užkrėsti naują bakterinę ląstelę, pernešdamas bakterijų genus.
Sometimes genes transferred in this manner become integrated into the genome of their new bacterial host by homologous recombination. Such transduced bacteria are not lysed because they do not contain adequate phage DNA for viral synthesis and these phages can enter an alternate life cycle called lysogeny. In this cycle, all the virus’s DNA becomes integrated into the genome of the host bacterium. The integrated phage, called a prophage, can confer new properties to the bacterium.
Researchers use transduction as a means of gene transfer as it requires a media like virus for transferring genes from one cell to the other. Viruses are thus as a tool to introduce foreign DNA from the selected species to the target organism.
There are two types of transduction called as generalized transduction in which any of the bacterial gene is transferred via the bacteriophage to the other bacteria and specialized transduction involves transfer of limited or selected set of genes.
Viral vectors for gene transfer:
The use of viruses as vectors for transduction, i.e. the introduction of genes into animal cells by exploiting the natural ability of the virus particle, within which the transgene is packaged, to adsorb to the surface of the cell and gain entry is being employed . Due to the efficiency with which viruses can deliver their nucleic acid into cells and the high levels of replication
and gene expression it is possible to achieve, viruses have been used as vectors not only for gene expression in cultured cells but also for gene transfer to living animals. Four classes of viral vector have been developed for use in human gene therapy and have reached phase 1 clinical trials. These are the retrovirus, adenovirus, herpesvirus and adenoassociated virus (AAV) vectors . Before introducing the individual vector systems,we discuss some general properties of viral transduction vectors. Transgenes may be incorporated into
viral vectors either by addition to the whole genome or by replacing one or more viral genes. This is generally achieved either by ligation (many viruses have been modified to incorporate unique restriction sites) or homologous recombination.
For many applications, it is favourable to use vectors from which all viral coding sequences have been deleted.These amplicons (also described as ‘gutless vectors’) contain just the cis-acting elements required for packaging and genome replication. The advantage of such vectors is their high capacity for foreign DNA and the fact that, since no viral gene products are made, the vector has no intrinsic cytotoxic effects. The choice of vector depends on the particular properties of the virus and the intended host, whether transient or stable expression is required and how much DNA needs to be packaged. For example, icosahedral viruses such as adenoviruses and retroviruses package their genomes into preformed capsids, whose volume defines the maximum amount of foreign DNA that can be accommodated. Conversely, rod-shaped viruses such as the baculoviruses form the capsid around the genome, so there are no such size constraints. There is no ideal virus for gene transfer ‘ each has its own advantages and disadvantages. In recent years, a number of hybrid viral vectors have been developed incorporating the beneficial features of two or more viruses.
Privalumai:
1) viral vectors that especially efficient at transducing the intended cell type but not other cell types.
2) retroviruses are particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
Limitations:
1) cannot deliver genes to terminally differentiated cells
2) viral vectors may be highly immunogenic
TRANSFECTION BY CHEMICAL METHODS
One of the methods of gene transfer where the genetic material is deliberately introduced into the animal cell in view of studying various functions of proteins and the gene is transfection. This mode of gene transfer involves creation of pores on the cell membrane enabling the cell to receive the foreign genetic material. When transformation is carried out in eukaryotic cells it is termed as transfection.
1) Calcium phosphate mediated DNA transfer
The process involves a mixture of isolated DNA (10-100ug) with solution of
calcium chloride and potassium phosphate. . When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface .Cells are then incubated with precipitated DNA either in solution or in tissue culture dish. A fraction of cells will take up the calcium phosphate DNA precipitate by a process not entirely understood but thought to be endocytosis.
Transfection efficiencies using calcium phosphate can be quite low, in the range of 1-2 % . Tai gali
be increased if very high purity DNA is used and the precipitate allowed to form slowly.
Apribojimai
1. Frequency is very low.
2. Integrated genes undergo substantial modification.
3. Many cells do not like having the solid precipitate adhering to them
and the surface of their culture vessel.
4. Integration with host cell chromosome is random.
5, Due to above limitations transfection applied to somatic gene therapy
yra ribotas.
Programos:
This technique is used for introducing DNA into mammalian cells. This process has been a preferred method of identifying many oncogenes.
2)DNA transfer by DAE-Dextran method:
DNA can be transferred with the help of DAE Dextran also. DAE-Dextran may be used in the
transfection medium in which DNA is present. This is a polycationic, high molecular weight substance and is convenient for transient assays. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis.
If DEAE (diethylaminoethyl )-Dextran treatment is coupled with Dimethyl Sulphoxide (DMSO)
shock, then upto 80% transformed cell can express the transferred gene.
Privalumai:
The advantage of this method is that, it is cheap, simple and can be used for transient cells
which cannot survive even short exposure of calcium phosphate.
The major advantages of the technique are its relative simplicity and speed, limited expense, and remarkably reproducible interexperimental and intraexperimental transfection efficiency.
Limitations:
Disadvantages include inhibition of cell growth and induction of heterogeneous morphological changes in cells.
Furthermore, the concentration of serum in the culture medium must be transiently reduced during the transfection.
It does not appear to be efficient for the production of stable transfectants.
For cells that grow in suspension, electroporation or lipofection is usually preferred, although DEAE-dextran-mediated transfection can be used.
Transfer of DNA by polycation-DMSO:
As calcium phosphate method of DNA transfer is reproducible and efficient but there is narrow range of optimum conditions. DNA transfer by
Another polycationic chemical,the detergent Polybrene is carried out to increase the adsorption of DNA to the cell surface followed by a brief treatment with 25-30% DMSO to increase membrane permeability and enhance uptake of DNA. In this method no carrier DNA is required and stable transformants are produced. This method works with mouse fibroblast and chick embryo.
LIPOSOME MEDIATED GENE TRANSFER
Liposomes are spheres of lipids which can be used to transport molecules into the cells. These are artificial vesicles that can act as delivery agents for exogenous materials including transgenes. They are considered as spheres of lipid bilayers surrounding the molecule to be transported and promote transport after fusing with the cell membrane.
Liposomes for use as gene transfer vehicles are prepared by adding an appropriate mix of bilayer constituents to an aqueous solution of DNA molecules. In this aqueous environment, phospholipid hydrophilic heads associate with water while hydrophobic tails self-associate to exclude water from within the lipid bilayer. This self-organizing process creates discrete spheres of continuous lipid bilayer membrane enveloping a small quantity of DNA solution. The liposomes are then ready to be added to target cells. Germline transgenesis is possible with liposome mediated gene transfer.Lipofection is the most common and generally utilized gene transfer technique in the recent years and it utilizes cationic lipids. The combined DNA and cationic lipids act instantaneously to form structures called as lipoplexes that are more complex in structure than the simple liposomes. Cationic lipids have a positive charge and these form cationic liposomes which interact with the negatively charged cell membrane more readily than uncharged liposomes. This leads to a fusion between cationic liposome and the cell surface resulting in quick entry by endocytosis and the delivery of the DNA directly across the plasma membrane. Cationic liposomes can be produced from a number of cationic lipids that are commercially available and sold as an in vitro-transfecting agent, termed lipofectin.
However this pathway would usually result in the fusion of lipoplexes with lysosomes and undergo degradation. This problem is overcome by utilizing the neutral helper lipids, which are generally included along with the cationic lipid. This allows entrapped DNA to escape the endosomes, reach the nucleus and get access to the cell’s transcriptional machinery.The endosomal structure is destroyed by increasing the osmotic pressure created by the lipids’ buffering action within the endosomes and by the fusion of the lipid with the endosomal membrane. The ability of a lipid to destroy endosomes is one of the main characteristics of a transfection reagent.
Privalumai
1. Simplicity.
2. Long term stability.
3. Low toxicity.
4. Protection of nucleic acid from degradation.
5. particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
6. cationic lipids effectively transfect suspension cells.
Limitations:
1) Cannot deliver genes to terminally differentiated cells
ELECTROPORATION
A rapid and simple technique for introducing genes into a wide variety of microbial, plant and animal cells, including E. coli, is electroporation. Electroporation uses electrical pulse to produce transient pores in the plasma membrane thereby allowing macromolecules into the cells. These pores are known as electropores which allow the molecules, ions and water to pass from one side of the membrane to another. The electropores reseal spontaneously and the cell can recover. The pores can be recovered only if a suitable electric pulse is applied .The formation of electropores depends upon the cells that are used and the amplitude and duration of the electric pulse that is applied to them. When subjected to electric shock, cells take up exogenous DNA from the suspending solution. Once inside the cell, the DNA is integrated and the foreign gene will express. A proportion of these cells become stably transformed and can be selected if a suitable marker gene is carried on the transforming DNA. The most critical parameters are the intensity and duration of the electric pulse, and these must be determined empirically for different cell types. Electric currents can lead to dramatic heating of the cells that can results in cell death. Heating effects are minimized by using relatively high amplitude, a short duration pulse or by using two very short duration pulses. However, once optimal electroporation parameters have been established, the method is simple to carry out and highly reproducible.
Many different factors affect the efficiency of electroporation, including temperature,
various electric-field parameters (voltage, resistance and capacitance), topological form of the DNA,
and various host-cell factors (genetic background, growth conditions) and post-pulse treatment.
General applications of electroporation.
1. Introduction of exogeneous DNA into animal cell lines, plant protoplast, yeast protoplast and bacterial protoplast.
2. Electroporation can be used to increase efficiency of transformation or transfection of bacterial cells.
3. Wheat, rice, maize, tobacco have been stably transformed with frequency upto 1% by this method.
4. Genes encoding selectable marker may be used to introduce genes using electroporation.
5. To study the transient expression of molecular constructs.
6. Electroporation of early embryo may result in the production of transgenic animals.
7. Hepatocytes, epidermal cells, haematopoietic stem cells, fibroblast, mouse T and B lymphocytes can be transformed by this technique.
8. Naked DNA may be used for gene therapy by applying electroporation device on animal cells.
Advantages of electroporation.
1. Method is fast.
2. Less costly.
3. Applied for a number of cell types.
4. Simultaneously a large number of cell can be treated.
5. High percentage of stable transformants can be produced.
DRAWBACKs
1)Limited effective range of

1 cm between the electrodes.
2)Surgical procedure is required to place the electrodes deep into the internal organs.
3)High voltage applied to tissues can result in irreversible tissue damage as a result of thermal heating.
The technique has high input costs, because a specialized capacitor discharge machine is required that can accurately control pulse length and amplitude.
4) Larger numbers of cells may be required than for other methods because, in many cases, the most efficient electroporation occurs when there is up to 50% cell death.
ULTRASONICATION
Sonication is the act of applying sound energy to agitate particles in a sample. Ultrasonic frequencies (>20 kHz) are usually used, leading to the process also being known as ultrasonication . Sonoporation, or cellular sonication, is the use of these ultrasonic frequencies for modifying the permeability of the cell plasma membrane. This technique is usually used in molecular biology and non-viral gene therapy in order to allow uptake of large molecules such as DNA into the cell, in a cell disruption process called transfection or transformation. Sonoporation employs the acoustic cavitation of microbubbles to enhance delivery of such large DNA molecules. Although the early results could achieve only 10- to 30-fold increases in transfection efficiency in vitro, technical refinements have lead to enhancements of up to several thousand fold in vitro ,sufficient to encourage ultrasonication mediated gene transfer in vivo.
Privalumai:
1) It is non-invasive and well tolerated,
2)extraordinary safety record over a wide range of frequency and intensity
3)high levels of public acceptability and understanding.
there are highly sophisticated, flexible, cost-effective and readily available diagnostic and therapeutic systems that can achieve site-specific transfer of ultrasound energy almost anywhere in the body, except perhaps the lung.
4) The bioactivity of this technique is similar to, and in some cases found superior to, electroporation.
5) in vivo is relatively nontoxic.
Limitations:
1)Extended exposure to low-frequency (<MHz) ultrasound has been demonstrated to result in complete cellular death (rupturing) as well as microvascular hemorrhage and disruption of tissue structure, thus cellular viability must also be accounted for when employing this technique.
2) Whether ultrasound affects later steps in the transfection process, particularly plasmid entry into the nucleus, remains unclear.
Programos:
Sonoporation is under active study for the introduction of foreign genes in tissue culture cells, especially mammalian cells. Sonoporation is also being studied for use in targetedGene therapy in vivo, in a medical treatment scenario whereby a patient is given modified DNA, and an ultrasonic transducer might target this modified DNA into specific regions of the patient’s body.
MICROINJECTION
In microinjection DNA can be introduced into cells or protoplast with the help of very fine needles or
glass micropipettes having the diameter of 0.5 to 10 micrometer. The DNA may be directly delivered into the nucleus or in the cytoplasm. Some of the DNA injected may be taken up by the nucleus. The desired gene in the form of plasmid or alone is injected directly into the plant protoplast.
Injection into the nucleus is more efficient than that into the cytoplasm. Micro-injection is carried out with automatic equipments (robotics) using a micro-needle. Computerized control of holding pipette, needle, microscope stage and video technology has improved the efficiency of this technique.
Advantages of microinjection.
1. Frequency of stable integration of DNA is far better as compare to other methods.
2. Method is effective in transforming primary cells as well as cells in established cultures.
3. The DNA injected in this process is subjected to less extensive modifications.
4. Mere precise integration of recombinant gene in limited copy number can be obtained.
Apribojimai
1. Costly.
2. Skilled personal required.
3.Has not been successful for many plant cells .
4. Embryonic cells preferred for manipulation.
5. Knowledge of mating timing, oocyte recovery is essential.
6. Method is useful for protoplasts and not for the walled cells.
7. Process causes random integration.
8. Rearrangement or deletion of host DNA adjacent to site of integration are common.
9. The technique is laborious, technically difficult, and limited to the number of cells actually injected.
Applications of microinjection.
1. Process is applicable for plant cell as well as animal cell but more common for animal cells.
2. Technique is ideally useful for producing transgenic animal quickly.
3. Procedure is important for gene transfer to embryonic cells.
4. Applied to inject DNA into plant nuclei.
5. Method has been successfully used with cells and protoplast of
tobacco, alfalfa etc.
Fig: microinjection in mouse egg.
BIOLISTICS
(MICROPROJECTILE/GENE GUN)
Biolistics or particle bombardment is a physical method that uses accelerated microprojectiles to
deliver DNA or other molecules into intact tissues and cells. Biolistics transformation is relatively new and novel method amongst the physical methods for artificial transfer of exogenous DNA. The nucleic acid is delivered through membrane penetration at a high velocity, usually connected to microprojectiles like microscopic particles of tungsten or gold coated into cells using an electrostatic pulse, air pressure, or gunpowder percussion. As the particles pass through the cell, the DNA becomes free to integrate into the plant-cell genome.
The gene gun is a device that literally fires DNA into target cells . The DNA to be transformed
into the cells is coated onto microscopic beads made of either gold or tungsten. Beads are carefully
coated with DNA. The coated beads are then attached to the end of the plastic bullet and loaded into
the firing chamber of the gene gun. An explosive force fires the bullet down the barrel of the gun
towards the target cells that lie just beyond the end of the barrel. When the bullet reaches the end of
the barrel it is caught and stopped, but the DNA coated beads continue on toward the target cells.
Some of the beads pass through the cell wall into the cytoplasm of the target cells. Here the bead and
the DNA dissociate and the cells become transformed. Once inside the target cells, the DNA is
solubilised and may be expressed.
Programos
1. Biolistics technique has been used successfully to transform soyabean,
cotton, spruce, sugarcane, papaya, corn, sunflower, rice, maize, wheat,
tobacco etc.
2. Genomes of subcellular organelles have been accessible to genetic
manipulation by biolistic method.
3. Mitochondria of plants and chloroplast of chlamydomonas have been
transformed.
4. Method can be applied to filamentous fungi and yeast (mitochondria).
5. The particle gun has also been used with pollen, early stage
embryoids, meristems somatic embryos, plant cells, root section, seeds and pollen.
6. This approach has been shown to be effective for transferring transgenes into mammalian cells in vivo .
Privalumai
1. Requirement of protoplast can be avoided. Unlike electroporation and microinjection, this technique does not require protoplasts or even single-cell isolations and is applicable to even intact plant tissue
2. Walled intact cells can be penetrated.
3. Manipulation of genome of subcellular organelles can be achieved.
4. This is also a highly mechanized or robotic mediated technique in which the
speed of the micro-projectile particles is controlled by foolproof mechanisms
5) It is also gaining in use as a method for transferring DNA construct into whole animals.
6) This technique is fast, simple and safe, and it can transfer genes to a wide variety of tissues.
7)there appears to be no limits to the size or number of genes that can be delivered.
Apribojimai
1. Integration is random.
2. Requirement of equipments.
3.It can be a challenge to obtain a sufficient number of cells modified by this method to see a biologically significant effect.
MICROLASER
A new technique is presented to incorporate exogeneous gene materials (DNA) into cells with a microbeam irradiation from an uv pulsed laser. A frequency-multiplied Laser, 355 m wavelength, 5 ns pulse duration, punches a self-healing hole of submicrometer aperture in cell membrane under selected irradiation conditions. At the site of the beam impact, due probably to local temperature changes, the cell membrane modifies its permeability. As a consequence of the hit, circular areas, whose radius may be apparently regulated by changing the irradiation time and/or the radiation intensity (energy), appear on the wall, last for a short time and fade spontaneously . It takes a fraction of a second for the aperture to close, long enough to allow the foreign DNA, contained in the medium, to slip into the cell.
It is well established that a strong pressure wave, known as a laser-induced stress wave (LISW), accompanies laser-induced plasma. We have extended their method to deliver macromolecules, such as genes. Plasmid DNA (circular DNA residing in bacterial cytoplasm) is used as a vector of the gene of interest. We inject the plasmid into target tissue, on which a laser target is placed, and subject the target to irradiation with a high-intensity, nanosecond laser pulse to induce plasma and hence an LISW. By placing optically transparent material on the target, the plasma is confined, resulting in an increase in the LISW’s impulse. Interaction of tissue cells with the LISW allows plasmid to enter the cytoplasm
Privalumai
1) it only takes advantage of the presence of phenol-red, a normal cell medium component, with no need of addition of extraneous substances
(2) it is a very mild treatment virtually suitable for any cell type and
(3) it allows transfection of selected cells even in the presence of cells of different type (providing that they are morphologically distinguishable).
4) . it is rapidly replacing virus mediated techniques as they have serious side effects caused by immune response and limited targeting characteristics rendering them inappropriate for clinical application
5) The method offers a clear advantage over existing methods: increases the success rate of DNA transfection as well as the efficiency of cell modification by orders of magnitude.
6) . It enables minimally invasive tissue interaction.
IŠVADA
Thus there are a number of ways by which the genes can be introduced into the cells. With the advent of molecular tools and technologies it is now comparatively easy to introduce gene into cells without losing its integrity and biological activity. Moreover the recent development in molecular biology has made the transfer of gene with great accuracy to the target cell. The transfer of gene through different gene transfer technologies has cured a number of diseases. Research is on progress to cure those diseases which cannot be cured by using drugs. Moreover the treatment of diseases by gene transfer provides better result for a prolong period of time. It is the need of hour to discover new and cheap method of gene transfer technologies so to make the treatment of the diseases a little easier and affordable. Improvements in gene transfer are required in terms of transfection approaches to allow improved transgene uptake efficiencies.
REFERENCES
1)Society of Applied Sciences.
Gene Transfer Technologies and their Applications: K.H.KHAN
Medical Biotechnology Division, School of Biosciences and Technology,
VIT University, Vellore-632014, Tamil Nadu, India.
2)Principles of gene manipulation: R.W.Old ,S.B. Primrose and R.M.Twymann ‘ sixth edition,chapter 10 and 11.
3) BIOTECHNOLOGY 2020-From the Transparent Cell to
the Custom-Designed Process–Prof. Gerhard Kreysa Dr.-Ing. E.h. Dr.h.c. & Dr. R??diger Marquardt
4) INTRODUCTION TOBIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING
-A.J. NAIR, PH.D.
5)From genes to genomes- concepts and applications of DNA technology–Jeremy W Dale, Malcom von Schantz
6) http://www.nature.com
7)www.learner.org

Essay Sauce is the free student essay website for college and university students. We've got thousands of real essay examples for you to use as inspiration for your own work, all free to access and download.

. (download the rest of the essay above)

About this essay:

If you use part of this page in your own work, you need to provide a citation, as follows:


Heat shock vs electroporation - Biology

Straipsnio santrauka:

Definition:-
Electroporation is the process of biotechnology to pass the electric current through the living surface fro example, a cell or a molecule. Through this way, pores appear in the surface of the living structure and biological material can pass through it easily. This method is usually used to enter the viruses or plasmids in the form of vectors or plasmids into the cell through pores in the cell membrane.

What is Electroporation:-
The technique of Electroporation is mostly used in the field of molecular biology. When this technique is applied on any cell by using electrical current from an external source, the cell membrane becomes more permeable allowing foreign objects enter into it. When the scientists have to insert a molecular probe, small piece of DNA or any drug which can change the function of the cell, they use this technique.

It is not easy to make pores in the cell membrane until it is exposed to proper electric field which can allow the plasma membrane to cross its dielectric strength. If the whole experiment is well controlled then after sometime, the pores of the plasma membrane can reseal, but during that time the molecules or foreign objects can enter the cell's cytoplasm. It is harmful for the cell if it is exposed to the electric current for long period of time. It results in the cell death or apoptosis.

Process of Electroporation is used mostly for the transformation of bacteria, plant protoplasts and yeast. Bacterial cell wall is made up of peptidoglycan and its derivatives. It has pores in its cell wall naturally, so when the plasmids have to enter into the bacterial cell, a small amount of electric current is used for this purpose just to let the plasmid enter into the bacterial cell. The whole process should be well controlled so that it can be observed that the bacterial cells can divide into new daughter cells containing the plasmids. This process is more effective than the chemical Electroporation. This process can also be used for the tissue culture cells to enter the foreign genes into the mammalian cells mainly.

How does process of Electroporation works?
Special kinds of devices are used for performing the process of Electroporation called as electroporators. This device is passed through the solution of the cell which contains usually bacteria but other call types can also be used for this purpose. The cell solution is put into the glass or plastic cuvette. A glass or plastic cuvette is a small circular tube which is specially designed to keep the samples for experiments of spectroscopic. It contains two aluminum electrodes one on each side. If the bacterial cell is used in the process of Electroporation then the suspension used must be of 50 microliters. Plasmids are placed in the suspension before the process starts and the whole suspension is inserted into the glass cuvette. The voltage is set to 240 volts in the electroporators and cuvette is placed inside the elctroporator. Before incubation, I milliliter of liquid medium is inserted into the cuvette and then incubation is started. After an hour of incubation, the whole solution is placed on the agarose gel. If the plasmid solution id pure then there are chances of getting better results of the experiment, otherwise bacterial cells might die due to the over explosion and process might be started once again.

Applications:-
Electroporation process of Electroporation is applicable in the field of medicine to treat the cancer and heart diseases by inserting new genes into the cancerous cell. Some other diseases can also be cured with the help of Electroporation in which there is need of tissue removal.

Apie autorių / Papildoma informacija:

Svarbus atsakomybės atsisakymas: Visi straipsniai šioje svetainėje yra skirti tik bendrajai informacijai ir nėra profesionalų ar ekspertų patarimai. Mes neprisiimame jokios atsakomybės už šiame straipsnyje pateiktos informacijos teisingumą ar autentiškumą arba jokius dėl to kylančius nuostolius ar sužalojimus. Mes nepatvirtiname šių straipsnių, nesame nei susiję su šių straipsnių autoriais, nei atsakingi už jų turinį. Išsamias sąlygas rasite mūsų atsakomybės atsisakymo skyriuje.


Principas

Transformation process allows a bacterium to take up genes from its surrounding environment that is transformation involves the direct uptakes of fragments of DNA by a recipient cell and the acquisition of new genetic characteristics. There are two major parameters involved in efficiently transforming a bacterial organism. The first is the method used to induce competence for transformation. The second major parameter is the genetic constitution of the host strain of the organism being transformed. Competent cells are capable of uptaking DNA from their environment and expressing DNA as functional proteins. If a bacterium is said to be competent, it has to maintain a physiological state in which it can take up the donor DNA. Calcium chloride treatment is one of the best methods for the preparation of competent cells. Competence results from alterations in the cell wall that makes it permeable to large DNA molecules. This is a naturally occurring process and through this bacteria can transfer advantageous characteristics, such as antibiotic resistance. Bacteria can take DNA from the environment in the form of plasmid. Most of them are double stranded circular DNA molecules and many can exist at very high copy numbers within a single bacterial cell. Many naturally occurring plasmids carry an antibiotic resistant gene referred to as a marker.

In the process of transformation, the competent cells are incubated with DNA in ice. Then it is placed in a water bath at 42ºC and further plunging them in ice. This process will take up the DNA into the bacterial cell. Then it is plated in an agar plate containing appropriate antibiotic. The presence of an antibiotic marker on the plasmid allows for rapid screening of successful transformants. Blue &ndashwhite selection (Alpha complementation) can be used to determine which plasmids carry an inserted fragment of DNA and which do not. These plasmids contain an additional gene (lac Z) that encodes for a portion of the enzyme &beta &ndash galactosidase. When it transformed into an appropriate host, one containing the gene for the remaining portion of &beta &ndashgalactosidase, the intact enzyme can be produced and these bacteria form blue colonies in the presence of X &ndash gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside) and a gratuitous inducer called IPTG (Isopropyl &beta-D- Thiogalactopyronoside). These plasmids contains a number of cloning sites within the lac Z gene, and any insertion of foreign DNA into this region results in the loss of the ability to form active &beta &ndashgalactosidase. Therefore colonies that carry the plasmid with the insert, ie, Transformants will remain white and the colonies without the foreign DNA (Non-Transformants) will remain Blue. We can also calculate the efficiency of transformation by using the concentration of DNA and number of transformed colonies.


Žiūrėti video įrašą: Noon Aesthetics Triple MCH medicininės estetikos įrangos veikimo ypatumai ir procedūra (Birželis 2022).