Informacija

3.3: fermentų kinetika – biologija

3.3: fermentų kinetika – biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Skirtingai nuo nekatalizuojamų (bet lengvai vykstančių) reakcijų, kurių metu reakcijos greitis priklauso tik nuo reagentų koncentracijos, fermentų katalizuojamų reakcijų greitį riboja turimų fermentų molekulių skaičius. Šis maksimalus apyvartos iš substrato į produktą greitis priklauso nuo fermento greičio ir fermento molekulių skaičiaus. (V_{max}), šis teorinis maksimalus greitis arba reakcija, pasiekiama tada, kai yra tokia didelė substrato molekulių koncentracija, kad ne tik kiekvienas turimas fermentas tam tikru metu yra užimtas, bet ir kai tik fermentas baigia konvertuoti substratą. prie produkto, jis iš karto suriša naują substratą. Kitas terminas Km yra susijęs su (V_{max}) tuo, kad (K_m) (Michaelo konstanta) yra substrato koncentracija, kuriai esant pusė maksimalaus reakcijos greičio (V_{max}/2) atsiranda. Šie du terminai yra susiję Michaelis-Menten lygtyje, kuri apibūdina reakcijos greitį (v) substrato koncentracijos [S] atžvilgiu.

[v = frac { V _ { max } [ mathrm { S } ] } { mathrm { K } _ { mathrm { M } } + [ mathrm { S } ] } label{Michaelis-Menten }]

Michaelis-Menten lygtį išvedė Leonoras Michaelis ir jo absolventas Maud Menten 1913 m., remdamasis Viktoro Henri darbu, ir ji taikoma tik paprastai fermentų kinetikai, kurioje yra tik vienas substratas, kuris iš karto pakeičiamas produktu. reakcija nesudarant jokio tarpinio junginio, aptariamas fermentas nerodo allosteriškumo, o reakcija yra vienakryptė.

Reikėtų pažymėti, kad reakcijos greitis v iš tikrųjų yra pradinis reakcijos greitis esant tam tikrai substrato koncentracijai ir kartais žymimas vo. Natūralu, kad reakcijai tęsiantis, substrato koncentracija mažėja kartu su reakcijos greičiu.

Michaelis-Menten lygtis prisiima paprastą tokios formos reakciją:

[ce{E + S <=> ES -> E +P}]

kur (E) yra fermentas, (S) yra substratas ir (P) yra produktas. Atkreipkite dėmesį į tarpinio fermento ir substrato komplekso ES susidarymą, kuris yra pereinamoji būsena (prisiminkime (PageIndex{2}) pav.), kai substratas yra nestabilus ir susijęs su fermentu. Tiesą sakant, (ES) taip pat lengvai galima laikyti (EP), nes ši būsena iš esmės yra lūžio taškas tarp pavertimo iš substrato į produktą. Šioje konstrukcijoje, Michaelis pastovus, (K_M), fermentų katalizuojamos reakcijos yra (k2 + k3)/k1. Tai yra ES disociacijos greitis, palyginti su ES asociacijos greičiu. (K_M), žinoma, skiriasi ne tik priklausomai nuo fermento, bet ir nuo substrato tapatybės. Kai kurie fermentai gali dirbti su keliais substratais, o to fermento (K_M) skirtingiems substratams paprastai skiriasi. Kadangi prisotinimo kreivė (PageIndex{5}) paveiksle gali būti sudėtinga, buvo sukurtos Michaelis-Menten lygties tiesinės (lygtis ef{Michaelis-Menten}). Labiausiai paplitęs yra dvigubas abipusis siužetas, geriau žinomas kaip Lineweaver-Burk siužetas. Šio tipo grafiniame fermentų kinetikos vaizde substrato koncentracijos atvirkštinė vertė nubraižyta pagal reakcijos greičio grįžtamąją vertę. Taip sukuriama linija, kurioje x kirtis yra (-1/K_m), y kirtis yra (1/V_{max}), o linijos nuolydis yra (K_m/V_{ max}).

Lineweaver-Burk siužetas

Gauti (V_{max}) ir (K_m) iš tiesioginio v diagramos prieš [S] gali būti sunku, nes net esant labai didelėms substrato koncentracijoms, eksperimentiniai duomenys vis tiek gali būti gerokai mažesni už (V_{max} ). Tai veda prie V. nuvertinimomaks.

Lineweaver-Burk siužetas išsprendžia šį susirūpinimą, tačiau turi tam tikrų trūkumų. Kadangi lengviau gauti duomenis esant didelėms koncentracijoms, dauguma duomenų taškų yra netoli 0, o toliau (dešinėje diagramos) yra mažiau duomenų taškų. Kadangi tai yra abipusiai dydžiai, tokiomis žemomis [S] sąlygomis išmatuotose (v) virsta didelėmis klaidomis per 1/v, todėl didelės klaidos (K_M) ir Vmaks. Tai akivaizdu išnagrinėjus Lineweaver-Burk lygtį:

[frac { 1 } { v } = left( frac { K _ { M } } { V _ { max } } ight) frac { 1 } { [ S ] } + frac { 1 } { V _ { max } }]


Michaelis-Menten kinetika

Stan A. Napper , Roy W. Schubert , biomedicinos inžinerija I , 1982 m.

SANTRAUKA

Michaelis-Menten kinetikos modelio deguonies suvartojimo greitis yra tiriamas kaip modeliavimo prielaida atliekant matematinį deguonies transportavimo į širdies audinį tyrimą. Modelis sukurtas pagal klasikinę Krogho kapiliarinio audinio cilindro geometriją ir pagrįstas fiziologiniais eksperimentais su izoliuotomis be ląstelių perfuzinėmis autoreguliuojančiomis kačių širdimis. Šis modelis lyginamas su pagrindiniu supaprastintu modeliu ir su tikrais deguonies pasiskirstymo duomenimis. Nustatyta, kad Michaelis-Menten kinetika yra patobulinimas, palyginti su pagrindiniu realių duomenų histogramų suderinimo modeliu. Tačiau reikės tirti tolesnes modeliavimo prielaidas, nes šis efektas visiškai neatitinka tikrų duomenų.


Abstraktus

Konspektas

Aktyviąją fermento vietą supa svyruojanti baltymų ir tirpiklio konformacinių būsenų aplinka, todėl realiai apskaičiuojant cheminių reakcijų greitį ir fermentų katalizuojamų reakcijų kinetinį izotopų poveikį reikia atsižvelgti į šią aplinkos įvairovę. Kaip būdas tokiems skaičiavimams atlikti buvo sukurta ansamblio vidurkio variacinių pereinamųjų būsenų teorija su daugiamačiu tuneliu (EA-VTST/MT). Ši teorija apima ansamblio vidurkį, kvantuotas vibracines energijas, energiją, tuneliavimą ir pereinamųjų būsenų dalijimo paviršių sistemingą perėjimą. Jis buvo sėkmingai pritaikytas daugeliui vandenilio, protonų ir hidrido perdavimo reakcijų. Teorija taip pat atskleidžia efektų rinkinį, į kurį reikėtų atsižvelgti atliekant patikimus greičio konstantų skaičiavimus.

Pirmiausia apžvelgiame pagrindinę teoriją ir skaičiavimo veiksmus. Pagrindinį vaidmenį atlieka apibendrinta laisvoji aktyvacijos profilio energija, kuri gaunama kvantuojant klasikinį vidutinės jėgos potencialą kaip reakcijos koordinatės funkciją, nes vienpusis srautas per pereinamosios būsenos dalijamąjį paviršių gali būti parašytas kaip apibendrinta laisvoji aktyvavimo energija. Perdavimo koeficientas atspindi skirtumą tarp vienos krypties srauto per pasirinktą pereinamojo būsenos dalijimo paviršių ir grynojo srauto, o tunelinio perdavimo koeficientas klasikinį judėjimą išilgai reakcijos koordinatės paverčia kvantiniu mechaniniu judesiu. Tuneliavimo skaičiavimas yra daugiamatis, atsižvelgiant į virpesių dažnių pokyčius tunelio kelyje ir tunelio kelio sutrumpėjimą, atsižvelgiant į minimalų energijos kelią (MEP), kurį skatina reakcijos kelio kreivumas. Apibendrinta laisvoji aktyvavimo energija ir perdavimo koeficientai apima vidurkį per reakcijos kelių ir konformacijų ansamblį, o tai apima baltymų judesių susiejimą su cheminių ryšių pertvarkymu statistiškai mechaniškai teisingu būdu. Standartiniai perdavimo koeficientų nuokrypiai suteikia informacijos apie reakcijos kelių, barjerų ir baltymų konformacijų pasiskirstymo įvairovę per pereinamąją būseną einančio reakcijos kelių ansamblio narius.

Pirmiausia iliustruojame teoriją aptardami taikymą tiek laukinio tipo, tiek mutantams Escherichia coli dihidrofolato reduktazė ir hipertermofilinė Thermotoga maritima dihidrofolato reduktazė (DHFR) DHFR yra ypač svarbus, nes baltymų konformaciniai pokyčiai buvo plačiai ištirti. Tada pateikiame trumpesnes diskusijas apie keletą kitų EA-VTST/MT pritaikymų protonų, vandenilio atomų ir hidrido jonų bei jų deuteruotų analogų perdavimui. Aptartos sistemos apima hidrido perkėlimą alkoholio dehidrogenazėje, ksilozės izomerazę ir timidilato sintazę, protonų perkėlimą metilamino dehidrogenazėje, vandenilio atomų perkėlimą metilmalonil-CoA mutazėje ir nukleofilinį pakeitimą halogenalkano dehalogenazėje ir dvimačius vidutinės protono ir potencialiai susietos jėgos potencialus. hidrido pernešimas butirilkofermento A β-oksidacijoje, katalizuojamas trumpos grandinės acil-CoA dehidrogenazės ir piruvato virsme laktatu, katalizuojamu laktatdehidrogenazės.

Specialusis leidimas

Paskelbta kaip dalis Cheminių tyrimų ataskaitos specialusis leidimas „Baltymų judėjimas katalizėje“.


EB 3.3.2.9

Kiti vardai): mikrosominė oksirano/oksetano hidrolazės epoksido hidratazė (dviprasmiška) mikrosominė epoksido hidratazė (dviprasmiška) epoksido hidrazė mikrosominė epoksido hidrazė areno oksido hidratazė (dviprasmiška) benzo[a]piren-4,5-oksido hidratazė benzo(a)piren-4,5-epoksido hidratazė arilepoksido hidrazė (dviprasmiška) cis-epoksido hidrolazė mEH EPHX1 (geno pavadinimas)

Sisteminis pavadinimas: cis-stilbeno oksido hidrolazė

Komentarai: Tai yra pagrindinis kepenų fermentas, katalizuojantis oksiranų (epoksidų) ir oksetanų hidrolizinį žiedo atidarymą, kad susidarytų atitinkami dioliai. Fermentas dalyvauja daugelio substratų metabolizme, įskaitant stereoselektyvų 7-oksabiciklo[4.1.0]hepta-2,4-dienų (areno oksidų) hidrolizinį žiedą. trans-dihidrodioliai. Reakcija vyksta per triados mechanizmą ir apima hidroksialkil-fermento tarpinio junginio susidarymą. Iki šiol stuburiniuose gyvūnuose buvo nustatyti penki epoksido-hidrolazės fermentai: EC 3.3.2.6 (leukotrienas-A4 hidrolazė), EC 3.3.2.7 (hepoksilino-epoksido hidrolazė), EC 3.3.2.9 (mikrosomų epoksido hidrolazė), EC 3.3.2.10 (tirpusis epoksido hidrolazė) ir EC 3.3.2.11 (cholesterolio-5,6-oksido hidrolazė).

Nuorodos į kitas duomenų bazes: BRENDA, EXPASY, KEGG, MetaCyc, CAS registro numeris:

1. Oesch, F. ir Daly, J. Kepenų epoksido hidrazės tirpinimas, gryninimas ir savybės. Biochim. Biofizė. Acta 227 (1971) 692-697. [PMID: 4998715]

2. Jakoby, W.B. ir Fjellstedt, T.A. Epoksidazės. In: Boyer, P.D. (Red.), Fermentai, 3-as leidimas, t. 7, Academic Press, Niujorkas, 1972, p. 199-212.

3. Oesch, F. Žinduolių epoksido hidrazės: indukuojami fermentai, katalizuojantys kancerogeninių ir citotoksinių metabolitų, gautų iš aromatinių ir olefininių junginių, inaktyvavimą. Ksenobiotika 3 (1973) 305-340. [PMID: 4584115]

4. Oesch, F. Žmogaus mikrosominės epoksido hidratazės gryninimas ir specifiškumas. Biochem. J. 139 (1974) 77-88. [PMID: 4463951]

5. Lu, A. Y., Ryanas, D., Jerina, D. M., Daly, J. W. ir Levin, W. Kepenų mikrosominė eksoksido hidrazė. Tirpinimas, gryninimas ir apibūdinimas. J. Biol. Chem. 250 (1975) 8283-8288. [PMID: 240858]

6. Bellucci, G., Chiappe, C. ir Ingrosso, G. Mikrosominio epoksido hidrolazės katalizuojamos hidrolizės kinetika ir stereochemija cis-stilbeno oksidai. Chirališkumas 6 (1994) 577-582. [PMID: 7986671]

7. Fretlandas, A.J. ir Omiecinski, C. J. Epoksido hidrolazės: biochemija ir molekulinė biologija. Chem. Biol. Bendrauti. 129 (2000) 41-59. [PMID: 11154734]

8. Morisseau, C. ir Hammock, B.D. Epoksido hidrolazės: mechanizmai, inhibitorių konstrukcijos ir biologiniai vaidmenys. Annu. Rev. Pharmacol. Toksikolis. 45 (2005) 311-333. [PMID: 15822179]

9. Newman, J. W., Morisseau, C. ir Hammock, B. D. Epoksidinės hidrolazės: jų vaidmuo ir sąveika su lipidų metabolizmu. Prog. Lipid Res. 44 (2005) 1-51. [PMID: 15748653]

10. Toselli, F., Fredenwall, M., Svensson, P., Li, X. Q., Johansson, A., Weidolf, L. ir Hayes, M. A. Žmogaus mikrosominės epoksidinės hidrolazės oksetano substratai. Narkotikų Metab. Dispos. 45 (2017) 966-973. [PMID: 28600384]

[EC 3.3.2.9 sukurta 2006 m. (EC 3.3.2.3, sukurta 1978 m., modifikuota 1999 m., dalis įtraukta 2006 m.), modifikuota 2017 m.]


Fermento fumarazės tyrimai. I. Kinetika ir pusiausvyra

Straipsnių peržiūros yra su COUNTER suderinama viso teksto straipsnių atsisiuntimų suma nuo 2008 m. lapkričio mėn. (tiek PDF, tiek HTML) visose institucijose ir asmenims. Šios metrikos reguliariai atnaujinamos, kad atspindėtų naudojimą iki kelių pastarųjų dienų.

Citatos yra kitų straipsnių, kuriuose cituojamas šis straipsnis, skaičius, apskaičiuotas Crossref ir atnaujinamas kasdien. Raskite daugiau informacijos apie Crossref citatų skaičių.

Altmetric Attention Score yra kiekybinis dėmesio, kurio mokslinis straipsnis sulaukė internete, matas. Spustelėjus spurgos piktogramą bus įkeltas altmetric.com puslapis su papildoma informacija apie nurodyto straipsnio balą ir buvimą socialinėje žiniasklaidoje. Raskite daugiau informacijos apie Altmetric Attention Score ir kaip jis apskaičiuojamas.

Pastaba: Vietoj santraukos tai yra pirmasis straipsnio puslapis.


Autoriaus informacija

Šie autoriai vienodai prisidėjo: Shufang Ji, Bing Jiang, Haigang Hao, Yuanjun Chen.

Filialai

Chemijos katedra, Tsinghua universitetas, Pekinas, Kinija

Shufang Ji, Yuanjun Chen, Zedong Zhang, Dingsheng Wang ir Yadong Li

Eksperimentinis pažangių medžiagų centras, Medžiagų mokslo ir inžinerijos mokykla, Pekino technologijos institutas, Pekinas, Kinija

Bing Jiang, Demin Duan ir Minmin Liang

CAS inžinerinė nanozimų laboratorija, Biofizikos institutas, Kinijos mokslų akademija, Pekinas, Kinija

Ruofei Zhang, Qian Liang ir Xiyun Yan

Chemijos ir chemijos inžinerijos koledžas, Vidinės Mongolijos universitetas, Hohotas, Kinija

Pekino sinchrotroninė spinduliuotė, Kinijos mokslų akademijos Didelės energijos fizikos institutas, Pekinas, Kinija

Juncai Dong, Haijing Li ir Shuhu Liu

Chemijos ir chemijos inžinerijos mokykla, Pietų Kinijos universitetas, Hengyang, Hunan, Kinijos Liaudies Respublika

Medžiagos ir ekologiškos programos, Medžiagų mokslo ir inžinerijos mokykla, Pekino technologijos institutas, Pekinas, Kinija

Šanchajaus sinchrotroninės spinduliuotės įrenginiai, Šanchajaus taikomosios fizikos institutas, Kinijos mokslų akademija, Šanchajus, Kinija

Pekino nacionalinė kondensuotųjų medžiagų fizikos laboratorija, Kinijos mokslų akademijos Fizikos institutas, Pekinas, Kinija


Medžiagos ir metodai

Metabolito politopo ir fermentų kainos funkcijos

Metabolinis tinklas su nurodytomis srauto kryptimis, pusiausvyros konstantomis ir metabolitų ribomis apibrėžia metabolitas politopas. Šis išgaubtas politopas rąstų koncentracijų erdvėje xi = ln ci reiškia galimų metabolitų profilių rinkinį. Naudojamas srauto profilis gali būti stacionarus (pvz., nustatytas FBA arba 13 C MFA) arba nestacionarus (pvz., iš dinaminio 13 C žymėjimo eksperimentų [66]). Jei pateiktos srauto kryptys termodinamiškai neįmanomos, metabolito politopas bus tuščias rinkinys, . Metabolito politopo veidai atsiranda dėl dviejų tipų nelygybės apribojimų. Pirma, fiziniai metabolitų lygių diapazonai apibrėžia dėžutės formos politopą (ribotą P veidais). Kai kurių metabolitų koncentracijos gali būti net apribotos iki fiksuotų verčių. Antra, kiekviena reakcija turi išsklaidyti laisvą Gibso energiją, o kad tai būtų įmanoma, varomosios jėgos ir srautai turi turėti tuos pačius ženklus (Θlvl > 0), taigi . Gauti apribojimai apibrėžia metabolito politopo E-veidus (atitinka pusiausvyros būsenas, Θl = 0). Netoli šių veidų fermentų kaina siekia begalybę.

Atskiriami normos dėsniai ir fermentų kainos funkcijos

Pagal (3) lygtį grįžtamojo greičio dėsniai gali būti suskirstyti į keturis terminus: fermento lygį E, jo priekinės katalizinės konstantos ir du efektyvumo koeficientai [22]. 6 paveiksle pridedame nekonkurencinį allosterinį inhibitorių x. Nors fermento lygis nėra tiesiogiai veikiamas metabolitų koncentracijos (nors gali skirtis priklausomai nuo tokių sąlygų kaip pH, jonų stiprumas ar molekulinis susikaupimas ląstelėse), efektyvumo veiksniai yra priklauso nuo koncentracijos, be vieneto ir gali svyruoti nuo 0 iki 1. Grįžtamumo koeficientas η apsisukimų dažnis priklauso nuo varomosios jėgos (taigi, netiesiogiai, nuo metabolitų lygio), o jai apskaičiuoti reikalinga pusiausvyros konstanta. Prisotinimo koeficientas η sat tiesiogiai priklauso nuo metabolitų lygio ir yra KM reikšmės kaip parametrai. Allosterinis reguliavimas normos įstatymo vardiklyje duoda adityvinius arba dauginamuosius terminus, kuriuos mūsų pavyzdyje galima užfiksuoti atskiru veiksniu η reg. Apskritai, η sėdėjo ir η reg gali būti sujungtas į vieną kinetinį faktorių η kin , kaip pavaizduota 6 lygtyje.

Reakcijai S ⇌ P su grįžtama Michaelis-Menten kinetika, varomoji jėga θ = −ΔrG′/RT, ir nekonkurencinio allosterinio slopinimo prefaktorius, greičio dėsnį galima parašyti kaip su inhibitorių koncentracija x. Pavyzdyje, esant nekonkurenciniam allosteriniam slopinimui, kinetinis veiksnys η kinas netgi gali būti padalintas į produktą η sėdėjo ⋅ η reg. Pirmieji du mūsų pavyzdžio terminai reiškia maksimalų greitį (greitis esant visiškam substrato prisotinimui, nėra atgalinio srauto, visiškas allosterinis aktyvavimas), o šie veiksniai mažina šį greitį dėl įvairių priežasčių: faktorius. η rev apibūdina sumažėjimą dėl atgalinių srautų (žr. S1 teksto A paveikslą) ir koeficientą η kin apibūdina tolesnį sumažėjimą dėl nepilno substrato prisotinimo ir allosterinio reguliavimo (žr. 1b pav.). Visų šių terminų atvirkštinė vertė atsiranda fermentų poreikio lygtyje, q, kuris gaunamas iš fermento lygio, padauginto iš to fermento naštos, hE.

Antroji lygtis 6 pav. apibūdina fermento kainą srautui v, ir jame yra normos įstatymo terminai atvirkštine forma, padauginti iš fermento naštos hE. Kairioji lygties dalis apibrėžia mažiausią fermento kainą, kuri vėliau padidinama šiais efektyvumo koeficientais. Vėlgi, 1/η giminė gali būti padalinta į 1/η šeštadienis ⋅ 1/η reg. Praleidus kai kuriuos iš šių veiksnių, galima sukurti supaprastintas fermentų sąnaudų funkcijas su didesniu specifiniu greičiu arba mažesniu fermentų poreikiu (palyginkite 1b pav.). Kadangi tiek greitis, tiek fermentų poreikis yra kelių terminų sandauga, patogu juos pavaizduoti kaip sumą logaritminėje skalėje (7 pav.), kur supaprastintos funkcijos matomos kaip viršutinė/apatinė sudėtingesnių greičio/paklausos funkcijų ribos. .

(a) Pradėdami nuo logaritminio fermento lygio (punktyrinė linija viršuje), pridedame terminus , log η aps., ir žurnalas η kin , ir gauti vis geresnį kurso apytikslį vaizdą. Pateiktame pavyzdyje skaitinė reikšmė mažesnė nei 1. Tikslesni apytiksliai (su daugiau terminų) duoda mažesnius rodiklius. EMC4 rodyklės nurodo kitus galimus kurso įstatymus, kurių vardiklyje yra papildomų terminų. b) Fermentų poreikį formuoja tie patys veiksniai (žr. (5) lygtį). Pradedant nuo norimo srauto (apatinė eilutė), numatoma paklausa didėja, kai atsižvelgiama į daugiau terminų.

Fermentų sąnaudų mažinimas gali būti suformuluotas kaip išgaubta metabolitų lygio optimalumo problema

Fermentų sąnaudų mažinimas (ECM) naudoja metabolinį tinklą, srauto profilį v, kinetinės greičio dėsniai, fermentų našta ir metabolitų lygio ribos, kad būtų galima numatyti optimalias metabolitų ir fermentų koncentracijas. Reakcijų arba kelių fermentų kaina yra išgaubta metabolito politopo funkcija (įrodymas S1 teksto 3.2 skyriuje), ty logaritminio skalės metabolito vektorius x, tiesiškai interpoliuota tarp vektorių xa ir xb, negali būti didesnės nei interpoliuotos išlaidos xa ir xb. Išgaubtumas taip pat taikomas išlaidų funkcijoms h(E), kurie yra netiesiniai, bet išgaubti E. Kai kurios EMC funkcijos yra griežtai išgaubta (t. y. lygtis (S18) galioja su < ženklu vietoj ≤), o kiti ne (pvz., EMC2). Labiausiai supaprastintos EMC funkcijos iš tikrųjų yra pastovios (kaip EMC0 ir EMC1). Norėdami rasti optimalią būseną, pasirenkame EMC funkciją ir sumažiname bendrą fermento kainą metabolito politope. Optimalūs metabolitų profiliai, fermentų profiliai ir fermentų sąnaudos gaunami išsprendus fermentų sąnaudų mažinimo (ECM) problemą (7)

Bendra kaina q(x, v) (apibrėžta (6) lygtyje) yra fermentų sąnaudų suma, nurodyta pagal EMC funkcijas. Nuo q(x) ir pats metabolito politopas yra išgaubtas, ECM yra išgaubta optimizavimo problema. Optimalus fermentų kiekis priklauso nuo išorinių sąlygų ir turi būti perskaičiuojamas pasikeitus išorinių metabolitų kiekiui. Pasitaiko atvejų, kai q(x) yra išgaubtas, bet ne griežtai išgaubtas, todėl (7) lygtis turės optimalių metabolitų tirpalų kontinuumą. Tai ypač pasakytina apie EMC1 balus, kurie nepriklauso nuo metabolitų lygio, ir EMC2 balams, kurie priklauso tik nuo reakcijos Gibbso laisvosios energijos, ty nuo kai kurių logaritminių metabolitų lygių linijinių derinių. Tokiais atvejais, siekiant įgyvendinti unikalų sprendimą, galima pridėti griežtai išgaubtą šoninį tikslą, kuris įvertina logaritminių metabolitų lygius, pvz., kvadratinę funkciją, palankią metabolitų lygiams, artimiems kokiam nors tipiškam koncentracijos vektoriui , kur λ yra mažas euristiškai pasirinktas svėrimo koeficientas (žr. S1 teksto 3.3 skyrių). Tokie papildomi tikslai gali būti pateisinami biologiškai, pvz. darant prielaidą, kad tarpiniai metabolitų kiekiai suteikia ląstelėms daugiau lankstumo prisitaikyti prie perturbacijų. Griežtas išgaubimas ne tik supaprastina skaitinius skaičiavimus, bet ir garantuoja, kad optimizavimo uždavinys turi unikalų sprendimą. Tiesą sakant, metabolito politopo ir sąnaudų funkcijos išlieka išgaubtos net esant įvairioms problemos modifikacijoms. Pridedant apribojimus bendram metabolitų lygiui, svertinėms metabolitų lygių sumoms arba svertinėms fermentų lygių sumoms, metabolito politopas susikerta su išlenktais kolektoriais (nes kalbame apie koncentraciją logaritminėje skalėje), tačiau lieka išgaubtas (S1 teksto skyrius). 3.4). Galiausiai galime apsvarstyti sudėtingesnę prevencinės fermentų ekspresijos problemą, kai fiksuotas fermento profilis ir allosterinis slopinimas turi leisti ląstelei realizuoti skirtingą srauto pasiskirstymą skirtingomis sąlygomis. Taip pat ši problema yra išgaubta (S1 teksto skyrius 3.7). Jei modelyje yra nefermentinių reakcijų (arba nefermentinių procesų, pvz., metabolito difuzijos iš ląstelės arba skiedimo augančiose ląstelėse), kiekviena tokia reakcija sukelia papildomą metabolito politopo apribojimą (S1 teksto 3.8 skirsnis). Žinomas srautas negrįžtamos difuzijos arba praskiedimo reakcijos metu nustato vieno metabolito koncentraciją. Vykstant negrįžtamoms nefermentinėms reakcijoms su masės veikimo greičio dėsniais, politopą kerta poerdvė. Abiem atvejais gautas subpolitopas gali būti tuščias, t. y. duotas srauto pasiskirstymas nebus realizuojamas.

Nestacionarios būsenos ir ribinių metabolitų svarba

Srauto balanso analizė ir kinetikos modeliai remiasi prielaida, kad tam tikrų metabolitų masė yra subalansuota: FBA ši prielaida kartu su stacionarumu apibrėžia pastovių srautų rinkinį kinetiniuose modeliuose, o masės subalansuoti metabolitai yra tie, kurių dinamika. aprašomas sistemų lygtimis. ECM, priešingai, daro prielaidą, kad turi būti pateikti srautai, ir nedaro prielaidų apie masės balansą. Jei mūsų kelio modelio srautai sukelia metabolito masės disbalansą, vis tiek galime manyti, kad visa ląstelė yra nejudančios būsenos, tačiau masės balansas pasiekiamas naudojant kitus būdus, kurie nėra mūsų modelio dalis. Arba galime manyti, kad metabolitas iš tikrųjų nėra subalansuotas masės ir kad aprašome nestacionarią, trumpalaikę būseną. Abiem atvejais ECM yra visiškai taikomas tol, kol medžiagų apykaitos srautai yra iš anksto nustatyti ir be kilpų (kad juos būtų galima realizuoti esant termodinaminei nuosekliai būsenai [67]).


3.3 Lipidai

Lipidai apima įvairią junginių grupę, kurios iš esmės yra nepolinės. Taip yra todėl, kad tai yra angliavandeniliai, kuriuose daugiausia yra nepolinių anglies-anglies arba anglies-vandenilio jungčių. Nepolinės molekulės yra hidrofobinės („bijoančios vandens“) arba netirpios vandenyje. Lipidai ląstelėje atlieka daugybę skirtingų funkcijų. Ląstelės kaupia energiją ilgalaikiam naudojimui riebalų pavidalu. Lipidai taip pat suteikia izoliaciją nuo aplinkos augalams ir gyvūnams (3.12 pav.). Pavyzdžiui, jie padeda išlaikyti vandens paukščius ir žinduolius sausus, kai sudaro apsauginį sluoksnį ant kailio ar plunksnų dėl vandens atstumiančio hidrofobinio pobūdžio. Lipidai taip pat yra daugelio hormonų statybinė medžiaga ir svarbi visų ląstelių membranų sudedamoji dalis. Lipidai apima riebalus, aliejus, vaškus, fosfolipidus ir steroidus.

Riebalai ir aliejai

Riebalų molekulę sudaro du pagrindiniai komponentai - glicerolis ir riebalų rūgštys. Glicerolis yra organinis junginys (alkoholis), turintis tris anglies atomus, penkis vandenilius ir tris hidroksilo (OH) grupes. Riebalų rūgštys turi ilgą angliavandenilių grandinę, prie kurios yra prijungta karboksilo grupė, todėl jos vadinamos „riebalų rūgštimis“. Riebalų rūgštyje esančių angliavandenių skaičius gali svyruoti nuo 4 iki 36, dažniausiai yra tie, kuriuose yra 12–18 anglies. Riebalų molekulėje riebalų rūgštys yra prijungtos prie kiekvieno iš trijų glicerolio molekulės anglies atomų esteriu per deguonies atomą (3.13 pav.).

Šio esterio jungties susidarymo metu išsiskiria trys vandens molekulės. Trys triacilglicerolyje esančios riebalų rūgštys gali būti panašios arba nepanašios. Riebalai dėl savo cheminės struktūros dar vadinami triacilgliceroliais arba trigliceridais. Kai kurios riebalų rūgštys turi bendrus pavadinimus, nurodančius jų kilmę. Pavyzdžiui, palmitino rūgštis, sočiųjų riebalų rūgštis, gaunama iš palmių. Arachido rūgštis gaunama iš Arachis hipogėja, mokslinis žemės riešutų arba žemės riešutų pavadinimas.

Riebalų rūgštys gali būti sočiosios arba nesočiosios. Riebalų rūgščių grandinėje, jei angliavandenilių grandinėje yra tik pavieniai ryšiai tarp gretimų anglies atomų, riebalų rūgštis yra prisotinta. Sočiosios riebalų rūgštys yra prisotintos vandeniliu, kitaip tariant, maksimaliai padidėja prie anglies skeleto prisijungusių vandenilio atomų skaičius. Stearino rūgštis yra sočiųjų riebalų rūgšties pavyzdys (3.14 pav.)

Kai angliavandenilių grandinėje yra dviguba jungtis, sakoma, kad riebalų rūgštis yra nesočioji. Oleino rūgštis yra nesočiųjų riebalų rūgšties pavyzdys (3.15 pav.).

Dauguma nesočiųjų riebalų kambario temperatūroje yra skysti ir vadinami aliejais. Jei molekulėje yra viena dviguba jungtis, ji vadinama mononesočiaisiais riebalais (pvz., alyvuogių aliejus), o jei yra daugiau nei viena dviguba jungtis, tai vadinama polinesočiaisiais riebalais (pvz., rapsų aliejus).

Kai riebalų rūgštis neturi dvigubų jungčių, ji vadinama sočiąja riebalų rūgštimi, nes į grandinės anglies atomus nebegalima pridėti vandenilio. Riebaluose gali būti panašių arba skirtingų riebalų rūgščių, prijungtų prie glicerolio. Ilgos tiesios riebalų rūgštys su viengubomis jungtimis linkusios sandariai susikaupti ir kambario temperatūroje yra kietos. Sočiųjų riebalų pavyzdžiai yra gyvuliniai riebalai su stearino ir palmitino rūgštimi (dažnai mėsoje) ir riebalai su sviesto rūgštimi (dažniausiai svieste). Žinduoliai riebalus kaupia specializuotose ląstelėse, vadinamose adipocitais, kur riebalų rutuliukai užima didžiąją dalį ląstelės tūrio. Augaluose riebalai arba aliejus kaupiasi daugelyje sėklų ir naudojami kaip energijos šaltinis daigams vystantis. Nesotieji riebalai arba aliejai dažniausiai yra augalinės kilmės ir juose yra cis nesočiųjų riebalų rūgščių. Cis ir trans nurodyti molekulės konfigūraciją aplink dvigubą jungtį. Jei vandeniliai yra toje pačioje plokštumoje, tai vadinama cis riebalais, jei vandenilio atomai yra dviejose skirtingose ​​plokštumose, tai vadinama transriebalais. The cis dviguba jungtis sukelia lenkimą arba „sulenkimą“, kuris neleidžia riebalų rūgštims sandariai susikaupti ir išlaiko jas skystas kambario temperatūroje (3.16 pav.). Alyvuogių aliejus, kukurūzų aliejus, rapsų aliejus ir menkių kepenų aliejus yra nesočiųjų riebalų pavyzdžiai. Nesotieji riebalai padeda sumažinti cholesterolio kiekį kraujyje, o sotieji riebalai prisideda prie apnašų susidarymo arterijose.

Transriebalai

Maisto pramonėje aliejai yra dirbtinai hidrinami, kad jie taptų pusiau kieti ir tokios konsistencijos, kokios pageidautina daugeliui perdirbtų maisto produktų. Paprasčiau tariant, vandenilio dujos burbuliuojamos per alyvas, kad jos sukietėtų. Šio hidrinimo proceso metu susidaro dvigubos jungtys cis- angliavandenilių grandinės konformacija transformacijos metu gali būti paversta dvigubomis jungtimis.

Margarinas, kai kurios žemės riešutų sviesto rūšys ir sutrumpinimas yra dirbtinai hidrintų transriebalų pavyzdžiai. Naujausi tyrimai parodė, kad padidėjus transriebalų kiekiui žmogaus mityboje, gali padidėti mažo tankio lipoproteinų (MTL) arba „blogojo“ cholesterolio kiekis, o tai savo ruožtu gali sukelti apnašų nusėdimą arterijose, todėl širdies liga. Daugelis greito maisto restoranų neseniai uždraudė naudoti transriebalus, o maisto produktų etiketėse privaloma nurodyti transriebalų kiekį.

Omega riebalų rūgštys

Nepakeičiamos riebalų rūgštys – tai riebalų rūgštys, kurių žmogaus organizmas reikalauja, bet nesintetina. Todėl jie turi būti papildyti per maistą. Omega-3 riebalų rūgštys (kaip parodyta 3.17 pav.) patenka į šią kategoriją ir yra vienos iš dviejų žmonėms žinomų (kita yra omega-6 riebalų rūgštis). Tai yra polinesočiosios riebalų rūgštys ir vadinamos omega-3, nes trečioji anglis iš angliavandenilių grandinės galo yra sujungta su gretima anglimi dviguba jungtimi.

Tolimiausiai nuo karboksilo grupės esanti anglis pažymėta omega (ω) anglies, o jei dviguba jungtis yra tarp trečiosios ir ketvirtosios anglies iš to galo, ji žinoma kaip omega-3 riebalų rūgštis. Mitybos požiūriu svarbios, nes organizmas jų negamina, omega-3 riebalų rūgštys apima alfa-linolo rūgštį (ALA), eikozapentaeno rūgštį (EPA) ir dokozaheksaeno rūgštį (DHR), kurios visos yra polinesočiosios. Lašiša, upėtakis ir tunas yra geri omega-3 riebalų rūgščių šaltiniai. Tyrimai rodo, kad omega-3 riebalų rūgštys sumažina staigios mirties nuo širdies priepuolio riziką, mažina trigliceridų kiekį kraujyje, mažina kraujospūdį ir apsaugo nuo trombozės, nes slopina kraujo krešėjimą. Jie taip pat mažina uždegimą ir gali padėti sumažinti kai kurių gyvūnų vėžio riziką.

Kaip ir angliavandeniai, riebalai sulaukė daug blogos reklamos. Tiesa, kad valgant per daug kepto maisto ir kito „riebaus“ maisto auga svoris. Tačiau riebalai atlieka svarbias funkcijas. Daugelis vitaminų yra tirpūs riebaluose, o riebalai yra ilgalaikė riebalų rūgščių kaupimo forma: energijos šaltinis. Jie taip pat suteikia kūno izoliaciją. Todėl „sveikuosius“ riebalus reikia vartoti saikingais kiekiais.

Vaškai

Vaškas dengia kai kurių vandens paukščių plunksnas ir kai kurių augalų lapų paviršius. Dėl vaškų hidrofobiškumo jie neleidžia vandeniui prilipti prie paviršiaus (3.18 pav.). Vaškai sudaryti iš ilgų riebalų rūgščių grandinių, esterintų į ilgos grandinės alkoholius.

Fosfolipidai

Fosfolipidai yra pagrindinės plazminės membranos, atokiausio gyvūnų ląstelių sluoksnio, sudedamosios dalys. Kaip ir riebalai, jie susideda iš riebalų rūgščių grandinių, prijungtų prie glicerolio arba sfingozino stuburo. Tačiau vietoj trijų riebalų rūgščių, prijungtų, kaip trigliceriduose, yra dvi riebalų rūgštys, sudarančios diacilglicerolį, o trečiąją glicerolio pagrindo anglį užima modifikuota fosfatų grupė (3.19 pav.). Vien tik fosfato grupė, prijungta prie diaglicerolio, nėra fosfolipidas, tai yra fosfatidatas (diacilglicerolio 3-fosfatas), fosfolipidų pirmtakas. Fosfatų grupę modifikuoja alkoholis. Fosfatidilcholinas ir fosfatidilserinas yra du svarbūs fosfolipidai, randami plazmos membranose.

Fosfolipidas yra amfipatinė molekulė, tai reiškia, kad ji turi hidrofobinę ir hidrofilinę dalis. Riebalų rūgščių grandinės yra hidrofobinės ir negali sąveikauti su vandeniu, o fosfatų turinti grupė yra hidrofilinė ir sąveikauja su vandeniu (3.20 pav.).

Galva yra hidrofilinė dalis, o uodegoje yra hidrofobinių riebalų rūgščių. Membranoje dvisluoksnis fosfolipidų sluoksnis sudaro struktūros matricą, fosfolipidų riebalų rūgščių uodegos yra nukreiptos į vidų, toliau nuo vandens, o fosfatų grupė yra nukreipta į išorę, vandeninę pusę (3.20 pav.).

Fosfolipidai yra atsakingi už plazmos membranos dinamiškumą. Jei fosfolipidų lašas įdedamas į vandenį, jis spontaniškai suformuoja struktūrą, žinomą kaip micelė, kur hidrofilinės fosfato galvutės yra nukreiptos į išorę, o riebalų rūgštys - į šios struktūros vidų.

Steroidai

Skirtingai nuo anksčiau aptartų fosfolipidų ir riebalų, steroidai turi lydyto žiedo struktūrą. Nors jie nėra panašūs į kitus lipidus, jie yra sugrupuoti kartu su jais, nes jie taip pat yra hidrofobiniai ir netirpūs vandenyje. Visi steroidai turi keturis susietus anglies žiedus, o kai kurie iš jų, kaip ir cholesterolis, turi trumpą uodegą (3.21 pav.). Daugelis steroidų taip pat turi –OH funkcinę grupę, todėl jie patenka į alkoholio klasifikaciją (steroliai).

Cholesterolis yra labiausiai paplitęs steroidas. Cholesterolis daugiausia sintetinamas kepenyse ir yra daugelio steroidinių hormonų, tokių kaip testosteronas ir estradiolis, kuriuos išskiria lytinių liaukų ir endokrininės liaukos, pirmtakas. Jis taip pat yra vitamino D pirmtakas. Cholesterolis taip pat yra tulžies druskų, kurios padeda emulsinti riebalus ir vėliau juos pasisavinti ląstelėse, pirmtakas. Nors pasauliečiai apie cholesterolį dažnai kalba neigiamai, jis būtinas tinkamam organizmo funkcionavimui. Jis yra gyvūnų ląstelių plazminės membranos komponentas ir randamas dvipusiame fosfolipidiniame sluoksnyje. Būdama atokiausia gyvūnų ląstelių struktūra, plazminė membrana yra atsakinga už medžiagų transportavimą ir ląstelių atpažinimą bei dalyvauja ląstelių tarpusavio komunikacijoje.

Nuoroda į mokymąsi

Norėdami gauti papildomos perspektyvos apie lipidus, peržiūrėkite interaktyvią animaciją „Biomolecules: The Lipids“


5) Fermentai

Katalizatorius: yra medžiaga, kuri padidina cheminės reakcijos greitį ir nėra keičiama dėl reakcijos.

Fermentas: yra baltymas, kuris veikia kaip biologinis katalizatorius.

Fermentai, kaip ir katalizatoriai, gali būti naudojami vėl ir vėl, nes vykstant reakcijai jie nesunaudojami, o reakcijai paspartinti reikia tik nedidelio kiekio.

The fermentai ir substratas molekulės turi

vienas kitą papildantis formų (pavyzdžiui, gretimų dėlionės dalių), kad jos derėtų viena prie kitos.

Substratas: medžiaga, kurią veikia fermentas.

Produktai: pagamintos molekulės.

Anabolinė reakcija: reakcijos, kurių metu iš mažesnių molekulių susidaro didelės molekulės.

Katabolinė reakcija: reakcijos, kurios suskaido dideles molekules į mažesnes.

Fermentų-substratų kompleksas: susidaro laikinai, kai fermentas susijungia su substratu.

Fermentai yra specifiniai, tai tiesiog reiškia, kad fermentas, kuris paprastai veikia vieną medžiagą, neveiks kitą.

Fermentas turi formą, vadinamą aktyvi svetainė, kuri tiksliai atitinka medžiagas, kurias veikia.

Fermento molekulės ir substrato molekulių aktyviosios vietos forma yra vienas kitą papildantis.

Fermentų katalizuojamos reakcijos greitis didėja didėjant temperatūrai. Tačiau aukštoje temperatūroje greitis vėl mažėja, nes fermentas denatūruojasi ir nebegali veikti kaip biologinis katalizatorius.

Didėjant temperatūrai, molekulės įgyja daugiau kinetinės energijos, todėl jos greičiau juda ir yra didesnė susidūrimų tikimybė. Todėl reakcijos greitis didėja.

Virš optimalios temperatūros reakcija sulėtėja. Taip yra todėl, kad fermentų molekulės yra baltymai. Baltymų molekulės aukštesnėje temperatūroje pradeda prarasti formą, todėl aktyvioji vieta deformuojasi.

Substrato molekulės negali tilpti kartu su fermentu, todėl reakcija sustabdoma. (Denatūravimas)

PH pokyčiai keičia fermento aktyviosios vietos formą. Skirtingi fermentai geriausiai veikia esant skirtingoms pH vertėms.

The optimum pH for an enzyme depends on where it normally works. For example, intestinal enzymes have an optimum pH of about 7.5, but stomach enzymes have an optimum pH of about 2.

Each enzyme has an optimum pH, if this pH changes, the shape of the active site of the enzyme is changed (Denatūruoti), thus the substrate will not be able to fit in it, and the enzyme becomes useless


Enzyme Kinetics

This experiment was performed to determine the factors that influence enzyme reaction rates. Amylase enzyme activity was measured through its absorption rate in spectrophotometer, using light with a wavelength of 560 nm. We compared the absorbance rates by varying temperatures in one experiment and increasing levels of pH in another. The highest levels of absorbance were found in samples with a temperature of 55 deg C and in pH levels measuring 5.5. It was found that amylase and starch reaction rates were highest when the temperature and pH had the highest level of absorbance. .
Įvadas.
"In living organisms, biochemical reactions are facilitated by catalyst, substances that accelerate reactions but are not consumed or permanently changed in the process (Vilet, 1993)." An enzyme is very specific in the reactions in which it undergoes: it contains an active site that allows only certain reactants to bind to it. In the experiment of enzyme kinetics, we examined the absorbance levels and rate of reactions of amylase and starch with varied temperature and pH levels. We hypothesized that environmental factors, temperature and pH level, increase reaction rates and thus we expected reaction rates to have a greater net conversion of substrates than those with a lower temperature and pH levels.
.
Now in order to maintain its specific function, an enzyme must retain the specialized shape of its active site. "Environmental factors such as temperature and pH levels have been known to alter the conformation of a protein (Neilands, 1955)." The goal of this is experiment is to find the optimum levels of temperature and pH that maximize the reaction rate between enzyme amylase and substrate starch without causing "instability or denaturation (Neilands, 1955)." .
.
Medžiaga ir metodai.
To calibrate the spectrophotometer at zero absorbance, a blank control tube prepared with 5 ml of distilled water and 0.

Essays Related to Enzyme Kinetics

1. Enzyme Kinetics - Alkaline Phosphatase

Introduction In this lab we studied how the enzyme alkaline phosphatase (AP) activity was influenced by time, the change of temperature and how the enzyme was affected by different substrate and inhibitor concentrations. . The purpose of the next experiment, experiment 3, was to characterise the enzyme by applying Michaelis-Menten kinetics. . At each of these temperatures we prepared a reaction containing enzyme and also a reaction which was used as a blank and contained no enzyme. . Experiment 3, determining the properties of AP by applying Michaelis-Menten kinetics. . Series D had no.

2. The Effects of 2-Aminoquinoline on SH3 Domain Proteins

Analysis of detachment kinetics yields the strength of synthetic ligand (2AQ) binding, and also simulates 'in vivo' results 'in vitro'. . Use EcoR1/Bam1 restriction enzymes on synthesized DNA, and on bacterial plasmid DNA, creating complementary sticky ends. Use two restriction enzymes so that the orientation of the synthesized DNA in the plasmid can be controlled. . Initially, increase SH3 protein concentration in presence of natural ligand, and measure association kinetics. . Gradually increase the competitor (natural ligand) concentration from zero, and measure t.

3. Enzyme Kinetics

Compounds that effect the ability of an enzyme that are not involved in the active site are called allosteric effectors. . Introduction ok but need sources for quotes Glycogen phosphorylase is a key enzyme in the regulation of glycogen metabolism. . The enzyme exists in two forms Glycogen phosphorylase a (active) and Glycogen phosphorylase b (inactive). . Crystallographic binding studies at 3.5 Å resolution show that NADH binds to the same sites on the enzyme as AMP. . Glycogen phosphorylase B was diluted 10X by 100um of a 1M enzyme stock with 1000 enzyme dilution buffer, 0.10.

4. Rates of Reaction Coursework - Hydrogen Peroxide and Catalas

The Catalysts which are found in living organisms are known as Enzymes. . The enzyme provides a surface for the reaction to take place on. . Enzymes have many different uses. . They are called Digestive enzymes. . Chemical Kinetics Chemical kinetics, the study of reaction rates, shows that three conditions must be met at the molecular level if a reaction is to occur: The molecules must collide they must be positioned so that the reacting groups are together in a transition state between reactants and products and the collision must have enough energy to form the transition st.

5. Chemical Reactions

Kinetics is one of these things. Kinetics decides The speed of the reaction and what is happening on a molecular level. . Lucifern, which the firefly makes naturally, is oxidized in the presence of luciferase, another natural enzyme, which acts as a catalyst in the reaction. .

  • Word Count: 1893
  • Approx Pages: 8
  • Has Bibliography
  • Grade Level: High School

6. reactions

Kinetics is one of these things. Kinetics decides The speed of the reaction and what is happening on a molecular level. . Lucifern, which the firefly makes naturally, is oxidized in the presence of luciferase, another natural enzyme, which acts as a catalyst in the reaction. .

7. Research review of parkinson's disease

Research review of Parkinson's disease Afflicting over one million Americans, Parkinson's disease is one of the most devastating neuro-degenerative diseases in the world. A British physician, James Parkinson, first discovered this disease while observing people on the streets of London. He not.


Žiūrėti video įrašą: Biologinių membranų struktūra (Birželis 2022).


Komentarai:

  1. Lonzo

    Mano nuomone, klystate. Aš siūlau tai aptarti. Parašyk man PM, mes kalbėsime.

  2. Taugul

    Tai nuostabus, gana linksmas kūrinys

  3. Jaden

    Šia tema galima kalbėti ilgai.

  4. Mosho

    Agree, this brilliant idea is all right about

  5. Keshicage

    Gaila, kad dabar negaliu išreikšti – vėluoju į susitikimą. Išleisiu – būtinai išsakysiu nuomonę.



Parašykite pranešimą