Informacija

Kodėl, analizuojant fosfoproteinus Western blot metodu, bendras tikslinio baltymo baltymų kiekis rekomenduojamas kaip vidinė apkrovos kontrolė?

Kodėl, analizuojant fosfoproteinus Western blot metodu, bendras tikslinio baltymo baltymų kiekis rekomenduojamas kaip vidinė apkrovos kontrolė?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aš analizuoju baltymų kinazės ekspresiją Western blot metodu, ir tai yra fosfoproteinas. Pažymėjau savo membraną antikūnais prieš fosforilintą baltymo formą (naudojant specifinius fosfo antikūnus) ir bendrą baltymą (naudojant specifinius antikūnus).

Skaičiau, kad tiriant fosfoproteinus reikia normalizuoti fosforilinto baltymo signalą iki bendro baltymo signalo. Šiame žurnalo straipsnyje teigiama, kad Biologinės chemijos žurnalas rekomenduoja tai „Signalai, gauti naudojant antikūnus, specifinius fosforilintiems epitopams, turėtų būti normalizuoti iki bendro baltymo kiekio tiksliniame baltyme“.

Kituose žurnalo straipsniuose, kuriuose analizuojama fosfoproteino ekspresija naudojant Western blot metodus, mačiau, kad jie taip pat normalizuoja fosfoproteino signalą į bendrą baltymo signalą (tikslinio baltymo).

Tačiau nesu tikras, kodėl bendras tikslinio baltymo baltymų kiekis gali būti naudojamas kaip vidinė apkrovos kontrolė?

Šiame vadove perskaičiau, kad vidinės apkrovos kontrolė yra endogeninis (-i) etaloninis (-iai) baltymas (-ai), kurio (-ių) yra visuose mėginiuose stabiliu lygiu ir kurių nepaveikia eksperimentinės sąlygos.

Noriu palyginti savo fosfoproteino išraišką skirtingų eksperimentinių sąlygų mėginiuose. Žinau, kad paprastai visos baltymų dėmės, tokios kaip Ponceau S arba namų ruošos baltymai, yra naudojamos kaip vidinė apkrovos kontrolė ir normalizavimui.

Bet kodėl rekomenduojama normalizuoti iki bendro tikslinio baltymo (žiūrint į fosfoproteinus), nes nežinoma, ar viso tikslinio baltymo ekspresija bus stabili skirtingomis eksperimentinėmis sąlygomis? Bet kokios įžvalgos yra vertinamos.


Taip yra todėl, kad jūs nežinote, kaip jūsų gydymas veikia bendro specifinio baltymo ekspresiją; galbūt tai sumažina arba padidina gaminamų baltymų kiekį, bet santykinė fosforilinimo dalis nesikeičia. Pavyzdžiui:

Įsivaizduokite, kad turite 4 skirtingų gydymo būdų mėginius, į kuriuos įdėjote vienodą bendrą baltymų kiekį (tarkim, iš viso 50 ug, atkreipkite dėmesį, kad tai yra per daug, kad būtų galima įkelti į WB, kad būtų galima tiksliai nustatyti; paprastai norite mažiau nei 10 ug). Vykdote Western blot ir rasite šiuos konkrečiam baltymui skirtus skaičius (visiškai sudarytus BTW). Pagal šį scenarijų 1 yra neapdorota kontrolė.

  1. 10 ug
  2. 20 ug
  3. 10 ug
  4. 20 ug

Tada išbandykite fosfospecifinį antikūną ir gausite toliau nurodytus dalykus

  1. 1 ug
  2. 2 ug
  3. 3 ug
  4. 1 ug

Ką tai mums sako apie 4 gydymo būdus?

Na, tai mums sako, kad 2 padidina bendrą baltymų kiekį, tačiau santykinė fosforilinimo dalis yra tokia pati. 3 fosforilintas baltymas yra reguliuojamas aukštyn (3x), bet ne bendras baltymas, o 4 bendras baltymas yra padidintas, bet fosforilintas - sumažintas (0,5x).


Nuorodos

Apimtys RK (1994). Baltymų valymas (Niujorkas, NY: Springer New York).

Taylor SC ir kt. (2013). Apibrėžta metodika patikimam Western blot duomenų kiekybiniam įvertinimui. Mol Biotechnol 55, 217–226.

Walsh T (2006). Baltymų modifikavimas po transliacijos: gamtos inventoriaus išplėtimas (Roberts and Company Publishers).

Yadav G ir Liu N (2014). Baltymų atskyrimo ir analizės tendencijos – technologijos be dėmių pažanga. bioradiations.com/trends-in-protein-separation-and-analysis-the-advance-of-stain-free-technology/, peržiūrėta 2018 m. lapkričio 11 d.

Bio-Rad yra Bio-Rad Laboratories, Inc. prekės ženklas tam tikrose jurisdikcijose. Visi čia naudojami prekių ženklai yra atitinkamo savininko nuosavybė.


Abstraktus

Fonas

Fosforilinimas baltymų kinazėmis yra pagrindinis molekulinis procesas, dalyvaujantis reguliuojant signalizacijos veiklą gyvuose organizmuose. Šio sudėtingo fosforilinimo tinklo, ypač fosfoproteinų, supratimas yra būtinas žingsnis norint suvokti ląstelių patofiziologijos pagrindą. Smegenų intracelulinio signalizacijos tyrimas yra ypač sudėtinga užduotis dėl nevienalyčio sudėtingo smegenų audinio, kurį sudaro daugybė įterptųjų struktūrų, pobūdžio.

Naujas metodas

Norint įveikti šį sudėtingumo laipsnį, reikia didelio našumo ir ekonomiško naudojamos biologinės medžiagos kiekio technologijos, kad būtų galima išanalizuoti daug signalizacijos kelių iš daugybės mėginių. Mes kreipiamės į Alpha (Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay) technologiją.

Palyginimas su esamu metodu

Western blot yra tikrai dažniausiai naudojamas baltymų fosforilinimo būsenos matavimo metodas. Nors Western blot yra tikslus ir patikimas baltymų modifikacijų analizės metodas, jis užima daug laiko ir reikalauja daug mėginių. Šie du parametrai yra labai svarbūs, kai tyrimo tikslas yra suprasti daugialypius baltyminius įvykius, kad būtų galima išanalizuoti kelis taikinius iš mažų smegenų sričių.

Rezultatas

Čia parodome, kad Alpha technologija ypač tinka smegenų signalizacijos keliams tirti, nes leidžia greitai, jautriai, atkuriamai ir pusiau kiekybiškai aptikti fosfoproteinus iš atskirų pelių smegenų audinio homogenatų ir iš pelių hipokampo ląstelių frakcionavimo ir sinaptosominių preparatų.

Išvada

Alfa technologija yra svarbus eksperimentinis žingsnis į priekį, siekiant išsiaiškinti su smegenų fosfoproteinais susijusius molekulinius mechanizmus, susijusius su smegenų sutrikimais.


Rezultatai

PP1 ir PP2A slopinimas ellagitanninais

Ellagitanninai (1 pav.), kurių PP1c arba PP2Ac aktyvumas šiame tyrime buvo ištirtas, savo sudėtimi yra panašūs į PGG, tačiau struktūriškai skiriasi dviem svarbiais aspektais: (i) visi jie apima heksahidroksidifenoilo vienetą, susietą įvairiose padėtyse, išskyrus pedunkulaginą. kuri apima dvi iš šių jungčių (ii) tellimagrandinas I, pedunkulaginas ir praekoksinas B turi laisvų glikozidinių hidroksilų, o GHG turi nemodifikuotą hidroksilą 3 gliukopiranozės žiedo padėtyje. Šios molekulės darė skirtingą slopinamąjį poveikį natūraliems PP1c ir PP2Ac. 2 paveiksle (A, B) parodytas nuo koncentracijos priklausomas ellagitanninų slopinamasis veiksmingumas vietiniam PP1c ir PP2Ac, atitinkamai išgrynintam iš triušio skeleto raumenų. 1 lentelėje parodytas IC50 PP1c ir PP2Ac vertės, kurios rodo, kad PP1c yra jautresnis šių ellagitanninų slopinimui nei PP2Ac. Tai taip pat atsispindi PP1/PP2A selektyvumo santykiu (1 lentelė) atitinkamai 1:98, 1:82 ir 1:81 tellimagrandinui I, mahtabinui A ir praekoksinui B, kurie yra trys stipriausi ellagitanino inhibitoriai. Mes nustatėme, kad išgrynintas, rekombinantines PP1cα ir PP1cδ (rPP1cα ir rPP1cδ) izoformas (rPP1cα ir rPP1cδ) slopino tellimagrandinas I (2(C) pav.) su IC.50 0.23 ±𠂐.05 µM ir 0.13 ±𠂐.02𠂐.02±𠂐,05 µM vertės, kurios yra panašios į 1, PP, 0009&#x 2(D) paveiksle parodyta, kad tellimagrandinas I slopina miozino fosfatazės holofermentą, sudarytą iš FLAG-MYPT1-PP1cδ komplekso, turintį panašų stiprumą (IC).50=0,11 ±𠂐,02 M) su izoliuotų PP1c katalizinių subvienetų. Taip pat buvo įvertintas ellagitanninų fosfatazės aktyvumo slopinimas HeLa ląstelių lizate. Pirma, mes nustatėme PP1 ir PP2A aktyvumą lizatuose, naudodami I2, kad slopintume PP1, ir mažą OA koncentraciją (2 nM), kad slopintume specifiškai PP2A, siekiant nustatyti PP1 ir PP2A indėlį į lizatų fosfatazės aktyvumą. (2 paveikslas (E) ). Šie duomenys rodo, kad PP1 (�%) ir PP2A (�%) aktyvumas HeLa lizate pasiskirsto maždaug vienodu santykiu. Mes nustatėme, kad nors ellagitanninų slopinamasis veiksmingumas HeLa lizato fosfatazės aktyvumui buvo toks pat, kaip ir išgrynintų fermentų atveju, IC50 vertės buvo bent viena eile didesnės (1 lentelė). Šie aukštesni IC50 vertės gali būti dėl to, kad ir PP1, ir PP2A holofermentai buvo tiriami lizate tuo pačiu metu, atsižvelgiant į skirtingą jų jautrumą. Kadangi atrodo, kad miozino fosfatazės holofermentas yra panašiai jautrus tellimagrandino I slopinimui kaip ir PP1c (2 (D) pav.), mažesnis jautrumas lizatų slopinimui gali būti ne dėl katalizinių subvienetų sąveikos su reguliuojančiais baltymais. Tačiau gali būti susijęs su mažesniu PP2A jautrumu, nes po PP1 aktyvumo slopinimo lizato I2 fosfatazės aktyvumą dėl PP2A šiek tiek slopino tellimagrandinas I, net esant didžiausiai taikytai koncentracijai (2 (F) pav.). Kita vertus, gana lipnus polifenolių pobūdis leidžia jungtis su keliais lizato baltymais ir sumažina efektyvią polifenolių koncentraciją slopinimui, kaip buvo aptarta anksčiau12.

Ellagitanninų poveikis PP1 ir PP2A aktyvumui. Ellagitanninai (0,1� µM) buvo iš anksto inkubuojami su fosfatazės mėginiais 10 min., o fosfatazės aktyvumas buvo nustatytas trimis egzemplioriais, naudojant 1  µM. skyrius. Fosfatazės aktyvumas buvo nustatytas naudojant tellimagrandin I (●) mahtabin A (Δ) praecoxin B (■) GHG (^) pedunkulagin (▼) su PP1c (A), PP2Ac (B) arba HeLa lizatas (F). Tellimarandino I poveikis rPP1cα (^) ir rPP1cδ (●) (C) arba FLAG-MYPT1-PP1cδ (▼) (D) arba fosfatazės aktyvumui HeLa lizato, dalyvaujant I2 (□) (F). I2 ir OA poveikis HeLa lizato (E) fosfatazės aktyvumui. Fosfatazės aktyvumas, kai nėra ellagitanninų, I2 ar OA, buvo laikomas 100%. Duomenys yra priemonės ± SD (n =𠂓𠄵).

1 lentelė.

IC50 PP1 ir PP2A slopinimo ellagitanninais vertės.

 IC50 (µM) PP1c/PP2Ac
EllagitanninaiPP1cPP2AcHeLa lizatas selektyvumas
tellimagrandinas 10.20 ±𠂐.0219.52 ±𠂘.604.46 ±𠂐.951:97
mahtabinas A0.41 ±𠂐.1833.77 ±𠂘.446.19 ±𠂐.371:82
praekoksinas B0.79 ±𠂐.1163.86 ±𠂕.526.97 ±𠂑.121:80
ŠESD1.41 ±𠂐.30𾄀12.97 ±𠂓.30n.d.
pedunculagin2.47 ±𠂐.22 * 𾄀33.90 ±𠂔.54n.d.

IC50 reikšmės buvo gautos iš 2 paveikslo (A,B,E) duomenų ir pateiktos kaip vidurkis ± SD.

Polifenolių sąveika su PP1c

Buvo atlikti eksperimentai su tellimagrandinu I ir rPP1cα arba rPP1δ, siekiant įvertinti jų sąveiką su skirtingų surišimo metodų taikymu (3 pav.). Tellimarandino I1H BMR spektrai, užfiksuoti nesant (3 (A) paveikslas, apatinis spektras) ir esant 10 µM rPP1cα (3 (A) paveikslas, vidurinis spektras), rodo didelius skirtumus. Reikšmingas tellimagrandino I 1 H rezonanso signalų išsiplėtimas, pastebėtas esant rPP1cα (3 (A) paveikslas, vidurinis spektras), yra tvirtas laisvos ir su PP1c surištos tellimagrandino I formos cheminių mainų požymis. -dimensinis (1D) 1H BMR prisotinimo perdavimo skirtumo (STD) eksperimentas suteikė papildomų įrodymų ir struktūrinių detalių apie tellimagrandino I-rPP1c kompleksų susidarymą. STD BMR spektras (3 (A) paveikslas, viršutinis spektras) identifikuoja aromatinio žiedo vandenilius, esančius glaudžiai kontaktuojant su PP1c, o tai rodo, kad tellimagrandino I prisijungime prie PP1c gali dominuoti hidrofobinės sąveikos. Remiantis PP1c ir tellimagrandino I sąveikos panašumu į PGG 12, taip pat į stiprią tellimagrandino I slopinančią įtaką PP1c, galima daryti išvadą, kad tellimagrandinas I taip pat gali užimti dalį hidrofobinio substrato surišimo griovelio. PP1c paviršius.

PP1c sąveika su tellimagrandinu I ir kitais polifenoliais. (A): Tellimarandino I BMR spektrai, kai nėra (apatinis skydelis) ir kai yra rPP1cα (vidurinis skydelis) ir atitinkamas STD-BMR spektras (viršutinis skydelis). (B): rPP1cα sąveika su tellimagrandinu I, kaip atskleidė ITC: ΔH =𠂘.038 ±𠂐.275𠂐.275α𠂐.275l x02009 kcal/mol/K N =𠂑.16 ±𠂐.03 Ka=4,68 ±𠂑,02x10 6 M − 1 . (C): rPP1cδ sąveika su tellimagrandinu I, kaip atskleidė SPR: Kd=0,31 µM. Parodytos dviejų nepriklausomų eksperimentų reprezentatyvios sensorinės diagramos. (D): rPP1cα afinitetas su tellimagrandinu I (^), PGG (●) ir EGCG (▼) buvo išmatuotas naudojant MST. Nežymėto rPP1cα vidinės fluorescencijos pokyčiai, prisijungus prie tellimagrandino I ir PGG, arba rPP1cα, išoriškai pažymėto dažais NT647, fluorescencinio signalo pokyčiai, prisijungus prie EGCG, buvo nustatyti esant įvairioms polifenolio koncentracijoms, ir pateikiamos surištos trupmenos. Duomenų taškai yra priemonės ± SD (n =𠂓).

PP1c-tellimagrandino I sąveika taip pat buvo įvertinta izoterminiu titravimo kalorimetrija (ITC) ir paviršiaus plazmoniniu rezonansu pagrįstu (SPR) surišimo metodu (3 paveikslas (B, C)) ir disociacijos konstantomis (K).d) buvo nustatyti atitinkamai 0,23 µM ir 0,31 µM. Šios Kd vertės gerai sutapo su IC50 vertė (0,20 µM), nustatyta natūralaus PP1c slopinimui tellimagrandinu I (1 lentelė). Mes taip pat taikėme mikroskalės termoforezės (MST) metodą, kad palygintume skirtingų polifenolių (tellimagrandino I, PGG ir EGCG) surišimo afinitetą su PP1c. MST nustatė Kd PP1c sąveikos su tellimagrandinu I, PGG ir EGCG vertės buvo 1,78 ±𠂐,59 µM, 3,08µM, 3,08µM, 3,08µM, 3,08µM, 3,08µM, 3,08µM, 3,08µM, 3,08µM, 3,08µM ir 3,08 x000b1𠂔.3 µM atitinkamai. Polifenolių afinitetas su PP1c yra toks pat, kaip ir jų slopinimo stiprumas, atspindėtas IC.50 reikšmės ( 1 lentelė ) 12 .

Polifenolių poveikis ląstelių sistemoms

Ankstesni rezultatai pateikė duomenis apie tellimagrandino I poveikį ląstelėms ir atskleidė, kad šis polifenolis 27 turėjo įtakos žmogaus leukeminių K562 ląstelių diferenciacijai 26 ir HeLa ląstelių jungties tarpo ryšiui. Tačiau nebuvo bandoma sieti šio poveikio su fosfatazės aktyvumo pokyčiais. Pirmiausia išbandėme tellimagrandino I ir mahtabino A poveikį HeLa ląstelių išgyvenimui ir fosfatazės aktyvumui. Tellimagrandinas I smarkiai sumažino HeLa ląstelių gyvybingumą 5� µM koncentracijos intervale po 24 h inkubacijos (4 paveikslas (A)). Tellimagrandinas I iš dalies sumažino HeLa ląstelių fosfatazės aktyvumą (po 1 h inkubacijos) priklausomai nuo koncentracijos, o efektyvus koncentracijos diapazonas buvo 10� µM (4(B) pav.). Šie duomenys gali reikšti, kad fosfatazės slopinimas tellimagrandinu I prisideda prie HeLa ląstelių mirties inicijavimo, tačiau dėl skirtingų gyvybingumo ir fosfatazės tyrimų laiko eigos, taip pat dėl ​​to, kad trūksta išsamesnio molekulinio fono, ši išvada yra sunkiai suprantama. Gana stebėtina, kad mahtabinas A, savo struktūra panaši į tellimagrandiną I ir kuris taip pat yra vienas iš stiprių PP1 ellagitanino inhibitorių (1 lentelė), neturėjo įtakos nei HeLa ląstelių išgyvenimui, nei fosfatazės aktyvumui (4 paveikslas (A, B). ) ).

Išskirtinė ellagitanninų įtaka HeLa ląstelių išlikimui ir fosfatazės aktyvumui. Tellimagrandin I ir mahtabino A poveikis buvo ištirtas HeLa ląstelių išgyvenimui (A) ir fosfatazės aktyvumui (B) 0� µM koncentracijos diapazone, kaip aprašyta skyriuje Medžiagos ir metodai. Ląstelių išgyvenamumas ir fosfatazės aktyvumas, kai nėra ellagitanninų, buvo laikomi 100%. Duomenys reiškia priemones ± SD (n =𠂓). ANOVA*p < .05, **p < .01, ***p < .001, n.s.: nereikšminga.

Norėdami dar labiau išsiaiškinti galimą tellimagrandino I ir mahtabino A fiziologinę įtaką, ištyrėme jų poveikį pelių žievės sinaptosomų egzocitozei. ex vivo preparatas su nepažeistomis membranomis ir yra pavyzdys egzocitozės/neuromediatorių išsiskyrimo tyrimams 25 . Ankstesnėje ataskaitoje aprašėme, kad sinaptosomų egzocitozė yra atvirkščiai koreliuojama su padidėjusiu su sinaptosomomis susijusio 25 kDa baltymo (SNAP-25) fosforilinimu Thr138 (SNAP-25 Thr138) su RhoA susijusioje baltymo PP1famitozės kinazėje (PP1famitozės). -tipo) tarpininkaujantis būdas 24 . Pirmiausia išbandėme, kaip sinaptosomų inkubavimas su tellimagrandinu I (5(A) pav.) arba mahtabinu A (5(B) pav.) paveikė SNAP-25 Thr138 fosforilinimo lygį. Tellimagrandinas neturėjo jokio poveikio, o mahtabinas A padidino fosforilinto SNAP-25 Thr138 (SNAP-25 pThr138) kiekį priklausomai nuo koncentracijos 1� µM diapazone. Antra, buvo ištirtas šių polifenolių poveikis KCl sukeltai sinaptosomų egzocitozei ir rezultatai atskleidė, kad mahtabinas A slopino egzocitozę, išmatuotą kaip FM 2� fluorescencijos sumažėjimą (5 (D) pav.), o tellimagrandinas I neturėjo jokios įtakos (pav. 5(C)). Galiausiai tellimagrandino I ir mahtabino A poveikis buvo lyginamas su tautomicetinu (TMC), tiksliai apibrėžtu PP1 specifiniu inhibitoriumi sinaptosomose25. 5 paveikslas (E, F) rodo, kad TMC ir mahtabinas A padidino SNAP-25 pThr138 kiekį tokiu pačiu būdu, o tellimagrandinas I neturėjo įtakos. Šie duomenys patvirtina išvadas, kad du ellagitanninai, nepaisant panašių struktūrų ir fosfatazę slopinančių savybių, tarpininkauja fiziologiniams ląstelių atsakams, taip pat membranų apsuptoms ląstelėms. ex vivo preparatai įvairiais būdais.

Tellimarandino I ir mahtabino A poveikis SNAP-25 Thr138 fosforilinimui ir pelių sinaptosomų egzocitozei. Tellimarandino I (A ir C) ir mahtabino A (B ir D) įtaka SNAP-25 Thr138 (A, B) fosforilinimui ir sinaptosomų (C, D) egzocitozei. Tellimarandino I, mahtabino A ir TMC poveikio SNAP-25 Thr138 fosforilinimo lygiui palyginimas. E: reprezentatyvus Western blot su anti-SNAP-25 pThr138 specifiniu antikūnu. F: Santykiniai SNAP-25 pThr138 kiekio pokyčiai, nustatyti Western blotų densitometrija, normalizuoti juostose, gautose pakrovimo kontrolei. Duomenys yra priemonės ± SD (n =𠂓). ANOVA*p < .05, **p < .01, ***p < .001, n.s.: nereikšminga.


Rezultatai

Cheminės bibliotekos patikrinimas

Atsižvelgiant į erdvinę NGF surišimo vietos konformaciją TrkA, junginiai, kurių molekuliniai matmenys telpa į 5 domeno maišelį 5, buvo atrinkti iš cheminės bibliotekos, pagrįstos bicikliniu trimačiu karkasu, pagamintu iš komercinių šaltinių, kuriuose yra dariniai. skirtingai dekoruoti šoninėmis proteinogeninių aminorūgščių grandinėmis ir yra suderinamos su kietosios fazės peptidų sinteze. 11, 12 Iš pradžių buvo patikrinta daugiau nei šimtas penkiasdešimt junginių, parenkant aktyvias molekules, kad jos galėtų išlaikyti išgyvenamumą, įvertintą MTT (tiazolilo mėlynojo tetrazolio bromido) testu, PC12 ląstelėse, kultivuotose be serumo, naudojant rhNGF kaip vidinį standartą. Aktyvių junginių veikimas buvo labai įvairus, greičiausiai susijęs su struktūriniais ir erdviniais pastolių ir jų apdailos skirtumais. Keturių junginių, kurie pakartotinai parodė NGF imitacinį aktyvumą su nuo dozės priklausomu poveikiu šiame tyrime, struktūra parodyta (1a ir b paveikslai, 1 papildoma lentelė Cheminis veikliųjų junginių pavadinimas – papildoma informacija).

Pasirinktų junginių NGF mimetinis aktyvumas. (a) PC12 ląstelės buvo kultivuojamos 72 valandas terpėje be serumo, esant arba nesant nurodytos koncentracijos junginių n. 11 (○), 13 (▵), 46 (▽), 60 (◊) arba 4 nM hrNGF kaip teigiama kontrolė. Ląstelių išgyvenamumas buvo matuojamas kaip MTT įtraukimas į tris egzempliorius kultūras ir išreikštas hrNGF sukelto išgyvenimo aktyvumo procentais. Pateikiami keturių skirtingų eksperimentų rezultatai (vidurkis ± S.E.). (b) Junginių n struktūrinė formulė. 11, 13, 46, 60. Junginys n. 11 buvo pavadintas MT2. (c) PC3 ląstelės buvo kultivuojamos 48 valandas, esant arba nesant nurodytos koncentracijos junginių n. (○), 13 (▵), 46 (▽), 60 (◊) arba 4 nM hrNGF kaip teigiamą kontrolę. Duomenys išreiškiami kaip stimuliacijos indeksas (3H-TdR įtraukimas į stimuliuojamas kultūras / 3 H-TdR įtraukimas į nestimuliuotas kultūras). Stimuliacijos indeksas, gautas naudojant 4 nM hrNGF, buvo 2,3±0,18 (vidurkis ±S.E.). Pateikiami trijų skirtingų eksperimentų rezultatai (vidurkis ± S.E.). (d) MT2 poveikis apoptozei, kurią sukelia serumo badas. PC12 ląstelės buvo kultivuojamos terpėje be serumo, kai buvo arba nėra skirtingos MT2 arba 4 nM hrNGF koncentracijos kaip teigiama kontrolė. Ląstelės buvo plaunamos, nudažytos FITC anneksinu V / PI ir aneksino + PI - ląstelių procentinė dalis buvo užregistruota citofluorimetrija. Statistinė analizė, atlikta Student’s t- testas rodo reikšmingus skirtumus (P mažiausiai <0,01) tarp neapdorotų prieš apdorotos (bet kokios koncentracijos) badaujančios kultūros

Be to, kadangi NGF skatina prostatos karcinomos ląstelių linijos PC3, kuri neišreiškia p75 NTR, proliferaciją, pasirinkome šį tyrimą, kad įvertintume, ar aktyvieji junginiai selektyviai sąveikauja su TrkA, o ne su p75 NTR arba heterodimeriniu kompleksu. 1c paveiksle parodyti proliferacijos indeksai, kuriuos sukėlė keturi junginiai, kurie galėjo sukelti energingą augimą, kartais net stipresnį nei NGF. Taigi biologinio signalo perdavimas tikriausiai priklausė tik nuo jų sąveikos su TrkA grandine.

Pasibaigus atrankos procedūrai, mes pasirinkome molekules, turinčias didžiausią į NGF panašų aktyvumą, ir nukreipėme jas į tolesnius tyrimus. Nuo šiol bus pranešta apie vienos reprezentacinės molekulės, pavadintos MT2, funkcinę analizę. Kadangi serumo trūkumas paprastai sukelia vidinį apoptozės kelią, norėdami paaiškinti išgyvenimą skatinantį aktyvumą, kurį sukelia NGF mimetikai serumo neturinčiose PC12 ląstelėse, norėjome konkrečiai ištirti, ar MT2 gali sumažinti apoptotinį procesą, ir pasirinkome ankstyvą įvykį, kurį reikia išmatuoti. jo aktyvumas, fosfatidilserino paviršiaus poveikis PC12. 1d paveiksle parodyta, kad junginys galėjo žymiai paveikti apoptozę, kuri vyksta badaujant serume, priklausomai nuo dozės ir net didesniu lygiu, nei pasiekiama optimaliomis žmogaus rekombinantinio (val) NGF koncentracijomis.

Sąveika su TrkA receptoriais

Remdamiesi aukščiau pateiktais selektyvios sąveikos su TrkA įrodymais, atlikome pradinius jungimosi tyrimus su 125 I-NGF PC12 ląstelėse ir išbandėme šalto MT2 gebėjimą išstumti fiksuoto joduoto citokino kiekio surišimą. 2a paveiksle parodyti reprezentatyvaus eksperimento rezultatai, rodantys MT2 afinitetą TrkA nanomoliniame koncentracijos diapazone.

MT2 sąveika su TrkA. (a) 125 I-hrNGF, prijungtų prie PC12 ląstelių, išstūmimas MT2. PC12 ląstelės buvo inkubuojamos su 0, 1 nM 125 I-hrNGF, esant skirtingoms MT2 koncentracijoms arba nesant. Specifinis su ląstelėmis susietas radioaktyvumas buvo apskaičiuotas ir rezultatai išanalizuoti Origin programine įranga. Pateikiami vieno reprezentatyvaus eksperimento iš trijų atliktų eksperimentų rezultatai. (b ir c) 3 H-MT2 surišimas su TrkA NIH-3T3. NIH-3T3, stabiliai transfekuotas viso ilgio žmogaus TrkA, buvo inkubuojamas trimis egzemplioriais su skirtingomis 3H-MT2 koncentracijomis, esant šalto MT2 pertekliui arba jo nėra (b) arba 4 nM šalto hrNGF (c). Specifinis su ląstelėmis susietas radioaktyvumas buvo apskaičiuotas, o rezultatai išanalizuoti naudojant Origin programinę įrangą (susirišimo vienoje vietoje tyrimas). Nebuvo užfiksuotas specifinis surišimas su netikrais transfekuotomis NIH-3T3 ląstelėmis (neparodyta). (d) 3 H-MT2 internalizavimas. TrkA-NIH-3T3 arba imitaciniu būdu transfekuotos ląstelės buvo inkubuojamos 1 valandą 4 ° C temperatūroje su 3H-MT2, esant arba nesant šalto MT2 arba hrNGF pertekliaus. Tada ląstelės buvo plaunamos ir 1 valandą laikomos 37 ° C temperatūroje. Membranos radioaktyvumas buvo išplautas 0,1 M glicino buferiu, pH 2,8. Raudonieji kraujo kūneliai buvo inkubuojami 1 valandą 37 ° C temperatūroje su 3H-MT2, esant arba nesant šalto MT2 arba hrNGF pertekliaus. Ląstelės buvo lizuojamos ir užregistruotas su ląstelėmis susietas radioaktyvumas. Duomenys išreiškiami kaip vidutinis surištas radioaktyvumas±S.E. trijų egzempliorių kultūrų. Rodomi vieno reprezentatyvaus eksperimento iš trijų atliktų eksperimentų rezultatai. (e) MT2 sąveika su žmogaus rekombinantinio TrkA ECD frakcija. Vienas mikrogramas išgrynintas TrkA ECD buvo inkubuojamas trimis egzemplioriais su skirtingomis 3H-MT2 koncentracijomis, esant šalto MT2 pertekliui arba jo nėra. Mišinys buvo absorbuojamas ant filtravimo popieriaus ir po plovimo buvo užregistruotas radioaktyvumas. Duomenys buvo analizuojami naudojant „Origin“ programinę įrangą. Rodomi vieno reprezentatyvaus eksperimento iš trijų atliktų rezultatų rezultatai

Ši analizė, nors ir įtaigiai, negalėjo įtikinamai įrodyti, kad NGF mimetinis junginys iš tikrųjų prisijungė prie TrkA. Todėl mes transfekavome plazmides, koduojančias žmogaus viso ilgio TrkA grandinę, į TrkA – NIH-3T3 ląsteles ir gavome stabilius transfektantus. Tada tokios ląstelės buvo naudojamos surišimo eksperimentuose su MT2, pažymėtos įvedant 3H-metilo fragmentą kaip paskutinį sintetinės procedūros etapą. Surišimo duomenų analizė 4 °C temperatūroje atskleidė Kd MT2 / TrkA sąveikos vertės svyruoja nuo 50 iki 100 nM (2b pav.), NIH 3T3 ląstelėse, kurios buvo transfekuotos, specifinio jungimosi nebuvo (duomenys nerodomi). Kaip ir tikėtasi, šaltas rekombinantinis žmogaus NGF efektyviai išstūmė tritiuoto junginio surišimą (2c pav.). Tolesniuose eksperimentuose, po inkubacijos 4 ° C temperatūroje, reagentai buvo pakelti į 37 ° C, kad būtų galima stebėti ligando internalizaciją, kuri iš tikrųjų įvyko TrkA + NIH-3T3 ląstelėse, bet ne imitacinio transfekuoto ląstelėse (2d pav.), 3 H- MT2 internalizavimą blokavo rhNGF. Nuosekliai nepastebėta pažymėto MT2 internalizavimo žmogaus eritocituose (RBC), laikomuose 37 ° C temperatūroje 1 valandą (2d pav.).

Galiausiai norėjome gauti tiesioginius, nedviprasmiškus MT2 – TrkA sąveikos įrodymus, atlikdami surišimo be ląstelių eksperimentus su pažymėtu MT2 ir ekstraląsteline receptorių grandinės dalimi, išreikšta rekombinantine forma. Pakartotiniai eksperimentai davė rezultatus, visiškai suderintus su tais, kurie buvo gauti naudojant ląstelinį metodą, nes pastebėtas specifinis surišimas parodė susiliejantį afinitetą. Kd reikšmės svyruoja tarp ~ 20 ir 80 nM (2e pav.).

Taigi, MT2 molekulė sugebėjo specifiniu būdu surišti TrkA, vėliau įvykdama receptorių sukeltą internalizaciją, antagonizuotą vietinio neurotrofino, ir nepavyko pasyviai difuzuoti per ląstelių membranas. Reakcijos afinitetas gražiai koreliavo su junginio išgyvenimo aktyvumu, kuris greičiausiai buvo susijęs su jo sąveika su TrkA receptorių grandine.

Molekuliniai modeliai ir surišimo hipotezė

TrkA domene-5 yra aminorūgščių liekanų, tiesiogiai susijusių su NGF ir TrkA kontaktu. Taigi, mes paklausėme, ar MT2 sąveikauja su bet kuria iš tų TrkA liekanų, ir pasirinkome atlikti molekulinio modeliavimo tyrimus, kuriuose prijungimas buvo atliktas kaip visuotinis energijos optimizavimas, naudojant šališkos tikimybės Monte Karlo stochastinę procedūrą. 13 Paaiškėjo, kad MT2 surišo TrkA penktąjį domeną seklioje hidrofobinėje ertmėje, esančioje netoli membranos. Kišenė yra abiejuose subvienetuose, tačiau tik vienas monomeras liečiasi su molekule. Kaip parodyta 3 paveiksle, MT2 nustatė tris pagrindines sąveikas su baltymu: (i) viena iš benzilo dalių sudarė π-statybos sąveiką su Phe327, beveik visiškai sutampa su NGF Arg103 šonine grandine, (ii) kitas benzilo žiedas. susidarė hidrofobinės sąveikos su Thr352 metilo grupe ir su Val354 šonine grandine, atitinkančia sritį, kurią kokristale užima NGF Ile31, ir (iii) metilo esterio grandinės karbonilo deguonis sudarė vandenilio ryšį su Thr325. Įrodymai, kad junginys greičiausiai sąveikauja su likučiais, kuriuos naudoja NGF, rodo iš dalies bendrus kontaktinius regionus tarp pastarojo ir jo mimetikų, kurie gali atskleisti funkciškai reikšmingus.

MT2 surišimo vietos TrkA molekulėje. In silico susijusių aminorūgščių likučių numatymas. Parodyta numatoma surišta MT2 konformacija TrkA surišimo vietoje. Kišenės paviršius yra aiškiai nurodytas su TrkA struktūra pilkomis juostelėmis kaip fonas. TrkA aminorūgštys, kurios sukuria tiesioginę sąveiką su MT2, rodomos rutulio ir lazdos pavidalu. MT2 rodomas rutulyje ir lazdele su anglies atomais, nudažytais tamsiai geltona spalva. Palyginimui galima pasakyti, kad NGF Arg103 ir Ile31 pateikiami rutulyje ir laikosi oranžinės spalvos anglies atomais. H-jungtis tarp TrkA Thr325 ir MT2 yra paryškinta žaliais taškais. Dalies Thr352 ir Val354 šoninių grandinių van der Waals tūris paryškintas juoda punktyrine linija

Todėl patikrinome, ar NGF mimetikų sąveika su TrkA apima aminorūgščių likučius, numatytus pagal aukščiau pateiktą prijungimo analizę. Mes transfekavome NIH-3T3 ląsteles su viso ilgio TrkA koduojančio konstrukto T352A arba F327A mutantais, pasirinkome stabilius transfektantus ir panaudojome juos surišimo eksperimentams su trititu MT2 atlikti, kaip aprašyta aukščiau. Remiantis doko analize, rezultatai parodė, kad praktiškai nėra prisotinimo kreivės (duomenys nerodomi), patvirtindami, kad šios liekanos buvo labai svarbios MT2 prisijungimui prie TrkA.

Biocheminių įvykių indukcija NGF jautriose ląstelėse

Pirmasis įrodytas įvykis, kai NGF prisijungia prie TrkA, yra receptoriaus autofosforilinimas. 1 Norėdami išsiaiškinti, ar tokį įvykį sukelia MT2, mes paruošėme TrkA imunoprecipitacijų iš PC12 ląstelių, paveiktų NGF arba MT2, Western blot testus, sukurtus su anti-fosfotirozino (PY) antikūnais (4a pav.). Akivaizdu, kad junginys galėjo sukelti autofosforilinimą, tačiau mažesniu lygiu, palyginti su NGF, kyla klausimas, ar NGF mimetinis junginys iš tikrųjų sukelia pilną receptorių aktyvavimo modelį.

NGF mimetinis aktyvumas, išreikštas MT2. (a) MT2 poveikis TrkA autofosforilinimui. PC12 ląstelės buvo inkubuojamos su 10 μM MT2 arba 4 nM hrNGF. Ląstelių lizatai buvo imunoprecipituoti a-TrkA arba kontroliniais IgG antikūnais, blotuojami ant nitroceliuliozės filtro ir nudažyti anti-PY antikūnais. (b) MT2 poveikis VGF gamybai PC12 ląstelėse. PC12 ląstelės, stimuliuojamos 10 μM MT2 arba 4 nM hrNGF, buvo lizuojami, blotuojami ir nudažyti anti-VGF antikūnais. Vieno reprezentatyvaus eksperimento iš trijų atliktų rezultatų pateikti a ir b. (c–e) MT2 sukelia į NGF panašų augimo sustabdymą PC12 ląstelėse. Ląstelės buvo veikiamos MT2 (5–20 μM) ir neuronų branduolių, nudažytų specifiniu neuronų žymekliu (NeuN), skaičius buvo įvertintas po 7 dienų. (c ir d) PC12 ląstelių, paveiktų MT2 10, fazinio kontrasto mikroskopinė analizė μM už 3 (c) arba 7 dienas (d). 3 dieną MT2 paveiktos PC12 ląstelės, atrodo, susikaupia į gumulėlius su trumpesniu ir ribotu neuritinių procesų skaičiumi, palyginti su atitinkamais NGF diferencijuotais (2 nM) mėginiais (c). Visi šie įvykiai yra ryškesni 7 dieną, kai dauguma MT2 apdorotų ląstelių yra agreguojamos ir sudaro didesnes grupes, o neuritiniai procesai yra žymiai trumpesni nei stebimi atitinkamose NGF apdorotose ląstelėse (d) (e) NeuN+ ląstelių skaičius po 7 dienų auginimo (n=6). Dešimt mikromolių MT2 yra didžiausia aktyvi koncentracija. (fi) Į NGF panašus neuronų diferenciacijos aktyvumas DRG neuronuose: (f) Neuronų branduoliai buvo įvertinti po 4 dienų stimuliacijos MT2 (10 μM) ir hrNGF (2 nM). MAP2 teigiami neuritiniai procesai nudažyti raudonai (skalės juosta: 25 μm). (g) Neuronų branduoliai įvertinti po 4 dienų stimuliacijos MT2 (5–20 μM) ir hrNGF (2 nM). (h-i) Atskyrimo taškų skaičius (h) ir neurito plėtinys (i) ląstelėse, stimuliuojamose 2 nM NGF arba 10 μM MT2 buvo užfiksuoti praėjus nurodytam laikui. Vaizdai buvo analizuojami naudojant „Olympus“ apverstą mikroskopą („Olympus Corporation“, Tokijas, Japonija) arba „NIH ImageJ“ (NIH, Bethesda, MD, JAV). Neuritai buvo žiūrimi naudojant × 20 objektyvą, vaizdai buvo projektuojami į vaizdo monitorių, o neuritų ilgiai buvo atsekami skaitmenine planšete, kai buvo žiūrima monitoriuje. Kiekvienai skaidrei buvo ištirta dešimt DRG neuronų ir eksperimentai kartojami mažiausiai tris kartus. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas nepriklausomu t-testas ir vienpusė ANOVA. Paskirstymui duomenys buvo pateikti kaip vidutiniai S.E.M.

Poveikio neurotrofinui, NGF jautrios ląstelės išreiškia genų rinkinius, kurie sukelia atitinkamą ląstelių tipui specifinį atsaką PC12 ląstelėse, vienas iš labiausiai atkuriamų įvykių yra VGF genas, kuris yra arba de novo išreikštas arba stipriai reguliuojamas NGF signalizacijos. 14 PC12 ląstelių gydymas MT2 aiškiai sukėlė neabejotiną VGF kiekio padidėjimą, nors ir mažiau ryškų nei NGF (4b pav.). Šis atradimas rodo, kad TrkA generuojamų signalų spektre gali būti reikšmingų skirtumų, kai juos suaktyvina skirtingi ligandai.

Kadangi pastarasis punktas buvo laikomas labai svarbiu išaiškinant NGF mimetikų funkcines savybes, junginys buvo išbandytas atliekant kitą tipišką nuo NGF priklausomą tyrimą: mitozinio sustojimo ir neurito augimo indukciją PC12 ląstelėse. 4c paveiksle parodyta, kad MT2 gydymas PC12 ląstelėmis 3 dienas nuosekliai sukėlė morfologijos modifikacijas, nes ląstelės buvo linkusios agreguotis į gumulėlius ir išplėsti neuritinius procesus, kurie pasirodė trumpesni ir riboti, palyginti su NGF. Be to, nors kultūros, veikiančios NGF 7 dienas, pasiekė beveik visišką į neuritą panašią morfologiją ir agregavosi, kad susidarytų maži gumulėliai, MT2 apdorotos ląstelės atrodė mažiau diferencijuotos ir sudarė didesnius agregatus (4d pav.). Tačiau po 7 dienų MT2 blokavo ląstelių augimą tokiu lygiu, kuris buvo panašus į tuos, kuriuos palaiko prisotinantys hrNGF kiekiai (4e pav.). Nuosekliai, kai buvo tiriamos embrioninės nugaros šaknies ganglijos (DRG) ląstelės, MT2 po 4 dienų sukėlė į NGF panašų neurito augimą skatinantį aktyvumą (4f pav.i) net jei atrodė, kad MT paveiktuose neuronuose sumažėjo neuritinė arborizacija ir fascikuliacija. Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant viršutinių gimdos kaklelio ganglijų ląstelių kultūras (duomenys nerodomi). Kartu šie rezultatai rodo, kad ribota, palyginti su NGF, sąsaja tarp NGF mimetikos ir TrkA molekulės virsta šiek tiek ribotu signalų, nukrypstančių nuo receptoriaus, masyvu.

Norėdami išsiaiškinti tokio funkcinio divariacijos biocheminius pagrindus, mes išsamiau ištyrėme TrkA grandinės intracitozolinės uodegos fosforilinimo modelį veikiant NGF. prieš MT2, naudojant monospecifinius antikūnus tirozinams 490, 674/675 ir 785, kurie, kaip žinoma, yra labai svarbūs perduodant neurotrofino signalą. 1, 8 Šiuo tikslu naudojome arba PC12 ląsteles, arba wtTrkA-NIH-3T3 stabilius transfektantus, gaudami vienodus rezultatus. 5a paveiksle parodyta, kad MT2, pridėtas prie PC12 ląstelių, visada sukėlė Tyr490 fosforilinimą ir kad Tyr674/675 ir Tyr785 buvo suaktyvinti minimaliai, o visi jie buvo aiškiai fosforilinti veikiant hrNGF. Pastarieji atradimai rodo, kad kai kurie biologiniai atsakai į NGF mimetikus yra išreikšti žemesniu lygiu, palyginti su NGF, ir paskatino mus toliau tirti biocheminius kelius, atsirandančius dėl Tyr490 aktyvacijos.

Biocheminiai keliai, kuriuos sukelia MT2 PC12 ląstelėse. (a) TrkA fosforilinimas. Serumo badaujančios PC12 ląstelės buvo stimuliuojamos 10 μM MT2 arba 4 nM hrNGF kaip teigiama kontrolė, 15 min. Ląstelių lizatai buvo blotuojami su antikūnais prieš P-Y490, P-Y674/675, P-Y785 ir anti-aktinu kaip pakrovimo kontrolę. Membranos buvo nuluptos ir nudažytos anti-total TrkA IgG. Santykinės histogramos rodo densitometrinės analizės duomenis ir išreiškiamos kaip santykis tarp fosfoproteino (P) ir bendro baltymo (T) penkių skirtingų eksperimentų metu (vidurkis ± S.E.). Statistinę analizę atliko suporuotas Studentas t- testas. (b) Kinazių fosforilinimas. Serumo badaujančios PC12 ląstelės buvo stimuliuojamos 10 μM MT2 arba 4 nM hrNGF, 30 min. Ląstelių lizatai buvo blotuojami triušio anti-P-ERK, anti-P-Akt, anti-P-p38 MAPK, anti-P-JNK. Tada membranos buvo nuluptos ir nudažytos antikūnais prieš atitinkamą bendrą baltymą ir anti-aktino antikūnais kaip pakrovimo kontrolė. Santykinės histogramos rodo densitometrinės analizės duomenis ir išreiškiamos kaip santykis tarp fosfoproteino (P) ir bendro baltymo (T) penkių skirtingų eksperimentų metu (vidurkis ± S.E.). Statistinę analizę atliko suporuotas Studentas t- testas. (c) Fosfatazė. Serumo badaujančios PC12 ląstelės buvo stimuliuojamos 10 μM MT2 arba 4 nM hrNGF kaip teigiama kontrolė, 30 min. Ląstelių lizatai buvo blotuojami naudojant triušio anti-MKP1 IgG ir anti-aktino antikūnus kaip pakrovimo kontrolę. Santykinė histograma parodo densitometrinės analizės duomenis ir išreiškiama kaip santykis tarp MKP1 ekspresijos ir aktino penkių skirtingų eksperimentų metu (vidurkis ± S.E.). Statistinę analizę atliko suporuotas Studentas t- testas

Yra žinoma, kad fosforilinant tokias liekanas, nuosekliai dalyvaujant Shc ir Ras, suaktyvėja MAP kinazės kaskada, pagrindinis mirties / išgyvenimo dalijimosi kelias skirtinguose ląstelių tipuose, kuriuos sudaro kinazės, dažnai pasižyminčios priešinga veikla. 15 Kadangi NGF vaidina ryškų vaidmenį tokių baltymų homeostazėje, 16, 17 ištyrėme ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK), c-Jun N-galinės kinazės (JNK), p38 mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės fosforilinimo būseną. MAPK) baltymų ir Akt, kitos kinazės, dalyvaujančios ląstelių išgyvenimo reguliavime, 18 serumo badaujančiose PC12 ląstelėse, veikiamose hrNGF arba MT2. 5b paveiksle parodyta, kad iš tikrųjų p42/44 ERK ir Akt stipriai suaktyvėjo pridėjus bet kurį stimulą. Ir atvirkščiai, MT2 – arba hrNGF kaip kontrolė – galėjo sukelti ryškų p38 MAPK defosforilinimą PC12 ląstelėse, nuo nuolatinio lygio iki nereikšmingo kiekio, o JNK aktyvacija sumažėjo, bet ne reikšmingu lygiu (5b pav.).

Norėdami geriau suprasti gilų p38 MAPK aktyvacijos moduliavimą, kurį sukelia MT2, išbandėme, ar MKP-1, fosfatazė, labai specifinė p38 MAPK, taip pat JNK, 17, 19, gali turėti įtakos šioje aplinkoje, kaip buvo pastebėta anksčiau. 17 5c paveiksle parodyta, kad PC12 ląstelių, neturinčių serumo, poveikis MT2 arba hrNGF sukėlė žymų MKP-1 baltymo lygio padidėjimą jau praėjus 30 minučių po stimuliacijos. Apibendrinant, šis eksperimentų rinkinys atitinka pastebėtą MT2 gebėjimą palaikyti ląstelių išgyvenimą kultūrose, kuriose vyksta medžiagų apykaitos sutrikimai.

Siekiant patvirtinti MT2 sąveiką su TrkA liekanomis, susijusiomis su NGF prisijungimu, ir atmesti kitų akceptorių, pavyzdžiui, kitų proteinkinazės receptorių, dalyvavimą atsake į MT2, panašūs tyrimai buvo pakartoti su laukiniu tipu (WT), F327A. , ir T352A TrkA-NIH-3T3 stabilūs transfektantai. 6a paveiksle pateikta Western blot analizė, rodanti ERK 1/2 fosforilinimo indukciją MT2, o 6b paveiksle parodyta p38 MAPK defosforilinimas tose pačiose ląstelių kultūrose. Abiem atvejais stebimas aktyvumas iš esmės buvo panašus į NGF sukeltą aktyvumą ir buvo beveik visiškai panaikintas pridedant K252a, klasikinio TrkA katalizinės funkcijos inhibitoriaus. Kaip ir tikėtasi, jei T352A- arba F327A-TrkA/NIH-3T3 mutantai buvo naudojami tiriant MT2 sukeltą ERK 1/2 ir p38 MAPK aktyvacijos būseną, pastarajai turėjo įtakos bet kuri mutacija, įvertinta Western blot analize (6a pav. ir b). Taip pat norėjome naudoti kiekybinį metodą aktyvuotų p38 MAPK baltymų kiekiui išmatuoti. Šios analizės rezultatai visiškai atitiko Western blot metodą (papildomas 1 paveikslas). Taigi, bent jau didelė MT2 biologinio aktyvumo dalis atsiranda sąveikaujant su dviem TrkA aminorūgščių liekanomis, dalyvaujančiomis surišant natūralų neurotrofiną.

Biocheminiai keliai, kuriuos sukelia MT2 WT TrkA-NIH-3T3 arba mutantuose. NIH-3T3 ląstelės, stabiliai transfekuotos viso ilgio WT žmogaus TrkA, T352A arba F327A TrkA mutantais, buvo kultivuojamos terpėje be serumo ir inkubuojamos su 10 μM MT2 arba 4 nM hrNGF, esant arba nesant K252a. Ląstelių lizatai buvo blotuojami triušio anti-P-ERK (a) ir anti-P-p38 MAPK (b). Tada membranos buvo nuplėštos ir nudažytos antikūnais prieš atitinkamą bendrą baltymą. Santykinės histogramos rodo densitometrinę analizę. Duomenys išreiškiami trijų skirtingų eksperimentų fosfoproteino (P) ir bendro baltymo (T) santykiu (vidurkis ± S.E.). Statistinę analizę atliko suporuotas Studentas t- testas

NGF mimetiko aktyvumas žiurkių hipokampo organų kultūrose

Remiantis aukščiau pateiktais atradimais, rodančiais aiškų MT2 aktyvumą keliose in vitro sistemose, norėjome įvertinti jo gebėjimą išgelbėti NGF deficitą neseniai apibūdintame žiurkės hipokampo neuronų modelyje, kuriame NGF trūkumas yra griežtai susijęs su amiloidogeninio kelio aktyvavimu. 7, 20 Šiame neurone in vitro modelis, tiek amiloido pirmtako baltymo (APP), tiek 28 kDa aktyviosios presenilino 1 formos (PS1) kaupimasis (suteiktas α-sekretazės aktyvumas) stebimas jau praėjus 30 min. po neutralizuojančių anti-NGF antikūnų skyrimo, tuo pačiu metu į kultūras įdėjus NGF tokių biocheminių modifikacijų išvengiama. Todėl išbandėme, ar MT2 galėjo imituoti natūralų neurotrofiną, užkertant kelią amiloidogenezei ir neuronų mirčiai. 7a paveiksle parodyta, kad MT2 tokiose kultūrose sukėlė nuo dozės priklausomą TrkA fosforilinimą. Be to, tai iš tikrųjų galėtų panaikinti dramatišką APP generavimo pagerėjimą, kurio lygis yra panašus į tą, kuris pasiekiamas pridėjus NGF. Dar stipresnis aktyvumas buvo akivaizdus, ​​kai buvo tiriamas viso ilgio PS1 arba jo 28 kDa fermentiškai aktyvios formos susidarymas, nes retkarčiais atliekant eksperimentus abiejų baltymų kiekiai buvo labai modifikuoti kultūrose, apdorotose MT2 (7b ir c paveikslai). veikė daugiau nei hrNGF lygiagrečiose kultūrose. Atsižvelgiant į amiloidogeninio kelio slopinimą, neuronai buvo stipriai apsaugoti nuo mirties priklausomai nuo dozės (7d ir e paveikslai). Taigi, NGF mimetikų aktyvumas taip pat buvo patvirtintas labai reprezentatyviame žmogaus patologijos modelyje, o tai pateisina išsamų jų įvertinimą. in vivo nustatymus.

MT2 apsaugo neuronus nuo Aβ amiloido sukelta mirtis neuronuose, kuriuose trūksta NGF. (a ir b) 3–4 dienas kultivuoti hipokampo neuronai buvo veikiami 2 nM NGF arba MT2 (5–30 μM) ir didžiausia aktyvi MT2 koncentracija, įvertinta kaip TrkA fosforilinimo indukcija, atliekant Western blot analizę su anti-fosforilintais (P) ir anti-bendriniais (T) Trk-A antikūnais arba skaičiuojant NeuN dažytų branduolių skaičių (b). (c ir d) hipokampo neuronai buvo netekę NGF dėl anti-NGF antikūnų poveikio (30 μg/ml) 24 valandas ir inkubuojamas, kai yra arba nėra 10 μM MT2 arba 2 nM hrNGF. Ląstelės buvo lizuotos ir atlikta Western blot analizė naudojant antikūnus prieš viso ilgio APP (c) ir PS1 28 kDa N-galo fragmentas (d). (e ir f) Hipokampo neuronai buvo netekę NGF dėl anti-NGF antikūnų poveikio (30 μg/ml) 24 valandas ir tada apdorojamas MT2 koncentracija nuo 5 iki 30 μM arba 2 nM hrNGF. Gyvų neuronų procentas buvo gautas suskaičiavus nepažeistų branduolių skaičių (d) arba skaičiuojant kondensuotų branduolių skaičių (e). Ctrl, neuronai neveikiami NGF arba MT2 NGF, neuronai, veikiami NGF MT2 48 val., neuronai, veikiami MT2 48 valandas (10 μM) Dep, neuronai, kuriems netaikomas NGF 24 valandas Dep+NGF, neuronai plaunami terpe, kurioje nėra NGF, ir nedelsiant veikiami NGF turinčioje terpėje. Dep+MT2 neuronai plaunami terpe, kurioje nėra NGF, ir iš karto veikiami terpėje, kurioje yra MT2. Statistinė analizė atlikta Newman-Keuls testu (N=4), P<0,05. Atsižvelgiant į amiloidogeninio kelio slopinimą, neuronai buvo visiškai apsaugoti nuo mirties


Žmogaus šlapimo proteomika: analizės metodai ir klinikinis pritaikymas gydant inkstų ligas

Šlapimas pastarąjį dešimtmetį buvo klinikinės proteomikos mokslininkų dėmesio centre, nes yra vertingas baltymų ir peptidų šaltinis, kurio santykinai stabili sudėtis ir kurį lengva surinkti dideliais ir pakartotiniais kiekiais neinvazine procedūra. Šioje apžvalgoje mes išsamiai aptariame techninius šlapimo proteomikos aspektus, įskaitant mėginių paruošimą, proteomines technologijas ir jų pranašumus bei trūkumus. Pateikiami keli naujausi eksperimentai, kuriuose šlapimo proteomas buvo pritaikytas biomarkerių atradimui sergant inkstų ligomis, įskaitant diabetinę nefropatiją, imunoglobulino A (IgA) nefropatiją, židininę segmentinę glomerulosklerozę, vilkligę nefritą, membraninę nefropatiją ir ūminį inkstų pažeidimą. Be to, trumpai pristatomos kelios turimos šlapimo proteomikos duomenų bazės.

1. Įvadas

Klinikiniai mėginiai, tokie kaip audiniai ir biologiniai skysčiai (pvz., serumas, plazma, šlapimas ir seilės), neabejotinai yra vertingi diagnostinių pasiūlymų biologinių žymenų atradimo tyrimų šaltiniai. Baltymų kiekio sudėtingumas yra pirmasis tokių mėginių tvarkymo ir analizės klausimas. Kadangi šlapimą, kuriame yra apie 2000 baltymų [1, 2] ir kuris yra mažiau sudėtingas mėginys nei plazma, kurioje yra daugiau nei 10 000 pagrindinių baltymų [3], galima surinkti neinvaziniu ir nevaržomu būdu, jis yra tinkamiausias šaltinis tiriant platus ligų spektras. Be to, baltymų sudėtis ir šlapimo suskaidymas yra gana stabilūs, palyginti su kitais biofluidais, tokiais kaip plazma ar serumas, kurie yra linkę į proteolitinį skaidymą mėginio ėmimo metu ir po jo [4].

Kadangi šlapimas yra kraujo filtravimo pasekmė, jame taip pat yra visi iš kanalėlių ir inkstų specifinių ląstelių išskiriami baltymai [5–10], todėl jis buvo tiriamas sisteminių ir inkstų ligų patologiniam procesui tirti [11]. Serumo baltymai filtruojami pagal jų dydį ir krūvį glomeruluose [12], o gausių serumo baltymų, tokių kaip albuminas, imunoglobulino lengvoji grandinė, transferinas, vitaminą D jungiantis baltymas, mioglobinas ir su receptoriais susiję baltymai, reabsorbcija vyksta daugiausia proksimaliniuose inkstų kanalėliuose. endocitiniais receptoriais, megalinu ir kubilinu [13–16]. Taigi, baltymų koncentracija normalaus donoro šlapime yra labai maža (mažiau nei 100 mg/l, kai šlapimo išskiriama 1,5 l/d.), o normalus baltymų išskyrimas yra mažesnis nei 150 mg/d. Tai yra maždaug 1000 kartų mažiau, palyginti su kitais kūno skysčiais, tokiais kaip plazma. Daugiau nei 150 mg per parą baltymų išskyrimas apibrėžiamas kaip proteinurija ir rodo glomerulų ar reabsorbcijos disfunkciją.

Šlapimo proteomikos tyrimai lemia keletą kliūčių, tokių kaip maža bendro baltymų koncentracija, didelė druskų ir kitų ingredientų koncentracija, trukdanti atskirti baltymus [17], ir didelė šlapimo sudėties pokyčių dinamika įvairiais medžiagos rinkimo sezonais. Dėl įvairių proteominių metodų jautrumo ir prieinamumo skirtumų buvo dedama daug pastangų ieškant tinkamo metodo specifinių šlapimo žymenų baltymų ekspresijai analizuoti [18].

Šlapimo proteomika yra galinga platforma, leidžianti nustatyti su šlapimu išskiriamus baltymus ir peptidus įvairiose ligos ar gydymo stadijose ir nustatyti jų kiekį, funkcijas ir sąveiką [19]. Todėl proteominiai metodai gali pasiūlyti ligos mechanizmą ir naujus terapinius tikslus. Šioje apžvalgoje mes sutelkiame dėmesį į techninius šios platformos šlapimo proteomų taikymo klinikoje analizės aspektus, taip pat apžvelgiamos kelios šlapimo proteomų duomenų bazės.

2. Normalus žmogaus šlapimo proteomas

Normalaus žmogaus šlapime yra daug peptidų ir baltymų. 2004 m. naudojant dvimatę gelio elektroforezę (2DE) buvo atskirta beveik 1400 baltymų dėmių, o masių spektrometrija buvo identifikuota 150 skirtingų baltymų iš 420 dėmių [8]. 2006 m. derinant vienmatę gelio elektroforezę ir atvirkštinės fazės skysčių chromatografiją kartu su masės spektrometrija, šis nustatytų šlapimo baltymų skaičius žymiai padidėjo iki maždaug 1534 [1]. Iki šiol normaliame žmogaus šlapime iš viso yra daugiau nei 2000 baltymų, iš kurių 1823 baltymus nustatė Marimuthu ir kt. 2011 metais [20]. Nustatyti baltymai Marimuthu ir kt. buvo

300 daugiau nei Adachi ataskaita ir todėl galėtų būti išsamus būsimų tyrimų nuorodų sąrašas. Kai kurie šlapimo baltymai turi didesnę eksperimentinę molekulinę masę, nei teoriškai įmanoma vien iš aminorūgščių sekos, o tai rodo, kad yra posttransliacinių modifikacijų. Normaliam žmogaus šlapimo proteomui buvo nustatyti 225 N-glikoproteinai [10] ir 31 fosfoproteinas [21]. Įprastame žmogaus šlapime yra egzosomų, mažų pūslelių, kurių skersmuo mažesnis nei 100 nm, kurios išsiskiria iš inkstų epitelio ląstelių.

Egzosomose yra daug su liga susijusių baltymų. Šlapimo egzosomose yra 1132 baltymai, įskaitant 14 fosfoproteinų [22]. Yra žinoma, kad sveikų žmonių, ypač vyrų ir moterų, šlapimo proteomas skiriasi. Be tarpindividualių skirtumų, to paties individo šlapimo proteomas skirtingais laiko momentais skiriasi dėl mankštos, dietos, gyvenimo būdo ir kitų veiksnių. Laikui bėgant šlapimo proteomas labai pasikeičia. Ryte surinktame šlapime buvo daugiau baltymų nei po pietų ir vakare. Be to, pastebėta, kad tarpdienių proteomų svyravimai yra didesni nei skirtumai skirtingais laiko momentais tą pačią dieną [23].

3. Šlapimo paruošimas

Mėginių paruošimo optimizavimas yra būtinas pirmasis žingsnis atliekant šlapimo proteomų analizę ir mėginio nušalinimą, tai yra, dažnai reikia naudoti nusodinimą arba dializę. Buvo naudojami keli protokolai, naudojami šlapimo baltymams išskirti, naudojant nusodinimą, liofilizavimą, ultracentrifugavimą ir išcentrinį filtravimą. Acetonas nusodina daugiau rūgštinių ir hidrofilinių baltymų. Ultracentrifugavimas frakcionuoja daugiau bazinių, hidrofobinių ir membraninių baltymų. Organiniai tirpikliai (90 % etanolio ir 10 % acto rūgšties) nusodina šlapimo baltymus didžiausiu regeneravimo greičiu. ACN nusodintas šlapimo mėginys sukūrė daugiausiai dėmių dvimačiame (2D) gelyje, o acto nusodintas mėginys davė mažiausią dėmių skaičių [24]. Šlapimo baltymų dializė ir koncentracija liofilizuojant be frakcionavimo žymiai pagerina atkuriamumą ir skiriamąją gebą ir tikriausiai gali atspindėti bendrą šlapimo baltymų kiekį 2D gelyje. Be to, albumino pašalinimas iš šlapimo padeda nustatyti mažai baltymų [25]. Taikant šlapimo paruošimo metodus buvo išanalizuoti du pagrindiniai kintamieji: kiekis (baltymų atkūrimo išeiga) ir kokybė (2D dėmių modeliai arba proteominiai profiliai). Prieita išvados, kad nėra vieno tobulo protokolo, kuriuo būtų galima ištirti visą šlapimo proteomą, nes kiekvienas metodas turi ir privalumų, ir trūkumų, palyginti su kitais. Norint gauti didžiausią kiekybinės ir kokybinės informacijos kiekį, reikalingas kelių mėginių paruošimo metodų derinys [24].

4. Šlapimo proteomų praturtinimas

Dėl to, kad ligai būdingi biomarkeriai greičiausiai yra mažai gausioje proteomo frakcijoje, kurią užmaskuoja didelis baltymų kiekis, sodrinimo strategijos gali padidinti galimybę užfiksuoti šiuos galimus biomarkerius.

Didelio kiekio baltymų išeikvojimas naudojant chromatografinius sodrinimo metodus arba komercinius rinkinius, skirtus šlapimo mėginiams, yra sodrinimo strategijų.

Keletas didelio koncentracijos baltymų (pvz., albumino, transferino, haptoglobino, imunoglobulino G, imunoglobulino A ir alfa-1 antitripsino) gali būti pašalinti naudojant antikūnais pagrįstus afiniteto išsekimo metodus (pvz., kelių afiniteto pašalinimo sistemą (MARS)), kurios gali būti susietas su 2DE arba LC-MS analize [26, 27]. Mažai gausių baltymų praturtinimas ir didelio gausumo baltymų išeikvojimas gali būti derinamas peptidų ligandų bibliotekos metodu. Taikant šį metodą, įvairi peptidų biblioteka, imobilizuota ant kietosios fazės chromatografinės matricos, sąveikauja su specifine baltymų atpažinimo vieta. Todėl sugauti baltymai įtraukiami į analizės procedūrą, o kiti baltymai, neturintys tinkamos sąveikos, išplaunami ir neįtraukiami. Dėl didelio baltymų kiekio peptidų prisotinimo sumažėja jų koncentracija galutiniame eliuente. Be to, koncentruoti mažai gausūs baltymai ant jų specifinių ligandų sumažina baltymų dinaminį diapazoną mėginyje [28]. Šio metodo sėkmė priklauso nuo to, ar bus naudojamas didelis pradinės medžiagos kiekis, priešingu atveju praturtintas profilis būtų panašus į nepraturtintą pradinį profilį [29]. Chromatografijos metodai, tokie kaip jonų mainai, dydžio išskyrimas ir afininė chromatografija, plačiai naudojami sodrinimo arba išeikvojimo tikslais, tačiau jie taip pat taikomi frakcionuojant ir atskyriant prieš MS (žr. 5.2 skyrių).

Krūvio ir krūvio sąveika tarp mėginio ir įkrautos kolonėlės baltymų yra subproteomo fiksavimo jonų mainų chromatografijoje pagrindas. Atliekant anijonų mainų chromatografiją, neigiamo krūvio baltymai arba peptidai sąveikauja su teigiamai įkrauta kolonėlė ir palaipsniui eliuuojami iš kolonėlės judriąja faze su druskos tirpalo gradientu. Didžioji dalis surištų baltymų, turinčių neigiamą krūvį, išplaunami esant didžiausiai jonų stiprumui [30]. Lu ir kt. Naudodamas šį metodą, praturtino mažai baltymų turinčius baltymus šlapimo mėginyje ir pastebėjo pagerėjusį identifikavimo skaičių 2DE praturtintų mėginių žemėlapyje, palyginti su neprisodrintų mėginių žemėlapiu [30].

Priešingai nei anijonų mainai, stacionarios fazės krūvis stiprios katijonų mainų chromatografijos (SCX) vandeniniame tirpale tampa neigiamas ir todėl sąveikauja su stipriai bazinėmis analitais. Analitėms eliuuoti kolonėlė plaunama tirpikliu su pH gradientu. Daugiausia katijoninių baltymų / peptidų išsiskirtų iš kolonėlės esant aukštesniam pH. Todėl šis metodas buvo pristatytas kaip tinkamas fosfoproteomų sodrinimo metodas [31]. Thongbonkerd ir kt. parodė SCX pritaikymą baziniam / katijoniniam šlapimo proteomui praturtinti [32].

Šiuo metu yra komercinių baltymų išeikvojimo rinkinių, kai kurie iš jų buvo optimizuoti šlapimo mėginių proteominiams tyrimams (pvz., UPCK šlapimo baltymų praturtinimo / koncentravimo rinkinys). Remiantis literatūra, naudojant šiuos išeikvojimo rinkinius galima iki 2,5 karto padidinti šlapime identifikuojamų mažo kiekio baltymų skaičių [33].

Sodrinimo strategijos pasirinkimas priklauso nuo tikslo ir konkrečių studijų reikalavimų.

5. Šlapimo proteominių tyrimų metodai

Įprasti šlapimo proteomų analizės metodai yra dvimatė gelio elektroforezė, po kurios atliekama masės spektrometrija (2DE-MS), skysčių chromatografija, sujungta su masės spektrometrija (LC-MS), paviršiaus sustiprinta lazerio desorbcija / jonizacija, sujungta su masės spektrometrija (SELDI-TOF), ir kapiliarinė elektroforezė, sujungta su masės spektrometrija (CE-MS) ir baltymų mikrogardelėmis [34].

5.1. DE-MS

Dvimatė gelio elektroforezė yra tvirtas ir plačiai naudojamas baltymų atskyrimo metodas. Šiuo metodu baltymai atskiriami pagal jų izoelektrinį tašką ir molekulinę masę, vizualizuojami ir pusiau kiekybiškai įvertinami dažant [25]. 2DE pranašumai apima galimybę aptikti santykinai dideles molekules, įvertinti baltymų molekulinę masę ir pI bei ištirti posttransliacines modifikacijas [35]. Dažni 2DE technikos apribojimai yra reikalavimai dideliam baltymų kiekiui, automatizavimo trūkumas, itin rūgščių (pH < 3) arba bazinių baltymų (pH > 10) praradimas, didelių (Mr > 150 kD) ir mažų (Mr <) aptikimo trūkumas. 10 kD) baltymai ir hidrofobiniai baltymai, atkuriamumo, mažo našumo ir siauro dinaminio diapazono trūkumas [36, 37]. Kai kurie iš šių apribojimų buvo suteikti dėl kai kurių techninių patobulinimų. Dviejų dimensijų skirtumo gelio elektroforezės (2D-DIGE) sukūrimas išsprendė mažo pralaidumo problemą, pagerina kiekybinio įvertinimo tikslumą ir statistinį patikimumą naudojant vidinį standartą ir sujungiant mėginius, pažymėtus skirtingais fluorescenciniais dažais (Cy2, Cy3 ir Cy5) [38] ]. Mėlyna natūrali technika buvo sukurta siekiant patikslinti hidrofobinių baltymų, baltymų kompleksų ir baltymų ir baltymų sąveikos gelio matricoje tyrimus [39]. Mėlyna natūrali technika atskiria baltymus pagal jų molekulinę masę dviem matmenimis. Atkuriamumo problema buvo sumažinta naudojant surenkamus gelius su daugiafunkciniais gelio rezervuarais, kurie gali vienu metu paleisti kelis elektroforezinius gelius. Be to, dažymo geliai su skirtingais fluorescenciniais dažais poelektroforetiškai padidina aptikimo dėmių jautrumą. Tiriant šlapimo baltymus 2DE metodu, rekomenduojama pašalinti druską chromatografinėmis kolonėlėmis arba filtrais, kad susidarytų gerai atskirtos dėmės ant gelio. Nepaisant to, kad pagerėjo 2DE technika, automatizavimo trūkumas ir daug laiko reikalaujantys žingsniai (maždaug 3 dienos 2DE modeliui gauti) sumažina tyrėjų polinkį taikyti šią techniką savo naujausiuose eksperimentuose.

5.2. LC-MS

Skysčių chromatografija (LC) yra didelės skiriamosios gebos atskyrimo metodas, kuris naudoja vieną ar daugiau būdingų baltymų charakteristikų, jo masę, izoelektrinį tašką, hidrofobiškumą arba biospecifiškumą [40]. Šis metodas atskiria didelius kiekius analičių (baltymų / peptidų) HPLC kolonėlėje arba nedidelį kiekį analičių (peptidų) kapiliarinėje LC kolonėlėje su dideliu jautrumu ir gali būti automatizuotas [41]. LC/MS gali nustatyti mažo gausumo ir hidrofobinius baltymus, kurių nemato 2DE, todėl yra laikomas papildomu 2DE metodu proteomikoje 2D skystosios fazės frakcionuojant ir gali būti naudojamas nuodugniai kūno skysčių, pvz., šlapimo, analizei [42]. Geresniam atskyrimui naudojamas gelio ir skirtingų be gelio metodų etapų derinys (ty nuoseklus atskyrimas naudojant skirtingas matricas dviem ar daugiau nepriklausomų etapų) ir vadinamas purvo PIT. Stipri katijonų mainų kolonėlė (SCX) yra geras pasirinkimas atskiriems šlapimo peptidams prieš injekciją į atvirkštinės fazės kolonėles, sujungtas su MS. Daugelio šlapimo junginių, įskaitant organines rūgštis ir tulžies druskas, sulaikymo laikas sutampa su peptidais atvirkštinės fazės LC, kuriuos galima pašalinti naudojant SCX kolonėlę [43]. Pastaruoju metu silpnų anijonų mainų kolonėlės naudojamos mažo kiekio baltymų, išsiskiriančių su šlapimu prieš 2DE, frakcionavimui ir sodrinimui [44]. Šis derinio metodas gali identifikuoti mažai gausius biomarkerius, tačiau vis dar kyla iššūkių nustatant izoformas ir PTM. Afininės chromatografijos kolonėlės prieš atliekant LC-MS tyrimus yra kiti alternatyvūs subproteomų, tokių kaip glikoproteomas ir fosfoproteomas, surinkimo iš šlapimo metodai [22, 45]. LC technika gali būti derinama su įvairių tipų masių spektrometrijos prietaisais, kurie turi įtakos identifikavimo ir kiekybinio įvertinimo tikslumui ir patikimumui.

Didelės skiriamosios gebos instrumentai, tokie kaip Furjė transformacijos jonų ciklotronų rezonansas (FTICR) ir orbitrap arba hibridiniai ir tribridiniai instrumentai, tokie kaip Q-exactive (kvadrupolio ir orbitrapo hibridas) ir orbitrap Fusion (kvadrupolio tribridas, orbitrap ir linijinis jonų gaudyklė). susiekite su LC klinikiniam mėginio, įskaitant šlapimą, analizei. Kalantari ir kt. ir Adachi ir kt. išanalizavo atitinkamai IgA nefropatija sergančių pacientų ir normalaus žmogaus šlapimo mėginius, naudojant LC kartu su didelės skiriamosios gebos MS instrumentais [1, 46]. Baltymai, atskirti LC, gali būti kiekybiškai įvertinti naudojant ženklinimą (pvz., stabilų izotopų afinitetą ir izobarines žymes) ir be etikečių metodus [41]. Baltymų ar peptidų kiekybinis nustatymas dideliu mastu galimas tik naudojant MS be gelio metodus, kurie yra laikomi šių metodų pranašumu. Kadangi LC-MS užima daug laiko ir yra jautrus trukdantiems junginiams (pvz., druskoms) ir analičių nusodinimui ant kolonėlės medžiagų, jis dar netaikomas įprastiniams klinikiniams diagnostiniams tyrimams [48].

5.3. SELDI-TOF

Paviršiaus pagerintos lazerinės desorbcijos/jonizacijos skrydžio laiko (SELDI-TOF) technologijoje naudojamos skirtingų paviršių savybių turinčios baltymų lustų matricos (hidrofilinės arba hidrofobinės medžiagos, katijoninės arba anijoninės matricos, lektinas arba antikūnų afiniteto reagentai), sujungti su TOF mase. spektrometras [36]. Dominantys baltymai arba peptidai yra prijungiami prie aktyvaus paviršiaus, priklausomai nuo paviršiaus savybių, o nepageidaujami neprisijungę baltymai nuplaunami tinkamu tirpikliu arba buferiu [36, 49]. Tai plačiai naudojamas klinikinėje proteomikoje metodas, galintis aptikti skirtingus kūno skysčių ir audinių mėginių baltymų ekspresijos modelius tarp pacientų ir sveikų asmenų, todėl yra galingas įrankis biožymenims atrasti [50]. SELDI-TOF yra didelio našumo ir lengvai naudojama technika, kurią galima automatizuoti. Be to, mažas mėginio tūris (<10 μL) reikalingas be išankstinio baltymų koncentravimo ar nusodinimo [42, 51]. Tačiau jis turi tam tikrų apribojimų, pavyzdžiui, standartizacijos sunkumų, nes SELDI generuojamiems proteomų profiliams įtakos turi daugelis veiksnių, tokių kaip paviršiaus dangos tipas, pH, druskos būklė ir baltymų koncentracija. Kiti SELDI apribojimai yra atkuriamumo trūkumas, pasirinktų baltymų apribojimas, mažos skiriamosios gebos masės spektrometras ir seka pagrįsto išskirtų smailių identifikavimo trūkumas [48, 52, 53].

5.4. CE-MS

Kapiliarinė elektroforezė, sujungta su MS, yra ideali analizės metodika, skirta skirtingiems omikos metodams, užtikrinantiems didelės skiriamosios gebos baltymų atskyrimą, pagrįstą diferencine migracija per buferiu užpildytą kapiliarinę kolonėlę elektriniame lauke (300–500 V/cm) [54, 55]. CE gali būti sujungtas su MALDI (neprisijungus) arba su ESI (on-line). Nors CE-MALDI duomenų analizė yra perspektyvesnė, signalo slopinimas ir kintamumas dėl matricos efekto, taip pat skiriamosios gebos praradimas yra laikomi šio metodo iššūkiais, todėl pirmenybė teikiama sujungimui su ESI [56]. Nors CE galima sujungti su bet kokio tipo MS prietaisu, ESI-FT-ICR yra tinkamiausias baltymų ir peptidų ligų biomarkerių šlapime identifikavimui [47, 57]. CE-MS siūlo keletą privalumų, įskaitant greitą ir efektyvų atskyrimą, selektyvumą, jautrumą, mažą kainą, buferio gradientų nebuvimą, galimybę greitai atstatyti naudojant NaOH ir nejautrumą nusodinantiems baltymams peptidams, lipidams ir kitiems junginiams, kurie dažnai trukdo LC- atskyrimas [51, 58].

Šis metodas ypač tinka mažos molekulinės masės (<20 kDa) molekulių analizei. Jo trūkumai yra ribotas gebėjimas atskirti didelės molekulinės masės baltymus (>20 kDa) ir mažo gausumo baltymus, atkuriamumo ir tvirtumo stoka bei maža mėginio įkrovimo talpa [53, 55].

5.5. Baltymų mikrogardelės

Baltymų mikrogardelės (arba baltymų lustai) yra miniatiūrinės kietosios fazės ligandų surišimo tyrimo sistemos, kuriose ant atraminio paviršiaus, paprastai stiklelio arba membranos, naudojami imobilizuoti antikūnai arba antigenai [59]. Pagal skirtingas savybes, tokias kaip turinys, paviršius ar aptikimo sistema, yra daug baltymų mikrogardelių tipų [60]. Pagrindiniai baltymų mikromasyvų pranašumai yra didelio našumo jautrumas ir mažos molekulinės masės žymenų atradimas, todėl jie yra idealus šlapimo proteomikos metodas. Tačiau mikrogardelės turi keletą apribojimų, pavyzdžiui, labai specifinio zondo kiekvienai analitei reikalavimas, mažo tankio aprėptis, leidžianti aptikti tik kelis baltymus, kintamas specifiškumas ir neaptikta posttransliacinių modifikacijų [25, 61].

6. Šlapimo proteominių tyrimų pažanga

Per pastaruosius du dešimtmečius proteominių įrankių pažanga buvo įspūdinga. „Mikrofluidinis mikroschemos CE (MC-CE) prietaisas“, naujausias biožymenų atradimo analizės įrankis, yra vienas iš brangių pasiekimų, sudarančių galimybę profiliuoti šlapimo žymenis su reguliuojamu mikroschemos mėginio skiedimu [62]. Šis prietaisas yra specialiai pritaikytas šlapimo anijoniniams biomarkeriams aptikti ir pasižymi dideliu atskyrimo efektyvumu bei jautrumu aptikdama analitę. Jį sudaro du vienetai: mėginio skiedimas ir mikroschemos CE atskyrimas [63]. Šioje įrenginio sekoje skiedimas ir atskyrimas yra taikomi magnetiniais skysčiais įjungiamais vožtuvais. Naujausius šlapimo mėginių tyrimus naudojant mikrofluidinius prietaisus apžvelgė Lin ir kt. [64].

Mėginio paruošimas naudojant filtrą (FASP), ploviklio išeikvojimo metodas, yra vienas iš veiksmingų naujausių ginklų proteominės analizės metodų [65]. Šis metodas turi naudos iš virškinimo gelyje ir tirpale privalumų ir turi daug baltymų [66].

Reikalingas mažas mėginio tūris, o baltymų mišinių virškinimas tiesiai ant filtro membranos yra svarbiausias šio metodo privalumas.

96 šulinėlių pagrįstas lygiagretusis FASP yra patikimas šlapimo proteomikos metodas, kuris yra ekonomiškas, pakartojamas ir efektyvus. Wiśniewski ir kt. ir Yu ir kt. [65, 66] sėkmingai taikė šį metodą šlapimo mėginiams analizuoti.

Kiekybinio nustatymo metodų pažanga suteikia daugiau informacijos apie peptidus ir baltymus biologiniuose mėginiuose, įskaitant šlapimą. Atliekant kiekybinį įvertinimą be etikečių, pagrindinis tikslas yra sukurti programinę įrangą, galinčią normalizuoti ir sumažinti paklaidas, kylančias iš prietaiso ir įkeliant mėginius. „Quanti“ yra tinkamas neseniai sukurtos programinės įrangos, galinčios palyginti tiksliai be etiketės kiekybiškai nustatyti baltymų kiekį, koreguojant atsaką į instrumentinius svyravimus, pavyzdys [67]. Ši programinė įranga buvo pritaikyta keliuose šlapimo proteomikos tyrimuose [46, 68–71]. MaxLFQ taip pat yra naujai sukurta programinė įranga be etikečių, kuri gali atlikti labai didelius eksperimentus, naudoja atidėtą normalizavimą, todėl yra suderinama su įvairiomis atskyrimo procedūromis, ir iš peptidų signalų išskiria informaciją apie maksimalų santykį [72]. Kitos programinės įrangos programos be etikečių ir šios technikos pranašumai bei apribojimai buvo apžvelgti kitur [73, 74].

Atrodo, kad pastaraisiais metais kiekybinio nustatymo ženklinimo metodai buvo mažiau patobulinti, konkuruojant su kiekybinio nustatymo metodais be etikečių. Tačiau izobarinės žymenys santykiniam ir absoliučiam kiekybiniam įvertinimui (iTRAQ) kaip universali ženklinimo technika, sukurta 2000-ųjų dešimtmečio pradžioje, vis dar yra populiarios ir dažnai naudojamos šlapimo proteomikos tyrimuose [75].

7. Šlapimo naudojimas klinikinėje proteomikoje

Pagrindinis klinikinės proteomikos iššūkis yra patikimų biomarkerių, padedančių anksti diagnozuoti ligą ir prisidėti prie individualizuotos medicinos kūrimo, nustatymas. Kadangi 70 % šlapimo baltymų yra iš inkstų ir šlapimo takų, o 30 % – iš kitų organų, kurie išskiriami į kraujotaką, šlapimo proteomikos tyrimas gali būti naudingas siekiant geriau suprasti patofiziologinius mechanizmus ir atrasti naujus biomarkerius bei terapinius tikslus. inkstų ir neinkstų ligų [76]. Anderson ir kt. pranešė, kad 1979 m. buvo identifikuoti keli baltymai kaip šlapimo biomarkeriai. Ligai būdingų biomarkerių šlapime paaiškinimą apsunkina reikšmingi šlapimo proteomų pokyčiai per dieną, veikiami kai kurių veiksnių, tokių kaip pratimai, mitybos pokyčiai ir cirkadinis laikotarpis. ritmai. Paprasčiausiai lyginti tam tikra liga sergančių pacientų šlapimą su sveikais asmenimis, kad būtų galima atskirti skirtingas ligas su panašiais simptomais, nepakanka. Kadangi sveikų žmonių ir tikslinės sergančiųjų grupės būklės kintamumas ir nereikšmingi skirtumai yra neišvengiamai dideli ir nekontroliuojami, biomarkerio atradimui rekomenduojama palyginti vieną ar daugiau simptominių panašių ligų, kurios skiriasi etiologija ir sunkumu. Taigi kruopštus eksperimentinis planavimas yra raktas į sėkmę atliekant biomarkerių tyrimus. Kita problema yra teisingas atvejo ir kontrolinių grupių atitikimas. Pavyzdžiui, kadangi kai kurios ligos, tokios kaip vėžys ir lėtinė inkstų liga, dažniausiai pasireiškia vidutinio ir vyresnio amžiaus žmonėms, jaunų savanorių šlapimo mėginiai nėra tinkama kontrolė šioms ligoms tirti. Šlapimo proteomika, jei stebimas kruopštus tyrimo planas, yra perspektyvi platforma ankstyvo aptikimo ir neinvazinių biomarkerių identifikavimui naujoje šiuolaikinės medicinos eroje.

Nepaisant daugybės tyrimų, paskelbtų per pastaruosius dešimtmečius, naudojant proteominius įrankius biomarkerių atradimo srityje, vis dar nėra patikimo, specifinio, jautraus biomarkerio. Bendras biomarkerių tyrimo trūkumas yra atkuriamumo trūkumas, o nežinomų veiksnių poveikis kyla iš tamsiosios ligos patogenezės pusės, apie kurią mes neturime pakankamai žinių ir todėl negalėjome būti kontroliuojami. Ateityje šis susirūpinimas išnyks dėl paruošimo metodų, atskyrimo procedūros ir išplėstų duomenų bazių pažangos. Be to, atlikus išsamią klinikinės proteomikos darbo eigą nuo pradinio atradimo iki vertimo į kliniškai naudingą tyrimą, biomarkeris būtų prasmingas ir pritaikomas klinikoje. Mischak ir kt. apibrėžė šešis šios darbo eigos etapus: (I) pirminis identifikavimas ir patikrinimas, (II) rezultatų įvertinimas, kurį atlieka išmananti nepriklausoma ekspertų grupė, (III) įvertinimas tinkamuose biobanko mėginiuose arba naujai surinktuose mėginiuose, (IV) įvertinimas atliekant klinikinį tyrimą, (V) įgyvendinimas klinikinėje praktikoje ir (VI) patvirtinto biomarkerio ekonomiškumo įrodymas [77].

Kitas svarbus dalykas, į kurį reikėtų atsižvelgti biomarkerio diegimo klinikose kontekste, yra biomarkerių grupės naudojimas vietoj vieno biomarkerio. Biologinių žymenų skydelis gali padidinti tyrimų jautrumą ir tikslumą.

7.1. Šlapimo biomarkeriai sergant inkstų ligomis
7.1.1. Diabetinė nefropatija

Diabetinė nefropatija (DN) yra rimta sudėtingos etiologijos diabeto komplikacija, kuri apima iki 40 % diabetu sergančių pacientų [39, 43]. DN diagnozuojama pagal 30–300 mg baltymo išsiskyrimą su šlapimu per 24 valandas (mikroalbuminurija), kuri gali progresuoti iki makroalbuminurija (>300 mg/24 val.) ir (arba) kreatinino kiekio serume pokyčiai, rodantys glomerulų filtracijos greičio sumažėjimą. Histologiniai DN požymiai yra podocitų praradimas, glomerulų bazinės membranos storis, mezangialinių ląstelių proliferacija ir kanalėlių intersticinė fibrozė [44]. Dabartinė DN diagnostikos priemonė yra biopsija, kuri yra invazinė ir dėl jos pasekmių nerekomenduojama visais įtartinais atvejais. Šlapimo diagnostikos biomarkeriai yra perspektyvios neinvazinės diagnostinės molekulės, papildančios biopsiją, kurios artimiausiu metu pateks į kliniką. Šios diagnostinės molekulės gali padėti nustatyti tikslią diagnozę arba nuspręsti dėl veiksmingesnio gydymo.

Mikroalbuminurija (MA) yra svarbi ankstyvai DN diagnostikai ir yra geriausia klinikoje prieinama DN prognozė [46]. Tačiau keli tyrimai parodė, kad tik daliai pacientų, sergančių MA, išsivysto proteinurija [47, 56]. Be to, daugelis asmenų, sergančių 1 tipo cukriniu diabetu, jau patyrė ankstyvą inkstų funkcijos pablogėjimą prieš MA atsiradimą arba atsitiktinai. Taigi, atrodo, kad MA gali būti netinkamas ankstyvas diagnostinis DN biomarkeris (tačiau jis gali būti tinkamas pažengusio DN diagnozavimui), todėl proteominiais metodais būtina atrasti naujus jautrius ir specifinius žymenis [76]. Be to, kai kurie siūlomi DN biomarkeriai buvo gauti iš pacientų, kurių liga buvo diagnozuota pagal klinikinius kriterijus ir nepatvirtinta biopsija, mėginiais, o tai pabrėžia būtinybę atlikti tikslesnius DN biomarkerio atradimo tyrimus. Soldatos ir Cooper tyrimas [44] buvo gerai suplanuotas pradinis bandomasis tyrimas, skirtas DN pacientų šlapimo proteomų profiliavimui naudojant SELDI-TOF ankstyviems diagnostiniams žymenims atrasti. Jie galėjo nustatyti 12 smailių šlapimo baltymo parašą 2 tipo cukriniu diabetu sergantiems pacientams, palyginti su sveikomis kontrolėmis, kurių jautrumas 93% ir specifiškumas 86%. Įdomu tai, kad jų tyrimo pacientai buvo normalūs albuminuriniai (albumino ir kreatinino santykis < 30 mg/g) be inkstų funkcijos sutrikimo. Atvejo kontrolės tyrime Rossingas, naudodamas didelės skiriamosios gebos dvimatį gelio elektroforezės atskyrimą ir baltymų identifikavimą MALDI-TOF-MS ir LC-MS/MS analize [43], pranešė apie koreliaciją tarp baltymų rinkinio lygio, ypač Tamm- Arklio kritimo šlapimo glikoproteinas (THP) ir cinkas.α-2 glikoproteiną (ZA2G) ir 1 tipo cukriniu diabetu sergančių pacientų progresuojančią diabeto būklę. Jim ir kt. ELISA tyrimas parodė, kad nefrinurija aptinkama visiems 2 tipo cukriniu diabetu sergantiems pacientams, sergantiems makroalbuminurija ir mikroalbuminurija, todėl nefrinas gali būti naujas ankstyvas DN biomarkeris [78]. Išilginio tyrimo metu DN pacientų šlapimo proteomui profiliuoti buvo naudojama su kapiliarine elektroforeze susieta masės spektrometrija. Pasikeitęs kolageno fragmentų kiekis buvo pasiūlytas kaip galimas ankstyvas biomarkeris, kuris atsiranda likus 3–5 metams iki makroalbuminurijos pradžios [79].

Naujausia ataskaita apie baltymų biomarkerius DN stadijoms naudojant iTRAQ rodo, kad kasos amilazės ir dezoksiribonukleazės I išsiskyrimas sumažėjo [80].Kai kurie nauji šlapimo biomarkeriai, skirti DN pranešimui per pastaruosius dvejus metus, yra pateikti 1 lentelėje.

Baltymų biomarkeriaiAukštyn/žemyn reguliavimasKohortaTechnikaBiomarkerio tipasNuoroda
Kasos amilazės dezoksiribonukleazė ISveikos kontrolės priemonės (

) ir T2DM su mikroalbuminurija (

) ir T2DM su makroalbuminurija (

Kadangi biopsija atliekama ne visiems pacientams, sergantiems cukriniu diabetu (dėl jo invaziškumo), kai kuriais atvejais DN diagnozuojama pagal klinikines apraiškas ir todėl gydoma pagal turimas DN gaires. Nepaisant to, įdomu tai, kad kai kuriems cukriniu diabetu sergantiems pacientams inkstų pažeidimas nebūtų diabetinės nefropatijos pasekmė, o diabetu sergantiems pacientams taip pat gali atsirasti kitų inkstų ligų, tokių kaip membraninė nefropatija ar židininė segmentinė glomerulosklerozė, kurių negalima diagnozuoti tik pagal klinikines apraiškas. Todėl jautrūs ir specifiniai DN biomarkeriai neabejotinai reikalingi kaip neinvazinė inkstų biopsijos alternatyva.

7.1.2. IgA nefropatija

IgA nefropatija (IgAN) yra labiausiai paplitęs glomerulonefrito tipas visame pasaulyje, kuriam biopsijos metu būdingi histologiniai požymiai, įskaitant mezangialinius IgA1 imunodepozicijas (imuninės fluorescencijos būdu) kartu su C3 ir IgG, IgM arba abiem [81, 82]. Klinikinis IgAN vaizdas yra įvairus ir gali būti klinikinių požymių spektras nuo besimptomės hematurijos iki greitai progresuojančio glomerulonefrito. Atitinkamų baltymų, tokių kaip imunoglobulinas, citokinai ir komplemento faktorius, išsiskyrimas su šlapimu rodo daug žadančią naują galimybę ieškant neinvazinių diagnostinių žymenų pacientams, sergantiems IgAN.

Kai kurios tyrimų grupės naudojo SELDI-TOF kaip vieną iš galingų šlapimo proteomikos metodų IgAN biomarkerio atradimui. Rocchetti ir kt. išanalizavo 49 IgA nefropatija sergančių pacientų, 42 pacientų, sergančių lėtine inkstų liga (CKD) ir 40 sveikų asmenų, šlapimo proteomą, naudodami šį metodą, po to MALDI-TOF diferencijuotiems baltymams identifikuoti ir pranešė apie Perlecan laminino G tipo 3 peptidą ir Ig.κ šviesos grandinės kaip ligos aktyvumo rodiklis [83].

Julianas ir kt. Taikant CE-MS šlapimo polipeptidinių biomarkerių nustatymui, pacientai, sergantys IgA nefropatija, buvo atskirti nuo kitų inkstų ligų, įskaitant diabetinę nefropatiją, vilkligę, hipertenzinę inkstų ligą, ūminį vaskulitą su nefritu ir amiloidozę bei tiriamuosius, kuriems buvo atliktas funkcinis inkstų transplantatas [84]. Kai kurie iš šių žymenų buvo nustatyti taikant MS/MS metodą iš viršaus į apačią (pvz., alfa-1-antitripsinas, III tipo alfa-1 kolageno grandinė ir uromodulinas). Be to, jie apibrėžė biologinių žymenų grupę, pavadintą „Inkstų pažeidimo modelis“, lygindami sveikų kontrolinių asmenų ir kelių inkstų ligų modelį. Tada šie žymenys koreliavo su IgA nefropatijos modeliu, naudojant SDS-PAGE / Western blot.

Zhao ir kt. pirmą kartą naudojo SILAC pažymėtą pelės serumą kaip vidinį standartą žmogaus ir šlapimo proteomų analizei IEF-LC-MS/MS. Jie palygino IgAN gydytų ir negydytų pacientų šlapimą ir pranešė apie penkiasdešimt tris peptidus, kurie skyrėsi dviejose grupėse. Pagal šią kiekybinio nustatymo strategiją autoriai galėjo rasti naujų kandidatų, tokių kaip ApoA1 ir į insuliną panašus augimo faktorių surišantis baltymas 7 (IGFBP7) IgAN [85]. Kalantari ir kt. bandomajame tyrime, kuriame dalyvavo 13 pacientų, sergančių IgA, šlapimo mėginiai, naudojant didelės skiriamosios gebos masės spektrometriją, bandė rasti ryšį tarp proteomų duomenų ir patologinio pateikimo, naudojamo IgAN klasifikavimui biopsijoje [46]. Jie atliko dvi nepriklausomas proteomines procedūras (nano-LC-MS/MS ir GeLC-MS/MS) ir pranešė apie kandidatų grupę kaip prognostinius žymenis, įskaitant afaminą, leucino turtingą alfa-2-glikoproteiną, ceruloplazminą, alfa-1-mikrogolbuliną, hemopeksinas, apolipoproteinas AI, komplementas C3, vitaminą D jungiantis baltymas, beta-2-mikroglobulinas ir retinolį surišantis baltymas 4. Neseniai atliktas IgAN tyrimas, kuriame dalyvavo 30 pacientų ir 30 kontrolinių asmenų, parodė 18 skirtingų šlapimo baltymų, atskirtų ir identifikuotų IEF/LC-MS/MS [86]. Dauguma šių kandidatų buvo komplemento komponentai, krešėjimo faktoriai ir tarpląstelinė bei tarpląstelinė matrica ir transmembrana. 2 lentelėje parodyti kai kurie neseniai (per pastaruosius 3 metus) pranešti IgAN šlapimo žymenys.

Baltymų biomarkeriaiAukštyn/žemyn reguliavimasKohortaTechnikaBiomarkerio tipasNuoroda
GP2, vazorinas ir EGF Sveikos kontrolės priemonės (
7.1.3. Židinio segmentinė glomerulosklerozė

Židininė segmentinė glomerulosklerozė (FSGS) yra glomerulinė podocitopatija, kuriai būdinga didžiulė proteinurija kaip klinikinis pasireiškimas ir glomerulų išgąsdinimas kaip histologinis požymis [87, 88]. hipoalbuminemija, hipercholesterolemija ir periferinė edema yra susijusios su proteinurija ir taip pat laikomos klinikinėmis apraiškomis [87]. Tai sudėtinga liga, klasifikuojama kaip pirminė (

20%), atsižvelgiant į etiologiją. Difuzinis pėdos proceso podocitų išnykimas dažniausiai yra susijęs su pirmine forma, nustatyta elektroniniu mikroskopu [88]. Didėjantis FSGS dažnis per pastaruosius 20 metų ir 50% ESRD dažnis per 5–8 metus nuo diagnozės nustatymo atspariems terapijai pacientams [88, 89] rodo, kad ankstyvai diagnostikai ir atsako prognozei reikalingi biomarkeriai. Molekuliniai biomarkeriai padeda ne tik diagnozuoti, bet net suprasti patogenezę ir ligos mechanizmą.

Shui ir kt. atliko klasikinį proteominį šlapimo biomarkerių FSGS pelės modelio tyrimą [90]. Serijiniai šlapimo mėginiai buvo paimti 0, 4, 7, 11, 15 ir 20 dienomis ir analizuojami naudojant dvimatę elektroforezę, o po to MALDI-TOF-MS. Jie nustatė 37 baltymus, kurie pasikeitė ligos eigoje, ir kai kuriuos iš jų patvirtino Western blot metodu. Kolageno IV fragmentas, glutationo S-transferazė ir E-kadherinas buvo pasiūlyti kaip ligos progresavimo kandidatai. Kiti jų tyrimo metu nustatyti ankstyvos diagnozės kandidatai yra pateikti 3 lentelėje.

Baltymų biomarkeriaiAukštyn/žemyn reguliavimasKohortaTechnikaBiomarkerio tipasNuoroda
Kolagenas IV, kadherinasAD gydytos pelės (

) bandomajai ir recidyvuojančiai grupei (

), steroidams jautrus nefrozinis sindromas (

Wang ir kt. taip pat tyrė biomarkerius, kad atskirtų adriamicino nefropatiją ir Thy1.1 glomerulonefritą žiurkės modelyje [10]. Šlapimo proteomas buvo nusodintas acetonu ir, nustačius baltymų koncentraciją, vienodas šlapimo proteomas iš kiekvieno penkių mėginių, sujungtų į keturias grupes ir praturtintas lektinu. Atlikus eliuuoto glikoproteomo LC-MS/MS analizę, po jos kiekybinį nustatymą naudojant spektrinio skaičiavimo metodą, buvo gauti 46 skirtingi baltymai, įskaitant Ig lambda-2 grandinės C sritį, baltymą YIPF3, hemopeksino pirmtaką ir 35 kitus baltymus su skirtinga pokyčių kryptimi ir serumo albumino pirmtaką. Serotransferino pirmtako 1 izoforma, alfa-1-antiproteinazės pirmtakas, T-kininogeno 1 pirmtakas, trefoil faktoriaus 3 pirmtakas, superoksido dismutazė ir šlapimo baltymo 1 pirmtakas su panašia pokyčių kryptimi.

SELDI techniką taikė Woroniecki ir kt. nustatyti skirtingus šlapimo proteomų modelius sveikiems ir steroidams atspariems (SRNS) ir steroidams jautriems (SSNS) pacientams, sergantiems nefroziniu sindromu, pvz., MCD ir FSGS [91]. Nuspėjamieji modeliai buvo sukurti naudojant prižiūrimą algoritmą, kad būtų galima atskirti kontrolę nuo sergančiojo (SSNS ir SRNS derinys) ir SSNS bei SRNS. Sukurtas reagavimo prognozavimo modelis turėjo 100% tikslumą ir lėmė 4144 daltonų masės diferencinį baltymą su reikšmingais pokyčiais kaip svarbiausias klasifikatorius.

Zhao ir kt. neseniai atliko tyrimą su šlapimo biomarkeriais, atspindinčiais dinaminius pokyčius ligos eigoje, analizuotą UPLC kartu su triguba TOF-MS, kiekybiškai įvertintą be etiketės ir patvirtintą Western blot [92]. Jie ištyrė šešis ADR sukeltų žiurkių etapus. Santykinis dvylikos baltymų gausa rodė bendrą didėjimo tendenciją, o devynių baltymų bendra mažėjimo tendencija. Fetuinas-B ir B2-mikroglobulinas pasikeitė ankstyvoje stadijoje. Šie žymenys buvo toliau tiriami, siekiant rasti žmogaus ortologus. Patvirtinti siūlomi kandidatai pateikti 3 lentelėje.

Neseniai buvo atlikti keli proteominių metodų tyrimai, skirti identifikuoti biomarkerius, ypač FSGS pacientų šlapimo mėginiuose. Keliuose tyrimuose FSGS tiriamieji nebuvo pagrindinis taikinys ir buvo laikomi kontroline liga. Reikia atlikti papildomus išilginius tyrimus, kad būtų galima nustatyti vertingesnius neinvazinius FSGS biomarkerius ankstyvo aptikimo, gydymo atsako ir prognozės kontekste.

7.1.4. Vilkligės nefritas

Lupus nefritas (LN), dažna sisteminės raudonosios vilkligės (SRV) pasekmė, yra susijusi su dideliu mirtingumu ir sergamumu. LN klasifikuojamas į šešias klases, remiantis histologiniais vaizdais ir dviem balų indeksais: aktyvumu ir chroniškumu. Šiuo metu LN diagnozei naudojama ne tik klinikinė, bet ir inkstų biopsija. Sudėtinga dalis yra gydymas, kuris visiškai skiriasi priklausomai nuo klasės ir aktyvumo bei chroniškumo rodiklių. Todėl kruopšti diagnozė yra labai svarbi gydymui. Be to, dabartiniai LN žymenys, tokie kaip proteinurija, kreatinino kiekis serume, kreatinino klirensas, komplemento lygis, anti-dsDNR ir antibranduoliniai antikūnai, nėra pakankamai jautrūs arba specifiški, todėl diagnozės, pagrįstos biopsija, kartais neįmanoma atlikti invaziniu būdu. Todėl reikia, kad kai kurie biomarkeriai, koreliuojantys su inkstų veikla, būtų naudojami diagnozuojant ligos klasę, anksti diagnozuojant prieš inkstų nepakankamumą ir prognozuojant bei atsakant. Proteominiais įrankiais aptikti šlapimo biomarkeriai yra tinkami kandidatai šiems klausimams išspręsti.

Šlapimo VCAM-1, CXCL16, P-selektinas ir TNFR-1 yra diagnostikos kandidatai, nustatyti ir patvirtinti ELISA metodu [93, 94]. Šlapimo monocitų chemotaktinis baltymas (MCP-1) ir TWEAK lygis buvo pasiūlyti kaip ligos aktyvumo rodiklis, taip pat naudojant ELISA [95, 96].

Transferino, ceruloplazmino aptikimas, α1-rūgštinis glikoproteinas (AGP), lipokalino tipo prostaglandino D-sintetazė (LPDGS), albuminas ir su albuminu susiję fragmentai vaikų, sergančių vilklige nefritu, šlapime, naudojant MALDI-TOF, yra vienas iš geriausių tyrimų, kuriuos atliko Suzuki ir kt. . [94]. Svarbūs šios ataskaitos punktai buvo šių kandidatų koreliacija su ligos aktyvumu ir kai kurių iš jų (pvz., transferino, AGP ir L-PDGS) lygio padidėjimas prieš klinikinius ligos paūmėjimo simptomus. Apie kitus kandidatus, apie kuriuos buvo pranešta kaip prognozuojamus paūmėjimo žymenis, vėliau pranešė Lee ir kt. naudojant SELDI-TOF [97]. Jie nustatė padidėjusį hepcidino 20 ir albumino fragmento (N-galo sritis) išsiskyrimą keturis mėnesius iki paūmėjimo ir sumažėjusį hepcidino 25 išsiskyrimą paūmėjimo metu. Šią techniką taip pat naudojo Mosley ir kt. už pacientų, sergančių aktyvia ir neaktyvia vilkligės nefrito formomis, diskriminaciją [98]. Baltymai, kurių masė yra 3340 ir 3980, buvo skirtingai išskiriami tarp šių dviejų formų, kurios nebuvo toliau identifikuotos.

Klasikinė 2D elektroforezė, po kurios MALDI-TOF atliko Oates ir kt. parodė sąrašą kandidatų į diagnozę, kurios klasės ir lėtinės formos didžiausias jautrumas priklausė a-1 rūgštiniam glikoproteinui [99].

7.1.5. Membraninė nefropatija

Membraninė nefropatija (MN) priskiriama vienai iš dažniausiai pasitaikančių pirminių glomerulų ligų priežasčių, ypač suaugusiems [100]. MN yra specifinė inkstų autoimuninė liga, kurios metu cirkuliuojantys autoantikūnai (pvz., IgG4) jungiasi prie vidinio antigeno glomerulų podocituose (ty M-tipo fosfolipazės A2 receptoriaus 1 pirminėje MN formoje), sudaro imuninį kompleksą ir nusėda subepitelio srityje. bazinė membrana [101]. Todėl glomerulų bazinės membranos sustorėjimas dėl imuninių kompleksų nuosėdų yra histologinis požymis atliekant šviesos mikroskopiją [102]. Kaip ir kitos inkstų ligos, pagrindinė mokslininkų susidomėjimo MN šlapimo biomarkerių atradimu priežastis yra inkstų biopsijos invaziškumas ir galima rimtų komplikacijų rizika.

Klasikinis šlapimo mėginių, paimtų iš pasyvaus Heymann nefrito (PHN), imituojančio žmogaus membraninę nefropatiją, modelio, naudojant 2D-PAGE ir SYPRO Ruby dažymą, o po to MALDI-TOF-MS, tyrimas parodė galimų biomarkerių grupę [103]. Buvo paimti serijiniai šlapimo mėginiai 6 skirtingais laiko momentais po anti-Fx1A injekcijos. Signalizacijos keliai, glomerulų judėjimas ir glomerulų pralaidumo kontrolė labai pasikeitė ligos eigoje. Nepaisant gero dizaino, pakankamai techninių kopijų trūkumas gali būti laikomas silpna jų tyrimo vieta.

Neseniai atliktas šlapimo mikropūslelių, gautų iš idiopatinės membraninės nefropatijos (iMN), židinine segmentine glomeruloskleroze (FSGS) sergančių pacientų ir sveikų kontrolinių asmenų, gautų iš idiopatinės membraninės nefropatijos (iMN), ir sveikų kontrolinių asmenų, naudojant iTRAQ ženklinimo sistemą, tyrimas parodė, kad iMN grupėje lizosomų membranos baltymo-2 (LIMP-2) išsiskyrimas padidėjo dvigubai [104]. . Sujungti iTRAQ8plex mėginiai buvo frakcionuoti naudojant stiprių katijonų mainų (SCX) ir atvirkštinės fazės (RP) kolonėles ir analizuojami naudojant LTQ orbitrap masės spektrometrą. Glomerulinė LIMP-2 ekspresija buvo toliau tiriama naudojant imunofluorescencinį dažymą, kuris atitiko proteominius rezultatus.

Be biomarkerių svarbos greitai diagnozuojant šią ligą dėl didelio MSL dažnio MN pacientams (

40%) [105], taip pat labai svarbu nustatyti biologinius žymenis, nuspėjančius atsaką į gydymą. Mūsų žiniomis, vis dar nėra tyrimų naudojant įprastus proteominius įrankius (ty 2DE arba LC, susietus su masės spektrometrija), tačiau Irazabal ir kt. ištyrė ryšį tarp žinomų biomarkerių grupės su MN pacientų reagavimu į rituksimabą su Western blot ir ELISA [106]. Jie pasiūlė šlapimo IgG (mg/24 val.) kaip reikšmingą proteinurijos pokyčių pirmaisiais gydymo metais prognozuotoją, tuo tarpu dalinį IgG, alfa 1 mikroglobulino (U) išsiskyrimą su šlapimu.α1M) (mg/24 val.) ir šlapimo retinolį surišantis baltymas (URBP) (μg/24 val.) buvo atsako prognozės 12 mėnesių, bet ne 24 mėnesių.

Didelio našumo proteominių priemonių taikymas nustatant MN nuspėjamuosius biomarkerius yra perspektyvus metodas, kuriam reikia daugiau pastangų. Kai kurie šlapimo baltymų tyrimai, kuriais siekiama atrasti biologinius žymenis, pateikti 4 lentelėje.

), minimalių pokyčių liga (MCD) (

7.1.6. Ūminis inkstų pažeidimas

Ūminis inkstų pažeidimas (AKI) yra sudėtinga būklė, apimanti daugybę klinikinių apraiškų (pvz., padidėjęs kreatinino kiekis serume ir anurinis inkstų nepakankamumas) [107]. Šis sutrikimas pasižymi dideliu mirtingumu ir sergamumu, kuris dažniausiai paveikė sunkios būklės pacientus (pvz., pacientus, paguldytus į ICU) ir yra susijęs su staigiu inkstų funkcijos sutrikimu [108]. Šiuo metu klinikoje naudojami žymenys, tokie kaip kreatinino kiekis serume ir GFR sumažėjimas, nustatomi vėlai po inkstų pažeidimo. Todėl ankstyvų žymenų trūkumas, dėl kurio vėluojama pradėti veiksmingą gydymą, didelė mirtingumo rizika ir didelė ESRD rizika paaiškina skubų AKI biomarkerių, kuriuos būtų galima aptikti anksti ir neinvaziškai, poreikį. Be to, identifikavimo biomarkeriai gali padėti suprasti šios paslaptingos būklės mechanizmą. Tyrimų skaičius buvo atliktas naudojant šlapimo proteomiką, kuri apžvelgta taip (5 lentelė).

) iš ICU pacientų kaip mokymo rinkinys, AKI (

) iš ICU pacientų ir AKI (

Nguyen ir kt. atliko šešiasdešimties pacientų, kuriems buvo atliktas kardiopulmoninis šuntavimas (CPB), šlapimo mėginių proteominį tyrimą ir ištyrė šios grupės ūminį inkstų pažeidimą [109]. Šių pacientų šlapimo baltymų profilis, gautas naudojant SELDI-TOF-MS ir biomarkerius su m/z 28,5, 43 ir 66 kDa buvo pasiūlyta AKI prognozavimui praėjus 2 valandoms po CPB, kurių jautrumas ir specifiškumas yra 100%. Šis tyrimas davė daug žadančių rezultatų ir pabrėžė galimą SELDI-TOF taikymą tiriant pacientus, kuriems yra AKI rizika. Tolesnis šios grupės tyrimas su proteominiais metodais atskleidė, kad aprotininas yra AKI prognozuotojas, praėjus 2 valandoms po CPB pradžios, kurio jautrumas 92%, o specifiškumas 96% [110]. Metzger ir kt. atliko CE-MS analizę, kad nustatytų AKI prognozuojančius peptidus [111]. Jie pasiūlė 20 šlapimo polipeptidų, būdingų AKI, ir patvirtino juos dviejose nepriklausomose, aklose ICU ir skerspjūvio HSCT pacientų grupėse. Be to, jų siūlomi žymenys galėtų tiksliai aptikti AKI likus 5 dienoms iki kreatinino padidėjimo serume. Duomenys parodė per daug albumino peptidų, α-1-antitripsinas ir β-2-mikroglobulinas ir nepakankamas fibrinogeno kiekis α ir kolagenai 1α(I) ir 1α(III) fragmentai 91 % tikslumu.

Išsamų tyrimą dėl tyrimo plano atliko Aregger ir kt. pacientams, kuriems atliekamas planinis kardiopulmoninis šuntavimas [112]. Jie išanalizavo baltymų profilį taškiniuose šlapimo mėginiuose iš trisdešimt šešių pacientų prieš ir po CPB ir ištyrė AKI (pagal RIFLE kriterijus), naudodami 2D-DIGE ir MALDI-TOF-MS. Reguliuojami baltymai, palyginti su pacientais prieš ir po CPB, buvo su uždegimu arba kanalėlių disfunkcija susiję baltymai, o modifikuotas šlapimo albuminas, cinko-alfa-2-glikoproteinas (ZAG) ir adrenomedulliną surišančio baltymo fragmentas buvo susiję su AKI. Nepriklausoma grupė, kurią sudaro 23 pacientai, turintys ūminį inkstų pažeidimą, ir 45 pacientai be jų, buvo toliau tiriami dėl ZAG (nes jis buvo nemodifikuotas ir nesuskaidytas), naudojant Western blot ir ELISA. Teigiami jų tyrimo taškai buvo patvirtinimas nepriklausomoje grupėje dviem metodais (WB ir ELISA) ir išsamių pašalinimo kriterijų apibrėžimas, įskaitant didelį proteinurijos ir mikrohematurijos skaičių, lėtinę inkstų liga sergančius pacientus su mažu GFR, radiokontrastinių medžiagų ar nesteroidinių vaistų nuo uždegimo vartojimą. (NVNU), todėl reikia skubios operacijos.

Tolesnis šlapimo biomarkerių tyrimas buvo atliktas vėliau, didesnėje kohortoje, naudojant panašų metodą šios tyrimo grupės. Šešiasdešimt keturi sunkiai sergantys pacientai, iš kurių 52 sirgo AKI, buvo ištirti 2D-DIGE, kad būtų galima atskirti, o po to LC-ESI-MS/MS nustatyti diferencines dėmes [113]. Šiame tyrime, α- 1 mikroglobulinas, α-1 antitripsinas, apolipoproteinas D, kalretikulinas, katepsinas D, CD59, į insuliną panašus augimo faktorių surišantis baltymas 7 (IGFBP-7) ir su neutrofilų želatinaze susijęs lipokalinas (NGAL) buvo pasiūlyti kaip žymenys. IGFBP-7 ir NGAL buvo atrinkti tolesniam patvirtinimui naudojant ELISA nepriklausomoje patikros grupėje, kurią sudaro 28 pacientai, sergantys AKI, ir 12 kontrolinių pacientų be AKI.IGFBP-7 turėjo didesnį tikslumą prognozuojant inkstų baigtį jų kohortoje.

Naujausiame tyrime Bell ir kt. tyrė neinkstų faktorių ryšį su padidėjusiu biožymenų lygiu AKI naudojant ELISA [114]. Jie pranešė apie NGAL ir cistatiną C, du žinomus AKI biomarkerius, taip pat šlapimo [TIMP-2]

[IGFBP7] kaip prastos prognozės, kurios negalėjo numatyti AKI per 12–48 valandas ir gali būti paveiktos kitų veiksnių nei AKI. Ši išvada rodo, kad reikia daugiau tirti AKI nuspėjamuosius biomarkerius, nepaisant daugybės iki šiol atliktų tyrimų ir praktiškesnio bei tikslesnio tyrimo plano.

8. Specifinė šlapimo proteomų duomenų bazė

Kandidatų biožymenų, kurie buvo kruopščiai išgauti iš daugybės sudėtingų ir painių duomenų, naudojant tinkamus statistinius metodus, identifikavimas ir apibūdinimas yra svarbus žingsnis atliekant tipišką biomarkerių atradimo tyrimą. Tvirčiausių šlapimo baltymų žymenų identifikavimas pagerinamas naudojant duomenų bazes, būdingas šlapimo ir inkstų baltymams.

Šiuo metu yra keletas duomenų, skirtų žmogaus šlapimo proteomams. Daugelis šlapimo duomenų bazių yra pagrįstos identifikuotais baltymais, gautais iš triptinių peptidų, iš kurių MAPU [115] ir Sys-BodyFluid [116] yra labiau nurodyti. Kitos naudingos specifinės šlapimo duomenų bazės pateiktos 6 lentelėje.

Max Planck institutas pateikė proteomų duomenų bazę MAPU, kurią sudaro įvairūs šaltiniai, pvz., ašaros, šlapimas, sėklų skystis ir audiniai iš Homo sapiens ir Musculus musculus [115]. Šlapimo dalyje MAPU yra informacija apie 1543 baltymus, kurie buvo atskirti ir frakcionuoti naudojant vienmatį SDS-PAGE ir atvirkštinės fazės HPLC ir analizuojami naudojant LTQ-FT ir LTQ-Orbitrap esant p.p.m. tikslumas po virškinimo ir gelyje, ir tirpale. Verta pažymėti, kad maždaug pusė šių deponuotų baltymų yra membraniniai baltymai pagal genų ontologijos (GO) analizę.

Sys-BodyFluid yra išsami proteomų duomenų bazė, kurią sudaro 11 kūno skysčių proteomų, įskaitant šlapimą [116]. Šioje duomenų bazėje saugomi duomenys yra iš 50 skirtingų laboratorijų visame pasaulyje recenzuojamų publikacijų. Baltymų informacija ir anotacija yra aprašymas, genų ontologija, domeno informacija, baltymų seka ir dalyvaujantis kelias.

Mosaiques diagnostikos duomenų bazė žinoma kaip peptidomų šlapimo duomenų bazė, apimanti 13027 šlapimo mėginius, paimtus iš sergančių ir sveikų asmenų, gautus naudojant analitinę platformą CE-MS [117]. Kita šlapimo Mosaiques duomenų bazės dalis yra biomarkerių sekos informacija, gauta apie 953 peptidus, kurie yra kilę iš 116 skirtingų baltymų [115, 117].

Žmogaus šlapimo proteominių pirštų atspaudų duomenų bazė (UPdb) buvo sukurta 2013 m., naudojant 200 asmenų šlapimo mėginius, analizuotus SELDI-MS keliuose lustų paviršiuose (SEND, HP50, NP20, Q10, CM10 ir IMAC30). Duomenų bazėje yra 2490 unikalių smailių / jonų rūšių iš 1172 nereikalingų SELDI analizių, taip pat 1384 smailės iš išorinių tyrimų naudojant CE-MS, MALDI ir CE-MALDI hibridus. Duomenų bazėje pateikiama informacija, susijusi su MS aplinka, subfrakcionavimo metodais, chromatografijos nustatymais, tirtomis ligomis, identifikuotu biomarkeriu, statistine informacija ir identifikuotais baltymais.

9. Išvada

Šlapimas yra vertingas molekulių šaltinis, galintis būti diagnostiniais žymenimis, ypač sergant inkstų ligomis. Šlapimo stiprumas, palyginti su plazmos ir audinių mėginiais, yra neinvazinė surinkimo procedūra ir mažiau sudėtingas baltymų kiekis. Dėl biopsija pagrįstos diagnostikos komplikacijų (t. y. invaziškumo, diagnozės priklausomybės nuo patologo takto ir stebėjimo, apribojimų dėl infekcijos, hipertenzijos ir inkstų dydžio) šlapimo biomarkeriai yra saugus ir patikimas alternatyvus diagnozavimo būdas šalia tradicinės biopsijos. Be to, dėl neriboto mėginio kiekio paėmimo metu ir santykinai stabilaus peptidų ir baltymų kiekio dėl visiško endogeninių proteazių proteolitinio proceso, vykstančio laikymo šlapimo pūslėje, šlapimas yra idealus mėginys biomarkerių tyrimams. Kadangi šlapimo baltymai daugiausia kilę iš inkstų audinio (

70%) (likę 30% gaunami iš plazmos), todėl šlapimas yra tinkamiausias mėginys biožymenų atradimui sergant inkstų ligomis, urogenitaliniu taku ir kraujagyslių sistema.

Tačiau molekuliniai biomarkeriai dar netapo praktiški klinikose ir buvo daug bandymų patvirtinti šiuos molekulinius žymenis. Proteominiai metodai, be pažangios statistinės analizės ir bioinformatikos žinių, yra universalūs šlapimo biomarkerių atradimo įrankiai. Tikimasi, kad analitinių įrankių ir programinės įrangos programų pažanga, taip pat tikslus tyrimo planas artimiausioje ateityje pagerins turimų biomarkerių jautrumą ir specifiškumą.

Santrumpos

IgA:Imunoglobulinas A
2D:Dvimatis
2DE-MS:Dvimatė gelio elektroforezė, po kurios atliekama masės spektrometrija
LC-MS:Skysčių chromatografija, sujungta su masės spektrometrija
CE-MS:Kapiliarinė elektroforezė, sujungta su masės spektrometrija
2D-DIGE:Dviejų dimensijų skirtumo gelio elektroforezė
LC:Skysčių chromatografija
SCX:Stipri katijonų mainų kolonėlė
FTICR:Furjė transformacijos jonų ciklotrono rezonansas
SELDI-TOF:Paviršiaus pagerinta lazerio desorbcijos / jonizacijos skrydžio laikas
DN:Diabetinė nefropatija
MA:Mikroalbuminurija
THP:Tamm-Horse rudens šlapimo glikoproteinas
ZA2G:cinkas-α- 2 glikoproteinai
IgAN:IgA nefropatija
IGFBP7:Į insuliną panašus augimo faktorių jungiantis baltymas 7
TEC:Vamzdinė epitelio ląstelė
LN:Lupus nefritas
SLE:Sisteminė raudonoji vilkligė
MCP-1:Monocitų chemotaktinis baltymas
AGP:α1-rūgštinis-glikoproteinas
LPDGS:Lipokalino tipo prostaglandinų D-sintetazė
CVD:Širdies ir kraujagyslių ligos
CAD:Vainikinių arterijų liga
HF:Širdies nepakankamumas
NCD:Nekardialiniu dusuliu sergantys pacientai
CHF:Lėtinis širdies nepakankamumas
AHF:Ūminis širdies nepakankamumas
IGFBP2:Į insuliną panašus augimo faktorių surišantis baltymas 2
NF-κB:Branduolinis faktorius

Atskleidimas

Autoriai A. Jafari, R. Moradpoor, E. Ghasemi ir E. Khalkhal yra mokslų daktarai. taikomosios proteomikos studentai. S. Kalantari yra Teherano Shahid Beheshti medicinos mokslų universiteto lėtinių inkstų ligų tyrimų centro docentas.

Interesų konfliktas

Dėl šio dokumento publikavimo nėra konkuruojančių interesų.

Autorių indėlis

R. Moradpoor, A. Jafari, E. Ghasemi ir E. Khalkhal vienodai prisidėjo prie šio darbo rašymo ir duomenų tyrimo. S. Kalantari prisidėjo prie referato sumanymo, dizaino, rašymo ir leidimo. Visi autoriai perskaitė ir patvirtino baigiamąjį darbą.

Pripažinimas

Autoriai yra dėkingi Lėtinių inkstų ligų tyrimų centrui už pagalbą ir paramą.

Nuorodos

  1. J. Adachi, C. Kumar, Y. Zhang, J. V. Olsen ir M. Mann, „Žmogaus šlapimo proteomuose yra daugiau nei 1500 baltymų, įskaitant didelę membraninių baltymų dalį“. Genomo biologija, t. 7, straipsnis R80, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  2. H. Husi, N. Stephens, A. Cronshaw ir kt., „Proteominė šlapimo viršutinės virškinimo trakto dalies vėžio žymenų analizė“, PROTEOMIKA—Klinikiniai pritaikymai, t. 5, Nr. 5–6, p. 289–299, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  3. V. C. Wasinger, M. Zeng ir Y. Yau, „Dabartinė padėtis ir pažanga kiekybinėje proteominėje masės spektrometrijoje“, Tarptautinis proteomikos žurnalas, t. 2013, Straipsnio ID 180605, 12 puslapių, 2013. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | Google Scholar
  4. D. M. Good, V. Thongboonkerd, J. Novak ir kt., „Kūno skysčių proteomika biomarkerių atradimui: praeities pamokos yra raktas į sėkmę ateityje“, Proteome tyrimų žurnalas, t. 6, Nr. 12, p. 4549–4555, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  5. S. Cui, P. J. Verroust, S. K. Moestrup ir E. I. Christensen, „Megalin/gp330 tarpininkauja albumino įsisavinimui proksimaliniuose inkstų kanalėliuose“, American Journal of Physiology— Inkstų skysčių ir elektrolitų fiziologija, t. 271, Nr. 4, p. F900–F907, 1996. Žiūrėti: Google Scholar
  6. T. Pisitkun, R.-F. Shen ir M. A. Knepper, „Žmogaus šlapimo egzosomų identifikavimas ir proteominis profiliavimas“, Jungtinių Amerikos Valstijų nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 101, Nr. 36, p. 13368–13373, 2004. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  7. A. Castagna, D. Cecconi, L. Sennels ir kt., „Paslėpto žmogaus šlapimo proteomo tyrinėjimas per ligandų bibliotekos granules“, Proteome tyrimų žurnalas, t. 4, Nr. 6, p. 1917–1930, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  8. R. Pieper, C. L. Gatlin, A. M. McGrath ir kt., „Žmogaus šlapimo proteomo apibūdinimas: metodas, skirtas didelės skiriamosios gebos šlapimo baltymams rodyti dvimačiuose elektroforezės geliuose su beveik 1400 skirtingų baltymų dėmių“ Proteomika, t. 4, Nr. 4, p. 1159–1174, 2004. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  9. W. Sun, F. Li, S. Wu ir kt., „Žmogaus šlapimo proteomų analizė trimis atskyrimo metodais“, Proteomika, t. 5, Nr. 18, p. 4994–5001, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  10. L. Wang, F. Li, W. Sun ir kt., „Concanavalin A užfiksuoti glikoproteinai sveiko žmogaus šlapime“, Molekulinė ir ląstelių proteomika, t. 5, Nr. 3, p. 560–562, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  11. M. Ożgo, W. F. Skrzypczak, A. Herosimczyk ir A. Mazur, „Proteomika a fizjologia i patofizjologia nerek“, MedWet, t. 63, p. 1146–1150, 2007. Žiūrėti: Google Scholar
  12. B. Haraldsson ir J. Sörensson: „Kodėl mes visi neturime proteinurijos? Mūsų dabartinio supratimo apie glomerulų barjerą atnaujinimas. Fiziologijos mokslų naujienos, t. 19, Nr. 1, p. 7–10, 2004. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  13. A. B. Maunsbachas, „I125 pažymėto homologinio albumino absorbcija žiurkės inkstų proksimalinėse kanalėlių ląstelėse. Mikroperfuzuotų pavienių proksimalinių kanalėlių tyrimas elektronų mikroskopine autoradiografija ir histochemija, 1966 m. Amerikos nefrologijos draugijos žurnalas, t. 8, Nr. 2, p. 323–351, 1997. Žiūrėti: Google Scholar
  14. M. J. Burne, T. M. Osicka ir W. D. Comper, „Didelės molekulinės masės baltymų frakcijinis klirensas sąmoningose ​​žiurkėse, naudojant nuolatinės infuzijos metodą“, Kidney International, t. 55, Nr. 1, p. 261–270, 1999. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  15. V. Batumanas, P. J. Verroustas, G. L. Navaras ir kt., „Mielomos lengvosios grandinės yra kubilino (gp280) ligandai“ American Journal of Physiology—Inkstų fiziologija, t. 275, Nr. 2, p. F246–F254, 1998. Žiūrėti: Google Scholar
  16. E. I. Christensen ir J. Gburek „Baltymų reabsorbcija proksimaliniuose inkstų kanalėliuose, 2014 m. funkcija ir disfunkcija inkstų patofiziologijoje“, Vaikų nefrologija, t. 19, Nr. 7, p. 714–721, 2004. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  17. M. Afkarian, M. Bhasin, S. T. Dillon ir kt., „Proteomikos platformos optimizavimas šlapimo biomarkerių atradimui“, Molekulinė ir ląstelių proteomika, t. 9, Nr. 10, p. 2195–2204, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  18. J. Peng ir S. P. Gygi, „Proteomika: perėjimas prie mišinių“, Masės spektrometrijos žurnalas, t. 36, Nr. 10, p. 1083–1091, 2001. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  19. V. Thongboonkerd, „Proteomika nefrologijoje: dabartinė padėtis ir ateities kryptys“, Amerikos nefrologijos žurnalas, t. 24, Nr. 3, p. 360–378, 2004. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  20. A. Marimuthu, R. N. O'Meally, R. Chaerkady ir kt., „Išsamus žmogaus šlapimo proteomo žemėlapis“, Proteome tyrimų žurnalas, t. 10, Nr. 6, p. 2734–2743, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  21. Q.-R. Li, K.-X. Ventiliatorius, R.-X. Li ir kt., „Išsamus ir nežmogaus šlapimo proteomo išankstinis frakcionavimas pagal baltymų lygio metodą: paliečiantis fosforilinimą šlapime. Greita komunikacija masės spektrometrijoje, t. 24, Nr. 6, p. 823–832, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  22. P. A. Gonzales, T. Pisitkun, J. D. Hoffert ir kt., „Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes“, Amerikos nefrologijos draugijos žurnalas, t. 20, Nr. 2, p. 363–379, 2009. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  23. A. Khan ir N. H. Packer, „Paprastas šlapimo mėginio paruošimas proteominei analizei“, Proteome tyrimų žurnalas, t. 5, Nr. 10, p. 2824–2838, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  24. V. Thongboonkerd, S. Chutipongtanate ir R. Kanlaya, „Sisteminis mėginių paruošimo metodų vertinimas gelio pagrindu veikiančiai žmogaus šlapimo proteomikai: kiekis, kokybė ir kintamumas“, Proteome tyrimų žurnalas, t. 5, Nr. 1, p. 183–191, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  25. G. Gopalan, V. S. Rao ir V. V. Kakar, „Šlapimo proteomikos taikymo žmonių ligų atveju apžvalga“, International Journal of High Throughput Screening, t. 1, p. 183–192, 2010. Žiūrėti: Google Scholar
  26. H.-Y. Tang, L. A. Beer ir D. W. Speicher, „Išsami plazmos arba serumo proteomo analizė naudojant 4D baltymų profiliavimo metodą“, Molekulinės biologijos metodai, t. 728, p. 47–67, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  27. N. S. Vasudev, R. E. Ferguson, D. A. Cairns, A. J. Stanley, P. J. Selby ir R. E. Banks, „Serumo biomarkerio atradimas sergant inkstų vėžiu, naudojant 2-DE ir prefrakciją imunodepletijos būdu ir izoelektriniu fokusavimu, didinant aprėptį ar daugiau? Proteomika, t. 8, Nr. 23–24, p. 5074–5085, 2008. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  28. C.-L. Chen, T.-S. Linas, C.-H. Tsai ir kt., „Galimų šlapimo pūslės vėžio žymenų nustatymas šlapime dėl gausaus baltymų išeikvojimo kartu su kiekybine proteomika“. Proteomikos žurnalas, t. 85, p. 28–43, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  29. S. Filip, K. Vougas, J. Zoidakis ir kt., „Mažo baltymų kiekio šlapime praturtinimo išeikvojimo strategijų palyginimas“, PLoS ONE, t. 10, Nr. 7, Straipsnio ID e0133773, 2015. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  30. CM. Lu, Y.-J. Wu, C.-C. Chen ir kt., „Mažo baltymų kiekio nustatymas frakcionuojant šlapimo proteomą naudojant silpną anijonų mainų chromatografiją“, Proteomo mokslas, t. 9, 17 straipsnis, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  31. S. A. Beausoleil, M. Jedrychowski, D. Schwartz ir kt., „HeLa ląstelių branduolinių fosfoproteinų didelio masto apibūdinimas“, Jungtinių Amerikos Valstijų nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 101, Nr. 33, p. 12130–12135, 2004. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  32. V. Thongboonkerd, T. Semangoen ir S. Chutipongtanate, „Bazinio/katijoninio šlapimo proteomo sodrinimas naudojant jonų mainų chromatografiją ir paketinę adsorbciją“, Proteome tyrimų žurnalas, t. 6, Nr. 3, p. 1209–1214, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  33. M. M. Kushnir, P. Mrozinski, A. L. Rockwood ir D. K. Crockett, „Išeikvojimo strategija, skirta geresniam žmogaus baltymų aptikimui iš šlapimo“, Biomolecular Techniques žurnalas, t. 20, Nr. 2, p. 101–108, 2009. Žiūrėti: Google Scholar
  34. V. Thongboonkerd, „Dabartinė inkstų ir šlapimo proteomikos būklė: paruošta įprastiniam klinikiniam naudojimui“, Nefrologija Dializė Transplantacija, t. 25, Nr. 1, p. 11–16, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  35. S. Decramer, A. G. de Peredo, B. Breuil ir kt., „Šlapimas klinikinėje proteomikoje“ Molekulinė ir ląstelių proteomika, t. 7, Nr. 10, p. 1850–1862, 2008. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  36. J. Jia ir L. Zhang, „Proteomikos tyrimų ir taikymo pažanga“, Žurnalas „Animal and Veterinary Advances“., t. 11, Nr. 20, p. 3812–3817, 2012. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  37. H. Dihazi, „Šlapimo proteomika: įrankis atrasti naujus ir stiprius inkstų pažeidimo biomarkerius“, Tarptautinės klinikinės chemijos ir laboratorinės medicinos federacijos žurnalas, t. 20, Nr. 1, p. 82–91, 2009. Žiūrėti: Google Scholar
  38. J. M. González-Buitrago, L. Ferreira ir I. Lorenzo, „Šlapimo proteomika“, Clinica Chimica Acta, t. 375, Nr. 1-2, p. 49-56, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  39. M. M. Camacho-Carvcajal, B. Wollscheid, R. Aebersold, V. Steimle ir W. W. A. ​​Schamelis, „Dviejų dimensijų mėlyna vietinė / SDS gelio elektroforezė kelių baltymų kompleksams iš visų ląstelių lizatų: proteomikos metodas“, Molekulinė ir ląstelių proteomika, t. 3, Nr. 2, p. 176–182, 2004. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  40. I. Neverova ir J. E. Van Eyk, „Chromatografijos metodų vaidmuo proteominėje analizėje“, Žurnalas „Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences“., t. 815, Nr. 1-2, p. 51-63, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  41. T. Niwa, „Inkstų ligų biologinių žymenų atradimas masės spektrometrijos metodu“, Chromatografijos žurnalas B, t. 870, Nr. 2, p. 148–153, 2008. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  42. M. G. Janech, J. R. Raymond ir J. M. Arthur, „Proteomika inkstų tyrime“, Amerikos fiziologijos žurnalas—Inkstų fiziologija, t. 292, Nr. 2, p. F501–F512, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  43. P. Rossingas, „Kintanti diabetinės mikroangiopatijos epidemiologija sergant 1 tipo cukriniu diabetu“, Diabetologija, t. 48, Nr. 8, p. 1439–1444, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  44. G. Soldatos ir M. E. Cooper, „Diabetinė nefropatija: svarbūs patofiziologiniai mechanizmai“, Diabeto tyrimai ir klinikinė praktika, t. 82, Nr. 1, p. S75–S79, 2008. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  45. A. Soggiu, C. Piras, L. Bonizzi, H. A. Hussein, S. Pisanu ir P. Roncada, „Atradimo fazės šlapimo proteomikos tyrimas 1 tipo diabetu“, Acta Diabetologica, t. 49, Nr. 6, p. 453–464, 2012. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  46. S. Kalantari, D. Rutishauser, S. Samavat ir kt., „Šlapimo prognozės biomarkeriai ir IgA nefropatijos klasifikavimas didelės skiriamosios gebos masės spektrometrija ir skysčių chromatografija“, PLoS ONE, t. 8, Nr. 12, Straipsnio ID e80830, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  47. B. Xin, D. Pu, S. X. Xiong ir G. H. Wang, „On-line atskyrimas ir peptidų aptikimas naudojant kapiliarinę elektroforezę / elektropurškimą FT-ICR-MS“, Kinijos cheminės raidės, t. 14, p. 191–194, 2003. Žiūrėti: Google Scholar
  48. D. Fliser, J. Novak, V. Thongboonkerd ir kt., „Pažanga šlapimo proteomų analizėje ir biomarkerių atradimas“, Amerikos nefrologijos draugijos žurnalas, t. 18, Nr. 4, p. 1057–1071, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  49. Z. Liu, Z. Yuan ir Q. Zhao, „SELDI-TOF-MS proteominis serumo, šlapimo ir amniono skysčio profiliavimas nervinio vamzdelio defektuose“, PLoS ONE, t. 9, Nr. 7, Straipsnio ID e103276, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  50. J. Siwy, A. Vlahou, L. U. Zimmerli, P. Zürbig ir E. Schiffer, „Klinikinė proteomika: dabartiniai metodai ir galimi pritaikymai vyresnio amžiaus žmonėms“, Maturitas, t. 68, Nr. 3, p. 233–244, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  51. H. Mischak, E. Schiffer, P. Zürbig, M. Dakna ir J. Metzger, „Šlapimo proteomų analizė naudojant kapiliarinę elektroforezę kartu su masės spektrometrija: galinga klinikinės diagnostikos, prognozės ir terapijos vertinimo priemonė“, Medicinos biochemijos žurnalas, t. 28, Nr. 4, p. 223–234, 2009. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  52. G. A. Müller, C. A. Müller ir H. Dihazi, „Klinikinė proteomika— ilgame kelyje nuo suolo iki lovos? Nefrologija Dializė Transplantacija, t. 22, Nr. 5, p. 1297–1300, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  53. A. Albalat, H. Mischak ir W. Mullen, „Šlapimo proteomika klinikinėse programose: technologijos, pagrindiniai svarstymai ir klinikinis įgyvendinimas“, Prilozi, t. 32, p. 44–45, 2011. Žiūrėti: Google Scholar
  54. M. M. Nilsenas, K.-E. Ulebergas, E. A. M. Janssenas, J. P. A. Baak, O. K. Andersenas ir A. Hjelle, „Nuo SELDI-TOF MS iki baltymų identifikavimo naudojant lustą“, Proteomikos žurnalas, t. 74, Nr. 12, p. 2995–2998, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  55. C. Ibá༞z, C. Simó, V. Garc໚-Ca༚s, A. Cifuentes ir M. Castro-Puyana, „Metabolomika, peptidomika ir proteomikos taikymas kapiliarinės elektroforezės-masės spektrometrijoje maisto masių spektrometrijoje : apžvalga," Analytica Chimica Acta, t. 802, p. 1–13, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  56. H. Mischak, J. J. Coon, J. Novak, E. M. Weissinger, J. P. Schanstra ir A. F. Dominiczak, „Kapiliarinė elektroforezės-masės spektrometrija kaip galingas įrankis biomarkerių atradimui ir klinikinei diagnostikai: naujausių pokyčių atnaujinimas“, Masės spektrometrijos apžvalgos, t. 28, Nr. 5, p. 703–724, 2009. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  57. J. Wu, Y.-D. Chen ir W. Gu, „Šlapimo proteomika kaip nauja priemonė biomarkerių atradimui sergant inkstų ligomis“, Džedziango universiteto žurnalas: Science B, t. 11, Nr. 4, p. 227–237, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  58. C. Simó, A. Cifuentes ir V. Kašička, „Kapiliarinė elektroforezės-masės spektrometrija peptidų analizei: taikiniais pagrįsti metodai ir proteomikos / peptidomikos strategijos“, Molekulinės biologijos metodai, t. 984, p. 139–151, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  59. S. Hu, J. A. Loo ir D. T. Wong, „Žmogaus kūno skysčio proteomų analizė“, Proteomika, t. 6, Nr. 23, p. 6326–6353, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  60. P. Dໞz, N. Dasilva, M. González-González ir kt., „Baltymų mikrogardelių duomenų analizės strategijos“, Mikroschemos, t. 1, p. 64–83, 2012. Žiūrėti: Google Scholar
  61. R. Chen ir M. Snyder, „Mielių proteomika ir baltymų mikrogardelės“, Proteomikos žurnalas, t. 73, Nr. 11, p. 2147–2157, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  62. W. Ruige ir Y. S. Fung, „Mikroskysčių lustų ir kapiliarų elektroforezės prietaisas, skirtas šlapimo metabolitų ir baltymų nustatymui“, Bioanalizė, t. 7, p. 907–922, 2015. Žiūrėti: Google Scholar
  63. W. P. Guo, Z. B. Rong, Y. H. Li, Y. S. Fung, G. Q. Gao ir Z. M. Cai, „Mikrofluidinė lusto kapiliarinė elektroforezė kartu su elektrochemiliuminescencija, skirta raceminių vaistų enantioseparacijai naudojant centrinį kompozicinio dizaino optimizavimą“. Elektroforezė, t. 34, Nr. 20–21, p. 2962–2969, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  64. C.-C. Linas, C.-C. Tseng, T.-K. Chuang, D.-S. Lee ir G.-B. Lee, „Šlapimo analizė mikrofluidiniuose prietaisuose“, Analitikas, t. 136, Nr. 13, p. 2669–2688, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  65. J. R. Wiśniewski, A. Zougman, N. Nagaraj ir M. Mann, „Universalus mėginio paruošimo metodas proteomų analizei“, Gamtos metodai, t. 6, Nr. 5, p. 359–362, 2009. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  66. Y. Yu, M.-J. Suh, P. Sikorski, K. Kwon, K. E. Nelson ir R. Pieper, „Šlapimo mėginio paruošimas 96 šulinėlių filtravimo plokštelėse kiekybinei klinikinei proteomikai“, Analitinė chemija, t. 86, Nr. 11, p. 5470–5477, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  67. Y. Lyutvinskiy, H. Yang, D. Rutishauser ir R. A. Zubarev: „In silico instrumentinė atsako korekcija pagerina proteomikos be etikečių tikslumą ir proteomika pagrįstų nuspėjimo modelių tikslumą“, Molekulinė ir ląstelių proteomika, t. 12, Nr. 8, p. 2324–2331, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  68. S. Samavat, S. Kalantari, M. Nafar ir kt., „Diagnostic šlapimo proteomų profilis imunoglobulino ir nefropatijos atveju“, Irano inkstų ligų žurnalas, t. 9, p. 239–248, 2015. Žiūrėti: Google Scholar
  69. S. Kalantari, M. Nafar, D. Rutishauser ir kt., „Prognozuojami šlapimo biomarkeriai, skirti steroidams atspariai ir steroidams jautriai židininei segmentinei glomerulosklerozei, naudojant didelės skiriamosios gebos masės spektrometriją ir daugiamatę statistinę analizę“, BMC nefrologija, t. 15, Nr. 1, straipsnis 141, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  70. S. Kalantari, M. Nafar, S. Samavat, M. Rezaei-Tavirani, D. Rutishauser ir R. Zubarev, „Šlapimo prognostiniai biomarkeriai pacientams, sergantiems židinine segmentine glomeruloskleroze“, Nefro-urologijos mėnesinis, t. 6, Nr. 2, Straipsnio ID e16806, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  71. M. Nafaras, S. Kalantari, S. Samavatas, M. Rezaei-Tavirani, D. Rutishuseris ir R. A. Zubarevas, „Nauji židininės segmentinės glomerulosklerozės diagnostiniai biomarkeriai“, Tarptautinis nefrologijos žurnalas, t. 2014, Straipsnio ID 574261, 10 puslapių, 2014. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | Google Scholar
  72. J. Cox, M. Y. Hein, C. A. Luber, I. Paron, N. Nagaraj ir M. Mann, „Tikslus proteomo masto kiekybinis nustatymas be etiketės, naudojant uždelstą normalizavimą ir maksimalaus peptidų santykio ekstrakciją, vadinamas MaxLFQ“, Molekulinė ir ląstelių proteomika, t. 13, Nr. 9, p. 2513–2526, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  73. K. A. Neilson, N. A. Ali, S. Muralidharan ir kt., „Mažiau etikečių, daugiau laisvų: kiekybinės masės spektrometrijos be etikečių metodai“, Proteomika, t. 11, Nr. 4, p. 535–553, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  74. S. Nahnsen, C. Bielow, K. Reinert ir O. Kohlbacher, „Peptidų kiekio nustatymo be etiketės įrankiai“, Molekulinė ir ląstelių proteomika, t. 12, Nr. 3, p. 549–556, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  75. L. Su, R. Zhou, C. Liu ir kt., „Sepsio biomarkerių šlapimo proteomikos analizė naudojant iTRAQ žymėjimą ir dvimatę skysčių chromatografijos tandeminę masės spektrometriją“, Traumos ir ūminės pagalbos chirurgijos žurnalas, t. 74, Nr. 3, p. 940–945, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  76. M. T. Davis, C. S. Spahr, M. D. McGinley ir kt., „Šlapimo proteomo apibrėžimas naudojant skysčių chromatografijos tandeminę masių spektrometriją II. Sudėtingų mišinių analizės apribojimai. Proteomika, t. 1, Nr. 1, p. 108–117, 2001. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  77. H. Mischak, J. P. A. Ioannidis, A. Argiles ir kt., „Proteominių biomarkerių įgyvendinimas: kad tai veiktų“, Europos klinikinių tyrimų žurnalas, t. 42, Nr. 9, p. 1027–1036, 2012. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  78. B. Jimas, M. Ghanta, A. Qipo ir kt., „Nereguliuojamas nefrinas sergant 2 tipo diabeto diabetine nefropatija: skerspjūvio tyrimas“, PLoS ONE, t. 7, Nr. 5, Straipsnio ID e36041, 2012. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  79. P. Zürbig, G. Jerums, P. Hovind ir kt., „Šlapimo proteomika ankstyvai diabetinės nefropatijos diagnostikai“ Diabetas, t. 61, Nr. 12, p. 3304–3313, 2012. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  80. A. Lewandowicz, M. Bakun, R. Kohutnicki ir kt., „Šlapimo proteomų pokyčiai, lydintys diabetinės nefropatijos progresavimą“, Polskie Archiwum Medycyny Wewnetrznej, t. 125, p. 27–38, 2015. Žiūrėti: Google Scholar
  81. J. Barratt ir J. Feehally, „IgA nefropatija“, Amerikos nefrologijos draugijos žurnalas, t. 16, Nr. 7, p. 2088–2097, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  82. B. A. Julian, S. Wittke, M. Haubitz ir kt., „IgA nefropatijos ir kitų su IgA susijusių inkstų ligų šlapimo biomarkeriai“, Pasaulio urologijos žurnalas, t. 25, Nr. 5, p. 467–476, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  83. M. T. Rocchetti, M. Papale, A. M. d'Apollo ir kt., „Šlapimo laminino G tipo 3 ir laisvųjų K lengvųjų grandinių susiejimas su ligos aktyvumu ir histologiniu pažeidimu IgA nefropatijoje“, Amerikos nefrologijos draugijos klinikinis žurnalas, t. 8, Nr. 7, p. 1115–1125, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  84. B. A. Julian, S. Wittke, J. Novak ir kt., „Elektroforetiniai šlapimo polipeptidų analizės metodai sergant su lgA susijusiomis inkstų ligomis“, Elektroforezė, t. 28, Nr. 23, p. 4469–4483, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  85. S. Zhao, R. Li, X. Cai ir kt., "SILAC pelės taikymas žmogaus kūno skysčių proteomikos analizėje atskleidžia baltymų modelius, susijusius su IgA nefropatija". Įrodymais pagrįsta papildoma ir alternatyvi medicina, t. 2013, Straipsnio ID 275390, 10 puslapių, 2013. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | Google Scholar
  86. K. Mucha, M. Bakun, R. Jaźwiec ir kt., „Šlapimo proteomikoje aptikti komplementų komponentai, su proteolize susiję ir su ląstelėmis susiję baltymai yra susiję su IgA nefropatija“, Polskie Archiwum Medycyny Wewnetrznej, t. 124, Nr. 7-8, p. 380-386, 2014. Žiūrėti: Google Scholar
  87. V. D. D'Agati, F. J. Kaskel ir R. J. Falk, „Židinio segmentinė glomerulosklerozė“, Naujosios Anglijos medicinos žurnalas, t. 365, Nr. 25, p. 2398–2411, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  88. B. Bose ir D. Cattran, „Glomerulinės ligos: FSGS“, Amerikos nefrologijos draugijos klinikinis žurnalas, t. 9, Nr. 3, p. 626–632, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  89. C. Kitiyakara, J. B. Kopp ir P. Eggers, „Židinio segmentinės glomerulosklerozės epidemiologijos tendencijos“, Nefrologijos seminarai, t. 23, Nr. 2, p. 172–182, 2003. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  90. H.-A. Shui, T.-H. Huangas, S.-M. Ka, P.-H. Chen, Y.-F. Lin ir A. Chen, „Šlapimo proteomas ir galimi biomarkeriai, susiję su židininės segmentinės glomerulosklerozės serijos patogenezės etapais“, Nefrologija Dializė Transplantacija, t. 23, Nr. 1, p. 176–185, 2008. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  91. R. P. Woroniecki, T. N. Orlova, N. Mendelevas ir kt., „Vaikystės steroidams jautraus ir steroidams atsparaus idiopatinio nefrozinio sindromo šlapimo proteomas“, Amerikos nefrologijos žurnalas, t. 26, Nr. 3, p. 258–267, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  92. M. Zhao, M. Li, X. Li, C. Shao, J. Yin ir Y. Gao, „Dinaminiai šlapimo baltymų pokyčiai židinio segmentinės glomerulosklerozės žiurkės modelyje“ Proteomo mokslas, t. 12, 42 straipsnis, 2014. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | Google Scholar
  93. T. Wu, C. Xie, H. W. Wang ir kt., „Padidėjęs šlapimo VCAM-1, P-selektino, tirpaus TNF receptoriaus-1 ir CXC chemokino ligando 16 kiekis daugelyje pelių vilkligės padermių ir žmogaus vilkligės nefrito“, Imunologijos žurnalas, t. 179, Nr. 10, p. 7166–7175, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  94. M. Suzuki, K. Wiers, E. B. Brooks ir kt., „Pradinis naujos baltymų biomarkerių grupės patvirtinimas aktyviam vaikų vilkligės nefritui“, Pediatriniai tyrimai, t. 65, Nr. 5, p. 530–536, 2009. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  95. R. F. Rosa, K. Takei, N. C. Araújo, S. M. A. Loduca, J. C. M. Szajubok ir W. H. Chahade, „Monocitų chemoatraktantas-1 kaip šlapimo biomarkeris diagnozuojant vilkligės nefrito aktyvumą Brazilijos pacientams“. Reumatologijos žurnalas, t. 39, Nr. 10, p. 1948–1954, 2012. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  96. Z. Xuejing, T. Jiazhen, L. Jun, X. Xiangqing, Y. Shuguang ir L. Fuyou, „Šlapimo TWEAK lygis kaip vilkligės nefrito aktyvumo žymuo 46 atvejais“, Biomedicinos ir biotechnologijų žurnalas, t. 2012, Straipsnio ID 359647, 7 puslapiai, 2012. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | Google Scholar
  97. P. Lee, H. Peng, T. Gelbart, L. Wang ir E. Beutler, „Hepcidino transkripcijos reguliavimas interleukinu-1 ir interleukinu-6“, Jungtinių Amerikos Valstijų nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 102, Nr. 6, p. 1906–1910, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  98. K. Mosley, F. W. K. Tam, R. J. Edwards, J. Crozier, C. D. Pusey ir L. Lightstone, „Šlapimo proteominiai profiliai išskiria aktyvų ir neaktyvų vilkligės nefritą“, Reumatologija, t. 45, Nr. 12, p. 1497–1504, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  99. J. C. Oates, S. Varghese, A. M. Bland ir kt., „Šlapimo baltymų žymenų numatymas sergant vilkligės nefritu“, Kidney International, t. 68, Nr. 6, p. 2588–2592, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  100. W. Sui, R. Zhang, J. Chen ir kt., „Membraninės nefropatijos biopsijos audinių lyginamoji proteominė analizė naudojant kiekybinę proteomiką“, Eksperimentinė ir terapinė medicina, t. 9, Nr. 3, p. 805–810, 2015. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  101. L. H. Beckas jaunesnysis ir D. J. Salantas, „Membraninė nefropatija: formuoja modelius žmogui“, Klinikinių tyrimų žurnalas, t. 124, Nr. 6, p. 2307–2314, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  102. L. H. Beckas jaunesnysis ir D. J. Salantas, „Membraninė nefropatija: naujausios kelionės ir nauji keliai ateityje“, Kidney International, t. 77, Nr. 9, p. 765–770, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  103. H. H.-Y. Ngai, W.-H. Sėdi, P.-P. Jiang, R.-J. Xu, J. M.-F. Wan ir V. Thongboonkerd, „Membraninės nefropatijos šlapimo proteomų profilio serijiniai pokyčiai: pasekmės patofiziologijai ir biomarkerio atradimui“, Proteome tyrimų žurnalas, t. 5, Nr. 11, p. 3038–3047, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  104. I. M. Rood, M. L. Merchant, D. W. Wilkey ir kt., „Padidėjusi lizosomų membranos baltymo 2 ekspresija pacientų, sergančių idiopatine membranine nefropatija, glomeruluose“, Proteomika, t. 15, Nr. 21, p. 3722–3730, 2015. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  105. P. Ruggenenti, C. Chiurchiu, V. Brusegan ir kt., „Rituximab in idiopathic membranous nephropathy: a vienerių metų perspektyvus tyrimas“, Amerikos nefrologijos draugijos žurnalas, t. 14, Nr. 7, p. 1851–1857, 2003. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  106. M. V. Irazabal, A. Eirin, J. Lieske ir kt., Mažos ir didelės molekulinės masės šlapimo baltymai kaip atsako į rituksimabą prognozės pacientams, sergantiems membranine nefropatija: perspektyvus tyrimas. Nefrologija Dializė Transplantacija, t. 28, Nr. 1, p. 137–146, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  107. R. L. Mehta, J. A. Kellum, S. V. Shah ir kt., „Ūminio inkstų pažeidimo tinklas: iniciatyvos, skirtos pagerinti ūminio inkstų pažeidimo rezultatus“, ataskaita. Būtinoji slauga, t. 11, straipsnis R31, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  108. S. Herget-Rosenthal, J. Metzger, A. Albalat, V. Bitsika ir H. Mischak, „Proteominiai biomarkeriai ankstyvam ūminio inkstų pažeidimo nustatymui“ Prilozi, t. 33, p. 27–48, 2012. Žiūrėti: Google Scholar
  109. M. T. Nguyen, G. F. Ross, C. L. Dent ir P. Devarajan, „Ankstyvas ūminio inkstų pažeidimo prognozavimas naudojant šlapimo proteomiką“, Amerikos nefrologijos žurnalas, t. 25, Nr. 4, p. 318–326, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  110. M. T. Nguyen, C. L. Dent, G. F. Ross ir kt., „Šlapimo aprotininas kaip ūminio inkstų pažeidimo prognozė po širdies operacijos vaikams, gydomiems aprotininu“. Vaikų nefrologija, t. 23, Nr. 8, p. 1317–1326, 2008. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  111. J. Metzger, T. Kirsch, E. Schiffer ir kt., „Dvidešimties peptidų išskyrimas su šlapimu sudaro ankstyvą ir tikslų ūminio inkstų pažeidimo diagnostikos modelį“. Kidney International, t. 78, Nr. 12, p. 1252–1262, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  112. F. Aregger, C. Pilop, D. E. Uehlinger ir kt., „Šlapimo proteomika prieš ir po ekstrakorporinės kraujotakos pacientams, sergantiems ūminiu inkstų pažeidimu ir be jo“, Krūtinės ir širdies ir kraujagyslių chirurgijos žurnalas, t. 139, Nr. 3, p. 692–700, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  113. F. Areggeris, D. E. Uehlingeris, J. Witowskis ir kt., „IGFBP-7 identifikavimas naudojant šlapimo proteomiką kaip naujas ankstyvojo ūminio inkstų pažeidimo prognostinis žymeklis“. Kidney International, t. 85, Nr. 4, p. 909–919, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  114. M. Bellas, A. Larssonas, P. Venge'as, R. Bellomo ir J. Mårtenssonas, „Ląstelių ciklo sustabdymo biomarkerių įvertinimas, siekiant numatyti ankstyvą ir uždelstą ūminį inkstų pažeidimą“, Ligos žymenys, t. 2015, Straipsnio ID 158658, 9 puslapiai, 2015. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | Google Scholar
  115. Y. Zhang, Y. Zhang, J. Adachi ir kt., „MAPU: max-Planck vieninga organelių, ląstelių, audinių ir kūno skysčių proteomų duomenų bazė“, Nukleino rūgščių tyrimai, t. 35, 1 priedas, p. D771–D779, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  116. S.-J. Li, M. Peng, H. Li ir kt., „Sys-BodyFluid: sisteminė žmogaus kūno skysčių proteomų tyrimų duomenų bazė“, Nukleino rūgščių tyrimai, t. 37, 1 priedas, p. D907–D912, 2009. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  117. J. Siwy, W. Mullen, I. Golovko, J. Franke ir P. Zürbig, „Žmogaus šlapimo peptidų duomenų bazė kelių ligų biomarkerių atradimui“, Proteomika—Klinikiniai taikymai, t. 5, Nr. 5–6, p. 367–374, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  118. T. M. Shiju, V. Mohan, M. Balasubramanyam ir P. Viswanathan, „Tirpus CD36 plazmoje ir šlapime: tikėtinas diabetinės nefropatijos prognostinis žymuo“. Diabeto ir jo komplikacijų žurnalas, t. 29, p. 400–406, 2015. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  119. J. Ma, X. Chen, J.-S. Li ir kt., „Podocitų išskiriamo angiopoetino tipo-4 reguliavimas sergant diabetine nefropatija“, Endokrininė, t. 49, Nr. 2, p. 373–384, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  120. A. Caseiro, A. Barros, R. Ferreira ir kt., „1 tipo cukrinio diabeto ir susijusių komplikacijų siekimas naudojant šlapimo proteomiką“, Vertimo tyrimai, t. 163, Nr. 3, p. 188–199, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  121. I. Zubiri, M. Posada-Ayala, A. Sanz-Maroto ir kt., „Diabetinė nefropatija sukelia žmogaus šlapimo egzosomų proteomų pokyčius, kaip atskleidė lyginamoji analizė be etikečių“, Proteomikos žurnalas, t. 96, p. 92–102, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  122. K. Inoue, J. Wada, J. Eguchi ir kt., „Šlapimo fetuinas-A yra naujas diabetinės nefropatijos žymuo sergant 2 tipo cukriniu diabetu, nustatytas lektino mikrogardeliu“. PLoS ONE, t. 8, Nr. 10, Straipsnio ID e77118, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  123. B. Surinas, E. Sachonas, J.-P. Rougier ir kt., „Endorepellino LG3 fragmentas yra galimas IgA nefropatijos sunkumo biomarkeris“, Proteomika, t. 13, Nr. 1, p. 142–152, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  124. J. Lopez-Hellin, C. Cantarell, L. Jimeno ir kt., „Apolipoproteino A-I forma randama konkrečiai židininės segmentinės glomerulosklerozės recidyvuose po transplantacijos“, Amerikos transplantacijos žurnalas, t. 13, Nr. 2, p. 493–500, 2013. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  125. N. Piyaphanee, Q. Ma, O. Kremen ir kt., „Atradimas ir pradinis patvirtinimas α1-B glikoproteino fragmentacija kaip diferencinis šlapimo biomarkeris sergant vaikų steroidams atspariu nefroziniu sindromu. Proteomika—Klinikiniai taikymai, t. 5, Nr. 5–6, p. 334–342, 2011. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  126. E. O. Honkanen, A.-M. Teppo ir C. Grönhagen-Riska, „Sumažėjęs kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus išsiskyrimas su šlapimu sergant idiopatiniu membraniniu glomerulonefritu“, Kidney International, t. 57, Nr. 6, p. 2343–2349, 2000. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  127. A. J. W. Branten, P. W. du Buf-Vereijken, I. S. Klasen ir kt., „Beta2 mikroglobulino ir IgG išskyrimas su šlapimu prognozuoja idiopatinės membraninės nefropatijos prognozę: patvirtinimo tyrimas“, Amerikos nefrologijos draugijos žurnalas, t. 16, Nr. 1, p. 169–174, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  128. T. Nakatsue, H. Koike, G. D. Han ir kt., „Nefrinas ir podocinas atsiskiria prasidėjus proteinurijai eksperimentinėje membraninėje nefropatijoje“ Kidney International, t. 67, Nr. 6, p. 2239–2253, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  129. C. R. Parikh, J. Mishra, H. Thiessen-Philbrook ir kt., „Šlapimo IL-18 yra ankstyvas nuspėjamas ūminio inkstų pažeidimo po širdies operacijos biomarkeris“, Kidney International, t. 70, Nr. 1, p. 199–203, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  130. W. K. Han, G. Wagener, Y. Zhu, S. Wang ir H. T. Lee, „Šlapimo biomarkeriai ankstyvam ūminio inkstų pažeidimo nustatymui po širdies operacijos“ Amerikos nefrologijos draugijos klinikinis žurnalas, t. 4, Nr. 5, p. 873–882, 2009. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  131. J. Mishra, C. Dent, R. Tarabishi ir kt., „Su neutrofilų želatinaze susijęs lipokalinas (NGAL) kaip ūminio inkstų pažeidimo biomarkeris po širdies operacijos“, Lancetas, t. 365, Nr. 9466, p. 1231–1238, 2005. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  132. V. S. Vaidya, V. Ramirez, T. Ichimura, N. A. Bobadilla ir J. V. Bonventre, „Šlapimo inkstų pažeidimo molekulė-1: jautrus kiekybinis biomarkeris, skirtas anksti nustatyti inkstų kanalėlių pažeidimą“. Amerikos fiziologijos žurnalas—Inkstų fiziologija, t. 290, Nr. 2, p. F517–F529, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  133. G. Ramesh, C. D. Krawczeski, J. G. Woo, Y. Wang ir P. Devarajan: „Šlapimo netrinas-1 yra ankstyvas nuspėjamas ūminio inkstų pažeidimo po širdies operacijos biomarkeris“, Amerikos nefrologijos draugijos klinikinis žurnalas, t. 5, Nr. 3, p. 395–401, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  134. P. Devarajan, C. D. Krawczeski, M. T. Nguyen, T. Kathman, Z. Wang ir C. R. Parikh, „Proteominis ankstyvųjų ūminio inkstų pažeidimo biomarkerių identifikavimas po širdies operacijos vaikams“, Amerikos žurnalas apie inkstų ligas, t. 56, Nr. 4, p. 632–642, 2010. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar
  135. L. E. Morales-Buenrostro, O. I. Salas-Nolasco, J. Barrera-Chimal ir kt., „Hsp72 yra naujas biomarkeris, skirtas prognozuoti ūminį inkstų pažeidimą kritiškai sergantiems pacientams“, PLoS ONE, t. 9, Nr. 10, Straipsnio ID e109407, 2014. Žiūrėti: leidėjo svetainė | Google Scholar

Autorių teisės

Autorių teisės © 2015 Shiva Kalantari ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal Creative Commons Attribution License, kuris leidžia neribotai naudoti, platinti ir dauginti bet kokioje laikmenoje, jei originalus darbas yra tinkamai cituojamas.


Medžiagos ir metodai

Adenovirusinės konstrukcijos

JR Nevinsas, Duke universiteto Genetikos katedra, Šiaurės Karolina, maloniai suteikė Ras 61L ir RAS N17 adenovirusus (adv). Adv dl309 buvo dosni daktaro Adriano dovana, Virusologijos katedra, Medizinische Hochschule Hannover, Vokietija. Adv β-gal konstrukcija buvo aprašyta anksčiau (Bradham ir kt., 1998).

Adenoviruso paruošimas

Norint sukurti didelio titro viruso atsargas, 2 × 10 8 293 pakavimo ląstelės, esančios 90% santakoje, buvo užkrėstos 5–10 Pfu vienoje ląstelėje. Užkrėstos ląstelės buvo kultivuojamos 3–5 dienas, kol buvo pastebėtas stiprus citopatinis poveikis ir apie 50% šių ląstelių buvo atskirta. Tada ląstelės buvo surinktos centrifuguojant, o virusinės dalelės buvo išleistos keturiais užšaldymo skystame azote ir greito atšildymo ciklais 37 ° C temperatūroje. Tolesniam gryninimui viruso preparatas buvo paveiktas dvigubai CsCl2 juostavimas. CsCl2 juostų nustatymas ir užkrečiamumo nustatymas naudojant virusines apnašas buvo atlikti pagal anksčiau aprašytus protokolus (Becker ir kt., 1994). Endotoksinų užterštumas buvo stebimas naudojant LAL-testo rinkinį (Chromogenix) pagal gamintojo pateiktą protokolą. Visi virusų preparatai, naudojami infekcijos eksperimentams ir luciferazės tyrimams, buvo be LPS. Viruso preparatai buvo laikomi –20 °C temperatūroje 25 % glicerolio, 10 mM Tris/HCl, pH 7,4 ir 1 mM MgCl.2, 140 m M NaCl.

Ląstelių kultūra, transfekcijos eksperimentai ir luciferazės tyrimai

HepG2 ląstelės buvo kultivuojamos DMEM, papildytu 10% FCS. DNR transfekcija buvo atlikta naudojant modifikuotą kalcio fosfato nusodinimo metodą, inkubuojant per naktį 3% CO2 ir 35°C, kaip aprašyta anksčiau (Niehof ir kt., 1997). HepG2 buvo auginami ant 60 mm lėkštelių iki maždaug 50% susiliejimo, kai buvo naudojami transfekcijos eksperimentams. Pridedant pBSK + DNR (Stratagene, JAV) iki 6 μg, bendras DNR kiekis buvo pastovus kiekviename transfekcijos eksperimente. Visose transfekcijose buvo 0,2 μg β-galaktozidazės reporterio pRSVβGal kaip vidinio standarto ir 3 μg luciferazės reporterio geno konstrukcijos. Po transfekcijos ląstelės du kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) ir inkubuojamos DMEM, papildytu 10% vaisiaus galvijų serumu. Po 4 valandų ląstelės buvo užkrėstos adv Ras 61L, adv Ras N17 arba adv dl309, kai infekcijos dažnis buvo 100 24 valandas.

Norėdami išmatuoti luciferazės aktyvumą, ląstelės du kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) ir lizuojamos pridedant 350 μl ekstrahavimo buferio (25 mM Tris-H).3PO4, pH 7,8, 2 m M EDTA, 10 % (v/v) glicerolio, 1 % (v/v) Triton X-100 ir 2 m M DTT) 10 min. Lizatai buvo išvalyti centrifuguojant. 50 μl supernatanto buvo ištirta pridedant 300 μl matavimo buferio (25 m M glicilglicino, 15 m M MgSO4 ir 5 m M ATP). Šviesos emisija buvo matuojama dviem egzemplioriais 10 s Lumat LB 9501 (Berthold, Bad Wildbad, Vokietija), suleidus 100 μl 250 μM luciferino (Niehof ir kt., 1997). Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas dviem egzemplioriais ir kartojamas bent tris kartus. Liuciferazės aktyvumas buvo normalizuotas prieš β-galaktozidazės aktyvumą. Duomenys rodo specifinį luciferazės aktyvumą ir yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis.

Dėl in vitro Infekcijos eksperimentai HepG2 ląstelės buvo auginamos 100 mm lėkštelėse iki maždaug 80% susiliejimo ir po to 24 valandas užkrėstos skirtingomis virusinėmis konstrukcijomis, kai MOl yra 100. Tada ląstelės du kartus plaunamos PBS, surenkamos ir lizuojamos NP-40 lizės buferyje (150 m M NaCl, 10 m M Tris/HCl, pH 7,4, 1 m M EDTA, 1 % NP-40), kad gautų visos ląstelės baltymą. ekstraktai.

Reporterio genų konstrukcijos

Cyclin E promotoriaus delecijos reporterio geno konstrukcijas maloniai pateikė P Jansen-Dürr, Insbrukas, Austrija (Botz ir kt., 1996).

GST-ciklino E suliejimo konstrukcija

Ciklino E kDNR buvo klonuota įdėtuoju PGR iš kepenų mRNR, naudojant pradmenis: sensorinis CCG AAT TCT GCC AAG GGA GAG AGA CTC GAC G ir antisensinis GGG GTC GAC TTA GCA GCT TCT GGA GCA CTC AG (pelės ciklinas E: prisijungimo numeris Nr. X 75888 Damjanov ir kt., 1994) į klonavimo vektorių Topo-TA (Invitrogen). PGR produktas buvo patikrintas nustatant seką. Cyclin E cDNR intarpas buvo paruoštas naudojant restrikcijos vietas EcoRI ir Sall ir klonuojami rėmelyje į vektoriaus pGEX-KG Glutagen TM plazmidę. Gautas GST-ciklino E konstruktas buvo naudojamas baltymų ekspresijai E. coli po indukcijos 0,5 m M IPTG. Sulieto baltymo kiekybinis nustatymas buvo atliktas dažant Coomassie mėlyna spalva. Baltymo specifiškumas buvo patikrintas Western blot analize, naudojant anti-Cyclin E antikūną.

Transaminazių nustatymas

Po trumpo apsisukimo ties 200 gplazma buvo išgauta ir laikoma -80 ° C temperatūroje, kol ji buvo naudojama aminotransferazėms nustatyti. ALT ir AST aktyvumas plazmoje buvo nustatytas automatizuotu fermentų tyrimu, kaip aprašyta anksčiau (Trautwein ir kt., 1998).

Dviejų trečdalių hepatektomija ir branduolinių ekstraktų paruošimas

Aštuonių savaičių amžiaus NMRI pelių patinai, sveriantys nuo 20 iki 25 g, buvo gauti iš Medizinische Hochschule Hannover gyvūnų įstaigos. Gyvūnai buvo laikomi 12 valandų tamsoje ir 12 valandų šviesoje. Dvidešimt keturios valandos prieš operaciją 1,6 × 10 9 Pfu atitinkamo viruso buvo sušvirkšta į uodegos veną 250 μl nešiklio tirpalo (10 m M Tris/HCl, pH 7,4, 1 m M MgCl2, 140 m M NaCl).

Naudojant didėjančius β-gal viruso kiekius, buvo tiriamas hepatocitų infekcijos veiksmingumas ir toksiškumas kepenims. 1,6 × 10 9 Pfu β-gal adenoviruso dozė (atsižvelgiant į apnašų tyrimą) užkrėtė mažiausiai 80% hepatocitų ir po 24 valandų reikšmingai nepadidėjo transaminazių. Infekcijos patikimumas buvo kontroliuojamas X-gal nudažytomis adv β-gal užkrėstų kepenų kepenų dalimis. Transaminazės buvo nustatytos kiekvienu laiko momentu po hepatektomijos. HGF eksperimentams naudojome rekombinantinį žmogaus HGF (Pepro-Tech, Inc.-USA, #100-39), ištirpintą nešiklio tirpale tokiomis koncentracijomis, kaip parodyta 7 paveiksle.

Likus dvylika valandų iki operacijos, gyvūnams buvo atimtas maistas. Operacija buvo atlikta nuo 08:00 iki 10:00 val. Gyvūnai buvo anestezuoti į pilvaplėvės ertmę suleidžiant rompuno / ketamino derinį. Po nedidelio subksifoidinio pjūvio buvo atlikta dviejų trečdalių hepatektomija, kaip aprašė Higginsas ir Andersonas (1931). Po operacijos pilvo ertmė uždaryta siūle. Apsimetinė operacija buvo atlikta tiksliai taip, kaip nurodyta atliekant dviejų trečdalių hepatektomiją, išskyrus tai, kad kepenys buvo tik manipuliuojamos, o ne rezekuotos.

Kiekvienam nurodytam laiko taškui lygiagrečiai buvo naudojamos penkios pelės. Kraujas buvo paimtas iš gyvūnų kiekvienu laiko momentu. Likusios kepenys buvo pašalintos, sujungtos, nuplaunamos ledo šaltu PBS, o dalis kepenų buvo nedelsiant užšaldytos skystame azote arba audinių tekėjime (Sakura Europe, Nyderlandai). Likusios kepenys buvo naudojamos branduoliniams ekstraktams ruošti, kaip aprašyta anksčiau (Trautwein ir kt., 1998). Visi veiksmai buvo atlikti 4 ° C temperatūroje.

SDS-poliakrilamido-gelio elektroforezė ir Western blot analizė

Branduoliniai ekstraktai buvo atskirti ant 10% SDS-poliakrilamido gelio ir blotuojami ant nitroceliuliozės membranos (Schleicher ir Schuell) 1% SDS, 20% metanolyje, 400 mM glicine, 50 mM Tris-HCL, pH 8,3, 4 ° temperatūroje. C 2 valandas esant 200 mA, kaip aprašyta anksčiau (Trautwein ir kt., 1999). Western blot analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau (Trautwein ir kt., 1999). Pirminiam antikūnų inkubavimui membranos buvo tiriamos anti-ERK2 (Santa Cruz, JAV, #Sc-153) anti-Cyclin A (Santa Cruz, USA, #Sc-751), anti-Cyclin E (Santa Cruz, JAV, #). Sc-481) arba anti-Cyclin D1/2 (Upstate Biotechnology, JAV, Nr. 05-362), anti-Phospho-p42/44 MAP kinazė (Thr 202, Tyr 204) (New England Biolabs, #9101S), anti- Phospho-c-Jun (Ląstelių signalizacijos technologija, JAV, #9261S) ir anti-α-Tubulinas (Santa Cruz, JAV, #Sc-5546). Kaip antrinis antikūnas buvo naudojamas peroksidaze konjuguotas asilas prieš triušią IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc. USA, #711-035-152). Antigeno ir antikūnų kompleksai buvo vizualizuoti naudojant ECL aptikimo sistemą, kaip rekomendavo gamintojas (Amersham, Braunschweig, Vokietija). Kiekvienam dominančiam baltymui buvo atlikta Western blot analizė bent tris kartus.

Gelio sulėtėjimo tyrimai

Gelio poslinkio eksperimentai buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau (Trautwein ir kt., 1999). Kepenų branduoliniai ekstraktai buvo inkubuojami su 32P pažymėta konsensuso E2F vieta 1x rišančiame buferyje (25 m M HEPES, pH 7,6, 5 m M MgCl2, 34 m M KCL, 2 m M DTT, 0,2 m M PMSF, 1 mg/ml poli (dI-dC), 2 mg/ml galvijų serumo albumino). 3,5 μg kepenų branduolių ekstraktų buvo inkubuojami 30 minučių ant ledo. Laisvieji DNR ir DNR-baltymų kompleksai buvo ištirpinti 4% TBE-poliakrilamido gelyje. Konkurencinių eksperimentų metu į surišimo reakciją buvo pridėtas nepažymėtas (šaltas) konsensuso E2F oligonukleotidas.

BrdU ženklinimas

Dėl in vivo ženklinimui, 30 μg/g pelėms buvo sušvirkšta 5-brom-2'-deoksiuridino (BrdU, Amersham, Braunschweig, Vokietija) ip. 2 val. prieš paaukojimą. Kepenų audinys buvo nedelsiant užšaldytas skystame azote. Norint aptikti paženklintus branduolius, buvo paruoštos kriosekcijos (5 μm storio).Audinys buvo fiksuotas lediniame acetone / metanolyje ir nudažytas pagal Amersham ląstelių proliferacijos rinkinio vadovą (Amersham, Braunschweig, Vokietija).

Northern blot analizė

Northern blot analizė buvo atlikta pagal standartines procedūras (Michalopoulos ir DeFrances, 1997). Ciklino E ir GAPDH cDNR zondai buvo pažymėti (α-P32) ATP pagal atsitiktinio pradėjimo protokolą (Boehringer, Manheimas, Vokietija). Hibridizacijos procedūra buvo atlikta taip, kaip aprašyta anksčiau (Trautwein ir kt., 1999).

In vitro kinazės tyrimai

ERK kinazės tyrimai

ERK aktyvumas buvo įvertintas iš esmės taip, kaip aprašyta anksčiau (Bradham ir kt., 1998). Imunoprecipitacija buvo atlikta su kepenų branduolių ekstraktais, naudojant anti-ERK 2 antikūną ir baltymo A agarozės granules (Santa Cruz, C14 kryžminė reakcija su ERK 1). Kinazės reakcija buvo atlikta 50 μl kinazės buferyje (20 m M HEPES (pH 7,5), 20 m M MgCl2, 20 m M glicerolio fosfato, 2 m M DTT) su 7,5 μg MBP ir 5 μCi (γ-P 32 ) ATP. Baltymai buvo frakcionuoti naudojant 12,5% SDS-poliakrilamido gelį ir vizualizuoti / kiekybiškai įvertinti naudojant fosfovaizdo analizę. Coomassie dažymas buvo naudojamas norint parodyti vienodą baltymų kiekį.

CDK2 kinazės tyrimas

CDK2 aktyvumas buvo nustatytas panašiai, kaip aprašyta ERK kinazės tyrimui. Imunoprecipitacija buvo atlikta su 1 μl anti-CDK2 (Santa Cruz, JAV, #Sc-163) 15 μg kepenų branduolių ekstraktų 0,5 valandos ant ledo. 1 valandai buvo pridėta keturiasdešimt μl baltymo A agarozės granulių. Po dviejų plovimų RIPA buferyje CDK2 aktyvumas buvo nustatytas inkubuojant 3 μg Histono H1 ir 7 μCi (γ-ATP 32 ) ATP kinazės buferyje. Kinazės reakcija buvo sustabdyta po 30 minučių naudojant 3 × SDS mėginio buferį, o baltymai buvo atskirti naudojant 12, 5% SDS-poliakrilamido gelį. Vizualizacija ir kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant phospho Imager analizę.

Ciklino E fosforilinimo tyrimas

Kinazės reakcijoje kaip substratas buvo naudojamas 5 μg GST-Cyclin E, prijungto prie glutationo agarozės. Sulietas baltymas buvo inkubuojamas su 25 μg branduolių ekstraktų 30 μl kinazės buferyje, kuriame yra 5 μCi γ-ATP 32, 30 minučių 30 ° C temperatūroje. Kinazės reakcija du kartus plaunama HBB buferiu (20 m M HEPES (pH 7,5), 50 m M NaCl, 0,1 m M EDTA, 2,5 m M MgCl2buvo pridėta 0,1 % Triton X-100, 20 m M glicerolio fosfato, 1 m M DTT) ir 3 × SDS mėginio buferis. Baltymai buvo atskirti naudojant 12,5% SDS-poliakrilamido gelį. Vizualizacija ir kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant phospho Imager analizę.


Fonas

Lauko svarba

Individualizuotas ligų valdymas buvo ir yra plečiamas, o tai reiškia, kad paskiriami konkretūs vaistai, geriausiai tinkantys konkrečiam pacientui ir jo ligos tipui. Derinant skirtingas proteomines strategijas, tai gali būti patobulinta, o tai reikštų proteominių ir klinikinių tyrimų susiejimą.

Šioje apžvalgoje aptariamos sritys

Klinikiniai ir proteominiai tyrimai gali būti atliekami vienas kitą papildant, siekiant tobulinti ir tobulinti gydymo ir diagnostikos priemones. Taip pat atkreipiame dėmesį į imunologinių ligų, įskaitant vėžį, ypač tų, kurios yra tiesiogiai susijusios su fosforilintomis proteinkinazėmis, svarbą ir fosfoproteinų-fosfopeptidų išskyrimo ir metodologinės analizės būdą, su jų pranašumais ir trūkumais naudojant proteominius įrankius.

Ką gaus skaitytojas

Įvairių tipų skirtingų proteominių strategijų derinių, pritaikytų konkrečioms ligoms, apžvalga. Taip pat paprastai pateikiami fosfoproteominių metodų principai su pavyzdžiais. Be to, bus išsamiai aprašytos svarbios masės spektrometrijos užuominos, kad būtų galima nustatyti ir teisingai priskirti fosfato grupę fosforilintame baltyme.

Pasiimk žinutę namo

Klinikiniams tyrimams galima naudoti daugybę proteominių derinių metodų. Visada būtina išbandyti įvairius proteominius įrankius, kad padidintumėte klinikinio proteominio tyrimo efektyvumą, ypač susijusius su fosforilintais baltymais, kurie yra prastai ekspresuojami kaip kai kurios kinazės. Šiais laikais labai svarbu, kad gydytojai ir proteomikos ekspertai dirbtų kartu, siekiant pagerinti gydymo būdus ir vaistų kandidatų kūrimą.

Siekiame išsamiai apibūdinti dabartinius ir naudingiausius metodus su tyrimų pavyzdžiais, kad būtų galima išskirti ir atlikti klinikinius fosfoproteominius tyrimus, kurie gali būti naudingi imunologijos ir vėžio tyrimams. Norint pasiekti gerą fosfopeptidų atgavimą ir gerus fosfopeptidų reguliavimo baltymų tyrimus, reikia derinti skirtingus fosfopeptidų sodrinimo ir kiekybinius metodus.

(A) Fosforilinimo vaidmuo imuninių sutrikimų ir vėžio atvejais

Fosforilinimas ir defosforilinimas serino, treonino ir tirozino liekanose yra vienas iš labiausiai paplitusių aktyvavimo ir (arba) inaktyvavimo signalų perdavimo būdų. Šio tipo modifikacijos kontroliuoja įvairius ląstelių procesus, įskaitant ląstelių augimą, proliferaciją, ląstelių ciklo kontrolę, citoskeleto mobilumą ir receptorių reguliavimą [1]. Fosforilinimas sukelia allosterines modifikacijas, kurios gali sukelti konformacinius pokyčius, kurių pakaktų suaktyvinti arba inaktyvuoti įvairius baltymus ir su tuo susijusį pakitusį funkcionavimą. Mūsų hipotezė, kad fosfoproteinų, susijusių su įvairių imunologinių sutrikimų, įskaitant vėžį, etapais, nustatymas gali suteikti informacijos apie patologijos vystymąsi. Be to, naviko atsiradimo mechanizmas leidžia suprasti diagnostinių ir terapinių procedūrų vystymąsi.

Yra žinoma, kad daugelio žmogaus piktybinių navikų mitogenu aktyvuotos baltymų kinazės (MAPK) keliai yra nereguliuojami [2–5]. Kalbant apie piktybinius navikus, geriausi MAPK tyrimai yra ekstraląstelinio signalo reguliuojamos baltymų kinazės (ERK). ERKs fosforilina citoplazminius taikinius migruoja į branduolį, kur gali suaktyvinti transkripcijos faktorius, dalyvaujančius ląstelių proliferacijoje. Eraktiškas signalizavimas MAPK / ERK keliuose buvo aprašytas sergant prostatos, krūties ir storosios žarnos vėžiu in vitro taip pat in vivo modeliai [6–9]. Be to, sergant gimdos kaklelio vėžiu, atliktas tyrimas aprašė sumažėjusį ERK1/2 aktyvavimą sergant invazine gimdos kaklelio karcinoma [10]. Antrasis svarbus pavyzdys yra aneksinas A1, kuris yra nuo kalcio priklausomas fosfolipidus surišantis baltymas, susijęs su membranų judėjimu per egzocitozę ir endocitozę [11]. Kiti tyrimai įvertino aneksino A1 vaidmenį moduliuojant MAPK/ERK [12]. Tiesą sakant, žinoma, kad daugelis aneksino šeimos narių patiria alternatyvų sujungimą, todėl gaunama daug izoformų. Gautos variantinės formos gali turėti skirtingas funkcijas ir surišimo pajėgumus, palyginti su vietinėmis formomis [13]. DNR-baltymų kinazės katalizinis subvienetas (DNR-PKcs) – dar vienas svarbus pavyzdys – makromolekulė, kuri, kaip nustatyta, dalyvauja atstatant dvigrandžius DNR lūžius, aktyvinant p53, vėžio pavyzdžiuose ekspresuojama tirozino fosforilinta ir suskaidyta forma. [14]. Priešingai, normaliuose pavyzdžiuose DNR-PKcs egzistavo visa, viso ilgio nefosforilinta forma. Šiuo tyrimu buvo siekiama nustatyti skirtingą baltymų ekspresiją ir modifikaciją, kuri galėtų pasiūlyti nepastovius kelius, kurie galėtų būti nauji tikslai kuriant naujus gydymo būdus gydant gimdos kaklelio vėžį ir padedant stebėti ligos pasikartojimą ar progresavimą. Iliustruojami bendrieji signalizacijos takų principai (1 pav.), taip pat atitinkamos fosforilintos proteinkinazės struktūros pavyzdys (2 pav.).

Signalizacijos keliai: bendrieji principai. Po signalo perdavimo į skirtingus ląstelių skyrius yra signalo apdorojimas ir stiprinimas plazmos membranos proksimaliniais įvykiais. Šiame procese dalyvauja kelių signalų kaskadų aktyvinimas receptoriais, skirtingos baltymų post-transliacinės modifikacijos (PTM), signalizacijos kelių ir grįžtamojo ryšio kilpos, siekiant užtikrinti optimalų signalizacijos išvestį. Receptorių Tyr kinazių (RTK) prisijungimas prie jų giminingų ligandų ląstelės paviršiuje sukelia receptorių dimerizaciją ir autofosforilinimą. Fosforilintos Tyr liekanos vėliau tarnauja kaip prijungimo vietos signalizacijos tarpininkams, tokiems kaip augimo faktoriaus receptorių surištas baltymas 2 (GRB2), įdarbinti. Suaktyvinamos kelios signalizacijos kaskados, tokios kaip fosfoinozitido-3 kinazė (PI3K)-AKT, Ras-Raf- ekstraląstelinio signalo reguliuojama kinazės (ERK) mitogeno aktyvuota proteinkinazė (MAPK) ir signalo keitiklis bei transkripcijos (STAT) kelių aktyvatorius. sujungiant šiuos signalizacijos kompleksus. Casitas B linijos limfomos (CBL) sukeltas RTK ubiquitilinimas kontroliuoja jų endocitozę ir receptorių signalizacijos trukmę. Be to, naviko nekrozės faktoriaus α (TNFα) prisijungimas prie jo receptoriaus, TNFR1, sukelia receptoriaus trimerizaciją ir su adapterio baltymu TNFR1 susieto mirties domeno (TRADD) įdarbinimą. Su TNFR susijęs 2 faktorius (TRAF2), receptorius sąveikaujantis Ser/Thr proteinkinazė 1 (RIPK1) ir branduolinio faktoriaus-κB (NF-κB) esminis moduliatorius (NEMO). Rezultatas yra skirtingų signalizacijos tinklų, tokių kaip ERK MAPK, p38 MAPK ir NF-κB, suaktyvinimas. Baltymus MAPK signalizacijos keliuose aktyvuoja ir RTK, ir TNFα, o tai leidžia ląstelėms integruoti kelis signalus. [Taškinės linijos rodo netiesioginį signalizacijos kelių aktyvavimą arba baltymų perkėlimą į branduolį. IκB, NF-κB IKK inhibitorius, NF-κB kinazės inhibitorius JNK1, Jun N-galinė kinazės 1 MEK, MAPK ERK kinazė mTOR, žinduolių rapamicino taikinys p70S6K, p70 ribosominis S6 kinazės α RSK, ribosominis baltymas-α RSK ].

Fosforilintos proteinkinazės pavyzdys. Fosforilinto Ser-279 vieta žmogaus MAP kinazės p38beta (p38B) baltymų struktūroje parodyta šiame paveikslėlyje. Fosforilinto serino modelis buvo Ser-279 liekanos struktūrinėje padėtyje p38B 3D kristalografinėse koordinatėse (baltymų duomenų banko kodas: 3GC8). Nurodyta ATP surišimo vietos padėtis. Sklypas buvo sukurtas naudojant PyMOL (DeLano Scientific, San Carlos, CA). P38 kelias yra vienas iš mitogeno aktyvuotų baltymų kinazės (MAPK) signalizacijos kaskadų kartu su ekstraląsteliniu signalu reguliuojamu kinazės (ERK) ir c-Jun N-galinės kinazės (JNK) keliais. Panašiai kaip ir kiti MAPK būdai, p38 signalizacijos kaskada apima nuoseklų MAPK kinazių (MAP3K) ir MAPK kinazių (MKK), įskaitant MKK3, MKK4 ir MKK6, aktyvavimą, kurios tiesiogiai aktyvuoja p38 per fosforilinimą priklausomai nuo ląstelės tipo ir stimulo. . Suaktyvinti p38 MAPK fosforilina serino / treonino likučius ant savo substratų, tokių kaip transkripcijos faktoriai, ląstelių ciklo reguliatoriai ir baltymų kinazės. P38 signalizacijos keliu ląstelės gali interpretuoti daugybę išorinių signalų, tokių kaip uždegimas, hiperosmoralumas, UV spinduliuotė ir oksidacinis stresas, ir tinkamai reaguoja sukurdamos pernelyg daug skirtingų biologinių poveikių.

Kita vertus, CDC25 baltymų šeimą sudaro dvigubo specifiškumo fosfatazės, reguliuojančios ląstelių ciklo perėjimus, ir jos yra pagrindiniai kontrolinio taško mechanizmų taikiniai, siekiant išlaikyti genomo stabilumą DNR pažeidimo metu. Žinduolių ląstelėse buvo nustatytos trys CDC25 izoformos: CDC25A, CDC25B ir CDC25C. Buvo pranešta apie per didelę CDC25A ir CDC25B ekspresiją sergant daugeliu žmonių vėžio tipų, tačiau jų nepakanka vėžiui sukelti, o mechanizmas, atsakingas už CDC25 per didelę ekspresiją, yra neaiškus [15, 16]. Priešvėžinio vaisto rapamicino dozės ir atsako poveikio fosfoproteomikos lygiui tyrimas nustatė šimtus naujų rapamicino nukreiptų ląstelių baltymų ir jų fosforilinimo vietų. Ši informacija leido mums nustatyti CDC25B kaip pagrindinį fermentą tarpininkaujant rapamicino sukeltai onkogeninei AKT aktyvacijai. Svarbu pažymėti, kad galime parodyti, kad tam tikro terapinio agento fosfoproteominis profiliavimas ne tik nustato galimą (-ius) vaisto taikinį (-ius), kad pagerintų to terapinio metodo veiksmingumą gydant ligas, bet taip pat gali suteikti ląstelių informacijos apie galimą naudą. ir nepageidaujamas konkrečios ligos gydymo šalutinis poveikis gydant pacientus [17].

Be to, pirminiai imunodeficitai (PID) yra „gamtos eksperimentai“, kurie leido ne tik išsiaiškinti daugelį signalizacijos takų, bet ir klinikinę reikšmę jų funkcijai. Brutono tirozino kinazė yra įdomus pavyzdys: (Btk kinazių šeimos Tec narys) [18, 19], svarbi B limfocitų vystymuisi, diferenciacijai ir signalizacijai. Btk daugiausia ekspresuojamas B limfocituose ir monocituose, bet ne plazmos ląstelėse [20, 21]. Btk ekspresija B-ląstelių linijoje taip pat yra reguliuojama vystymosi metu, kai iš kaulų čiulpų gautos kraujodaros kamieninės ląstelės, bendrosios limfoidinės pirmtakinės ląstelės, besivystančios B ir mieloidinės linijos rodo aukščiausią lygį, o likusios subrendusios ląstelės prieš aktyvavimą sumažino ląstelių Btk. Dar reikia nustatyti Btk ekspresijos fiziologinę reikšmę kituose ląstelių tipuose, nes B limfocitai yra vienintelės ląstelės, kurios yra paveiktos su X susijusia agamaglobulinemija (XLA). Btk geno mutacijos žmonėms sukelia XLA, o pelėms – su X susietą imunodeficitą (Xid). Btk aktyvinimas sukelia signalizacijos įvykių kaskadą, kuri baigiasi kalcio mobilizacija ir srautais, citoskeleto pertvarkymais ir transkripcijos reguliavimu, apimančiu branduolinį faktorių-κB (NF-κB) ir aktyvuotų T ląstelių branduolinį faktorių (NFAT). Įrodyta, kad B ląstelėse NF-κB jungiasi prie Btk promotoriaus ir sukelia transkripciją, o nuo B ląstelių receptorių priklausomam NF-κB signalizacijos keliui reikalingas funkcinis Btk. Be to, Btk aktyvaciją griežtai reguliuoja daugybė kitų signalinių baltymų, įskaitant baltymų kinazę C (PKC), Sab/SH3BP5 ir caveolin-1. Be to, prolilo izomerazė Pin1 neigiamai reguliuoja Btk, mažindama tirozino fosforilinimą ir vienodą Btk būseną [22]. Labai įdomu, kad PKC ir Pin1, kurie abu yra neigiami Btk reguliatoriai, jungiasi prie Btk pleckstrin homologijos srities. Šiuo tikslu tiriamos naujos plekstrino homologijos mutacijos, siekiant sukurti selektyvius ir naujus vaistus [23]. Dažnas kintamasis imunodeficitas (CVID) yra PID liga. CVID yra vidinio deficito, turinčio įtakos imuninėms funkcijoms, rezultatas. Be to, nustatyta, kad limfomos ir neoplazmos yra susijusios su CVID. CVID yra nevienalytis, gali pasireikšti ankstyvame arba vėlyvame gyvenime ir yra susijęs su specifinėmis gretutinėmis ligomis [24, 25]. Tebesitęsia pastangos suskirstyti CVID į subkategorijas, kad būtų galima prognozuoti rezultatus ir gretutines ligas, tiek kliniškai, tiek remiantis imunologiniais fenotipais [26]. Nustatyta, kad TNF šeimos receptoriaus B ląsteles aktyvuojantis faktorius [27], transmembraninis aktyvatorius, kalcio moduliatorius, ciklofilino ligandų interaktorius (TACI) [28–30] ir tam tikri HLA haplotipai [31, 32] yra potencialūs jautrumo genai. į CVID. Indukuojamas kostimuliatorius [33, 34], CD81 [35], CD19 [36, 37] ir CD20 [38] turi ligas sukeliančių mutacijų, kurios šiuo metu paaiškina tik nedidelę dalį atvejų [39]. Neseniai genomo masto asociacijos darbas [40] nustatė įvairias bendro kintamo imunodeficito priežastis, suteikiančias naujų mechaninių įžvalgų apie imunopatogenezę, pagrįstą šiomis unikaliomis genetinėmis variacijomis. Buvo pastebėtas labai didelis skaičius tiriamųjų, kuriems pasikartojo ORC4L, genas, anksčiau susijęs su B ląstelių limfoproliferaciniais sutrikimais. Visos šios naujos įžvalgos gali būti jautrios fosfoproteominei analizei, siekiant išsiaiškinti skirtingų patologijų įkalčius [41].

(B) Fosfoproteomikoje naudojami analizės metodai

B.1. Mėginių paruošimas

Sėkmingos analizės raktas yra geras mėginio paruošimas. Fosforilinti baltymai yra gana stabilūs chemiškai, tačiau yra labai jautrūs fermentiniam modifikavimui. Pabrėžiame baltymų kinazių fosforilinimo svarbą dėl to, kad jos moduliuoja daugelį imunologinių ligų ir dažniausiai yra prastai ekspresuojamos. Be to, žmogaus genome yra apie 500 kinazių ir daugiau nei 100 fosfatazių [42], todėl, kai audiniai ar ląstelės yra lizuojami ir ekstrahuojami, labai tikėtina, kad įvyks tolesnių fermentinių reakcijų. Mėginiai turi būti paruošti (a) greitai, (b) paprastai užšaldyti ir (c) apdoroti fosfatazės inhibitoriais, kad apdorojant mėginį nebūtų pakitę fosfopeptidai [43, 44]. Fosfopeptidai paprastai sudaro nedidelę peptidų dalį tam tikrame baltymų mėginyje, todėl juos sunku aptikti IS, nes jų praturtinimas padeda įveikti šią problemą. Svarbu d) vengti druskų ir ploviklių, kurie gali sumažinti fosfopeptidų regeneraciją ir (arba) trukdyti tolesniam tyrimui [45].

B.2. Fosfoproteinų ir fosfopeptidų praturtinimas

Daugelio krypčių, įskaitant imuninių sutrikimų tyrimą, tikslas yra sukurti bendrą vaizdą apie serino, treonino ir tirozino fosforilinimą mėginyje, daugiausia dėmesio skiriant pasirinktam fosfopeptidų pogrupiui. Kadangi MS aptikti fosfopeptidus dažnai trukdo slopinimo poveikis, buvo sukurta daug skirtingų strategijų: nefosforilintų peptidų pašalinimui: (I) imunoprecipitacija antikūnais, (II) išankstinės frakcijos sistemos, tokios kaip jonų chromatografinė mainai (SCX/). SAX), kalcio fosfato nusodinimas ir hidrofilinės sąveikos chromatografija (HILIC) (III) metalų giminingumo chromatografija, ty IMAC, TiO2, ZrO2ir (IV) atvirkštinės fazės chromatografija (RP). (V) Fosfotirozino, sujungto arba ne su poliakrilamido geliais, imunoprecipitacija vis dar yra daug dažnesnė [43] nei imunoprecipitacija naudojant fosfoserino arba treonino antikūnus. Taip yra todėl, kad afininė chromatografija, tokia kaip IMAC arba titano dioksidas, turi didesnį fosfoserino ir fosfotreonino peptidų surišimo pajėgumą.

• Antikūnų valymas ir poliakrilamido geliai

Afinitetinis gryninimas, baltymų gryninimo metodas, gali būti naudojamas kartu su SDS-PAGE arba atskirai. Antikūnai, sukurti prieš baltymą, gali būti naudojami baltymo imuniniam nusodinimui ir fosforilinimo vietų paieškai. Imunoprecipitacija leidžia išskirti baltymą įvairiomis biologinėmis sąlygomis, kad būtų galima įvertinti šio baltymo fosforilinimo pokyčius. Lygiai taip pat antikūnai, sukurti prieš specifinį baltymo fosfitą, gali būti naudojami imunoprecipitacijai. Pagal šį scenarijų galima įvertinti kitus baltymo fosfitus, kai žinomas vienas fosfitas (antikūno epitopas). Tačiau reikia būti atsargiems, kai baltymas fosforilinamas keliuose serinuose, nes tam tikri fosforilinimo įvykiai gali būti vienas kitą nesuderinami ir panaikinti vėlesnės analizės metu. Fosfospecifiniai antikūnai gali būti naudojami norint nustatyti baltymus, kurie jungiasi su fosfoproteinu (baltymų ir fosfoproteinų sąveika), naudojant specifinį fosfitui imuninį nusodinimą, po kurio atliekama surišimo partnerių analizė. Be to, antikūnai, specifiniai fosfotirozinams, kurių nepaveikia aplinkinės aminorūgštys, buvo sėkmingai panaudoti ląstelių „fosfotirozinomui“ imuniniu būdu nusodinti.Kadangi fosfoserino ir fosfotreonino ląstelėse yra daug daugiau ir atrodo, kad šie antikūnai yra mažiau specifiški, fosfoproteomų masto eksperimentai yra daug sudėtingesni [46].

Be to, fosfospecifiniai antikūnai prieš konsensuso sekos motyvą konkrečiam kinazės motyvui (pavyzdžiui, SXR, kur × yra bet kuri aminorūgštis) taip pat gali būti naudojami imuniniam valymui visiems baltymams, kuriuose yra šis motyvas. Ši fosforilinimo forma buvo praturtinta naudojant antifosfotirozino antikūnus. Tai įdomi strategija, nes fosfotirozinas yra daug rečiau paplitęs nei fosfoserinas ar treoninas, todėl antikūnai paprastai turi didesnį specifiškumą, o tirozino kinazės vaidina svarbų vaidmenį sergant žmogaus vėžiu. Išskirti baltymai fermentiniu būdu suskaidomi tripsinu ir analizuojami MS arba fosfopeptidai gali būti dar labiau praturtinti analizei naudojant MS. Šiais metodais tirozino fosforilinti baltymai praturtinami iki tokio lygio, kad būtų galima aptikti ir nustatyti MS [47–52]. Taip pat buvo sukurti antifosfoserino ir antifosfotreonino antikūnai [43], tačiau jie nebuvo plačiai naudojami dėl mažo specifiškumo.

Norėtume paminėti mokslinį Kemnos ir bendradarbių tyrimą (2007) [53], kurie naudojo imunofiksaciją ir tandeminę MS, kad nustatytų ir apibūdintų hepcidiną serume ir šlapime. Be diagnostikos taikymo, jie ištyrė ir serumo, ir šlapimo mėginių skysčių analitinį atkuriamumą ir biologinius bei ikianalitinius pokyčius. Mėginiai buvo paimti iš sveikų kontrolinių asmenų ir pacientų, kuriems nustatyta geležies stokos anemija, uždegimo sukelta anemija, didžioji talasemija ir paveldima hemochromatozė. Šis svarbus proteominis metodas parodė, kad šlapime yra hepcidino-20, -22 ir -25 izoformų. Hepcidinas-25 serume turėjo tokią pačią aminorūgščių seką kaip hepcidinas-25 šlapime, o hepcidinas-22 serume nebuvo aptiktas. Šiame darbe Kemna ir bendradarbiai (2007) taip pat pastebėjo, kad šlapimo hepcidiną labiau veikia keli užšaldymo-atšildymo ciklai ir laikymo sąlygos, tačiau mažiau įtakos turi paros svyravimai nei serumo hepcidinas.

Barbey ir bendradarbiai (2009) [54] taip pat parengė kitą įdomų mokslinį darbą, kuriame aprašė proteominės analizės, pagrįstos SDS-PAGE, imunoblotu ir masės spektrometrija, rezultatus, skirtus identifikuoti išskiriamus baltymus, kurie skirtingai ekspresuojami 30 m. °C, palyginti su 37 °C, ir esant vidutinei eksponentinei augimo fazei, palyginti su ankstyva stacionaria augimo faze ir antigeniniais baltymais nuo Rhodococcus equi ATCC 33701. Iš viso buvo identifikuoti 48 baltymai, neatsižvelgiant į augimo sąlygas. Cholesterolio oksidazė ChoE yra pagrindinis sekrecinis baltymas. Be to, keturi baltymai atskleidė didelę homologiją su Ag85 komplekso mikolilo transferazėmis. Mycobacterium tuberculosis. 24 baltymai yra transportuojami nuo signalo peptido priklausomu keliu pagal sekos analizės prognozę. Be to, penki antigeniniai baltymai R. equi buvo identifikuoti imunoblotu, įskaitant naują, stipriai imunoreaktyvų baltymą, kurio funkcija nežinoma. Apibendrinant, išaiškinama sekrecija R. equi nustatė keletą skirtingų biologinių funkcijų turinčių baltymų ir naują kandidatą, kuriantį vakcinas nuo R. equi arklių infekcija.

Kita vertus, radioaktyviojo žymėjimo poliakrilamido geliai (P32 ir 2DE) ir 2D fosfopeptidų kartografavimas P32 žymėjimas jau seniai buvo naudojamas imuniniu būdu nusodintų ir geliu atskirtų signalizacijos kompleksų analizei ir diferencijuotai fosforilintų baltymų katijonų kiekybiniam įvertinimui dviem būdais. visų ląstelių lizatų matmenų gelio elektroforezė (2DE). Pastarasis metodas naudoja diferencinį ląstelių žymėjimą P32 ir P33 atitinkamai kontrolinėje ir eksperimentinėje grupėje. Mėginiai sujungiami, o po to atskiriami 2DE, o prieš gelius du kartus veikiant radiacijai jautria plėvele. Palyginus šias dvi ekspozicijas, bus atskleistos dėmės, kurios yra specialiai fosforilintos išbandytomis eksperimentinėmis sąlygomis [55, 56]. Jis matuoja etiketės įtraukimą, bet ne fosforilinimo lygį, nors galima atlikti įdomių tyrimų, skirtų tirti skirtingas to paties baltymo izoformas [57]. Dviejų dimensijų (2D) fosfopeptidų kartografavimas elektroforezės būdu yra dar vienas naudingas metodas, derinamas su plonasluoksne peptidų chromatografija, gauta fosfoproteino proteolizės būdu. Aptiktų dėmių skaičius rodo fosforilinimo vietų skaičių, tačiau nustatyti fosforilinimo vietų padėtį nėra lengva. Nepaisant to, naudojant šį metodą galima analizuoti baltymų fosforilinimo modelio laikinus ir padėties pokyčius skirtingomis fiziologinėmis sąlygomis [58]. Imuninis nusodinimas specifiniais antikūnais prieš fosfopeptidus gali būti naudojamas fosfoproteinų imunoprecipitavimui iš ląstelių lizatų [59].

• Imobilizuota metalo jonų afininė chromatografija (IMAC)

IMAC [60] yra sodrinimo metodas, kuriame naudojami metalų jonai neigiamo krūvio fosfopeptidams užfiksuoti ir praturtinti prieš masių spektrometrinę analizę [61–66]. Paprasti ir sudėtingi mėginiai, kuriuose yra fosfopeptidų ir nefosforilintų peptidų, ištirpinami rūgštiniame tirpale, kad būtų skatinama elektrostatinė sąveika tarp neigiamo krūvio peptidų, daugiausia fosfopeptidų, ir metalo jonų [64]. Fosfopeptidai eliuuojami iš stacionarios fazės naudojant šarminius buferius. Taip pat galima surišti peptidus, kuriuose yra rūgščių aminorūgščių liekanų glutamo rūgšties ir asparto rūgšties su metalo jonais. Ficarro ir bendradarbiai [67] apėjo šią problemą naudodamas IMAC (Fe 3+ ), paversdamas rūgštines aminorūgščių liekanas metilo esteriais. Jie sugebėjo išvalyti ir sekvenuoti šimtus fosfopeptidų iš mielių, nors buvo stipri tendencija į ląstelėje labai išreikštus fosfoproteinus.

Collinsas ir bendradarbiai (2008) [68] išanalizavo pelės priekinių smegenų citozolinį fosfoproteomą, naudodami nuoseklų (baltymų ir peptidų) IMAC gryninimą, fermentinį defosforilinimą ir tikslinės tandeminės masės spektrometrijos analizės strategijas (MS įkalčiais, kuriuos aptarsime vėliau). biologinis tyrimas. Apibendrinant, Collinsas ir kt., (2008) [68], naudojant komplementarias fosforilinimo ir LCMS/MS strategijas, buvo apibūdinta 512 fosforilinimo vietų 540 nereikalingų fosfopeptidų iš 162 citozolinių fosfoproteinų. Šio citozolinių fosfoproteinų duomenų rinkinio baltymų domenų ir aminorūgščių sekos sudėties analizė parodė, kad jis yra žymiai praturtintas vidiniu sekos sutrikimu, kurio praturtėjimas yra susijęs tiek su ląstelių vieta, tiek su fosforilinimo būsena. Dauguma fosforilinimo vietų, kurias aptiko MS, buvo už struktūrinių baltymų domenų ribų (97%). Jos dažniausiai buvo vidinio sekos sutrikimo regionuose (86%). Ilguose sutrikimo regionuose (daugiau nei 40 aminorūgščių ilgio) buvo 368 fosforilinimo vietos, o 94% baltymų buvo bent vienas toks ilgas sutrikimo regionas. Be to, buvo nustatyta, kad 58 fosforilinimo vietos šiame duomenų rinkinyje yra 14-3-3 surišimo konsensuso motyvų linijiniuose motyvuose, kurie yra susiję su nestruktūrizuotomis baltymų sritimis. Šie rezultatai rodo, kad šiame duomenų rinkinyje baltymų fosforilinimas yra išskirtinai išeikvotas baltymų domenuose ir išskirtinai praturtintas netvarkingomis baltymų sekomis ir kad vidinio sekos sutrikimo praturtėjimas gali būti bendras fosfoproteomų bruožas. Tai patvirtina hipotezę, kad netvarkingi baltymų regionai leidžia kinazėms, fosfatazėms ir nuo fosforilinimo priklausomiems baltymams patekti į tikslines sekas, kad reguliuotų vietinę baltymų konformaciją ir aktyvumą.

• Titano dioksido metalo chromatografija (TiO2)

TiO2 taip pat gali surišti neigiamo krūvio fosfatų grupes iš vandeninių tirpalų [65, 69, 70]. TiO2, kaip ir IMAC, susiduria su rūgščių nefosforilintų peptidų (neigiamo krūvio peptidų) surišimo problema. Heckas ir bendradarbiai [65] savo analizėje pastebėjo daugybę nefosforilintų peptidų ir rekomendavo rūgštines liekanas esterinti prieš atliekant MS analizę. Larsenas ir kt. [45, 71, 41] naudojo 2,5-dihidroksibenzenkarboksirūgštį (DHB) su TiO2 ir pasiektas didesnis specifiškumas ir išeiga, lyginant su IMAC (Fe 3+ ), selektyviai sodrinant fosforilintus peptidus iš modelinių baltymų. Taip pat buvo įrodyta, kad naudojant glikolio rūgštį įkrovimo buferyje, daugiau fosfopeptidų prisijungia prie metalo jonų ir daugiau fosfopeptidų galima išplauti naudojant amonio hidroksidą kaip eliuentą. TiO2 stipriai suriša daug fosforilintus peptidus, todėl jų eliuavimas yra sunkus. Tačiau tai labai efektyvus pavieniui fosforilintų peptidų išskyrimo metodas [72].

Craft ir bendradarbių (2007) moksliniai tyrimai [73] yra įdomus TiO taikymo pavyzdys.2 technika, sujungta su kitais proteominiais įrankiais. Amfifizinas I (amphI) yra defosforilinamas kalcineurino nervų galų depoliarizacijos ir sinaptinės pūslelės endocitozės (SVE) metu. Buvo identifikuotos kai kurios amphI fosforilinimo vietos (fosfitai). in vitro tyrimai arba fosfoproteomikos ekranai. Daugialypė strategija, apimanti 32P stebėjimą, kad būtų galima nustatyti visus in vivo Buvo panaudoti amphI fosfitai ir nustatyti jų santykinį gausumą bei galimą svarbą SVE. AmphI buvo ekstrahuotas iš 32P pažymėtų sinaptosomų, fosfopeptidai buvo išskirti iš proteolitinių skaidymų naudojant TiO2 chromatografija ir masių spektrometrija atskleidė 13 vietų: 250, 252, 262, 268, 272, 276, 285, 293, 496, 514, 539 ir 626 serinus ir Thr-310. Jie buvo paskirstyti į dvi grupes aplink prolino turtingą domeną ir C-galo Src homologijos 3 domeną. Hierarchinis Ser-262 fosforilinimas buvo prieš Ser-268, -272, -276 ir -285 fosforilinimą. Neprisijungęs HPLC (aukšto slėgio skysčių chromatografijos arba aukšto slėgio skysčių chromatografijos atskyrimas ir 32P pažymėto amphI dvimatis tripsinis kartografavimas atskleidė, kad Thr-310, Ser-293, Ser-285, Ser-272, Ser-276, ir Ser-268 turėjo didžiausią 32P inkorporaciją ir buvo jautriausi dirgikliui. Atskirai Thr-310 ir Ser-293 buvo daugiausiai fosfositų, kuriuose buvo 16 ir 23 % 32P. Keli fosfopeptidai, kurių sudėtyje yra Ser-268, Ser- 276, Ser-272 ir Ser-285 turėjo 27 % 32P. Buvo gauti bent vienos į proliną nukreiptos baltymų kinazės ir vienos ne prolino kinazės vaidmens įrodymai. Numatyti, kad į proliną nekreipiamoms kinazėms gali būti keturi fosfositai, Ser-626, -250, -252 ir -539 sudėtyje buvo mažai 32P ir jie nereaguoja į depoliarizaciją. Bent viena alternatyviai susijungusi amphI izoforma buvo identifikuota sinaptosomose kaip konstituciškai fosforilinta, nes per 1 ji neįtraukė 32P -h ženklinimo laikotarpis Keli fosfosai Taip pat buvo nustatyti amfikai migruojančių sinaptosominių baltymų, įskaitant SGIP (Src homology 3 domeno augimo faktoriaus, surišto 2 (Grb2) tipo (endofiliną) sąveikaujantį baltymą 1), AAK1, eps15R, MAP6, α/β-adduciną, ir HCN1. Jų rezultatai atskleidė du amphI fosfitų rinkinius, kurie dinamiškai virsta arba konstituciškai fosforilinami nervų galuose, ir jie pagerina atskirų amphI vietų arba fosfitų grupių vaidmens supratimą sinaptiniame SVE.

• IMAC (SIMAC) nuoseklus eliuavimas

Nuoseklus eliuavimas iš IMAC yra naudingas norint išvalyti, aptikti ir apibūdinti fosforilintus peptidus iš sudėtingų biologinių mėginių [72]. Jame remiamasi pastebėjimu, kad monofosforilinti peptidai linkę išsiskirti iš IMAC (Fe 3+ ) rūgštinėmis sąlygomis, o daug fosforilinti peptidai eliuuoja esant aukštam baziniam pH. TiO2 naudojamas nesurištiems monofosforilintiems peptidams surinkti ir išvalyti kombinuotame IMAC sraute ir plovimuose. SIMAC buvo sėkmingai naudojamas tiriant žmogaus kamienines ląsteles.

300 μg) su daugiau nei 300 fosfopeptidų, įskaitant mono ir daugybiškai fosforilintų peptidų identifikavimą [74].

Šią technologiją sukūrė Tine E. Thingholm ir bendradarbiai (2007) [74]. Jie pranešė apie paprastą ir greitą strategiją SIMAC (nuoseklus eliuavimas iš IMAC), naudojant kamienines ląsteles kaip mėginį, kurį reikia tirti, nuosekliam monofosforilintų peptidų atskyrimui ir fosforilintų peptidų padauginimui iš labai sudėtingų biologinių mėginių. Šis tyrimas leido individualiai analizuoti skirtingus fosforilintų peptidų telkinius, naudojant masių spektrometrinius parametrus, skirtingai optimizuotus dėl jų unikalių savybių. Jie palygino fosfoproteomą, identifikuotą iš 120 μg žmogaus mezenchiminių kamieninių ląstelių, naudodami SIMAC ir optimizuotą titano dioksido chromatografijos metodą. Daugiau nei dvigubai daugiau nei bendras nustatytų fosforilinimo vietų skaičius buvo gautas naudojant SIMAC, visų pirma dėl 3 kartus padidėjusio dauginamos fosforilinimo peptidų atkūrimo.

• Cirkonio dioksidas (ZrO2)

ZrO naudingumas2 fosfopeptidų išskyrimas prieš masių spektrometrinę analizę buvo įrodytas [75]. Lyginant su TiO2 naudojant α ir ß kazeiną kaip baltymų modelius, ZrO2 galėjo išskirti pavieniui fosforilintus peptidus selektyviau nei TiO2. Įdomų tyrimą atliko Houjiang Zhou ir kt (2007) [76], kur didelis šio metodo specifiškumas taip pat buvo įrodytas fosfopeptidų išskyrimu iš modelinių fosfoproteinų virškinimo. Stiprus ZrO giminingumas2 nanodalelių pavertimas fosfopeptidais leidžia specifiškai praturtinti fosfopeptidus iš sudėtingo peptidų mišinio, kuriame fosfopeptidų gausa yra dviem dydžiais mažesnė nei nefosfopeptidų. ZrO2 nanodalelės buvo toliau naudojamos selektyviai izoliuoti fosfopeptidus iš pelių kepenų lizato skaidymo triptiniu būdu, kad būtų galima atlikti fosfoproteomų analizę naudojant nanolitrų LC MS/MS (nano-LC-MS/MS) ir MS/MS/MS. Rankinis patvirtinimas, naudojant daugybę griežtų kriterijų, iš viso nustatė 248 apibrėžiančias fosforilinimo vietas ir 140 fosforilintų peptidų. Todėl ZrO2 buvo sėkmingai naudojamas didelio masto fosfoproteinų apibūdinimui iš pelių kepenų mėginių (

1 mg) [76]. Šiame tyrime iš viso buvo nustatytos 248 fosforilinimo vietos ir 140 fosforilintų peptidų.

• Kalcio fosfato nusodinimas

Tai strategija, suteikianti naudingą išankstinio frakcionavimo žingsnį, siekiant supaprastinti ir praturtinti fosfopeptidus iš sudėtingų mėginių. Zhang ir bendradarbiai [77] įrodė, kad fosfopeptidų nusodinimas kalcio fosfatu kartu su dviejų pakopų IMAC (Fe 3+ ) procedūra leido pastebėti padidėjusį fosfopeptidų skaičių. Šis metodas susideda iš fosfopeptidų nusodinimo pridedant 0,5 M NaHPO4 ir 2 M NH3OH į peptidų mišinį, po to 2 M CaCl2. Mėginys sumaišomas ir centrifuguojamas, o po to supernatantas pašalinamas prieš plaunant nuosėdas 80 mM CaCl.2. Išplautos nuosėdos ištirpinamos 5% skruzdžių rūgšties, o gautas peptidų mišinys nudruskinamas atvirkštinės fazės chromatografijos būdu prieš išskiriant fosfopeptidus IMAC (Fe 3+).

Zhang ir bendradarbiai [77] atkreipia dėmesį į tai, kad net naudojant labai sudėtingus biologinius mėginius, tokius kaip bendras fermentinis ryžių embriono baltymų virškinimas, galima pasiekti didelį fosfopeptidų praturtinimą minimaliai užteršant ne fosfopeptidais. Be to, būtų įmanoma sumažinti mėginių sudėtingumą nuosekliai sodrinant IMAC, naudojant ribotą kiekį IMAC medžiagos kiekviename etape. Šis metodas parodo, kad serijinis fosfopeptidų sodrinimas, inicijuotas nusodinimo etapu, pagerina fosfopeptidų sodrinimo selektyvumą ir leidžia identifikuoti daugiau fosfopeptidų. Be to, Zhangas ir bendradarbiai teigia, kad dabar atliekama tolesnė analizė, skirta išsamiai ištirti ryžių fosfoproteomą. Be to, jis gali būti taikomas klinikiniams fosfoproteomikos klinikiniams tyrimams.

• Stiprūs katijonų ir anijonų mainai (SCX ir SAX)

SCX/SAX fosfopeptido sodrinimo principas pagrįstas fosfopeptidų neigiamo krūvio fosfatų grupe (PO 4-). Atliekant katijonų mainų chromatografiją, teigiamai įkrauta analitė pritraukiama prie neigiamo krūvio kieto pagrindo, o anijonų mainų chromatografijoje neigiamo krūvio molekulės pritraukiamos prie teigiamai įkrauto kieto nešiklio. SAX anksčiau buvo sėkmingai derinamas su IMAC [66] ir dėl to MS geriau atkūrė ir identifikavo monofosforilintus peptidus, kilusius iš membraninių baltymų. Panašiu būdu SCX buvo derinamas su IMAC (Fe 3+ ) ir MS analize, leidžiančia identifikuoti tūkstančius fosforilintų likučių iš sudėtingų biologinių mėginių [78]. Be to, Gruhleris ir bendradarbiai [78] įrodė, kad SCX / IMAC derinio naudojimas atitinka jų ankstesnį tyrimą, kuriame buvo naudojama stipri anijonų mainų chromatografija / IMAC. Taigi, norint sumažinti mėginio sudėtingumą prieš IMAC sodrinant fosfopeptidus didelio masto fosfoproteomikoje, galima naudoti stiprią anijonų mainų chromatografiją (SAX) arba SCX.

Kalbant apie praktinius klausimus, Nuhse ir kt., 2003 [66], ištyrė ir pateikė dvimačio peptidų atskyrimo schemą, naudojant SAX chromatografiją prieš IMAC (Fe 3+ ), siekiant sumažinti IMAC išgrynintų fosfopeptidų sudėtingumą ir gauti plačią monofosforilintų peptidų aprėptį. Nuhse ir bendradarbiai iš tikrųjų gavo didelį derlių nustatydami fosfopeptidus iš membraninių baltymų. SCX taip pat buvo sėkmingai naudojamas kartu su IMAC (Fe 3+ ) ir MS analize, leidžiančia identifikuoti tūkstančius fosforilintų likučių iš biologinių kompleksinių mėginių [78, 79]. Gruhleris ir bendradarbiai parodė, kad atliekant SCX esant žemam pH (2,7–3,0), fosforilinti peptidai yra atskiriami nuo nefosforilintų rūšių pagal krūvio skirtumą, susijusį su neigiamai įkrauta fosfatų grupe. Todėl grynieji įkrauti peptidai (+1) buvo surinkti pirmosiose SCX prefrakcijos pakopos frakcijose, kuriose daugiausia yra pavienių fosforilintų peptidų. Šios pirmosios frakcijos buvo įkeltos į IMAC (Fe 3+ ) mikro antgalius, kad iš biologiškai sudėtingų mėginių būtų atgauta daug fosfopeptidų.

• Hidrofilinės sąveikos chromatografija (HILIC)

Hidrofilinės sąveikos chromatografija (HILIC) yra rečiau naudojamas peptidų frakcionavimo metodas, nepaisant to, kad jis dažnai naudojamas smulkiems metabolitams frakcionuoti. HILIC paprastai apibūdinama kaip padalijimo chromatografija arba skysčio/skysčio ekstrahavimo sistema tarp mobiliosios ir stacionarios fazės. Poliarinės stacionarios fazės paviršiuje susidaro vandens neturtingas judriosios fazės sluoksnis, palyginti su vandens turtingu sluoksniu. Taigi analitės pasiskirstys tarp šių dviejų sluoksnių. Be to, HILIC apima silpnus elektrostatinius mechanizmus, taip pat vandenilio donorų sąveiką tarp neutralių polinių molekulių esant didelėms organinės eliuavimo sąlygoms. Tai išskiria HILIC nuo jonų mainų chromatografijos – pagrindinis HILIC atskyrimo principas yra pagrįstas junginio poliškumu ir išsigelbėjimo laipsniu. Poliškesni junginiai turės stipresnę sąveiką su nejudančiu vandeniniu sluoksniu nei mažiau poliniai junginiai, todėl jų sulaikymas bus stipresnis.Be to, HILIC rodo labai gerą kritinių junginių, tokių kaip adenozinas ir jo fosfato dariniai, atskyrimą ir smailės formą.

Įdomu pastebėti, kad Alburquerque ir bendradarbiai (2008) [80] atliko tyrimą, susijusį su nefosforilintų peptidų atskyrimu naudojant SCX, HILIC ir RP-HPLC, nurodydami, kad tarp HILIC ir RP-HPLC gali susidaryti geresnis ortogoninis atskyrimas. RP-HPLC nefosforilintiems peptidams. Stebėtas ortogoninis HILIC ir RP-HPLC atskyrimas tikriausiai atspindi skirtingus jų atskyrimo mechanizmus. Nors RP-HPLC priklauso nuo sąveikos su hidrofobinėmis aminorūgščių šoninėmis grandinėmis, HILIC priklauso nuo sąveikos su tomis hidrofilinėmis ir galbūt įkrautomis aminorūgščių liekanomis per vandenilio ryšį ir jonines sąveikas. Be to, kadangi fosfopeptidai paprastai yra hidrofiliniai ir įkrauti, galima tikėtis, kad fosfopeptidai turėtų stipriau sąveikauti su HILIC nei nefosforilinti peptidai. Taigi turėtų būti įmanoma atskirti fosfopeptidus naudojant HILIC.

Dean E. McNulty ir Roland S. Annan (2008) [81] pranešė apie hidrofilinės sąveikos chromatografijos (HILIC) naudojimą kaip daugiamatės chromatografijos proteomikos strategijos dalį. HeLa ląstelių triptinių virškinamų medžiagų analizė davė baltymų identifikavimo skaičių, panašų į tuos, kurie buvo gauti naudojant stiprų katijonų mainą. Jie taip pat parodo, kad HILIC yra reikšmingas fosfoproteomikos analizės pažanga. Tiesą sakant, jie išnaudojo stiprų fosfatų grupės hidrofiliškumą, kad selektyviai praturtintų ir frakcionuotų fosfopeptidus, remdamiesi padidėjusiu jų sulaikymu HILIC sąlygomis. Be to, šiame tyrime HILIC frakcijų fosfopeptidų praturtinimas IMAC parodė daugiau nei 99% selektyvumą. Tai buvo pasiekta nenaudojant derivatizacijos ar cheminių modifikatorių. 300 μg HeLa ląstelių lizato ekvivalente buvo nustatyta daugiau nei 1000 unikalių fosforilinimo vietų. Į HeLa fosfoproteomą buvo įtraukta daugiau nei 700 naujų vietų.

• Atvirkštinės fazės chromatografija

Visi fosforilinti baltymai ir fosfopeptidai gali būti sujungti su atvirkštinės fazės chromatografija. Vėliau daugumą fosfoproteinų-fosfopeptidų analizių šiais laikais atlieka MS. Kadangi MS metodas yra jautrus teršalams, pvz., druskoms, prieš analizę būtina išvalyti mėginius, paprastai taikant atvirkštinės fazės chromatografiją, sujungiant PORO R3 su C18 diskais ir grafito milteliais [82–84]. Poros R3, C18 diskai ir grafito milteliai yra medžiagos, turinčios ilgas angliavandenilių grandines, kurios, kaip įrodyta, yra veiksmingos labai hidrofilinių peptidų, įskaitant fosfopeptidus, nušalinimui ir valymui [71, 85]. 1999 m. Gobomas ir bendradarbiai [82] pristatė mikrokolonėlės valymo metodą, kai chromatografinė derva buvo supakuota į mažo susiaurėjusio GELoader antgalio galą, sukuriant mikrokolonėlę. Naudojant GELoader antgalius, užpildytus R3, C18 arba grafito medžiaga, teršalus, tokius kaip druskos, galima atskirti nuo fosfopeptidų naudojant chromatografinį metodą. Iš tikrųjų, naudojant RP chromatografiją, molekulės, tokios kaip baltymai, peptidai ir nukleorūgštys, yra atskiriamos pagal jų hidrofobiškumą. Be druskų pašalinimo, šie metodai taip pat palengvina mėginio koncentravimą naudojant mažą eliuavimo tūrį. Tai papildomas tolesnės masės spektrometrinės analizės jautrumo ir kokybės patobulinimas. RP chromatografija paprastai yra susieta su visais anksčiau aprašytais fosfoproteinų ir fosfopeptidų sodrinimo metodais.

• Dabartinės fosforilintų baltymų aptikimo metodikos – privalumai ir apribojimai

Yra keletas analitinių fosforilinimo analizės metodų, ty Edmano sekos nustatymas ir 32P-fosfopeptido kartografavimas fosforilinimo vietoms nustatyti, tačiau šie metodai neleidžia atlikti didelio našumo analizės arba reikalauja labai daug darbo reikalaujančių operacijų [86]. galima sukurti didelio našumo fosforilintų baltymų likučių masinės spektrometrijos (MS) analizę [67, 78]. Kita vertus, fosfospecifiniai antikūnai yra įprastai naudojami imuniniam nusodinimui ir todėl praturtinami fosforilintais baltymais iš sudėtingų mišinių [87], tačiau šiuo metu nėra komercinių antikūnų, kurie būtų tinkami praturtinti visus fosforilintus baltymus, taigi ir šiuos baltymus. turi būti išgrynintas arba praturtintas iš sudėtingų mišinių, naudojant alternatyvius metodus [88]. Atliekant baltymų kompleksinių mišinių skaidymą gelyje arba tirpale tripsinu, gauti fosfopeptidai ir nefosfopeptidai gali būti įkeliami į skirtingas metalo jonų chromatografijas (t. y. imobilizuotą metalo jonų afininę chromatografiją IMAC (Fe 3+ ) ir titano dioksido TiO2 [71] siekiant praturtinti fosfopeptidais. Prisodrintą tirpalą taip pat galima apdoroti įvairiomis atvirkštinių fazių chromatografijomis (pvz., grafito milteliai [89], POROS R3 [88], kad būtų išvalyti ir nudruskyti anksčiau išplauti fosfopeptidai. Be to, tokios chromatografijos sumažins fosforilintų peptidų slopinimą masių spektruose.

Naudojant IMAC (Fe 3+) ir (TiO2) [71] ir (ZrO2) [1], neigiamo krūvio fosfopeptidai išgryninami dėl jų afiniteto teigiamai įkrautiems metalų jonams, tačiau kai kurie iš šių metodų susiduria su rūgščių, nefosforilintų peptidų surišimo problema. Ficarro ir bendradarbiai [67] apėjo šią problemą IMAC (Fe 3+ ), paversdami rūgštinius peptidus metilo esteriais, tačiau padidino spektro sudėtingumą ir reikalavo mėginio liofilizavimo, o tai ypač sukelia fosfopeptidų adsorbcijos nuostolius [90]. Ficarro ir kt., sugebėjo sekti šimtus fosfopeptidų iš mielių, įskaitant Slt2p kinazę, tačiau iš kinazių nustatytų fosforilintų liekanų lygis buvo žemas, palyginti su fosfoproteinų, labai ekspresuojamų ląstelėje, lygis. Neseniai TiO2 chromatografija naudojant 2,5-dihidroksibenzenkarboksirūgštį (DHB) buvo įdiegta kaip perspektyvi Larseno strategija. ir kt., [71]. TiO2/DHB, lyginant su IMAC (Fe 3+ ), buvo didesnis specifiškumas ir išeiga, skirta selektyviai praturtinti fosforilintus peptidus iš modelinių baltymų (t. y. galvijų laktoglobulino, galvijų kazeino). Be to, SIMAC buvo sukurtas siekiant didesnio efektyvumo nei IMAC ir TiO2 siekiant išskirti kuo daugiau fosfopeptidų [74].

Tai, kad daugiausia fosfopeptidai iš labai išreikštų baltymų ląstelėse gali būti išgryninti, o tie iš fosforilintų baltymų, kurių ekspresija yra žema (ty kinazių), taip gerai nesijungia su tomis dervomis, yra dar vienas svarbus apribojimas, susijęs su fosfo sodrinimo metodais. dalis šios rūšies baltymų arba, kita vertus, turimas jų kiekis jungiasi su metalo jonais, nors to nepakanka, kad jį aptiktų MS. SCX derinys su IMAC (Fe 3+ ) buvo įrodytas ant mielių, todėl buvo nustatyta daug fosforilintų likučių (daugiau nei 700, įskaitant Fus3p kinazę) [78]. Nors buvo nustatyta daugiau nei 100 signalinių baltymų ir funkcinių fosforilinimo vietų, įskaitant receptorius, kinazes ir transkripcijos faktorius, buvo aišku, kad buvo atskleista tik dalis fosfoproteomo [78]. Be to, naujausi HILIC deriniai su IMAC (Fe 3+ ) buvo įrodyta klinikiniais tyrimais (HeLa mėginiais), kurių rezultatas buvo didelis fosforilintų likučių skaičius (1000) [81].

Neabejotinai būtina tobulinti metodikas, skirtas praturtinti kinazių fosforilintais likučiais. Tačiau tai nėra paprasta dėl kelių priežasčių: (a) mažas tų signalizuojančių molekulių gausa ląstelėse, (b) streso / stimuliacijos trukmė, nes bet kuriuo metu yra prieinama tik nedidelė fosforilintų kinazių dalis. stimulo rezultatas. Laiko adaptacija per signalizacijos kelius taip pat yra svarbus ir greitas kinazių fosforilinimo veiksnys [91].

• Santrauka – fosfoproteinų ir fosfopeptidų praturtinimas, pagrįstas elektrostatinėmis sąveikomis

Dažniausiai naudojami individualaus ir (arba) visuotinio fosforilinimo sodrinimo būdai yra IMAC ir titano dioksidas (TiO).2) [45], kurie yra pagrįsti dideliu teigiamai įkrautų metalų jonų afinitetu. Tačiau karboksilato grupių pavertimas esteriais veiksmingai pašalina nespecifinį nefosforilintų peptidų susilaikymą, nors tai yra trūkumas dėl padidėjusio sudėtingumo tolesnėje MS analizėje.

Per pastaruosius penkerius metus titano dioksidas (TiO2) pasirodė kaip labiausiai paplitęs metalo oksido afiniteto chromatografija (MOAC) pagrįstas fosfopeptidų sodrinimo metodas. Šis metodas suteikia didesnį pajėgumą, palyginti su IMAC dervomis, siekiant surišti ir eliuuoti monofosforilintus peptidus. TiO2 naudoja tą patį principą kaip IMAC ir yra panašiai linkęs į nespecifinį rūgščių nefosforilintų peptidų susilaikymą. Tačiau įkeliant peptidus į 2,5-dihidroksibenzenkarboksirūgštį (DHB) [71], glikolio ir ftalio rūgštis, nespecifinis prisijungimas prie TiO2 sumažinamas, taip pagerinant fosfopeptidų sodrinimą be cheminio mėginio modifikavimo. Be to, TiO2 dažnai laikomas pakeičiamu su IMAC. Jis veikia su panašiais mėginių kiekiais (pvz., mikrogramais baltymų), kad būtų galima identifikuoti fosfo vietas pagal MS analizę. Neseniai SIMAC [72, 74] pasirodė kaip fosfopeptidų sodrinimo įrankis, kuris išnaudoja IMAC, sujungto su TiO, savybes.2, leidžianti atlikti išsamesnius tyrimus. Kitas fosfopeptido sodrinimas prieš masės spektrometrinę analizę yra ZrO2 [75], o jo principas pagrįstas metalų giminingumo chromatografija, tokia kaip IMAC ir TiO2. ZrO2 leidžia išskirti pavienius fosforilintus peptidus selektyviau nei TiO2. Tiesą sakant, jis buvo sėkmingai naudojamas didelio masto fosfoproteinų apibūdinimui [66, 78–80]. Be to, strategijos, kurias sudaro fosfopeptidų frakcionavimas ir vėliau praturtinimas plačiu proteomų mastu, yra pagrįstos stipria katijonų / anijonų mainų (SCX ir SAX) chromatografija ir HILIC sąveikos chromatografija. Kalcio fosfato nusodinimas taip pat yra naudingas išankstinio frakcionavimo etapas, siekiant supaprastinti ir praturtinti fosfopeptidus iš sudėtingų mėginių, kuriuos galima prijungti prie IMAC [77].

B.3. Proteominiais metodais išskirti fosfopeptidai – MS analizė

Fosforilinimas ant serino ir treonino liekanų yra labilus, o įprastinė CID (susidūrimo sukelta disociacija) fragmentacija paprastai sukelia dalinį neutralų fosforo rūgšties (H) praradimą.3PO4, 98/z) MS2 režimu, dėl fosforo-esterio jungties dujinės fazės β-eliminacijos. Todėl susidaro dehidroalaninas ir dehidroaminosviesto rūgštis. Kai peptidų jonai suskaidomi CID, susidaro eilė y ir b jonų [92, 93]. Koreliuojant masių skirtumą tarp smailių y-jonų serijoje arba tarp smailių b-jonų serijoje su aminorūgščių liekanų masėmis, gaunama peptidų seka. CID suskaidymas vyksta peptido pagrinde ir gaunama tik ribota sekos informacija. Šis įvykis taip pat gali pakenkti fosforilinimo vietų identifikavimui. Kalbant apie fosfotirozino likučius, MS2 režimu taip pat stebimas dalinis neutralus praradimas (HPO3, 80/z), tačiau fosfatų grupė ant tirozino liekanų yra stabilesnė nei ant serino ir treonino liekanų. Be to, fosfotirozinui būdingas fosfotirozino pirštų atspaudas yra fosfotirozino amonio jonas (

216 Da), tai yra teigiamas tirozino fosforilinto peptido buvimo rodiklis [94, 95]. Jonas, atsirandantis dėl neutralaus fosforo rūgšties praradimo (H3PO4) galima pasirinkti tolesniam suskaidymui MS3 režimu. Po neutralių nuostolių suskaidymo pasirinktas jonas automatiškai parenkamas tolesniam suskaidymui. Tai leidžia pridėti papildomos energijos peptidų stuburo suskaidymui. Tačiau MS3 režimas reikalauja, kad serino ir treonino liekanų fosforilinimas būtų labilus, o įprastinė fragmentacija CID (susidūrimo sukelta disociacija) paprastai sukelia dalinį neutralų fosforo rūgšties (H) praradimą.3PO4, 98/z) MS2 režimu, dėl fosforo-esterio jungties dujinės fazės β-eliminacijos. Todėl susidaro dehidroalaninas ir dehidroaminosviesto rūgštis. Kai peptidų jonai suskaidomi CID, susidaro eilė y ir b jonų [92, 93]. Peptidų seka gaunama koreliuojant masių skirtumą tarp smailių y-jonų serijoje arba tarp smailių b-jonų serijoje su aminorūgščių liekanų masėmis. CID suskaidymas vyksta peptido pagrinde ir gaunama tik ribota sekos informacija. Šis įvykis taip pat gali pakenkti fosforilinimo vietų identifikavimui. Kalbant apie fosfotirozino likučius, taip pat stebimas dalinis neutralus nuostolis (HPO3, 80/z) MS2 režimu, tačiau fosfatų grupė ant tirozino liekanų yra stabilesnė nei ant serino ir treonino liekanų. Be to, fosfotirozinui būdingas fosfotirozino pirštų atspaudas yra fosfotirozino amonio jonas (

216 Da), kuris yra teigiamas tirozino fosforilinto peptido buvimo rodiklis [94, 95]. Jonas, atsirandantis dėl neutralaus fosforo rūgšties praradimo (H3PO4) galima pasirinkti tolesniam suskaidymui MS3 režimu. Pasirinktas jonas po neutralių nuostolių suskaidymo automatiškai parenkamas tolesniam suskaidymui. Tai leidžia pridėti papildomos energijos peptidų stuburo suskaidymui. Tačiau MS3 režimas reikalauja, kad pasirinktas jonas būtų gausus, kad būtų galima stebėti suskaidytus jonus. Pseudo-MS3 plėtra yra MultiStage Activation (MSA) [96], kuri buvo įdiegta kvadrupolio IT ir linijinio IT orbitrapuose. MSA pirmtako jono suskaidymas vyksta tuo pačiu metu, kai suskaidomas jonas, atsirandantis dėl neutralaus nuostolio. Tada MS2 ir MS3 masės duomenys sujungiami į hibridinį spektrą, todėl gaunama geresnė sekos informacija ir pagerėjo priklausomybė nuo fosforilinimo vietos priskyrimo. Alternatyvios CID fragmentacijos yra ECD (elektronų surinkimo disociacija) ir ETD (elektronų perdavimo disociacija). Taikant ECD, radikalių peptidų jonai gaunami, kai daugkartinio krūvio peptidų jonai yra normuojami mažos energijos šiluminiais elektronais. Be to, šis suskaidymas vyksta peptide tarp pagrindinio amido ir alfa anglies, sukuriant c ir z jonus [97]. ECD privalumas yra tas, kad jis atsiranda tik peptido pagrinde, o labilios fosfatų grupės lieka nepažeistos ant susidariusių c ir z fragmentų jonų, todėl galima nustatyti specifines fosforilinimo vietas. Todėl jis yra labai naudingas daugkartinio fosforilinimo peptidų analizei. ECD trūkumas yra jo selektyvumas disulfidinėms jungtims dėl didelio jungties radikalinio giminingumo [98, 99]. Pagrindinis ECD trūkumas yra tas, kad jis naudojamas tik Furjė transformacijos jonų ciklotrono rezonanso (FT-ICR) prietaisuose, nes šiluminiams elektronams reikalingas statinis magnetinis laukas, o tai reiškia dideles išlaidas ir didelę specializaciją. c- ir z- jonai taip pat generuojami ETD. Šis suskaidymas iš tikrųjų buvo sukurtas siekiant atlikti į ECD panašius disociacijos eksperimentus keturpolio linijinio jonų gaudyklėje [96, 100]. ETD yra cheminis procesas, kurio metu reakcija su fluoranteno radikalų anijonais reguliariais intervalais pažeidžia peptido pagrindą. ETD išsaugo nepažeistą informaciją apie labilius modifikacijas, kurios nėra tiesiogiai stebimos naudojant CID. Pavyzdžiui, fosfato grupės yra geros paliekančios grupės, o tai reiškia, kad jos lengvai prarandamos sužadinimo procese. Tačiau naudojant ETD galima tiesiogiai stebėti fragmentus, kuriuose yra nepažeistų fosfopeptidų. ETD trūkumas yra tas, kad jis yra mažiau jautrus, palyginti su CID, dėl mažesnio jonizacijos efektyvumo. Todėl rekomenduojame pradėti naudoti CID ir rekomenduojame pereiti prie ETD, jei negalėsite nustatyti fosforilinimo vietos.

(C) Kiekybinės proteominės metodikos, naudojamos klinikiniuose tyrimuose, atitinkamų tiriamų fosforilintų baltymų pavyzdžiai

Fosfopeptidams baltymai, turintys aminorūgščių su vienu ar daugiau stabilių 2H, 13C, 15N arba 18O izotopų, gali būti naudojami kaip vidiniai standartai, ankstyvoje analizės stadijoje pridedant kompleksinio baltymo mėginio. Yra du būdai, kaip įterpti stabilų izotopą į baltymus arba peptidus: metabolinis ženklinimas naudojant visas kultūroje išaugintas ląsteles (pvz., SILAC) arba cheminis žymėjimas (pvz., iTRAQ, ICAT). Kadangi baltymų fosforilinimas yra labai dinamiškas ir nuolat kinta per visą ląstelės gyvenimą, fosforilinimo pokyčių matavimas yra labai svarbus norint suprasti fosforilinimo įvykio biologiją, čia aptariame keturias MS pagrįstas kiekybinio nustatymo strategijas, kurios yra tiesiogiai naudingos matuojant pokyčius. baltymų fosforilinimas: SILAC, iTRAQ, AQUA ir MRM. Kiti cheminio ženklinimo būdai, kurie priklauso nuo stabilaus izotopų įtraukimo, naudojant pvz. 18 O pažymėtas vanduo skaidant tripsiną ir įtraukiant stabilius izotopus ICAT taip pat gali būti laikomas turinčiu atitinkamos informacijos, bet čia jis nebus aprašytas. Be to, mes taip pat įtrauksime 2-D fluorescencijos skirtumo gelio elektroforezės (2D_DIGE) kiekybinio nustatymo metodikos paaiškinimą ir pavyzdžius, kurie šiais laikais taip pat suteikia įdomių tyrimų.

C.1. Stabilus izotopų ženklinimas aminorūgštimis ląstelių kultūroje (SILAC)

Stabilių izotopų žymėjimas aminorūgštimis ląstelių kultūroje (SILAC) yra kiekybinis metodas, pagrįstas baltymų ženklinimu ląstelių kultūrose in vivo aminorūgštimis, kuriose yra stabilių izotopų (neradioaktyvių, pvz., 2 H, 13 C ir 15 N) [57, 101]. Paprasčiausia forma, dvi atskirtos ląstelių kultūros auginamos poromis, pavyzdžiui, kultūra A gali būti mielių ląstelės, auginamos „įprastomis“ sąlygomis (šviesos sąlygomis), o kultūra B gali būti mielių ląstelės, auginamos esant stresui. sąlyga. Ląstelių augimo sąlygos yra identiškos (išskyrus streso dirgiklius), tačiau B kultūros augimo terpėje yra nepakeičiama aminorūgštis (viena, kurios nesintetina ląstelė), kuri yra pakeista izotopiškai „sunkia“ šios aminorūgšties forma. rūgštis (pvz., 13 C6- argininas). SILAC eksperimentams buvo panaudotos kelios ląstelių linijos, o ląstelių augimui ir morfologijai izotopiškai pažymėta aminorūgštis įtakos neturėjo [78, 101, 102].

Po maždaug penkių padvigubinimo raundų ląstelių baltymai iš esmės yra 100% pažymėti pasirinkta aminorūgštimi. Po kultivavimo lengvųjų ir sunkiųjų ląstelių populiacijos sujungiamos (1:1) į vieną telkinį ir išskiriami baltymai. Tada baltymų telkinys virškinamas proteaze, paprastai tripsinu, kad susidarytų peptidų telkinys, kurį analizuoja MS. Kiekvienas analizuojamas peptidas bus dviejų formų: lengvas ir sunkus. Jie skiriasi pagal masės skirtumą dėl sunkiųjų izotopų įtraukimo į pasirinktą aminorūgštį. SILAC metodas yra suderinamas su aukščiau minėtu fosfoproteinų / fosfopeptidų praturtinimu, įskaitant tikslinio baltymo imunoprecipitaciją [103]. Gruhleris ir jo bendradarbiai (2005) pateikė vieną iš pirmųjų tyrimų, kuriuose buvo atlikta ši technologija [78].Šiame tyrime buvo nustatyta daugiau nei 700 fosfopeptidų iš Sacharomyces cerevisiae, 139 buvo skirtingai reguliuojami bent 2 kartus, reaguojant į poravimosi feromoną. Tarp šių reguliuojamų baltymų buvo komponentai, priklausantys mitogeno aktyvuotam baltymų kinazės signalizacijos keliui ir tolesniems procesams, įskaitant transkripcijos reguliavimą, poliarizuoto augimo nustatymą ir ląstelių ciklo reguliavimą.

C.2. Izobarinė santykinio ir absoliutaus žyma (iTRAQ)

Antrasis visuotinio baltymų ir baltymų modifikacijų kiekio nustatymo metodas yra cheminio ženklinimo in vitro procedūra, vadinama iTRAQ. iTRAQ reagentas susideda iš dviejų iki aštuonių izobarinių žymenų, kurios gali būti naudojamos dviem ar aštuoniems atskiriems baltymų mėginiams pažymėti. iTRAQ žymenys turi tris sritis: peptidų reaktyviąją sritį, reporterio sritį ir pusiausvyros sritį [104]. Peptidų reaktyvioji žymens sritis susideda iš NHS esterio ir yra skirta reaguoti su peptidų N-galais ir lizinais po proteazių skaidymo. 4-plex iTRAQ atveju keturios reporterių grupės rodomos tandemo masių spektre, kai m/z yra 114, 115, 116 ir 117. Pridėtos svarstyklių grupės sukurtos taip, kad bendra svarstyklių ir pranešimų grupės masė būtų 145 Da kiekvienai žymai, dėl to susidaro atitinkamai 31 Da, 30 Da, 29 Da ir 28 Da balanso grupės. Baltymų mėginiai, skirti kiekybiniam įvertinimui, yra atskirai išskiriami ir virškinami proteolitiškai, o kiekvienas mėginys chemiškai paženklinamas vienu iš iTRAQ reagentų. Po ženklinimo mėginiai sujungiami ir vėliau analizuojami MS. Identiškų peptidų iš kiekvieno mėginio masė bus vienoda, nes iTRAQ reagentai yra izobariniai. Sodrinimo strategijos, pvz., IMAC [44, 105] arba imunoprecipitacija anti-fosfotirozino antikūnais [44], buvo naudojamos siekiant pašalinti nefosforilintus peptidus, kad analizė būtų sutelkta į specifinį fosforilinimą. Kadangi iTRAQ yra in vitro ženklinimo procedūra, ji taip pat gali būti taikoma klinikiniams mėginiams, tokiems kaip naviko audiniai ir skysčiai (pvz., serumas, šlapimas, kraujas). iTRAQ buvo apibūdintas kaip labai galingas fosforilinimo kiekybinio nustatymo metodas proteominiu mastu. Kaip atitinkamą pavyzdį minime, kad Boja ir bendradarbiai (2009) [106] sėkmingai stebėjo mitochondrijų baltymų, įskaitant adenino nukleotidų translokazę, malato dehidrogenazę ir mitochondrijų kreatino kinazę, fosforilinimo vietas. Iš jų keturi baltymai pasižymėjo fiziologiniais fosforilinimo pokyčiais. dirgikliai: (a) BCKDH-E1α subvienetas padidino fosforilinimą Ser337 su DCA ir energijos pašalinimą (b) apoptozę sukeliančio faktoriaus fosforilinimas buvo padidintas Ser345 su kalcio (c) ATP sintazės F1 komplekso α subvienetu ir (d) mitofilino dephos5 serosphofilin. ir Ser264 išjungus energiją. Šis patikrinimas patvirtino iTRAQ / HCD technologiją kaip mitochondrijų baltymų fosforilinimo funkcinio kiekybinio nustatymo metodą, taip pat suteikiant įžvalgų apie mitochondrijų reguliavimą fosforilinant.

C.3. Absoliutus kiekybinis nustatymas (AQUA)

AQUA strategija suteikia absoliutų dominančio baltymo kiekybinį įvertinimą [107]. Taikant AQUA metodą, iš dominančio baltymo sintetiniu būdu konstruojamas peptidas, turintis stabilių izotopų, o izotopiniu būdu pažymėtas sintetinis peptidas vadinamas AQUA peptidu. Sintetiniai peptidai gali būti sintetinami naudojant modifikacijas, tokias kaip fosforilinimas, kad būtų galima tiesiogiai, kiekybiškai analizuoti po transliacijos modifikuotus baltymus. Stabilūs izotopai yra įtraukiami į AQUA peptidą, naudojant izotopiškai „sunkias“ aminorūgštis įdomaus peptido (natūralaus peptido) sintezės proceso metu. Tokiu būdu sintetinis peptidas turi masės padidėjimą pvz. 10 daltonų, dėl 13C6 ir 15N4-arginino įtraukimo į sintetinį peptidą, palyginti su natūraliu peptidu. Nors masių skirtumas tarp natūralaus ir sintetinio peptido leidžia masių spektrometrui atskirti dvi formas, abi formos turi tas pačias chemines savybes, todėl chromatografinis sulaikymas, jonizacijos efektyvumas ir fragmentacijos pasiskirstymas yra vienodi. AQUA eksperimentuose žinomas kiekis izotopiniu būdu pažymėto peptido pridedamas prie baltymų mišinio, kuris proteolitiškai virškinamas ir vėliau analizuojamas MS. Kadangi natūralus peptidas ir jo sintetinis atitikmuo turi tas pačias chemines savybes, kiekybiškai įvertinto sintetinio peptido MS signalą galima palyginti su natūralaus peptido signalu. Taigi pagaliau leidžiama nustatyti absoliutų peptido kiekį [108]. Keli AQUA peptidai gali būti naudojami norint nustatyti kelių baltymų kiekį viename eksperimente.

Ziwei Yu ir bendradarbiai (2007) [109], naudodami AQUA kaip naują kiekybinės baltymų ekspresijos analizės in situ sistemą, ištyrė fosforilinto Akt (p-Akt) baltymų ekspresijos lygius. Akt aktyvinimas navikuose yra tarpininkaujamas keliais mechanizmais, įskaitant ląstelių membranos receptorių tirozino kinazių, tokių kaip EGFR, aktyvavimą ir fosfatazės PTEN praradimą defosforilinant fosfoinozitolio trifosfatą. Ziwei ir bendradarbiai (2007) išsiaiškino, kad Akt aktyvacija sergant burnos ir ryklės plokščiųjų ląstelių karcinoma (OSCC) yra susijusi su nepalankiomis pacientų baigtimis, o tai rodo, kad Akt yra perspektyvus molekulinis taikinys sergant burnos ir ryklės plokščialąsteline karcinoma.

C.4. Kelių reakcijų stebėjimas (MRM)

MRM yra labai jautrus metodas aptikti fosforilintus peptidus naudojant hibridinį trigubo kvadrupolio linijinio jonų gaudyklės masės spektrometrą (qTRAP). Šis metodas reikalauja, kad būtų žinoma baltymo seka, kad būtų galima apskaičiuoti pirmtakų ir fragmentų jonų reikšmes, kurios gali būti naudojamos priklausomiems jonų nuskaitymui qTRAP prietaise [110, 111]. Šis metodas taip pat gali būti naudojamas atliekant pirmtakų jonų ir neutralių nuostolių nuskaitymą, siekiant nustatyti nežinomus fosfopeptidus iš sudėtingo mišinio, ir tai yra galingas metodas potransliacinių baltymų modifikacijų identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui. MRM neseniai naudojo White'as ir jo bendradarbiai [112, 113], norėdami nustatyti ir kiekybiškai įvertinti tirozino fosforilintas kinazes šimtams mazgų signalizacijos tinkle ir keliomis eksperimentinėmis sąlygomis. Be to, White'as ir bendradarbiai [112, 113] pritaikė iTRAQ kartu su MRM, kad atliktų kiekybinę signalizacijos tinklų analizę, nustatydama ir kiekybiškai įvertindama 222 tirozino fosforilintus peptidus, gaudama ypač didelį aprėptų signalizacijos mazgų procentą. Jie apibrėžė mechanizmus, kuriais EGFRvIII baltymas keičia ląstelių fiziologiją, nes jis yra vienas iš dažniausiai mutavusių baltymų GBM ir yra susijęs su radiacijos ir chemoterapiniu atsparumu. Jie atliko EGFRvIII signalizacijos tinklų fosfoproteominę analizę GBM ląstelėse. Šio tyrimo rezultatai suteikė svarbių įžvalgų apie šio mutavusio receptoriaus biologiją, įskaitant onkogeno dozės poveikį ir skirtingą signalizacijos kelių panaudojimą. Be to, fosfoproteominių duomenų rinkinio grupavimas atskleidė anksčiau neaprašytą EGFRvIII ir c-Met receptoriaus susikirtimą. Ląstelių apdorojimas deriniu, naudojant tiek EGFR, tiek c-Met kinazės inhibitorius, smarkiai sumažino ląstelių gyvybingumą in vitro.

C.5. 2-D fluorescencijos skirtumo gelio elektroforezė (DIGE)

DiGE iš kontrolinio ekstrakto išgauti baltymai yra paženklinti vienu CyDye (konjuguotas Cy3 arba Cy5), o baltymai, išskirti iš bandomojo ekstrakto, pažymėti kita CyDye fluoroforo spalva, kurių dydis ir krūvis atitinka. Šie pažymėti baltymų ekstraktai sumaišomi ir kartu išskiriami (dažnai pridedant vidinį etaloną, kuris gali būti pažymėtas Cy2) ant didelio formato dvimačių gelių, kad būtų galima analizuoti ekspresijos pokyčius gautame dėmių modelyje (dėmių žemėlapiai). “) [114]. Palyginti su dvimačia gelio elektroforeze, DiGE pranašumas yra tas, kad kelis mėginius galima palyginti viename gelyje („multipleksavimas“), todėl prieš elektroforezę galima nudažyti kontrolinius ir tiriamuosius mėginius skirtingais fluorescenciniais dažais. Šis pažanga palengvino gelio ir gelio palyginimo problemas ir sumažino reikalingų gelių skaičių. Galimybė įtraukti vidinį standartą, sudarytą iš vienodos visų eksperimento mėginių dalies, taip pat pagerino tarpgelių suderinimą ir palengvino suderintų dėmių normalizavimą kartotiniuose mėginiuose ant kelių gelių. CyDyes naudojimas baltymams žymėti vietoj nefluorescencinių dėmių gali labai padidinti baltymų aptikimo jautrumą [115] ir yra esminis DiGE metodo privalumas biomedžiagų panaudojimui. Tai leidžia analizuoti net labai ribotus baltymų mėginius, įskaitant nedidelius lazeriu mikroskirstyto audinio plotus [116, 117]. Dviejų dimensijų skirtumo gelio elektroforezė (2D-DIGE) su naujais itin jautriais fluorescenciniais dažais (CyDye DIGE Fluor prisotinimo dažais) leidžia efektyviai nustatyti lazeriu mikroskirstytų audinių mėginių baltymų ekspresijos profiliavimą. Kombinuotas lazerinio mikrodissekcijos naudojimas leidžia tiksliai nustatyti specifinių ląstelių, įskaitant naviko audinius, proteominį profiliavimą [118].

Pavyzdžiui, Yefei Rong ir bendradarbiai (2010) [119] atliko diferencinę baltymų analizę naudojant 2 dimensijų diferencinę elektroforezę gelyje (2D-DIGE). Jie nustatė, kad 16 baltymų dėmių buvo skirtingai išreikštos tarp dviejų mišinių (palyginimas buvo atliktas su serumo mėginiais iš penkių asmenų, sergančių kasos vėžiu, ir penkių asmenų, nesergančių vėžiu). Yefei Rong ir bendradarbiai [119] įrodė, kad aštuonių šių skysčių baltymų reguliavimas buvo padidintas, o 8 – sumažintas vėžiu. Masių spektrometrija ir duomenų bazės paieška leido identifikuoti baltymus, atitinkančius gelio dėmes. Pastebėtas manozę surišančio lektino 2 ir miozino lengvosios grandinės kinazės 2 reguliavimas, kurie anksčiau nebuvo susiję su kasos vėžiu. Nepriklausomoje serumo mėginių serijoje iš 16 pacientų, sergančių kasos vėžiu ir 16 vėžiu nesergančių kontrolinių grupių, padidėjęs manozę surišančio lektino 2 ir miozino lengvosios grandinės kinazės 2 kiekis buvo patvirtintas Western blot metodu.

Be to, Nagano (2010) [120] neseniai sukūrė technologiją, pavadintą „antikūnų proteomikos technologija“. Ši technologija gali patikrinti biomarkerių baltymus, greitai ir visapusiškai išskirdama antikūnus prieš kiekvieną kandidatą. Jis pritaikė "antikūnų proteomikos technologiją" su krūties vėžiu susijusių biomarkerių atradimui ir įvertino šios naujos technologijos naudingumą. Ląstelių ekstraktai, gauti iš krūties naviko ląstelių (SKBR3) ir normalių ląstelių, buvo analizuojami naudojant dvimatę diferencinę gelio elektroforezę (2D-DIGE), siekiant nustatyti naviko ląstelėse per daug ekspresuotus baltymus. Kandidatai baltymai buvo ekstrahuoti iš gelio gabalėlių, imobilizuoti ant nitroceliuliozės membranos naudojant dot blot aparatą ir tada naudojami kaip tiksliniai antigenai scFv fago sodrinimo ir atrankos metu. scFv, prisijungiantys prie 21 skirtingo per daug ekspresuoto baltymo naviko ląstelėse, buvo sėkmingai išskirti per kelias savaites po šios in vitro fagų atrankos procedūros. Tada nustatytų baltymų ekspresijos profiliai buvo nustatyti audinių mikrogardelių analize, naudojant scFv fagus. Todėl buvo nustatyti trys krūties navikui būdingi baltymai. Jo duomenys parodė antikūnų proteomikos sistemos naudingumą, norint atrasti ir patvirtinti su naviku susijusius baltymus farmacinėje proteomikoje. Šiuo metu jis ir kitos susijusios grupės analizuoja šių baltymų funkcijas, kad galėtų patvirtinti ir panaudoti juos kaip diagnostinius žymenis ar terapinius taikinius.

(D) Fosforilinti baltymai, susiję su įvairiomis ligomis, ir proteominių strategijų nauda atliekant tokius klinikinius tyrimus

Neseniai atliktame tyrime Steenas ir kt. ištyrė fosforilinimo vaidmenį anafazę skatinančio komplekso (APC) dinamikoje [121]. Kai kurie vaistai, kurie jungiasi prie mikrotubulių ir blokuoja mitozę, yra neveiksmingi gydant vėžį, kiti rodo nepaaiškinamą židinio efektyvumą. Pavyzdžiui, vinca alkaloidai yra naudingi gydant limfomą, neuroblastomą ir nefroblastomas, o taksolis yra naudingas pažengusiam krūties vėžiui ir kiaušidžių vėžiui. Nežinoma, kodėl šie vaistai nėra vienodai veiksmingi ir kodėl jie turi skirtingą gydomąją vertę nuo skirtingų vėžio formų. Autoriai pastebėjo skirtingas APC fosforilinimo būsenas, reaguojant į skirtingus antimitozinius vaistus, ir siūlo, kad jie gali paaiškinti kai kuriuos iš šių skirtumų. Jie taip pat siūlo, kad ląstelės iš skirtingų audinių arba ląstelės, turinčios skirtingas mutacijas, arba ląstelės, patiriančios skirtingą fiziologinį įtampą, pavyzdžiui, hipoksija, gali skirtis savo atsaku į verpstės nuodus ir taip atspindėtų tuos skirtumus skirtingose ​​fosforilinimo vietose. Verpstės kontrolinio taško fosforilinimo skirtumai gali atskleisti naujas mitozinės būsenos ypatybes. Vaistų skirstymą į kategorijas, navikų atsako į vaistus diskriminaciją ir naujų kontrolinių punktų kontrolės priemonių identifikavimą gali palengvinti galimybė apibūdinti vaistų kandidatus pagal APC fosforilinimo spektrą. Autoriai taip pat teigia, kad tyrimo rezultatai. rodo, kad terminas mitozinis areštas yra klaidingas: sustojimas yra dinamiška būsena, kai kai kurios ląstelės patenka į apoptozę, o kitos ląstelės grįžta į tarpfazę. Gebėjimas stebėti biocheminius įvykius sulaikymo metu gali būti labai svarbus norint suprasti antiproliferacinį gydymą. Tačiau fosforilinimo dinamikos tyrimas kelia didelius reikalavimus kiekybinio nustatymo tikslumui. Dauguma masių spektrometru pagrįstų kiekybinių metodų, įskaitant stabilų izotopų ženklinimą aminorūgštimis ląstelių kultūroje (SILAC) ir izobarinę žymę santykiniam ir absoliučiam kiekybiniam nustatymui (iTRAQ), pateikia santykinius duomenis, o tai reiškia, kad viena fosforilinimo būsena nustatoma, palyginti su kita fosforilinimo būsena. 122–124] šie duomenys gali padėti nustatyti kelio kinetiką. Šiame darbe naudojamas metodas yra reikšmingas pranašumas, palyginti su ankstesniais metodais. Tai leido išmatuoti specifinius kiekybinius APC fosforilinimo pokyčius ląstelėse, sulaikytose nokodazole įvairiems laikotarpiams. Jei ši dinamika gali būti koreliuojama su procesu, kurio metu sulaikyta būsena išsprendžiama, mums gali būti suteikta naujų įrankių, leidžiančių suprasti mitozinį procesą ir rasti veiksmingesnius vėžio taikinius.

Vėžio tyrimų bendruomenės ilgalaikis įsitikinimas, kad tikslus molekulinis vėžio supratimas gali sukelti vėžio terapiją, yra patvirtintas kuriant vaistus, skirtus specifiniams biologiniams keliams, kurių specifiškumas yra didesnis ir toksiškas. Herceptin – monokloninio antikūno prieš HER2 receptorių, skirto krūties vėžio gydymui, sukūrimas yra vienas sėkmingiausių naujausių vėžio specifinių vaistų pavyzdžių. HER2 yra svarbus vėžio taikinys, nes jo per didelė ekspresija padidina naviko ląstelių proliferaciją, kraujagyslių formavimąsi ir invaziškumą bei prognozuoja prastą prognozę. Wolf-Yadlin ir kiti mokslininkai [111, 112], [121–124] naudojo fosfoproteomiką ir MS, kad ištirtų fosforilinimo vaidmenį per didelės HER2 ekspresijos poveikiui EGF ir HRG tarpininkaujamam erbB receptorių signalizavimui. Buvo įmanoma nustatyti specifinius fosforilinimo vietų derinius, kurie koreliuoja su ląstelių proliferacija ir migracija ir gali būti terapinės intervencijos tikslai. Deja, dėl jautrumo apribojimų tik 68 iš 322 fosforilinimo vietų galėjo būti analizuojamos kinetiškai, todėl tyrimas nepateikia išsamios daugybės HER2 ekspresijos sukeliamų padarinių analizės. Tačiau tai žymi svarbų proveržį apibūdinant erbB receptorių signalizacijos tinklą navikuose ir iliustruoja baltymų fosforilinimo supratimo svarbą.

Mitochondrijos vaidina pagrindinį vaidmenį energijos apykaitoje ir ląstelių išlikime, todėl mitochondrijų disfunkcija yra susijusi su daugybe žmogaus patologijų. Be to, mitochondrijų disfunkcija yra susijusi su atsparumu insulinui žmonėms, sergantiems nutukimu ir 2 tipo cukriniu diabetu. Neseniai Zhao ir bendradarbiai (2011) [125] ištyrė iš žmogaus skeleto raumenų išskirtų mitochondrijų fosfoproteomą. Zhao ir bendradarbiai atskleidė platų vidinės membranos baltymų kompleksų ir fermentų, jungiančių titano dioksidą (TiO) fosforilinimą.2) protokolai su atvirkštinės fazės chromatografija, sujungta su MS analize. Buvo nustatytos 155 skirtingos fosforilinimo vietos 77 mitochondrijų fosfoproteinuose, įskaitant 116 fosfoserino, 23 fosfotreonino ir 16 fosfotirozino liekanų. Taip pat buvo priskirtos fosforilinimo vietos mitochondrijų baltymuose, dalyvaujančiuose aminorūgščių skaidyme, importuotojai ir transporteriai, kalcio homeostazė ir apoptozė. Be to, daugelis šių mitochondrijų fosfoproteinų yra proteinkinazės A, proteinkinazės C, kazeino kinazės II ir nuo DNR priklausomos proteinkinazės substratai. Didelis fosfotirozino likučių skaičius rodo, kad tirozino fosforilinimas vaidina svarbų vaidmenį perduodant mitochondrijų signalus. Daugelis mitochondrijų fosfoproteinų yra susiję su oksidaciniu fosforilinimu, trikarboksirūgšties ciklu ir lipidų metabolizmu, ty procesuose, kurie gali būti susiję su atsparumu insulinui. Gerai žinoma, kad mitochondrijų disfunkcija yra pagrindinė daugelio žmonių patologijų, tokių kaip 2 tipo diabetas, Parkinsono liga ir vėžys [126]. Šiame tyrime labiausiai paplitusi ląstelių baltymų posttransliacinių modifikacijų (PTM) forma – grįžtamasis fosforilinimas [127–134][135–139] – yra pagrindinis mechanizmas reguliuojant mitochondrijų funkcijas [130, 131]. Nuolat didėjantis mitochondrijų kinazių, fosfatazių ir fosfoproteinų skaičius taip pat reiškia svarbų baltymų fosforilinimo vaidmenį įvairiuose mitochondrijų procesuose [132–134]. Pavaizduota klinikiniams tyrimams naudinga proteomikos vamzdyno prototipinė linija (3 pav.).

Prototipinis proteomikos vamzdynas, naudingas klinikiniams tyrimams. Priklausomai nuo taikymo, skirtingi mėginiai, apdoroti ir tiekiami į proteomikos vamzdyną, duoda skirtingus rezultatus. Keli dujotiekio etapai yra išvardyti skirtingose ​​plokštėse: (1) proteolitinis skaidymas, (2) peptidų atskyrimas ir jonizavimas, (3) jų analizė naudojant MS, (4) pasirinktų peptidų suskaidymas ir gautų MS/MS analizė. spektrai ir (5) (6) duomenų kompiuterinė analizė, kuri apima baltymų iš kelių aptiktų peptidų identifikavimą ir kiekybinį įvertinimą.

(E) Stebėjimai ir ateities poreikiai

Vėžys ir imuninės sistemos sutrikimai vis dar yra viena iš pagrindinių mirties priežasčių visame pasaulyje. Todėl vis dar reikia identifikuoti naudingus biomarkerius ir pagerinti supratimą apie šių ligų vystymąsi. Imuninę sistemą lengvai paveikia vėžys organizme, net ir ikiklinikinėje stadijoje, todėl ateityje šie tyrimai turėtų būti išplėsti ir išplėsti, kad būtų atsakyta į daugybę klausimų, susijusių su (a) imuninių ląstelių vaidmeniu stebint vėžį. b) uždegimo ypatybes, susijusias su vėžio vystymusi, c) aplinkos / gyvenimo būdo veiksnių poveikį imuninei sistemai ir d) senėjimo ligų sąveiką.Dėl baltymų kinazės reguliuojamų signalų perdavimo kelių svarbos imunologijos sutrikimams ir vėžiui buvo sukurti vaistai, slopinantys baltymų kinazes šių takų viršūnėse arba tarpiniuose lygiuose. Šių signalizacijos takų baltymų fosforilinimo priskyrimo tyrimai suteiks svarbių įžvalgų apie šių kelių veikimą ir ryšį, o tai padės nustatyti geriausius vėžio gydymo ir imunologinių ligų taikinius (pvz., nustatyti fosfatų grupę konkrečiame serine, treonine ar tirozinas, sodrinant fosfatą kartu su MS). Atskirų navikų, kraujo, serumo, audinių fosfoproteominė analizė taip pat padės pritaikyti tikslinius terapinius vaistus atitinkamiems pacientams. Dabar visuotinai pripažįstama, kad nė vienas proteominis metodas nėra išsamus, tačiau skirtingų sodrinimo metodų deriniai sukuria skirtingus persidengiančius fosfopeptidų duomenų rinkinius, kad pagerintų bendrus fosfoproteomų analizės rezultatus. Per pastarąjį dešimtmetį fosfopeptidų sekos nustatymas masių spektrometrijos būdu padarė didžiulę pažangą. Pavyzdžiui, MS/MS produkto jonų nuskaitymas, daugiapakopis aktyvinimas ir pirmtakų jonų nuskaitymas yra veiksmingi serino (Ser), treonino (Thr) ir tirozino (Tyr) fosforilintų peptidų identifikavimo metodai.

Dabartiniai fosfoproteominiai tikslai reiškia fosfoproteinų identifikavimą, fosforilinimo vietų kartografavimą, fosforilinimo kiekybinį įvertinimą skirtingomis sąlygomis ir fosforilinimo stechiometrijos nustatymą. Be to, žinojimas, kada baltymas fosforilinamas, kuri kinazė (-ės) dalyvauja ir kaip kiekvienas fosforilinimas patenka į signalizacijos tinklą, taip pat yra svarbūs iššūkiai tyrėjams, siekiant suprasti skirtingų biologinių įvykių reikšmę. Naujosios MS technologijos yra labai svarbios visos šios informacijos katalogavimui, ir jos siekia rinkti tikslius duomenis apie fosfopeptidus pasauliniu mastu. Be to, reikia atkreipti dėmesį į galimus sunkumus gauti pakankamą specifinių mažai gausių proteinkinazių specifinių fosforilintų baltymų kiekį in vivo, o tai gali apriboti fosfoproteomų analizės panaudojimą.

Galiausiai, svarbu pasakyti, kad kuriant klinikines proteomines programas naudojant identifikuotus baltymus ir fosfoproteinus, būtinas bendradarbiavimas tarp mokslininkų, gydytojų ir diagnostikos įmonių bei proteomikos ekspertų, ypač ankstyvosiose biomarkerių kūrimo projektų fazėse. Šiuo metu turimi proteomikos būdai gali paskatinti klinikinių pritaikymų vystymąsi, todėl reikia skubiai nukreipti gautą informaciją konkretiems ir specifiniams klinikiniams tikslams.


DISKUSIJA

Šiame tyrime su TAA susijusi baltymų ekspresija pacientams, sergantiems BAV ir TAV, buvo nustatyta naudojant 2D-DIGE kartu su daugiamatine statistika. Be to, baltymų dėmių analizė buvo derinama su microarray mRNR ir egzono ekspresijos analize. Mūsų rezultatai bendrai parodė, kad TAA susidarymas pacientams, sergantiems BAV, turi aiškiai skirtingus ekspresijos pirštų atspaudus, palyginti su pacientais, sergančiais TAV, visais trimis genų, egzonų ir baltymų analizės lygiais. Šis tyrimas papildomai remia mūsų anksčiau atliktas mRNR ekspresijos analizes, įskaitant visus išreikštus genus žmogaus genome (2).

2D-DIGE proteominiai rezultatai buvo patvirtinti naudojant nepriklausomą, peptidais pagrįstą proteominį metodą, LC-MS/MS ir 57 ir 71% nustatytų baltymų buvo patvirtinti atitinkamai TAV ir BAV. Svarbu pastebėti, kad atlikus 2D-DIGE analizę atsiranda daug baltymų dėmių, kurios buvo identifikuotos kaip tas pats baltymas, tačiau gali būti modifikuotos dėl potransliacinių modifikacijų. Kita vertus, LC-MS/MS analizė nustato daugybę baltymų izoformų, kurių sekoje yra bent vienas unikalus peptidas. 2D-DIGE statistinė analizė buvo atlikta 302 baltymų dėmių, kurių statistika buvo apibendrinta 43 baltymuose I lentelėje, o LC-MS/MS statistinė analizė buvo atlikta su 35 baltymais (43 baltymų pogrupis iš 2D-DIGE eksperimentų). nes aštuoni baltymai nebuvo identifikuoti naudojant LC-MS/MS) (II lentelė). Vis dėlto šis dviejų metodų neatitikimas patvirtintų baltymų procentas pasirodė esąs labai didelis, o tai aiškiai sustiprina 2D-DIGE analizės rezultatus (II lentelė).

Literatūroje atlikta identifikuotų baltymų paieška parodė, kad diferencijuotai ekspresuotų baltymų funkcija sergant TAV sergančių pacientų medialinėje aortos degeneracijoje dominuoja uždegiminiai procesai. Kita vertus, atitinkama funkcija pacientams, sergantiems BAV, greičiausiai atsirado dėl sutrikusio šių pacientų atkūrimo pajėgumo. Visų nustatytų baltymų funkcinis repertuaras apibendrintas III lentelėje. Du baltymai, susiję su BAV, buvo plazmos baltymas transtiretinas (TTR) ir labai konservuotas plazmos glikoproteinas, serumo amiloido P komponentas (SAP/APCS). Šių dviejų baltymų funkcija BAV pacientų aortopatijoje nėra aiški. Tačiau BAV pacientų išsiplėtusioje aortoje buvo sumažinta TTR baltymų ekspresija, palyginti su BAV pacientais, kurių aorta neišsiplėtė, o APCS baltymų ekspresija padidėjo. Taigi abu baltymai gali veikti pažeistų kraujagyslių atstatymo procesuose BAV, nes buvo pranešta apie padidėjusį TTR ryšį su palengvėjusiu žaizdų gijimu (13) ir fibroblastų diferenciacijos slopinimu dėl padidėjusio APCS lygio gydant žaizdas (14). TTR taip pat yra susijęs su senatvine sistemine amiloidoze (SSA), kai laukinio tipo TTR formuoja amiloido sankaupas įvairiuose audiniuose, ir yra su amžiumi susijusi nepaveldima sisteminė amiloidozė, daugiausia paveikianti vyresnio amžiaus žmonių širdies funkcijas (apžvelgta (15)). TTR vaidmuo sergant amiloidoze yra sudėtingas ir, nors pats TTR buvo siejamas su fibrilių susidarymu amiloidozėje, jis taip pat gali veikti kaip proteazę skaidantis amiloidinį beta peptidą ir taip atlikti apsauginį vaidmenį Alzheimerio ligos AD (16) ). Nustatyta, kad TTR koncentracijos sumažėjimas AD pacientų smegenų skystyje (17) ir AD pelės modelio hipokampe (18) neigiamai koreliuoja su ligos sunkumu. Panašiai kaip ir TTR, APCS taip pat yra visuotinai susijęs su amiloido nuosėdomis, nepriklausomai nuo baltymo kilmės (19). BAV išsiplėtimo galimybė yra susijusi su proteinopatijomis ir šių dviejų su amiloidoze susijusių baltymų funkcija plečiant BAV pacientus, nusipelno tolesnio paaiškinimo. Be to, trijų miozino lengvųjų grandinių, MYL6, MYL9 ir MYL12B, ekspresija žymiai padidėjo plečiantis BAV, tuo tarpu pacientams, kuriems išsiplėtė TAV, taip pat padidėja tik MYL6 ekspresija. Miozino lengvosios grandinės yra fosforilintos ir taip skatina aktomiozino susitraukimą, kuris sukuria traukimo jėgą tarp gretimų ląstelių ir padidina tarpląstelinį tarpą (20). Tai gali reikšti, kad kraujagyslių barjero skilimo procesas yra aktyvesnis BAV išsiplėtimo metu. Tai dar labiau patvirtina padidėjusi albumino ekspresija išsiplėtusiame BAV.

Vienintelis baltymas, kuriame viena iš baltymų dėmių (izoformų) buvo reguliuojama išsiplėtusioje BAV aortoje, o kita baltymo dėmelė (izoforma) buvo reguliuojama išsiplėtusioje TAV, yra filaminą surišantis LIM baltymas (FBLIM1 / migfilinas). FBLIM1 turi keletą svarbių sąveikų, todėl jis yra labai svarbus molekulinis jungiklis ląstelių-ECM ir ląstelių-ląstelių sąveikai. Jis lokalizuojasi tiek ląstelės-ekstraląstelinėje matricoje, tiek endotelio ląstelėse adhereno jungtyse per savo C-galo galo LIM surišimo domeną. Tačiau jo įdarbinimas į ECM vyksta sąveikaujant su kitu baltymu, fermitino šeimos nariu 2 (FERMT2 / MIG2), kuris nėra būtinas FBLIM1 lokalizacijai prie adhereno jungčių. N-galinė baltymo dalis jungiasi su filaminu, per kurį reguliuoja citoskeletą (apžvelgta (21)). Be to, jis veikia kaip molekulinis jungiklis, atjungiantis filaminą nuo integrino, kad reguliuotų integrino aktyvaciją ir tarpląstelinės matricos ir aktino jungties dinamiką (22). Buvo pasiūlyta, kad kadangi C-galo domenas reikalingas tiek FBLIM1 lokalizavimui prie ląstelių-ECM adhezijų, tiek ląstelių-ląstelių jungčių, tarp dviejų FBLIM1 veiklų bus konkurencija ir tai diktuos santykinį FBLIM1 pasiskirstymą. tarp dviejų kelių (peržiūrėta (21)). Įdomu tai, kad mes pastebėjome didesnę FREMT2 / MIG2 mRNR ekspresiją BAV, palyginti su TAV, nepriklausomai nuo išsiplėtimo būsenos (Maleki ir kt., (23)), o tai reiškia, kad pusiausvyra tarp dviejų ląstelių kelių galėjo pasikeisti dėl BAV išsiplėtimo, palyginti su TAV. Šis pastebėjimas gali būti labai svarbus atsižvelgiant į BAV ir TAV išsiplėtimo skirtumus ir gali mechaniškai atskirti du įvykius. Kitas svarbus pastebėjimas šiuo atžvilgiu yra tas, kad FBLIM1 pasiskirstymas yra vos aptinkamas normaliose lygiųjų raumenų ląstelėse (SMC), bet gausus neoplastiškai transformuotame SMC, o tai reiškia, kad jo ekspresija SMC yra susijusi su patologiniais pokyčiais (24).

Transglutaminazės 2 (TGM2) padidėjimas buvo nustatytas tik TAV sergantiems pacientams. Tai įdomu, nes žinoma, kad transformuojantis augimo faktorius β (TGFβ) padidina TGM2 reguliavimą (25). Ankstesni duomenys parodė TGFβ signalizacijos kelio skirtumus tarp BAV ir TAV pacientų (4, 26). Be to, vimentinas (VIM), vienas iš tarpinio gijų komponentų, yra pagrindinis transglutaminazių substratas (27). Taigi, TAV sergančių pacientų medialinė degeneracija gali būti dėl vimentino kryžminimo TGM2, kaip buvo pasiūlyta arterijų rekonstrukcijai (27). Be to, dauguma baltymų yra konkrečiai susiję su TAV išsiplėtimu t.y. FGG, VIM, MFAP4 ir HSPA1L taip pat buvo cituojami kartu su uždegiminėmis ligomis arba uždegiminiais procesais (I lentelė, III lentelė), o tai atitinka mūsų ankstesnį stebėjimą dėl padidėjusio vidurinio uždegimo TAV, bet ne BAV pacientams (2). ). Siūlome, kad TAV medialinė degeneracija gali būti tiesioginio priešuždegiminių molekulių atakos prieš medialinį sluoksnį rezultatas, o BAV atveju tai gali būti antrinė dėl didesnio kraujagyslių endotelio pralaidumo ir sumažėjusio regeneracijos pajėgumo. Kaip buvo parodyta, vienas iš veiksnių, galinčių prisidėti prie didesnio endotelio sluoksnio pralaidumo, gali būti nuolatinis BAV aortos nenormalios hemodinamikos poveikis (28, 29). Pagrįsdami šį argumentą, neseniai parodėme, kad BAV aortoje yra angiostatinis genų ekspresijos profilis, kuriame yra keletas EB specifinių genų, net ir neišsiplėtusiose aortose (23).

Nors tiek mRNR ekspresija, tiek baltymų ekspresija gali atskirti pacientus, kurių aorta išsiplėtė nuo pacientų, kurių aorta neišsiplėtė, buvo aišku, kad buvo labai nedaug skirtingai išreikštų genų, turinčių tą patį diferencinės ekspresijos modelį baltymų lygiu (papildoma S8 lentelė, I ir IV lentelės). . Tai nėra netikėta ir, remiantis mūsų duomenimis, kiti tyrimai parodė, kad koreliacija tarp mRNR ekspresijos ir baltymų ekspresijos apskritai yra maža (30). To paaiškinimas gali būti toks, kad atskirus baltymų pusinės eliminacijos periodus įtakoja keli post-transliaciniai veiksniai, kurie turės įtakos mRNR ir baltymo ekspresijos koreliacijai. Baltymų gyvavimo laikas priklauso nuo daugelio skirtingų procesų, pvz. baltymų stabilumas, apdorojimas po transliacijos (fosforilinimas ir ubikvinacija), taip pat baltymo lokalizacija (31) (30), procesai, dėl kurių gali atsirasti neatitikimų, pastebėtų transkripto ir baltymų lygių ekspresijoje. Be to, kaip parodė mūsų analizė, buvo keletas dėmių, kurios buvo aptiktos, atstovaujančios tam pačiam baltymui. Skirtingos dėmės tikriausiai atspindi skirtingas potransliacines modifikacijas, kurios turės įtakos mRNR lygio, atspindinčio bendrą geno ekspresiją, palyginimui su baltymo pogrupio ekspresija. Kita galimybė gali būti, kad skirtingos dėmės atspindi skirtingas baltymo susiliejimo formas. Anksčiau išanalizavome skirtingą sujungimą TGFβ signalizacijos kelyje toje pačioje grupėje (4). Iš šios analizės buvo aišku, kad diferencinis sujungimas yra dažnas reiškinys, tačiau tyrimas taip pat parodė, kad skirtingai sujungtų mRNR ekspresija buvo žema, palyginti su laukinio tipo transkriptu. Todėl mažai tikėtina, kad baltymų dėmės, kurias galima aptikti atliekant 2D gelio analizę, yra skirtingos baltymų izoformos dėl diferencinio sujungimo. Tai dar labiau patvirtina tai, kad nėra aiškaus ryšio tarp susiliejimo buvimo ir aptiktų baltymų dėmių skaičiaus.

Keletas ankstesnių tyrimų atliko proteominius tyrimus, kad nustatytų baltymų ekspresiją, susijusią su TAA. Tik viename iš tyrimų TAV ir BAV pacientai buvo analizuojami atskirai (32). Tačiau į tą tyrimą buvo įtraukti tik pacientai, kurių aortos audiniai išsiplėtę. Iš viso išanalizavę 16 pacientų, autoriai parodė, kad BAV pacientų išsiplėtusioje aortoje 27 šilumos sukelto baltymo kiekis buvo žymiai mažesnis, palyginti su išsiplėtusia TAV pacientų aorta. Šiame tyrime šilumos šaltinio baltymas 27 buvo žymiai didesnis išsiplėtimas tiek TAV, tiek BAV mėginiuose (I lentelė), tuo tarpu reikšmingo skirtumo tarp TAV ir BAV nepastebėta nei išsiplėtusiuose, nei neišsiplėtusiuose mėginiuose (duomenys nerodomi). Be to, žmogaus kylančiosios aortos aneurizmos tyrimas parodė, kad ENO1 varianto (fragmento) ekspresija buvo žymiai didesnė, o VIM aneurizmos audiniuose ekspresija yra mažesnė, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (33). Šiame tyrime ENO1 baltymo ekspresija buvo didesnė išsiplėtusioje aortoje tiek TAV, tiek BAV sergantiems pacientams (I lentelė), todėl buvo panašus modelis kaip ir Schachnerio atliktas tyrimas. ir kt. Tačiau VIM buvo didesnis išsiplėtusiuose mėginiuose tik TAV, bet ne BAV šiame tyrime (I lentelė).

Kadangi neišsiplėtę mėginiai buvo paimti iš pacientų, sergančių TAV ir BAV, kuriems atliekamas vožtuvo taisymas, svarbu įvertinti jų, kaip kontrolinių mėginių, būklę. Anksčiau išanalizavome šių mėginių pasaulinius mRNR ekspresijos profilius kartu su kontroliniais mėginiais, paimtais iš širdies transplantacijos donorų. Remiantis bendra mRNR ekspresija, kontroliniai transplantacijos mėginiai buvo suskirstyti į PCA arti neišsiplėtusių aortos terpės audinių mėginių, taip parodydami, kad neišplėstų audinių mėginiai turi panašų mRNR ekspresijos profilį kaip ir transplantacijos kontroliniai mėginiai (2). Skirtinga mRNR ekspresija ir baltymų pirštų atspaudai dar labiau sustiprina mintį, kad išsiplėtusius BAV sergančių pacientų mėginius reikia palyginti su neišsiplėtusia BAV sergančių pacientų aorta.

Apibendrinant, šis tyrimas rodo, kad pacientams, sergantiems BAV ir TAV, išsiplėtimas ir medialinė degeneracija vystosi dviem skirtingais mechanizmais. Visų pirma pabrėžiama žaizdų gijimo mechanizmų ir uždegimo komponentų svarba stebimiems aortopatijos skirtumams tarp pacientų, sergančių BAV ir TAV.


Žiūrėti video įrašą: Ką daryti, jei norisi cukraus (Birželis 2022).