Informacija

8: Transkripcija – biologija

8: Transkripcija – biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Nors DNR yra puiki terpė informacijai saugoti, dėl pačios savybės, dėl kurios ji tokia stabili ir savaime koreguojanti – dvigrandė – taip pat sunku naudoti tą genetinę informaciją ląstelių komponentams gaminti. Kadangi informacinės molekulės dalys (azoto bazės) yra užrakintos kopėčių viduje, jas perskaityti reikia energetiškai brangios užduoties suardyti visas vandenilio jungtis, laikančias dvi sruogas. Norint tai padaryti kiekvienai ląstelei reikalingai kiekvieno baltymo kopijai, prireiktų ne tik daug energijos, bet ir daug laiko. Vietoj to turi būti mechanizmas, leidžiantis vieną kartą (arba kelis kartus) paimti informaciją iš DNR ir tada iš tos vienintelės informacijos padaryti daug baltymo kopijų. Tas mechanizmas yra transkripcija.

Miniatiūra: supaprastinta mRNR sintezės ir apdorojimo schema. (CC BY 3.0 – neportuotas ; Kelvinsong).


8: Transkripcija – biologija

Šio skyriaus pabaigoje galėsite:

  • Išvardykite eukariotų transkripcijos etapus
  • Aptarkite RNR polimerazių vaidmenį transkripcijai
  • Palyginkite ir supriešinkite tris RNR polimerazes
  • Paaiškinkite transkripcijos faktorių reikšmę

Prokariotai ir eukariotai iš esmės atlieka tą patį transkripcijos procesą su keliais pagrindiniais skirtumais. Svarbiausias skirtumas tarp prokariotų ir eukariotų yra pastarųjų membrana surištas branduolys ir organelės. Kai genai yra surišti su branduoliu, eukariotinė ląstelė turi sugebėti pernešti savo mRNR į citoplazmą ir apsaugoti savo mRNR nuo skilimo prieš ją transliuojant. Eukariotai taip pat naudoja tris skirtingas polimerazes, kurių kiekviena transkribuoja skirtingą genų pogrupį. Eukariotinės mRNR paprastai yra monogeninės, tai reiškia, kad jos nurodo vieną baltymą.


Prieigos parinktys

Gaukite visą žurnalo prieigą 1 metams

Visos kainos nurodytos NET.
PVM bus pridėtas vėliau kasoje.
Mokesčių apskaičiavimas bus baigtas apmokėjimo metu.

Gaukite ribotą laiką arba visą straipsnių prieigą „ReadCube“.

Visos kainos nurodytos NET.


Adelman, K. ir Lis, J. T. Promoter-proksimalinė RNR polimerazės II pauzė: atsirandantys metazoanų vaidmenys. Nat. Kunigas Genet. 13, 720–731 (2012).

Fuda, N. J., Ardehali, M. B. ir Lis, J. T. RNR polimerazės II transkripciją in vivo reguliuojančių mechanizmų apibrėžimas. Gamta 461, 186–192 (2009).

Proudfoot, N. J. Transkripcijos nutraukimas žinduoliuose: RNR polimerazės II juggernauto sustabdymas. Mokslas 352, aad9926 (2016).

Eick, D. & amp Geyer, M. RNR polimerazės II karboksigalinio domeno (CTD) kodas. Chem. Rev. 113, 8456–8490 (2013).

Harlen, K. M. ir Churchman, L. S. Kodas ir ne tik: transkripcijos reguliavimas RNR polimerazės II karboksigalo domenu. Nat. kun. Mol. Cell Biol. 18, 263–273 (2017).

Zaborowska, J., Egloff, S. & Murphy, S. The pol II CTD: new twists in the tail. Nat. Struktūra. Mol. Biol. 23, 771–777 (2016).

Jeronimo, C., Collin, P. ir Robert, F. RNR polimerazės II CTD: didėjantis mažo sudėtingumo baltymų domeno sudėtingumas. J. Mol. Biol. 428, 2607–2622 (2016).

Bentley, D. L. MRNR apdorojimo susiejimas su transkripcija laike ir erdvėje. Nat. Kunigas Genet. 15, 163–175 (2014).

Hsin, J. P. ir Manley, J. L. RNR polimerazės II CTD koordinuoja transkripciją ir RNR apdorojimą. Genes Dev. 26, 2119–2137 (2012).

Herzel, L., Ottoz, D. S. M., Alpert, T. & Neugebauer, K. M. Sujungimas ir transkripcijos jutiklinė bazė: bendro transkripcijos spliceosomų surinkimas ir funkcija. Nat. kun. Mol. Cell Biol. 18, 637–650 (2017).

Marzluff, W. F. ir Koreski, K. P. Histono mRNR gimimas ir mirtis. Tendencijos Genet. 33, 745–759 (2017).

Duronio, R. J. ir Marzluff, W. F. Ląstelių ciklo reguliuojamo histono geno ekspresijos koordinavimas per histono lokuso kūno surinkimą ir funkciją. RNR Biol. 14, 726–738 (2017).

Sullivan, K. D., Steiniger, M. & amp Marzluff, W. F. Pagrindinis CPSF73, CPSF100 ir Symplekin kompleksas gali sudaryti du skirtingus skilimo faktorius, skirtus apdoroti poli(A) ir histono mRNR. Mol. Ląstelė 34, 322–332 (2009).

Kohn, M., Ihling, C., Sinz, A., Krohn, K. & amp Huttelmaier, S. Y3** ncRNR skatina histono mRNR 3′ galų apdorojimą. Genes Dev. 29, 1998–2003 (2015).

Pirngruber, J. ir kt. CDK9 nukreipia H2B monoubikvitinaciją ir kontroliuoja nuo replikacijos priklausomą histono mRNR 3′ galo apdorojimą. EMBO Rep. 10, 894–900 (2009).

Narita, T. ir kt. NELF sąveikauja su CBC ir dalyvauja nuo replikacijos priklausomų histonų mRNR 3' galų apdorojime. Mol. Ląstelė 26, 349–365 (2007).

Saldi, T., Fong, N. & amp Bentley, D. L. Transkripcijos pailgėjimo greitis turi įtakos besiformuojančiam histono pre-mRNR lankstymui ir 3′ galo apdorojimui. Genes Dev. 32, 297–308 (2018).

Hsin, J. P., Sheth, A. & amp Manley, J. L. RNAP II CTD, fosforilintas ant treonino-4, reikalingas histono mRNR 3′ galo apdorojimui. Mokslas 334, 683–686 (2011).

Medlin, J. ir kt. P-TEFb nėra esminis žmogaus U2 snRNR ir histono H2b genų pailgėjimo veiksnys. EMBO J. 24, 4154–4165 (2005).

Hintermair, C. ir kt. Žinduolių RNR polimerazės II CTD treoninas-4 yra nukreiptas į Polo tipo kinazę 3 ir reikalingas transkripcijos pailgėjimui. EMBO J. 31, 2784–2797 (2012).

Loyer, P. ir kt. Ciklino L1 ir L2 sąveikos su CDK11 ir splaisingo faktorių apibūdinimas: ciklino L izoformų įtaka splaisingo vietos parinkimui. J. Biol. Chem. 283, 7721–7732 (2008).

Cornelis, S. ir kt. Naujos ląstelių ciklo reguliuojamos vidinės ribosomų įėjimo vietos identifikavimas ir apibūdinimas. Mol. Ląstelė 5, 597–605 (2000).

Hu, D., Valentine, M., Kidd, V. J. & Lahti, J. M. CDK11 (p58) reikalingas seserinės chromatidinės sanglaudos palaikymui. J. Cell Sci. 120, 2424–2434 (2007).

Petretti, C. ir kt. PITSLRE / CDK11p58 baltymų kinazė skatina centrosomų brendimą ir bipolinio veleno susidarymą. EMBO Rep. 7, 418–424 (2006).

Zhou, Y., Shen, J. K., Hornicek, F. J., Kan, Q. & amp Duan, Z. Nuo ciklino priklausomos kinazės 11 (CDK11) atsirandantys vaidmenys ir terapinis potencialas sergant žmogaus vėžiu. Oncotarget 7, 40846–40859 (2016).

Li, T., Inoue, A., Lahti, J. M. ir Kidd, V. J. CDK11 (p110/p58) nulinių mutantų pelių proliferacijos nesugebėjimas ir mitozinis sustabdymas embrioninių ląstelių vystymosi blastocistos stadijoje. Mol. Cell Biol. 24, 3188–3197 (2004).

Hu, D., Mayeda, A., Trembley, J. H., Lahti, J. M. & Kidd, V. J. CDK11 kompleksai skatina pre-mRNR susijungimą. J. Biol. Chem. 278, 8623–8629 (2003).

Trembley, J. H. ir kt. PITSLRE p110 baltymų kinazės asocijuojasi su transkripcijos kompleksais ir veikia jų aktyvumą. J. Biol. Chem. 277, 2589–2596 (2002).

Valente, S. T., Gilmartin, G. M., Venkatarama, K., Arriagada, G. & Goff, S. P. ŽIV-1 mRNR 3′ galo apdorojimą išskirtinai reguliuoja eIF3f, CDK11 ir susiliejimo faktorius 9G8. Mol. Ląstelė 36, 279–289 (2009).

Tiedemann, R. E. ir kt. Molekulinių žmogaus daugybinės mielomos ląstelių pažeidžiamumo nustatymas atliekant vaistinio genomo RNR trukdžių mirtingumo atranką. Cancer Res. 72, 757–768 (2012).

Chi, Y. ir kt. Nenormali CDK11p58 ekspresija sergant prostatos vėžiu. Cancer Cell Int. 14, 2 (2014).

Duan, Z. ir kt. Sisteminis kinomo shRNR atranka nustato, kad CDK11 (PITSLRE) kinazės ekspresija yra labai svarbi osteosarkomos ląstelių augimui ir dauginimuisi. Clin. Cancer Res. 18, 4580–4588 (2012).

Kren, B. T. ir kt. Ikiklinikinis nuo ciklino priklausomų kinazės 11 ir kazeino kinazės 2 išgyvenamumo kinazių, kaip RNR trukdžių taikinių gydant trigubai neigiamą krūties vėžio gydymą, įvertinimas. Breast Cancer Res. 17, 524 (2015).

Liu, X. ir kt. Nuo ciklino priklausoma kinazė 11 (CDK11) reikalinga kiaušidžių vėžio ląstelių augimui in vitro ir in vivo, o jos slopinimas sukelia apoptozę ir jautrina ląsteles paklitakseliui. Mol. Vėžys Ther. 15, 1691–1701 (2016).

Du, Y. ir kt. CDK11 (p110) vaidina lemiamą vaidmenį stemplės plokščiųjų ląstelių karcinomos ląstelių navikogeniškumui ir yra galimas vaistų taikinys. Ląstelių ciklas 18, 452–466 (2019).

Sokolova, M. ir kt. Genomo pločio ląstelių ciklo reguliatorių ekranas normaliose ir naviko ląstelėse nustato skirtingą atsaką į nukleozomų išeikvojimą. Ląstelių ciklas 16, 189–199 (2017).

Yang, X. C., Burch, B. D., Yan, Y., Marzluff, W. F. ir Dominski, Z. FLASH, proapoptotinis baltymas, dalyvaujantis aktyvuojant kaspazę-8, yra būtinas histono pre-mRNR apdorojimui 3′ gale. Mol. Ląstelė 36, 267–278 (2009).

Kohoutek, J. & Blazek, D. Cyclin K dera su Cdk12 ir Cdk13. Cell Div. 7, 12 (2012).

Marzluff, W. F., Wagner, E. J. & Duronio, R. J. Kanoninių histonų mRNR metabolizmas ir reguliavimas: gyvenimas be poli(A) uodegos. Nat. Kunigas Genet. 9, 843–854 (2008).

Zhao, J. ir kt. NPAT susieja cikliną E-Cdk2 su nuo replikacijos priklausomo histono geno transkripcijos reguliavimu. Genes Dev. 14, 2283–2297 (2000).

Castello, A. ir kt. Įžvalgos apie RNR biologiją iš žinduolių mRNR surišančių baltymų atlaso. Ląstelė 149, 1393–1406 (2012).

Baltz, A. G. ir kt. Su mRNR surištas proteomas ir jo pasaulinis užimtumo profilis baltymus koduojančiuose nuorašuose. Mol. Ląstelė 46, 674–690 (2012).

Konig, J. ir kt. iCLIP atskleidžia hnRNP dalelių funkciją sujungiant atskirą nukleotidų skiriamąją gebą. Nat. Struktūra. Mol. Biol. 17, 909–915 (2010).

Van Nostrand, E. L. ir kt. Tvirtas RNR surišančių baltymų surišimo vietų su patobulintu CLIP (eCLIP) transkripto mastu atradimas. Nat. Metodai 13, 508–514 (2016).

Beltran, M. ir kt. PRC2 sąveika su RNR arba chromatinu yra abipusiai antagonistinė. Genome Res. 26, 896–907 (2016).

Trembley, JH, Hu, D., Slaughter, CA, Lahti, JM & Kidd, VJ Kazeino kinazė 2 sąveikauja su nuo ciklino priklausoma kinaze 11 (CDK11) in vivo ir fosforilina RNR polimerazės II karboksilo galinį domeną ir CDK11 in vitro . J. Biol. Chem. 278, 2265–2270 (2003).

Pak, V. ir kt. CDK11 TREX / THOC reguliuoja ŽIV mRNR 3 'galo apdorojimą. Ląstelės šeimininko mikrobas 18, 560–570 (2015).

Peterlin, B. M. & amp Price, D. H. Transkripcijos pailgėjimo fazės kontrolė naudojant P-TEFb. Mol. Ląstelė 23, 297–305 (2006).

Bosken, C. A. ir kt. Žmogaus Cdk12 / Cyclin K struktūra ir substrato specifiškumas. Nat. Komun. 5, 3505 (2014).

Lyons, S. M. ir kt. Nuo replikacijos priklausomų histonų mRNR pogrupis yra išreikštas kaip poliadenilintos RNR galutinai diferencijuotuose audiniuose. Nucleic Acids Res. 44, 9190–9205 (2016).

Larochelle, S. ir kt. RNR polimerazės II iniciacijos ir pailgėjimo jungiklio nuo ciklino priklausoma kinazės kontrolė. Nat. Struktūra. Mol. Biol. 19, 1108–1115 (2012).

Gruber, J. J. ir kt. Ars2 skatina tinkamą nuo replikacijos priklausomą histono mRNR 3′ galo susidarymą. Mol. Ląstelė 45, 87–98 (2012).

Sullivan, K. D., Mullen, T. E., Marzluff, W. F. ir Wagner, E. J. SLBP numušimas sukelia histono mRNR branduolinį susilaikymą. RNR 15, 459–472 (2009).

Drogat, J. ir kt. Cdk11-cyclinL kontroliuoja RNR polimerazės II tarpininko komplekso surinkimą. Cell Rep. 2, 1068–1076 (2012).

Kim, D. U. ir kt. Viso genomo genų delecijų rinkinio dalijimosi mielėse analizė Schizosaccharomyces pombe. Nat. Biotechnol. 28, 617–623 (2010).

Kurat, C. F. ir kt. Histono geno transkripcijos reguliavimas mielėse. Cell Mol. Gyvenimas Sci. 71, 599–613 (2014).

Barcaroli, D. ir kt. FLASH reikalinga histono transkripcijai ir S fazės progresavimui. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 103, 14808–14812 (2006).

Chapman, R. D. ir kt. Transkribuojanti RNR polimerazė II fosforilinama ties CTD liekana serine-7. Mokslas 318, 1780–1782 (2007).

Schuller, R. ir kt. Specifinis RNR polimerazės II CTD fosforilinimas. Mol. Ląstelė 61, 305–314 (2016).

Lin, A. ir kt. Netikslinis toksiškumas yra įprastas klinikinių tyrimų metu atliekamų vaistų nuo vėžio veikimo mechanizmas. Sci. Vertimas Med. 11, eaaw8412 (2019).

Rouschopas, K. M. ir kt. Nuo dangtelio priklausomo mRNR transliacijos reguliavimo panaikinimas padidina naviko jautrumą spinduliuotei, nes sumažėja hipoksinė frakcija. Radiatorius. Oncol. 99, 385–391 (2011).

Huppertz, I. ir kt. iCLIP: baltymų ir RNR sąveika esant nukleotidų skyrai. Metodai 65, 274–287 (2014).

Roberts, T. C. ir kt. Besiformuojančios transkripcijos kiekybinis įvertinimas naudojant bromuridino imunofiksavimo branduolinį paleidimą RT-qPCR. Nat. Protok. 10, 1198–1211 (2015).

Mahat, D. B. ir kt. Bazinės poros skiriamosios gebos genomo mastu aktyvių RNR polimerazių kartografavimas naudojant precizinį branduolinį paleidimą (PRO-seq). Nat. Protok. 11, 1455–1476 (2016).

Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. Santykinių genų ekspresijos duomenų analizė naudojant realaus laiko kiekybinę PGR ir 2 –∆∆C(T) metodą. Metodai 25, 402–408 (2001).

Narita, T. ir kt. NELF sąveikauja su CBC ir dalyvauja nuo replikacijos priklausomų histonų mRNR 3' galų apdorojime. Mol. Ląstelė 26, 349–365 (2007) .


Genų ekspresiją valdo daugybė funkcijų – transkripcijos ir vertimo reguliavimas:

Eukariotuose transkripcija arba tiksliniai genai gali būti stimuliuojami arba slopinami, kai specifiniai transkripcijos veiksniai pereina iš citoplazmos į branduolį. Kadangi transkribuojami tik tiksliniai genai, tai reiškia, kad gaminami specifiniai baltymai. Kiekvieno tipo kūno ląstelės turi skirtingas tikslines ląsteles, todėl jos turi skirtingas savybes, t. y. nervinė ląstelė skiriasi nuo raudonųjų kraujo kūnelių. Transkripcijos veiksniai gali pakeisti transkripcijos greitį, o procesas yra toks:

  • Transkripcijos faktoriai difuzijos būdu patenka į branduolį iš citoplazmos.
  • Būdami branduolyje, jie gali prisijungti prie promotoriaus sekos (sekos, kuri yra tikslinio geno pradžia).
  • Transkripcijos faktoriai padidina arba sumažina transkripcijos greitį, priklausomai nuo to, ar jie prisijungė prie promotoriaus sekos.

Kai kurie transkripcijos faktoriai vadinami aktyvatoriais, kur jie padidina transkripcijos greitį. Tai atlieka transkripcijos faktoriai, padedantys RNR polimerazei prisijungti prie promotoriaus sekos ir suaktyvinti transkripciją. Kiti vadinami represoriais, kur jie sumažina transkripcijos greitį. Tai daroma transkripcijos faktoriams prisijungus prie promotoriaus sekos, neleidžiančių RNR polimerazei prisijungti. Tai sustabdo transkripciją.

Estrogenai gali inicijuoti tikslinių genų transkripciją. NB: Kartais dėl to transkripcijos faktorius gali būti slopinantis. AQA egzaminui to žinoti nereikia. Transkripcijos faktorius gali būti sujungtas su inhibitoriumi, neleidžiančiu jam prisijungti prie promotoriaus sekos. Estrogenai jungiasi prie transkripcijos faktoriaus, sudarydami estrogeno-estrogeno receptorių kompleksą ir pakeičia vietą, prie kurios prisijungia inhibitorius (vadinama DNR surišimo vieta). Tai reiškia, kad inhibitorius yra atskirtas, todėl transkripcijos faktorius gali prisijungti prie promotoriaus sekos. NB: Jums nereikia žinoti inhibitoriaus pavadinimo. Taip pat DNR surišimo vieta ant transkripcijos faktoriaus lieka pakeista, kol estrogenas prisijungia prie jo.

Eukariotuose ir kai kuriuose prokariotuose mRNR, pagamintos iš tikslinių genų, transliaciją gali slopinti RNR trukdžiai, žinomi kaip RNRi. Trumpos RNR molekulės, tokios kaip mikro RNR, žinoma kaip miRNR, ir mažų trukdžių RNR, žinoma kaip siRNR, su baltymais sudaro RNR sukeltą slopinimo kompleksą, žinomą kaip RISC. NB: Mažos RNR molekulės, kurios, kaip žinoma, yra dvigrandės peržiūros vadovuose arba vadovėliuose, kelia painiavą, todėl geriau pradėti procesą, kai miRNR ir siRNR yra vienos grandinės. RNR sudaro kompleksą su baltymu, kuris yra fermentas, vadinamas RNR hidrolaze. miRNR nesudaro komplekso su RNR hidrolaze, o su kitu baltymu. Kiekviena iš šių RNR molekulių gali sudaryti RISC su daugiau nei vienu baltymu, o dalyvaujantys baltymai neturi būti žinomi dėl AQA. Kiekvienas kompleksas prisijungia prie savo tikslinės mRNR sekos ir įvairiais būdais užkerta kelią vertimui. Štai kaip tai daroma kiekvienai mažai RNR molekulei:

  • siRNR/miRNR augaluose:
  • siRNR bazės prisijungia prie mRNR bazių papildomu bazių poravimu.
  • RNR hidrolazė hidrolizuoja mRNR grandinę į fragmentus, neleidžiant įvykti transliacijai, nes nebus sudaryta visa polipeptido grandinė

NB: Nebūtina žinoti, kad skeveldros suyra apdorojimo korpuse. Jei nori tai išmokti, nieko blogo.

  • miRNR žinduoliuose:
  • MiRNR bazės prisitvirtina prie mRNR bazių papildomu bazių poravimu.
  • Ribosomoms neleidžiama prisitvirtinti prie mRNR grandinės, sustabdant vertimą.

NB: Vėlgi, čia nebūtina žinoti, kad mRNR yra suskaidyta arba saugoma apdorojimo kūne.

Epigenetika apima paveldimus genų funkcijos pokyčius, nepakeitus DNR bazinės sekos. Šiuos pokyčius sukelia aplinkos pokyčiai (didesnis taršos poveikis), kurie slopina transkripciją:

  • Padidėjęs DNR metilinimas:Metilo grupė (žinoma kaip epigenetinis ženklas) prisijungia prie citozino, kuris turi būti nukleotido, prijungto prie guanino fosfodiesterio ryšiu, dalis. NB: Šiuo metu galite būti sumišę, bet pažiūrėkite į žemiau pateiktą vienos DNR grandinės diagramą ir atkreipkite dėmesį, prie kurio citozino nukleotidų prisijungia metilo grupė. Atkreipkite dėmesį, kad nukleotidas, esantis dešinėje grandinės pusėje, ir trečiasis iš kairės neturi metilo grupės, nes jie nėra šalia nukleotido, kurio pagrindas yra guaninas. Metilo grupės sujungimas neturėtų būti painiojamas prisijungiant prie citozino, kuris papildo guaniną kitoje grandinėje, nes tai neteisinga. Taip pat metilo grupė – CH3 – pakeičia ne bazinę seką, o struktūrą. Pasikeitus struktūrai, fermentams tapo sunkiau prisijungti prie DNR, stabdant geno ekspresiją. Jei naviko slopinimo genas nėra transkribuotas, jis gali sukelti vėžį.

  • Sumažėjęs susijusių histonų skaičius: Acetilo grupė – COCH3 – yra dar vienas epigenetinis ženklas, kuris prisitvirtina prie histono baltymų, kad chromatinas (aplink histono baltymus suvyniotos DNR mišinys) būtų mažiau kondensuotas, kad būtų lengva genetinė ekspresija. Problema kyla, kai histono deacetilazė nutraukia ryšį tarp histono baltymo ir acetilo grupės. DNR tampa labai kondensuota, todėl fermentams sunku atlikti genų ekspresiją. NB: Histono deacetilazė gali būti sutrumpinta į HDAC, bet geriausia likti su visu pavadinimu.

Laimei, DNR epigenetiniai pokyčiai yra grįžtami, todėl jie yra geri vaistų taikiniai, siekiant sustabdyti epigenetinio pasireiškimo poveikį. Šie vaistai gali sustabdyti DNR metilinimą arba slopinti histono deacetilazę, todėl acetilo grupės gali likti prisijungusios prie DNR.


Kaip veikia transkripcijos faktoriai?

Aktyvatoriai

Represoriai


Abstraktus

Oksiduotas 1-palmitoil-2-arachidonoil-sn-glicero-3-fosforilcholinas (Ox-PAPC) padidina uždegiminių citokinų ir adhezijos molekulių spektrą, kuris skiriasi nuo tų, kurias sukelia klasikiniai uždegimo mediatoriai, tokie kaip naviko nekrozės faktorius-α (TNF-α) arba lipopolisacharidas. Įdomu tai, kad Ox-PAPC taip pat sukelia baltymų, panašių į tuos, kuriuos sukelia TNF-α arba lipopolisacharidas, ekspresiją, įskaitant chemokinų monocitų chemotaktinį baltymą-1 (MCP-1) ir interleukiną (IL)-8. Norėdami išsiaiškinti Ox-PAPC sukeltos genų ekspresijos molekulinius mechanizmus ir nustatyti, ar Ox-PAPC ir kiti uždegiminiai mediatoriai, tokie kaip TNF-α, naudoja bendrus signalizacijos kelius, ištyrėme Ox-PAPC ir TNF-8 transkripcijos reguliavimą. α žmogaus aortos endotelio ląstelėse. Ir Ox-PAPC, ir TNF-α sukėlė IL-8 mRNR ekspresiją priklausomai nuo dozės, tačiau IL-8 mRNR kaupimosi tarp 2 ligandų kinetika skyrėsi. Ox-PAPC sukelta IL-8 mRNR buvo pastebėta jau po 30 minučių, didžiausias rodiklis buvo nuo 4 iki 8 valandų ir žymiai sumažėjo 24 val. Priešingai, TNF-α sukelta IL-8 mRNR sintezė padidėjo po 30 minučių, didžiausias buvo 2 valandas ir pasiekė bazinį / neaptinkamą lygį per 6 valandas. Eksperimentai su aktinomicinu D parodė, kad tiek Ox-PAPC, tiek TNF-α reguliuoja IL-8 ekspresiją transkripcijos lygiu. Be to, abiejų ligandų IL-8 mRNR pusinės eliminacijos laikas buvo panašus (<30 minučių), o tai rodo, kad mRNR stabilumas nebuvo atsakingas už IL-8 kaupimosi tarp 2 ligandų kinetikos skirtumus. Laikinieji transfekcijos tyrimai su reporterių konstrukcijomis, turinčiomis 1,48 kb IL-8 promotoriaus, nustatė Ox-PAPC specifinį atsako regioną tarp -133 ir -1481 bp IL-8 promotoriaus. Priešingai, IL-8 promotoriaus TNF-α aktyvacija buvo beveik visiškai tarpininkaujama per branduolinį faktorių-κB ir aktyvacijos baltymo-1 atsako elementus, esančius nuo –70 iki –133 bp IL-8 promotoriaus. Taigi, nors Ox-PAPC ir TNF-α sukėlė IL-8 sintezę, mūsų duomenys rodo, kad 2 ligandai naudoja skirtingus IL-8 transkripcijos reguliavimo mechanizmus.

Anksčiau parodėme, kad oksiduotas 1-palmitoil-2-arachidonoil-snGlicero-3-fosforilcholinas (Ox-PAPC), pagrindinis biologiškai aktyvus minimaliai modifikuoto MTL (MM-LDL) komponentas, yra ateroskleroziniuose pažeidimuose ir kitose lėtinio uždegimo vietose. 1,2 Panašiai kaip ir kiti uždegiminiai citokinai, tokie kaip naviko nekrozės faktorius-α (TNF-α), Ox-PAPC aktyvina endotelio ląsteles, kad sustiprintų monocitų ir endotelio sąveiką, iš dalies indukuodamas chemokinus, tokius kaip monocitų chemotaktinis baltymas-1 (MCP-1). ) ir interleukiną (IL)-8. 3,4 Įdomu tai, kad Ox-PAPC (arba MM-LDL), bet ne TNF-α, sustiprina monocitų ir endotelio jungimąsi tarpininkaudamas β1-integrinų aktyvacijai, todėl fibronektino jungiamojo segmento-1 domenas nusėda ant viršūninio paviršiaus. endotelio ląstelės. 5 Kita vertus, TNF-α sustiprina endotelio ir monocitų sąveiką, indukuodamas E-selektiną ir kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulę-1, kurioms Ox-PAPC neturi įtakos. Taigi, Ox-PAPC ir TNF-α naudoja panašius ir skirtingus genų ekspresijos indukcijos modelius, kad inicijuotų endotelio ir monocitų sąveiką. Nors TNF-α sukeliami genų indukcijos molekuliniai mechanizmai yra gerai suprantami, tiksliniai receptoriai, signalizacijos keliai ir molekuliniai mechanizmai, kuriais Ox-PAPC (1) inicijuoja funkcinius pokyčius endotelio ląstelėse ir (2) sustiprina endotelio ir monocitų sąveiką, nėra žinomas.

IL-8, CXC chemokinų šeimos narys, iš pradžių buvo apibūdintas kaip neutrofilų chemotaktinis ir aktyvinantis faktorius. Vėliau buvo nustatyta, kad 7,8 IL-8 vaidina svarbų vaidmenį daugelyje fiziologinių ir patofiziologinių procesų. 9, 10 Visai neseniai IL-8 buvo susijęs su monocitų aktyvacija ir endotelio chemotaksija angiogenezės metu. Nustatyta, kad IL-8 mRNR yra padidėjęs esant ateroskleroziniams pažeidimams iš aterektomizuotų žmogaus miego arterijų, taip pat makrofagų putplasčio ląstelėse žmogaus ateromos atveju. 12 Ox-MTL gydymas ir cholesterolio pakrovimas sukelia IL-8 mRNR makrofaguose. 13 Gerszten ir kt. 14 parodė, kad IL-8 yra labai svarbus tvirtam monocitų sukibimui su aktyvintomis endotelio ląstelėmis. Kaulų čiulpų transplantacija iš pelių, neturinčių CXC receptoriaus-2 (žmogaus IL-8 receptoriaus ortologo), į peles, kurioms trūksta MTL receptorių, sumažino aterosklerozės vystymąsi recipientų aortose. 15 Šie duomenys rodo, kad IL-8 prisideda prie aterosklerozės vystymosi.

Daugybė ligandų, tokių kaip TNF-α ir lipopolisacharidas, sukelia IL-8 sintezę daugelio tipų ląstelėse, įskaitant endotelio ląsteles. 16–18 IL-8 indukcija TNF-α, IL-1β, IL-6 ir lipopolisacharidu reguliuojama transkripcijos lygiu. 18,19 IL-8 promotoriuje yra sutarimo jungimosi vietos su branduoliniu faktoriumi-κB (NF-κB), CCAAT stipriklį jungiančiu baltymu-β (C/EBPβ) ir aktyvaciniu baltymu-1 (AP-1), kurie visi yra žmogaus IL-8 promotoriaus proksimalinė sritis tarp –70 ir –133 bp. 20 Makrofaguose ir epitelio ląstelėse TNF-α ir kiti uždegiminiai citokinai suaktyvina IL-8 promotorių, bendradarbiaudami sujungdami šiuos 3 transkripcijos faktorius su sudėtine enhivenosoma nuo –70 iki –133 bp proksimalinio promotoriaus. 21–24 Ox-PAPC ir MM-LDL skatina IL-8 baltymo kaupimąsi žmogaus aortos endotelio ląstelių (HAEC) supernatantuose 3, tačiau Ox-PAPC sukeltos IL-8 sintezės mechanizmai nėra žinomi. Siekdami nustatyti molekulinius mechanizmus, kuriais Ox-PAPC sukelia IL-8 geno ekspresiją, ištyrėme Ox-PAPC ir TNF-α IL-8 reguliavimą HAEC.

Metodai

Reagentai

Audinių auginimo terpė ir reagentai buvo gauti iš Irvine Scientific Inc. Fetal bovine serum (FBS) buvo gautas iš Hyclone. PAPC buvo nupirktas iš Sigma, o Ox-PAPC buvo paruoštas, kaip aprašyta anksčiau. 2 Oksidacija buvo stebima masės spektrometrijos metodu ir buvo nutraukta, kai oksidavosi >90% PAPC. Tokiomis sąlygomis buvo stebimas minimalus lizofosfatidilcholino susidarymas. Taigi, šiuose tyrimuose naudojami Ox-PAPC masės spektrometrijos profiliai buvo panašūs į anksčiau parodytus. 2 Endotoksinų koncentracijos fosfolipidų tirpaluose buvo <0,1 pg/mL. TNF-α buvo nupirktas iš R&D. AP-1 (5′-CTAGTGATGAGTCAGCCGGATC-3′), NF-κB (5′-GATCCAGGGGACTTTCCCTAGC-3′) ir Oct-1 (5′-TGTCGAATGCAAATCACTAGA-3′) buvo perkamos oligonukleotidų mobilumo elektrocidai. Kruzo biotechnologija. Radioizotopai buvo įsigyti iš Amersham Pharmacia Biotech. Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM) / didelės gliukozės koncentracijos terpė HeLa ląstelių kultūrai ir M199 terpė HAEC kultūrai buvo įsigyta iš Gibco/BRL.

Ląstelių kultūros

HAEC buvo išskirtos iš eksplantuotų donorų širdžių aortos žiedų, kaip aprašyta anksčiau 1, ir kultivuoti M199 terpėje, papildytoje 20% (tūrio / tūrio) FBS, penicilino-streptomicino (atitinkamai 100 V / ml ir 100 μg / ml, Gibco / BRL). , natrio piruvatas (1 mmol/L), heparinas (90 μg/mL, Sigma) ir endotelio ląstelių augimo faktorius (20 μg/mL, Fisher Scientific). HeLa ląstelės (American Type Culture Collection, Manassas, Va) buvo kultivuojamos DMEM / didelės gliukozės terpėje su 10% (tūrio / tūrio) FBS ir penicilinu-streptomicinu.

Plazmidės ir vietinė mutagenezė

Luciferazės reporterių plazmidžių konstravimas su ilgesniu žmogaus IL-8 promotoriumi (nuo -1481 iki +44 bp), trumpesniu IL-8 promotoriumi (nuo -133 iki +44 bp) ir keliomis atskirų NF-κB, C/EBPβ kopijomis, arba AP-1 elementai buvo aprašyti anksčiau. 25 NF-κB ir AP-1 elementų mutacijos, atsižvelgiant į luciferazės reporterio konstrukciją, turinčią ilgesnį IL-8 promotorių nuo –1481 iki +44 bp (p[−1481/+44]-Luc), buvo sukurtos naudojant komerciškai prieinamas vietinės mutagenezės rinkinys (QuickChange, Stratagene) ir gamintojo pateikti protokolai. 3 elementų mutacijos pradmenys buvo sukurti taip, kaip aprašyta anksčiau 26, 27 ir pritaikyti iš Invitrogen. NF-κB elementas buvo mutavęs iš TGAATTTCCT į TGGAATTTaaa ir AP-1 elementas, nuo TGACTCA iki TGACTgt.

Laikinoji transfekcija

HeLa ląstelės buvo dedamos į 6 šulinėlių auginimo lėkštes (2 × 105 ląstelių viename duobutėje) DMEM / didelės gliukozės terpėje, turinčioje 10% FBS. Visos transfekcijos buvo atliktos naudojant iš viso 1 μg DNR vienoje duobutėje su Superfect Reagent (8 μL viename šulinyje, Qiagen) pagal gamintojo protokolą. Praėjus keturioms valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo stimuliuojamos Ox-PAPC arba TNF-α DMEM / didelės gliukozės terpėje / 1% FBS. Po 12 valandų buvo surinkti visi ląstelių lizatai ir ištirtas luciferazės aktyvumas, naudojant luciferazės tyrimo sistemos rinkinį (Promega). Liuciferazės aktyvumas buvo normalizuotas iki kotransfekuotos pSV-β-galaktozidazės (Promega).

Imunofermentinis tyrimas

IL-8 lygiai HAEC supernatantuose buvo matuojami naudojant IL-8 ELISA rinkinį (Quantikine, R&D) pagal gamintojo protokolą.

Northern Blotting

Bendra ląstelių RNR buvo išskirta iš HAEC ir HeLa ląstelių naudojant Trizol reagentus (Gibco / BRL) pagal gamintojo protokolą. Žmogaus IL-8 kDNR zondas (1,2 kb EcoŽmogaus IL-8 kDNR RI fragmentas) buvo radioaktyviai pažymėtas [α-32P]dCTP atsitiktinio paleidimo metodu. Normalizavimui buvo įtrauktas gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazės zondas, o kiekybinės analizės buvo atliktos visuose eksperimentuose su fosfovaizdu (Kodak).

Branduolinių baltymų ekstrahavimas ir elektroforetinio mobilumo poslinkio tyrimas

HeLa ląstelės buvo iš anksto inkubuojamos su 1% FBS turinčia DMEM / didelės gliukozės terpės 1 dieną. Ląstelės buvo apdorotos 30 minučių Ox-PAPC, TNF-α ir forbolo 12-miristato 13-acetatu (Sigma). Tada ląstelės buvo surenkamos ir resuspenduojamos 50 μl ląstelių lizės buferio (10 mmol/L HEPES pH 7,9, 10 mmol/L KCl, 1,5 mmol/L MgCl2, 0,5 mmol/l ditiotreitolio [DTT] ir 0,1 % NP-40) ir inkubuojamas ant ledo 10 minučių. Ląstelių lizatai buvo trumpai maišomi ir centrifuguojami 10 000 aps./min 10 minučių 4 ° C temperatūroje. Tada granulės buvo resuspenduotos 15 μl branduolių lizės buferio (20 mmol/l HEPES pH 7,9, 1,5 mmol/l MgCl2, 5 mmol/L DTT, 0,5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L PMSF, 25% glicerolio ir 0,42 mol/L NaCl) ir inkubuojamas ant ledo 15 minučių. Branduoliniai lizatai buvo trumpai maišomi ir centrifuguojami 14 000 aps./min. greičiu 15 minučių 4 °C temperatūroje. Supernatantai buvo surinkti ir laikomi -80 ° C temperatūroje būsimiems elektroforetinio mobilumo poslinkio tyrimams. Baltymų koncentracija buvo nustatyta Bradfordo metodu.

Elektroforetinio mobilumo poslinkio tyrimas buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau. 28 Trumpai tariant, oligonukleotidų galai buvo pažymėti [γ-32P]ATP naudojant T4 polinukleotidų kinazę ir išgryninti Microspin kolonėlėse (Bio-Rad). Kiekvienai 10 μL reakcijai 8 μg branduolio ekstrakto baltymo ir 1 μL išgrynintų paženklintų oligonukleotidų buvo inkubuojami su 1 μL dI-dC (1 μg/μL) ir 1 μL 10 × surišimo buferio (10 mmol/L Tris- HCl pH 7,5, 50 mmol/l NaCl, 0,5 mmol/l EDTA, 1 mmol/l MgCl2, 0,5 mmol/L DTT ir 4 % glicerolio) kambario temperatūroje 20 minučių. Mėginiams buvo atlikta elektroforezė ant 4% nedenatūruoto poliakrilamido gelio 0,5 × Tris-borate-EDTA buferyje, esant 100 V įtampai, 1 valandą. Geliai buvo išdžiovinti ir veikiami 32 P fosfovaizdu nuo 2 valandų iki nakties, priklausomai nuo džiovintų gelių radioaktyvumo intensyvumo.

Rezultatai

Ox-PAPC sukelta IL-8 mRNR ir baltymų sintezė HAEC

Anksčiau mes parodėme, kad Ox-PAPC skatina IL-8 baltymo kaupimąsi HAEC supernatantuose. 3 Norėdami nustatyti, ar Ox-PAPC sukeltas IL-8 baltymo kaupimasis buvo naujos IL-8 mRNR sintezės rezultatas, atlikome Northern blot analizę HAEC, apdorotoms skirtingomis Ox-PAPC ir PAPC koncentracijomis. Ox-PAPC sukėlė IL-8 mRNR sintezę priklausomai nuo dozės (1A pav.). Neapdorotų ir PAPC apdorotų (iki 100 μg/mL) HAEC buvo labai minimalus IL-8 pranešimas, jei toks buvo (1A pav.). Ox-PAPC taip pat sukėlė IL-8 baltymų kaupimąsi HAEC supernatantuose priklausomai nuo dozės (1B pav.).

Figūra 1. Ox-PAPC sukelia IL-8 pranešimą ir baltymą. HAEC buvo apdorotos įvairios koncentracijos Ox-PAPC (nuo 0 iki 100 μg/mL) ir PAPC (nuo 0 iki 100 μg/ml). Po keturių valandų buvo surinkta bendra RNR ir supernatantas, siekiant nustatyti Ox-PAPC sukeltos IL-8 mRNR (A) ir baltymo (B) lygius. Rezultatai reprezentuoja 4 atskirus eksperimentus, klaidų juostos buvo statistiškai nustatytos naudojant tris tos pačios būklės egzempliorius 1 eksperimente.

IL-8 mRNR kaupimosi kinetika skiriasi Ox-PAPC ir TNF-α apdorotose HAEC

Toliau išnagrinėjome TNF-α sukeltos ir Ox-PAPC sukeltos IL-8 pranešimų kaupimosi HAEC laiko eigą. Ox-PAPC sukeltos IL-8 transkriptai buvo pastebėti jau po 30 minučių (padidėjimas 3 kartus), didžiausias buvo 4–8 valandas (≈60 kartų padidėjimas) ir žymiai sumažėjo 24 valandas (8 kartus padidėjimas, 2A pav. ir 2B). Priešingai, TNF-α sukeltas IL-8 mRNR kiekis buvo didžiausias po 2 valandų (300 kartų indukcija), bet grįžo į pradinį lygį po 6 valandų (2A ir 2B pav.). Esant cikloheksimidui, IL-8 mRNR vis tiek padidėjo 65 kartus, o tai rodo, kad nauja baltymų sintezė neturi įtakos šiai ilgalaikei Ox-PAPC indukcijai. IL-8 baltymas buvo aptiktas Ox-PAPC apdorotuose HAEC supernatantuose jau po 2 valandų, o lygis vis dar didėjo po 24 valandų (2C pav.). TNF-α sukeltas IL-8 baltymas susikaupė jau po 1 valandos ir didžiausias buvo nuo 8 iki 12 valandų. Po 12 valandų reikšmingo IL-8 lygio skirtumo nebuvo (2D pav.). Šie duomenys rodo, kad IL-8 baltymo kaupimasis yra lygiagretus IL-8 mRNR indukcijai, kurią sukelia 2 agentai.

2 pav. Ox-PAPC ir TNF-α indukuoja IL-8 mRNR ir baltymus, tačiau turi skirtingą kinetiką. HAEC buvo gydomi Ox-PAPC (50 μg/ml) arba TNF-α (2 ng/ml). Bendra RNR ir terpė buvo renkama skirtingais laiko intervalais (nuo 0 iki 24 valandų). A, Northern blot buvo atliktas naudojant 5 μg visos RNR, išskirtos iš Ox-PAPC- (viršutinė plokštė) arba TNF-α- (apatinė plokštė) apdorotų HAEC. B, Ox-PAPC ir TNF-α sukeltų IL-8 mRNR Northern blotų fosfovaizdo analizė. Visi IL-8 pranešimų lygiai buvo normalizuoti iki gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazės lygio. C ir D, ELISA buvo atlikta su HAEC supernatantais, siekiant nustatyti Ox-PAPC (C) ir TNF-α (D) sukeltos IL-8 baltymų sintezės lygį skirtingu laiko intervalu (nuo 0 iki 24 valandų). Rezultatai reprezentuoja 3 atskirus eksperimentus.

Ox-PAPC padidino IL-8 mRNR kaupimąsi didinant transkripciją

Norint nustatyti, ar IL-8 mRNR kaupiasi transkripcijos lygyje, HAEC buvo iš anksto apdorotos aktinomicinu D (400 nmol/L) 30 minučių, o po to buvo apdorotos Ox-PAPC (50 μg/mL) arba TNF-α (20). ng/ml) 2 valandas. Northern blot analizė (3A pav.) parodė, kad aktinomicinas D visiškai slopino IL-8 transkripciją tiek Ox-PAPC, tiek TNF-α (87 % ir 91 % sumažėjimas, atitinkamai 3B pav.). Norint nustatyti, ar IL-8 potranskripcijos reguliavimo skirtumai lėmė Ox-PAPC ir TNF-α sukeliamos IL-8 indukcijos kinetikos skirtumus, HAEC buvo gydomi Ox-PAPC arba TNF-α 2 valandas prieš aktinomiciną. D (400 nmol/L) ir IL-8 mRNR buvo kiekybiškai įvertinta įvairiais laiko momentais. IL-8 mRNR nuorašas buvo visiškai suskaidytas 1 valandą tiek TNF-α, tiek Ox-PAPC (3B pav.), o tai rodo, kad abiejų IL-8 mRNR pusinės eliminacijos laikas buvo panašus (<30 minučių). These data suggest that both Ox-PAPC-induced and TNF-α-induced IL-8 expression is regulated at the level of transcription in HAECs (Figure 3C).

3 pav. Ox-PAPC and TNF-α regulate IL-8 message at the level of transcription. HAECs were treated with or without actinomycin D (400 nmol/L) for 30 minutes and then with Ox-PAPC (40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL). Two hours later, total RNA were extracted and IL-8 message induced by TNF-α and Ox-PAPC was determined by Northern blot (A) and quantified by phosphoimage analysis (B). All IL-8 message levels were normalized to glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase levels. The stability of induced IL-8 mRNA by both ligands was determined by measuring the message half-life. HAECs were first treated with either Ox-PAPC or TNF-α. Two hours later, actinomycin D (400 nmol/L) was added to inhibit any further synthesis of new message. Total RNA was extracted at different time intervals (0, 1, 2, and 4 hours) after addition of actinomycin D. Northern blots and phosphoimager analysis were performed to quantify the levels of IL-8 mRNA (expressed as the percentage of IL-8 message amount at 0 hours) induced by Ox-PAPC (solid line) or TNF-α (dashed line). Results are representative of 2 separate experiments.

Ox-PAPC and TNF-α Activated Reporter Constructs Containing a 1.48-kb IL-8 Promoter

Both Ox-PAPC and TNF-α induced IL-8 protein synthesis in HeLa cells (data not shown) therefore, IL-8 promoter regulation study was performed in this easily transfected cell type. To determine whether Ox-PAPC can induce transcriptional activation of the human IL-8 promoter, HeLa cells were transiently transfected with a luciferase reporter plasmid containing −1481 to +44 bp of the human IL-8 promoter and were then treated with various concentrations of Ox-PAPC. Ox-PAPC induced luciferase activity in a dose-dependent fashion, suggesting that Ox-PAPC response elements are present in the first 1.48 kb of the IL-8 promoter (Figure 4).

4 pav. Ox-PAPC and TNF-α activate luciferase reporter constructs containing the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected for 2 hours with 0.8 μg per well of p(−1481/+44)-Luc, together with 0.2 μg per well of β-galactosidase expression plasmid, as described in Methods. Transfected cells were treated with various concentrations of Ox-PAPC (from 25 to 40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL) for 12 hours. Cell lysates were collected and assayed for luciferase and β-galactosidase activities. Luciferase activities were expressed in arbitrary units after being normalized against β-galactosidase activities. Results are representative of 3 separate experiments.

Studies on NF-κB, AP-1, and Oct-1 Activation

To determine whether NF-κB, C/EBPβ, or AP-1 response elements participate in Ox-PAPC-mediated transcriptional activation, reporter constructs containing multiple NF-κB (p[NF-κB]3-Luc), C/EBPβ (p[C/EBPβ]3-Luc), or AP-1 (p[AP-1]3-Luc) elements were transiently transfected into HeLa cells. TNF-α strongly activated p[NF-κB]3-Luc by 7-fold, whereas Ox-PAPC had no effect (Figure 5A). On the other hand, Ox-PAPC mildly activated the p[AP-1]3-Luc construct (Figure 5B), whereas TNF-α had no effect. Plasmid p[C/EBPβ]3-Luc was not activated by either TNF-α or Ox-PAPC (data not shown). Furthermore, nuclear extracts from cells treated with TNF-α but not Ox-PAPC showed increased binding activity to a [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB consensus sequence from the human IL-8 promoter (Figure 5C). TNF-α did not affect AP-1 binding activity in HeLa nuclear extracts, whereas a minimal increase was seen with Ox-PAPC (Figure 5C). Phorbol 12-myristate 13-acetate, an AP-1 activator, served as a positive control. Previous studies had shown that the induction of IL-8 may be the result of downregulation of Oct-1, a constitutive repressor of the C/EBPβ response element. 29 Because Ox-PAPC did not induce NF-κB and only minimally induced AP-1 activity, we hypothesized that Oct-1 binding activity might be decreased by Ox-PAPC and result in induction of IL-8. However, nuclear extracts from HeLa cells treated with Ox-PAPC or TNF-α showed no decrease in Oct-1 binding activity on the electrophoretic mobility shift assay (Figure 5C).

5 pav. Activation of NF-κB, AP-1, and Oct-1. HeLa cells were transiently transfected with 0.8 μg of (A) p[NF-κB]3-Luc or (B) p[AP-1]3-Luc as per the aforementioned protocol in the legend to Figure 4. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (solid black bar) or 2 ng/mL TNF-α (dotted bar) for 12 hours. Results were shown in luciferase activity units that were normalized against β-galactosidase activities. p[NF-κB]3-Luc is a luciferase reporter construct with 3 copies of the NF-κB responsive element and p[AP-1]3-Luc, with 3 copies of the AP-1 responsive element. C, HeLa cell nuclear extracts were harvested after 30 minutes of stimulation with Ox-PAPC (40 μg/mL), TNF-α (2 ng/mL), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 20 ng/mL), or control media (C). [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB, AP-1, and Oct-1 oligonucleotides were individually incubated with 5 μg of nuclear extracts at room temperature for 20 minutes. Reaction products were run on nondenatured gels and exposed to phosphoimage analysis. These image values were used to calculate the fold induction (above lanes) compared with untreated cells, and all values obtained were well within the linear range of phosphoimage measurement. Results are representative of 2 separate experiments.

An Ox-PAPC-Responsive Element Is Located in the Upstream Region of the Human IL-8 Promoter

To determine the sequences in the IL-8 promoter important for Ox-PAPC-induced transcription, reporter constructs containing different lengths of the IL-8 promoter (−1481 to +44 and −133 to +44) were transiently transfected into HeLa cells. The IL-8 promoter construct containing p[−1481/+44]-Luc was activated by Ox-PAPC however, the construct containing p[-133/+44]-Luc was only mildly activated by Ox-PAPC (Figure 6B). In contrast, TNF-α activated both the longer p[−1481/+44]-Luc and the shorter p[−133/+44]-Luc constructs (>17-fold, Figure 6A). Thus, deletion of the upstream region of the IL-8 promoter from −1481 to −133 bp resulted in a 75% reduction in promoter activation by Ox-PAPC (Figures 6A and 6B), suggesting that an Ox-PAPC-response region resides between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. Individual mutations in the conserved response elements (NF-κB and AP-1) generated in the context of the longer construct p[−1481/+44]-Luc] resulted in significant inhibition of TNF-α-induced IL-8 promoter activation but only slightly decreased Ox-PAPC-induced activation (Figures 6A and 6B).

6 pav. Ox-PAPC mediates IL-8 promoter activation through an Ox-PAPC-specific response region between −133 and −1481 bp of the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected with 2 luciferase reporter plasmids, p[−1481/+44]-Luc and p[−133/+44]-Luc, or with 3 separate p[−1481/+44]-Luc constructs containing site-directed mutations of the NF-κB or AP-1 element, as described in Methods. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (A) or 1 ng/mL TNF-α (B). Results are shown as the fold induction above control. P-1481 indicates p[−1481/+44]-Luc P-133, p[−133/+44]-Luc. Results are representative of 3 separate experiments.

Diskusija

This study is the first to examine the mechanism by which Ox-PAPC, an oxidatively fragmented lipid component of MM-LDL, regulates transcription. In this study, Ox-PAPC was compared with the more thoroughly characterized regulation of IL-8 by TNF-α. Our results demonstrate that the major effect of Ox-PAPC on the IL-8 promoter is involved with an upstream sequence between −1481 and −133 bp. There are several responsive elements present in this region of the human IL-8 promoter that have been known for years, eg, the glucocorticoid responsive element and the hepatocyte nutrition factor-1 binding site, which are located at positions −330 to −325 bp and −381 to −376 bp, respectively, upstream from the TATA box. 20 Neither has been demonstrated to have a transcription-enhancing property in fact, activated glucocorticoid responsive element mediates the downregulation of NF-κB-activated transcription by interfering with the binding of NF-κB p65 to its cis-element 30 or by directly interfering with transactivation of the NF-κB p65 subunit. 31 There is no other cis-element in the human IL-8 promoter that has been described. Thus, we propose that there is a novel cis-element located in the 5′-flanking region between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. One likely candidate for this putative distant enhancer may be the peroxisome proliferator-activated receptor response element (PPRE).

Recently, work from our laboratory has shown that MM-LDL and Ox-PAPC activate PPRE and peroxisome proliferator-activated receptor-α activators and stimulate the production of MCP-1 and IL-8 in HAECs. 3 Additionally, the PPRE has been reported to function as an indispensable cis-enhancing element that may be located as far as −2 kb upstream from the transcription initiation site. 32 These observations support the notion that the PPRE may be the cis-enhancing element responsive to Ox-PAPC in the 5′-flanking sequence of the human IL-8 promoter.

In our current study, by using both gel shift assays and transient transfection experiments, neither the NF-κB nor AP-1 signaling pathway was activated by Ox-PAPC. This result is different from previous data showing activation of NF-κB and AP-1 signaling by Ox-LDL, 33–35 MM-LDL, 36 or oxidized phospholipids, such as platelet-activating factor-like lipids. 37 Activation of NF-κB by Ox-LDL was demonstrated to be a result of enhanced phosphorylation of inhibitor-κB in monocytes. 34 Platelet-activating factor-like lipids, enzymatically oxidative fragmentation products of ether-containing phosphatidylcholine, activate NF-κB signaling in the cells expressing platelet-activating factor receptors, such as monocytes. 37 MM-LDL was also shown by electrophoretic mobility shift assay to activate binding to an NF-κB consensus sequence. 36 Although Ox-PAPC activates the AP-1 element in isolation, it only minimally increased AP-1 binding on the electrophoretic mobility shift assay and activated the longer IL-8 promoter with the AP-1 mutation. Thus, we have demonstrated that unlike Ox-LDL, the AP-1 element is not important in the human IL-8 promoter activation by Ox-PAPC.

The difference in the effects of Ox-LDL, MM-LDL, platelet-activating factor-like lipids, and Ox-PAPC may be related to the different cell types used for these studies. Furthermore, they may be related to the different bioactive lipid components in Ox-PAPC versus Ox-LDL and platelet-activating factor-like lipids. We found that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine, an oxidative fragmented product purified from Ox-PAPC, is the major bioactive lipid that enhances monocyte binding to endothelial cells. 38 The level of this phospholipid is quite low in Ox-LDL furthermore, Ox-PAPC, being ester derived, does not contain platelet-activating factor-like lipids. In a separate study, it will be shown that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine and its dehydration product are the lipids in Ox-PAPC that are mainly responsible for inducing IL-8 in HAECs.

In summary, this current study has provided information on the mechanism by which Ox-PAPC induces IL-8 transcription. We have demonstrated that Ox-PAPC transcriptionally regulates IL-8 and causes a prolonged increase in transcription, compared with TNF-α. This prolonged increase was not secondary to new protein synthesis. We have also shown that the induction of IL-8 by Ox-PAPC, unlike that by Ox-LDL or TNF-α, is not mediated by way of the NF-κB signaling pathway. IL-8 upregulation by Ox-PAPC is also not a result of activation of NF-κB, C/EBPβ, and AP-1 or of downregulation of a constitutive transcriptional repressor Oct-1. Rather, we have demonstrated that Ox-PAPC induces IL-8 expression by activation of a putative cis-enhancer element in the upstream IL-8 promoter sequence. Our results showing differential regulation of the IL-8 promoter by Ox-PAPC compared with that by TNF-α provide a basis for the differences previously reported in genes activated by the 2 agents.

This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grant HL30568 and NIH training grant 5T32HL07895.

Received July 16, 2001 revision accepted July 27, 2001.

We thank Dr Yin Tintut for her technical support in several key experiments in this work.


Transcription: from DNA to mRNA

Both prokaryotes and eukaryotes perform fundamentally the same process of transcription, with the important difference of the membrane-bound nucleus in eukaryotes. With the genes bound in the nucleus, transcription occurs in the nucleus of the cell and the mRNA transcript must be transported to the cytoplasm. The prokaryotes, which include bacteria and archaea, lack membrane-bound nuclei and other organelles, and transcription occurs in the cytoplasm of the cell. In both prokaryotes and eukaryotes, transcription occurs in three main stages: initiation, elongation, and termination.

Iniciacija

Transcription requires the DNA double helix to partially unwind in the region of mRNA synthesis. The region of unwinding is called a transcription bubble . The DNA sequence onto which the proteins and enzymes involved in transcription bind to initiate the process is called a promoter . Daugeliu atvejų promotoriai egzistuoja prieš genus, kuriuos jie reguliuoja. The specific sequence of a promoter is very important because it determines whether the corresponding gene is transcribed all of the time, some of the time, or hardly at all (Figure 2).

2 pav. The initiation of transcription begins when DNA is unwound, forming a transcription bubble. Enzymes and other proteins involved in transcription bind at the promoter.

Pailgėjimas

Transcription always proceeds from one of the two DNA strands, which is called the template strand . The mRNA product is complementary to the template strand and is almost identical to the other DNA strand, called the nontemplate strand , with the exception that RNA contains a uracil (U) in place of the thymine (T) found in DNA. During elongation, an enzyme called RNA polymerase proceeds along the DNA template adding nucleotides by base pairing with the DNA template in a manner similar to DNA replication, with the difference that an RNA strand is being synthesized that does not remain bound to the DNA template. As elongation proceeds, the DNA is continuously unwound ahead of the core enzyme and rewound behind it (Figure 3).

3 pav. During elongation, RNA polymerase tracks along the DNA template, synthesizes mRNA in the 5′ to 3′ direction, and unwinds then rewinds the DNA as it is read.

Nutraukimas

Kai genas transkribuojamas, prokariotinei polimerazei reikia nurodyti atsiskirti nuo DNR šablono ir išlaisvinti naujai pagamintą mRNR. Depending on the gene being transcribed, there are two kinds of termination signals, but both involve repeated nucleotide sequences in the DNA template that result in RNA polymerase stalling, leaving the DNA template, and freeing the mRNA transcript.

On termination, the process of transcription is complete. In a prokaryotic cell, by the time termination occurs, the transcript would already have been used to partially synthesize numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently using multiple ribosomes (polyribosomes) (Figure 4). Priešingai, branduolio buvimas eukariotinėse ląstelėse užkerta kelią vienalaikei transkripcijai ir vertimui.

4 pav. Kelios polimerazės gali transkribuoti vieną bakterijų geną, o daugelis ribosomų tuo pačiu metu paverčia mRNR nuorašus į polipeptidus. Tokiu būdu specifinis baltymas gali greitai pasiekti didelę koncentraciją bakterijų ląstelėje.


Koks yra transkripcijos ir vertimo ryšys?

Transkripcija yra genų sekos RNR kopijos kūrimo procesas. Vertimas yra procesas, kai baltymų sintezės metu RNR molekulės seka paverčiama aminorūgščių seka. Taigi, ryšys tarp dviejų procesų yra tas, kad jie abu dalyvauja baltymų sintezėje ir kad pirmiausia yra transkripcija, o paskui - vertimas. Galiausiai tai yra viskas, ką mes žinome apie transkripciją ir vertimą genetikos požiūriu. Skaitykite toliau, jei norite daugiau sužinoti apie transkripciją ir vertimą kai kalbame apie paslaugas.

Nesvarbu, ar tai vieša kalba, interviu, rinkos tyrimas ar finansinė ataskaita, jei tikitės, kad jūsų pranešimas pasieks kuo platesnę auditoriją, turėtumėte apsvarstyti galimybę jį perrašyti ir išversti į tikslines kalbas. Taigi, štai!

Transkripcija

Kaip ir genetikoje, pirmiausia būtina įvykti transkripcija. Merriam Webster teigimu, tai yra ištartų žodžių rašytinės, atspausdintos ar atspausdintos kopijos darymas. Pavyzdžiui, įmonėms visiškai būtina turėti dokumentuotą garso ir vaizdo failų teksto formatą. Tai pragmatiškas būdas sekti ir geriau suprasti, kas sakoma. Jei jums patiko idėja, kruopščiai planuokite, nes kiekvienam, nepatyrusiam transkripcijos srityje, reikia daug laiko, kad garso įrašą paverstų aiškaus teksto dokumentu. Patarimas: palikite šią varginančią ir varginančią užduotį mūsų profesionaliems transkripcijos specialistams, kurie garantuoja konfidencialumą, tikslumą ir aukščiausią kokybę.

Vertimas

Kai turėsite paruoštą ir patikrintą nuorašą, galėsite tęsti vertimą. Iš esmės tai yra vienos kalbos pakeitimas kita. Tačiau praktiškai tai nėra tiesiog žodžių keitimas į jų atitikmenis skirtingomis kalbomis. Kokybiškas vertimas reiškia, kad reikia žinoti kontekstą ir kultūrinį foną, iš kurio kilo žodžiai originaliame tekste, ir tada pasirinkti žodžius ir frazes nauja kalba, kurie geriausiai perteiks originalo esmę ir prasmę naujame ir kitokiame kultūriniame kontekste. Jei visa tai neįvyks, pranešimas gali būti neteisingai interpretuotas arba net prarastas. Be to, jei ketinate investuoti išteklius šiai paslaugai, įsitikinkite, kad ieškote geriausio laiko, paprastumo ir pritaikymo auditorijai.


Regulated nuclear translocation of the Mig1 glucose repressor.

Glucose represses the transcription of many genes in bakers yeast (Saccharomyces cerevisiae). Mig1 is a Cys2-His2 zinc finger protein that mediates glucose repression of several genes by binding to their promoters and recruiting the general repression complex Ssn6-Tup1. We have found that the subcellular localization of Mig1 is regulated by glucose. Mig1 is imported into the nucleus within minutes after the addition of glucose and is just as rapidly transported back to the cytoplasm when glucose is removed. This regulated nuclear localization requires components of the glucose repression signal transduction pathway. An internal region of the protein separate from the DNA binding and repression domains is necessary and sufficient for glucose-regulated nuclear import and export. Changes in the phosphorylation status of Mig1 are coincident with the changes in its localization, suggesting a possible regulatory role for phosphorylation. Our results suggest that a glucose-regulated nuclear import and/or export mechanism controls the activity of Mig1.


Žiūrėti video įrašą: Translacija (Birželis 2022).