Informacija

Fosfodiesterio jungties susidarymo DNR polimerazės būdu chemija

Fosfodiesterio jungties susidarymo DNR polimerazės būdu chemija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mokydamas savo kolegijos studentams bendrosios biologijos, supratau, kad iki galo nesuprantu, kaip toks 3-P nukleotidas, kaip ATP, suskaidomas, kad būtų įtrauktas į DNR replikacijos metu. Kaip tai veikia??

Kitaip tariant, koks yra tikrasis mechanizmas / reakcijos būdas:

Ka as zinau:

Suprantu, kad ATP paprastai yra hidrolizuojamas, kad būtų defosforilintas kituose kontekstuose. Taip pat suprantu, kad vieno nukleotido fosfatas yra prijungtas prie gretimo nukleotido dezoksiribozės per dehidratacijos sintezę, kai jų hidroksilo grupės susijungia ir susidaro DNR.

Tačiau, atrodo, negaliu rasti gero šaltinio (internete arba bet kuriame iš mano [tiesa, paprastų] bendrųjų biografinių vadovėlių), kurie parodytų, kaip tiksliai abi šios reakcijos vyksta replikacijos metu...

Darau prielaidą, kad DNR polimerazė naudojasi iš ATP išleistais fosfatais (ir atitinkamomis GTP, CTP, TTP formomis), kad suaktyvėtų?

Apskritai, kaip atrodo visas šis procesas cheminiu / molekuliniu lygmeniu?

Norėčiau vaizdinės medžiagos (ypač vaizdo įrašo), jei galėtumėte pateikti tokį šaltinį, be išsamaus paaiškinimo, kas čia vyksta.


Radau šį dokumentą, kuriame labai giliai įsigilinta į atskirų šios reakcijos etapų molekulines detales ir aptariama, kaip tai susiję su nukleotidų selektyvumu.

„Pagrindinė“ informacija apie reakciją (cituota iš šio skyriaus, kuriame taip pat yra gražus paveikslas):

Polimerizacijos reakcija vyksta paprastu nukleofiliniu pradmens 3'OH ataku į gaunamo dNTP α-fosfatą, po kurio pašalinamas pirofosfatas [… ] Reakcijai naudojamas "dviejų metalų jonų" mechanizmas, kuriame metalo jonas A aktyvuoja 3'OH kaip metalo hidroksidą, o metalai A ir B stabilizuoja besivystantį neigiamą α-fosfato krūvį pereinamojoje būsenoje.

Metalo jonai yra magnio (Mg$^{2+}$) ir yra tinkamai išdėstyti pagal fermento struktūrą, o kai kurios papildomos aminorūgščių šoninės grandinės taip pat padeda suaktyvinti reakciją.


Atsiprašau

@Nicolai pateiktas atsakymas iš esmės yra teisingas (ir aš už jį balsavau). Tačiau manau, kad klausimas įkūnija tam tikras klaidingas prielaidas, kurias reikėtų nuginčyti, kad naivieji klausimo skaitytojai nebūtų suklaidinti, kad jas priimtų. (Toliau jas vadinu „problemais“.) Taip pat manau, kad šiuo atžvilgiu reikalingos iliustracijos, kurios neįtrauktos į @Nicolai pateiktą atsakymą.)

Pagalbinė institucija

Kaip autoritetą naudojau 2016 m. Gao ir Wango mokslinį darbą, cituodamas iš jo ir pateikdamas dalį vieno iš jo paveikslų tiems, kurie neturi bibliotekos prieigos prie šio žurnalo. Autoriai iš tikrųjų siūlo „trijų metalų jonų“ mechanizmą, o ne „dviejų metalų jonų“ mechanizmą, kurį paminėjo @Nicolai. Tačiau tai neturi įtakos pagrindinėms mano iškeltoms mintims, nors tai padeda iliustruoti, kad fermento mechanizmo detalės yra tokios sudėtingos, kad netinka mokyti įvadiniame lygmenyje.

Štai du pagrindiniai kadrai iš to popieriaus 1 pav.:

1 problema

„Manau, kad DNR polimerazė naudojasi iš ATP (ir atitinkamomis GTP, CTP, TTP formomis) išleistais fosfatais, kad suaktyvėtų?

Fermento „neaktyvuoja“ jo katalizuojamos reakcijos produktai. Substrato surišimas gali lemti konformacijos pasikeitimą, dėl kurio katalizei susidaro palankesnė būsena – ir diskutuojant ta tema tai gali būti vadinama „aktyvacija“‡; tačiau šio žodžio vartojimas gali suklaidinti tik tuo lygiu, kuriuo užduodamas dabartinis klausimas. Taip yra todėl, kad viena iš pagrindinių fermentų katalizės sąvokų yra „aktyvinimo energija“ - energijos, reikalingos norint pasiekti pereinamoji būsena. Aktyvinimo energija reiškia reagentų, o ne fermento, aktyvavimą. Cituoti iš popieriaus:

Fermentai padidina cheminių reakcijų greitį, kuris, kaip manoma, įvyksta sumažėjus aktyvacijos energijai, reikalingai pereinamajai būsenai pasiekti (1A pav.)

Cheminės reakcijos, dėl kurių sumažėja (Gibso) laisvoji energija („Energijos“ ašis 1A pav.), yra termodinamiškai palankios. Jie atsiranda lėtai, nes pereina aukštesnės energijos pereinamąją būseną. Fermento katalizatoriaus vaidmuo yra sumažinti energiją, kad būtų pasiekta pereinamoji būsena (aktyvacijos energija). Kaip parodyta paveikslėlyje, ši reakcija yra termodinamiškai palanki. Išsiskyręs pirofosfatas neatlieka jokios funkcijos, išskyrus tai, kad jį hidrolizuoja pirofosfatazės, kad polimerizacija nepasikeistų.

2 problema

Neaišku, ką turi pavaizduoti klausimo paveikslo kairėje esanti rodyklė (nuo dNTP α-fosfato iki pradmens OH)†. Paprastai būtų galima manyti, kad tai būtų elektronas, tačiau čia tai neturi prasmės. Kaip sako @Nicolai

„...reakcija vyksta paprastu nukleofiliniu pradmenų 3'OH ataku prieš gaunamo dNTP α-fosfatą“

y., rodyklė turėtų būti OH deguonies elektronai į nukleofilinis fosfatas. Tai parodyta 1B pav. (kur besiformuojanti DNR grandinė yra kairėje, o dNTP – dešinėje). Pastarasis paveikslas iš tikrųjų rodo pereinamąją būseną, kuri leidžia bendrai pamatyti, kaip tai gali būti mažesnės energijos nei nekatalizuotos nefermentinės reakcijos atveju. Jį stabilizuoja du metalo jonai (Mg2+), kurias atitinkamoje padėtyje laiko rūgštinės šoninės grandinės aktyvioje fermento vietoje.

Išnašos
‡ Kaip pažymi @user1136, posakis „fermento aktyvinimas“ taip pat vartojamas apibūdinti teigiamų allosterinių efektorių – mažų molekulių, kurios padidina aktyviosios vietos aktyvumą dėl struktūrinio pokyčio, kurį inicijuoja jų prisijungimas toli nuo aktyvios vietos esančioje vietoje. - alosterinė svetainė. Tai yra dar viena galima painiavos priežastis, nes ji čia neturi reikšmės.

†Komentare plakatas rašo: „Rodyklė... paveikslėlyje... reiškia konceptualų molekulių judėjimą, o ne „realią“ cheminę sąveiką“. Jei taip buvo siekiama (aš nesu susipažinęs su šaltiniu), mano nuomone, autoriai turėjo naudoti kitokio stiliaus rodyklę (pvz., platesnę, ➡︎, o ne ➛, ir ne ištraukė jį iš fosfato į OH. Tai išduoda žinių trūkumą arba susirūpinimą dėl cheminių konvencijų ir ypač klaidina studentą, kuris nori suprasti biologiją cheminiu lygmeniu. Manau, kad tai nepateisinama leidykloje, turinčioje tokią reputaciją kaip Benjamino.


RNR metabolizmas: sintezė, polimerazė ir katabolizmas

Šiame straipsnyje aptarsime: - 1. RNR sintezė. Pernešimo RNR (tRNR) yra plačiai apdorojama ir modifikuojama.

  1. RNR sintezė
  2. RNR polimerazė
  3. Sigma (σ) RNR faktoriai
  4. RNR taip pat žinoma kaip ribozimai
  5. RNR katabolizmas
  6. Ribosominės RNR yra apdorojamos iš didelio pirmtako
  7. Messenger RNR (mRNR) yra modifikuota 5′ ir 3′ galuose
  8. Pernešimo RNR (tRNR) yra plačiai apdorojama ir modifikuojama

i. Transkripcija yra procesas, kurio metu pradedama ir baigiama RNR molekulės sintezė.

ii. Transkripcijos etapai:

a) Transkripcijos komplekso susidarymas:

Fermentas RNR polimerazė (priklauso nuo DNR) turi jungtis su specifinėmis DNR sekomis. RNR polimerazės atpažįstamos sekos vadinamos promotoriumi. DNR grandinė, kuri tarnauja kaip RNR sintezės tem­plate, vadinama tem­plate grandine (-grand).

DNR grandinė, papildanti šabloną, vadinama ne šablonine grandine (+ grandine). Ši nešablono kryptis vadinama kodavimo grandine. RNR polimerazė (holofermentas) jungia pagrindinį fermentą ir sigmą (a) fac­tor.

Sigma faktorius atpažįsta promotoriaus sekas.

RNR polimerazė prisijungia prie pro­moter srities.

RNR polimerazė ištirpdo spiralinę struktūrą ir lokaliai atskiria 2 DNR grandines.

RNR polimerazė inicijuoja RNR sintezę. Vieta, kurioje įterpiamas pirmasis nu&šikleotidas, vadinama pradžios tašku.

Pagrindinis fermentas pradeda transkripciją atskirtoje iniciacijos komplekso DNR grandinėje. RNR polimerazės subvienetas turi dvi specifines surišimo vietas nukleotidų trifosfato (NTP) surišimui. Pirmasis įeinantis NTP prisijungia prie RNR polimerazės pradžios taške, kuriame yra šytėjimas, ir H prisijungia prie DNR komplekso pagrindo.

Ši vieta jungiasi tik su purino nukleotido trifosfatu A arba G. Surišimas vyksta su 3′ NTP galais, o 5′ galas lieka laisvas. Antrasis įeinantis NTP prisijungia prie polimero ir šiazės pailgėjimo vietos.

Šis dinukleotido tetrafosfatas turi 5′ galinį branduolį ir šiotidą. Po šio fosfodiesterio jungties susidarymo išsiskiria faktorius. Tada pirmoji bazė yra atskirta nuo inicijavimo vietos ir nurodo inicijavimo jungtį.

Pagrindinė fermento polimerazė juda 3′-5′ koduojančios grandinės kryptimi ir prideda nuoseklius NTP ribonukleotidų grandinės 3′-OH gale, jau išdėstytoje 5′-3′ kryptimi. Įeinantis NTP sudaro fosfodiesterio ryšį su einančio ribonukleotido 3′-OH galu. DNR spiralė vėl užsidaro po to, kai per ją transkribuoja RNR polimerazė ir auganti RNR grandinė atsiskiria nuo DNR.

RNR molekulės sintezės nutraukimą signalizuoja seka DNR molekulės tem­plate grandinėje, signalą, kurį atpažįsta terminio sintetinimo baltymas, Rho (p) faktorius. Tam tikrose pabaigos vietose išleidžiama nauja RNR grandinė.

Nutraukus, pagrindinis fermentas atsiskiria nuo DNR šablono, o pagrindinis fermentas vėl jungiasi su faktoriumi ir dalyvauja formuojant naują RNR molekulę. Pasibaigus nutraukimui, Rho (p) faktorius disocijuoja RNR ir šis fac­tor vėl perdirbamas. Visas procesas parodytas 25.12 pav.

i. Tai yra pagrindinis transkripcijos fermentas.

ii. Vieno tipo RNR polimerazė yra atsakinga už mRNR, rRNR, tRNR ir tt sintezę.

iii. Įvairių tipų RNR sintezei ir sintezei reikalingi skirtingi fermentai. Jie vadinami RNR polimeraze I, RNR polimeraze II, III ir kt.

iv. E. Coli RNR polimero ir šiazės subvienetų sudėtis.

v. Holofermentas α2ββ’σ gali būti padalytas į du komponentus – pagrindinį fermentą (α2ββ’) ir sigmos faktorius.

vi. Holofermentui reikalingas dvigrandės DNR šablonas, keturi ribonukleotido trifosfatai (GTP, ATP, UTP, CTP) ir Mg++ arba Mn++.

vii. Holoenzimas inicijuoja transkripciją.

viii. Pagrindinis fermentas turi galimybę sintetinti RNR ant DNR šablono.

3. Sigma (σ) RNR veiksniai:

Transkripcijos inicijavimui reikalingi specifiniai baltymai (žinomi kaip σ faktoriai). Šie sigmos faktoriai grįžtamai jungiasi prie kataliziškai aktyvios šerdies RNR polimerazės.

Pagrindinė RNR polimerazė sąveikauja su sigma (σ) faktoriais, sudarydama holofermentą. Po σ faktoriaus išsiskyrimo pagrindinis fermentas pailgina RNR grandinę.

Daugumai ląstelių transkripcijos reikia pirminio σ faktoriaus. E. coli pirminis σ faktorius vadinamas σ 70, o B. subtilis – σ 43.

Pastaraisiais metais buvo išskirti genai, koduojantys bakterijų ir fago a faktorius, o jų aminorūgščių sekos buvo išvestos iš atitinkamų DNR sekų. Tai rodo, kad daugelis σ faktorių turi panašias aminorūgščių sekas ir sudaro homologinę baltymų šeimą, todėl σ faktoriai gali panaudoti įvairias baltymų struktūras, kad atliktų bakterijų ląstelėse susijusias funkcijas.

Biocheminė veikla σ Veiksniai:

Bakterijų σ fac­tors biocheminė veikla apima:

b) Promoterio atpažinimo aktyvinimas

d) nespecifinės transkripcijos slopinimas.

(e) Visi σ veiksniai turi bent dvi pirmąsias iš šių veiklų.

Skirtingi σ faktoriai sąveikauja su tuo pačiu pagrindinio RNR polimerazės komplekso atkūrimu. Todėl daugelis faktorių gali turėti bendrą baltymų struktūrą, leidžiančią prisijungti prie šerdies. Promotorių atpažinimas gali įvykti tik tada, kai susidaro holofermentas.

Labiausiai tikėtina, kad patys σ veiksniai užmezga specifinius ryšius su reklama. Bakterijų σ faktoriai lengvai nesijungia su DNR, jei nėra pagrindinio RNR polimero ir šiazės. Kaip ir promotoriaus atpažinimo atveju, σ faktoriai nerodo DNR tirpimo aktyvumo, jei nėra pagrindinių RNR polimerazės subvienetų.

Galiausiai, buvo įrodyta, kad E. coli σ 70 faktoriai sumažina pagrindinių subvienetų afinitetą be promotoriaus turinčiam DNR promotoriui maždaug 10 4 . Buvo teigiama, kad ši veikla yra svarbi, kad būtų galima atpažinti promotorių prieš didelį nespecifinės DNR užnugarį ir šešėlį. B. subtilis sepa­rate baltymo komponentas δ21 slopina DNR, kurioje nėra promotorių, transkripciją.

δ 21 baltymas jungiasi prie B. subtilis šerdies en­zyme, kai yra σ faktorių arba jų nėra, ir sumažina RNR polimerazės sąveiką su DNR šablonu. Įdomu tai, kad gebėjimas slopinti nespecifinę transkripciją taip pat buvo priskirtas specifiškumo faktoriui iš mielių mitochono ir shydrijos, kuris funkciškai gali būti panašus į σ faktorių.

Bendrosios savybės σ Veiksniai:

a) σ faktoriai sudaro nevienalytę baltymų grupę.

(b) E.coli σ 70 ir B. subtilis σ 43 turi maždaug 50 % aminorūgščių tapatumo, todėl į mažesnį σ 43 faktorių patenka 245 aminorūgščių tarpas.

c ) Visi susiję σ baltymai yra rūgštūs, o neigiamo krūvio perteklius, esant pH 7, 0. E. coli σ 70 faktorius yra vienas rūgštiausių E. coli baltymų.

(d) Dauguma bakterijų a faktorių yra pavieniai polipeptidai.

4. RNR taip pat žinoma kaip ribozimai:

a. RNR, kurios pasižymi dideliu substratui specifiniu kataliziniu aktyvumu ir atitinka visus klasikinius fermentų apibrėžimo kriterijus, vadinamos ribozimais.

b. Jie katalizuoja RNR molekulių fosfodiesterio jungčių transesterifikaciją ir galutinę hidrolizę. Šias reakcijas palengvina laisvos -OH grupės, pvz., ant guanozilo liekanų.

c. Jie atlieka pagrindinį vaidmenį intronų sujungimo įvykiuose, kurie yra būtini pre-mRNR pavertimui subrendusiomis mRNR.

d. Neseniai buvo pastebėta, kad ribosomų RNR komponentas hidrolizuoja aminoacilo esterį ir taip vaidina pagrindinį vaidmenį pep­tide jungties funkcijoje. Šie stebėjimai, atlikti augalų, mielių, vi­rusų ir aukštesnių eukariotinių ląstelių organelėse, rodo, kad RNR gali veikti kaip fermentas.

5. RNR katabolizmas:

a. Ribonukleazės specialiai hidrolizuoja ri&šibonukleino rūgštis.

b. Endonukleazės skaido vidines fosfo ir hidrodiesterio jungtis, kad susidarytų 3′-hidroksilo ir 5′-fosfarilo arba 5′-hidroksilo ir 3′-fosfarilo galas.

c. Egzonukleazės gali hidrolizuoti nukleotidą tik tada, kai jis yra molekulės gale.

RNR molekulės dažnai apdorojamos, kol jos tampa funkcinėmis:

i. Visi eukariotų RNR pirminiai transkriptai yra apdorojami prieš atliekant jų funkciją, nesvarbu, ar tai būtų mRNR, rRNR ar tRNR. Šis apdorojimas pirmiausia vyksta branduolyje. Apdorojimas apima nukleolitinį skilimą į mažesnes molekules ir susietas nukleolitines bei ligavimo re­akcijas.

ii. Žinduolių ląstelėse 50–75 procentai branduolinės RNR neprisideda prie citoplazminės mRNR. Šis branduolinės RNR praradimas yra žymiai didesnis nei vien tik įkyrių sekų praradimas.

Daugumos eukariotų genų koduojančias dalis (egzonus) pertraukia intronai:

i. Daugelio genų egzonai yra ilgos DNR sekos, kurios neteikia genetinės informacijos ir galiausiai yra transsiliuojamos į baltymo molekulės aminorūgščių seką. Šios sekos pertraukia struktūrinių genų koduojančią sritį. Šios tarpinės sekos (intronai) egzistuoja daugumoje eukariotų.

ii. Introno RNR sekos išskaidomos iš nuorašo, o transkripto egzonai sujungiami branduolyje, kol gauta mRNR molekulė ap­pear atsiduria citoplazmoje transliacijai. Egzonai yra genetinės informacijos tiekimo priemonė.

Intronai pašalinami, o egzonai sujungiami:

i. Pašalinus intronus, egzonai surišami, kad susidarytų mRNR molekulė, kuri pernešama į citoplazmą.

ii. Iš keturių skirtingų sujungimo reakcijos mechanizmų čia aprašytas dažniausiai naudojamas eukariotinėse ląstelėse. Yra pakankamai konservuotos sekos kiekvienoje iš dviejų egzonų-intronų (susijungimo) jungčių ir šakos vietoje, kuri yra už 20–40 nukleotidų prieš 3′ sujungimo vietą. Spliceosoma, speciali struktūra, dalyvauja konvertuojant pri­mary transkriptą į mRNR.

iii. Spliceosomos susideda iš pirminio transkripto, penkių mažų branduolinių RNR (U1, U2, U5 ir U4/U6) ir daugiau nei 50 pro­teinų. Kartu jie sudaro mažą nukleoproteinų (snRNP) kompleksą, kartais vadinamą snurp. Snurps yra naudojami RNR segmentams nustatyti, kad būtų galima atlikti būtinas sujungimo ir drebėjimo reakcijas.

Sujungimo reakcija prasideda pjūviu 5′ egzono sandūroje. Tai atlieka nukleofilinis at­tack adenililo liekana šakos taško sekoje, esančioje tiesiai prieš srovę nuo šio introno 3′ galo.

iv. Tada laisvasis 5′ gnybtas sudaro kilpą, kuri neįprasta 5′ — 2′ fosfodiesterio jungtimi yra susieta su reaktyviuoju A PyNPyPyPuAPy šakos vietos sekoje (25.13 pav.). Adenililo liekana paprastai yra 28–37 nukleotidai prieš srovę nuo pašalinamo introno 3′ galo. Filialo svetainė identifikuoja 3′ sujungimo vietą.

Antrasis pjūvis atliekamas introno sandūroje su 3′ egzonu. Šioje antroje transesterifikavimo reakcijoje prieš srovę esančio egzono 3′ hidroksilas atakuoja 5′ fosfatą, esantį pasroviui esančioje eksonintrono riboje, o struktūroje yra ir intronas išsiskiria ir hidrolizuojasi. 5′ ir 3′ egzonai yra susieti, kad susidarytų ištisinė seka.

v. U1 pirmiausia jungiasi prie 5 egzonų ir intronų susietų ir drovių, suporuodamas bazes, tada U2, suporuodamas bazes, prie šakos vietos. Tada U5/U4/U6 kompleksas prisijungia prie spliceosomos. Nuo ATP priklausomas baltymų sukeliamas atsipalaidavimas ir drebėjimas sukelia bazinio porinio U4/U6 komplekso sutrikimą ir U4 išsiskyrimą. Tada U6 gali bendrauti iš pradžių su U2, tada su U1.

Šios sąveikos padeda apytiksliai nustatyti 5′ sujungimo vietą, šakos tašką su jo reaktyviuoju A ir tada 3′ sujungimo vietą. Tai sustiprina U5. Abu galus suskaido U2/U6 kompleksas. RNR tarnauja kaip katalizinis agentas. Tada ši sekvencija kartojasi genuose, kuriuose yra daug intronų. Intronai nebūtinai pašalinami iš eilės - 1, tada 2, tada 3 ir tt.

vi. hn RNR molekulės yra pirminiai nuorašai ir jų anksti apdoroti produktai, kurie kaip subrendusios mRNR molekulės transportuojami į cito ir šiplazmą, pridėjus Caps ir Poly (A) uodegas ir pašalinus dalį, atitinkančią intronus.

6. Ribosominės RNR apdorojamos iš didelis pirmtakas:

i. Žinduolių ląstelėse trys rRN A molekulės yra transkribuojamos, kad veiktų kaip didelė pirmtakų molekulė. Tada pirmtakas apdorojamas branduolyje, kad būtų gautas RNR komponentas citoplazmos ribosomų subvienetams.

rRNR genai yra branduoliuose ir šimtai šių genų yra kiekvienoje ląstelėje. Šis didelis genų skaičius galiausiai susintetina daug kiekvieno tipo rRNR kopijų, kad susidarytų 10 7 ribosomos, reikalingos kiekvienai ląstelės replikacijai. Viena mRNR molekulė yra nukopijuojama į 105 baltymų molekules, skatinant didelį amplifikaciją, o rRNR yra galutiniai produktai.

ii. Kiekvienas iš rRNR genų transkribuojamų vienetų koduoja (nuo 5′ iki 3′) 18s, 5,8s ir 28s ribosominę RNR. Pri­mary nuorašas yra 45 s molekulė, kuri yra labai metilinta branduolyje. 45s pirmtako 28s segmente yra 65 ribozės metilo grupės ir 5 bazinės metilo grupės. 45s pirmtakas yra apdorojamas nukleolitiniu būdu.

iii. Apdorojant rRNR, vyksta tolesnis metilinimas. Branduoliuose didesnis 60-ųjų subvienetas susidaro sujungiant 28-ųjų grandines su 50 ribosomų pro-shiteinų. 5,8 s rRNR molekulė taip pat susidaro iš 45 s pirmtako RNR branduolyje. 18s rRNR molekulė yra taip susieta su 30 ribosomų baltymų, kad susidarytų ribosomų subvienetai (40s).

7. Messenger RNR (mRNR) yra modifikuota 5′ ir 3′ galuose:

i. Žinduolių mRNR molekulių 5 galuose yra 7-metilguanozino dangtelio struktūra, o dauguma jų turi poli (A) uodegą 3′ gale. Dangtelio struktūra pridedama prie naujai transkribuoto mRNR pirmtako 5′ galo branduolyje prieš transportuojant mRNR molekulę į citoplazmą.

RNR transkripto 5′ dangtelis yra būtinas transliacijos inicijavimui ir mRNR 5′ galo apsaugai nuo 5′ → 3′ egzonukleazių atakos.

ii. Poli (A) uodegos pridedamos prie mRNR molekulių 3′ galo po transkripcijos ir įprasto apdorojimo etapo. Pirmiausia mRNR suskaidoma maždaug 20 nukleotidų pasroviui nuo AAUAA atpažinimo sekos. Poli (A) polimerazė prideda trumpą poli (A) uodegą, kuri pailgėja iki 200 A liekanų.

Šis fermentas apsaugo mRNR 3′ galą nuo 3′ → 5′ egzonukleazės atakos. Mam ir shymalian ląstelėse citoplazminiai procesai gali pridėti ir pašalinti adenilato likučius iš poli (A) uodegų.

iii. Papildomi nukleotidai atsiranda nekoduojančiuose regionuose tiek 5′, tiek 3′ iki koduojančios re′ ilgiausios nekoduojančios sekos paprastai yra 3′ gale.

8. Pernešimo RNR (tRNR) yra plačiai apdorojama ir modifikuojama:

i. tRNR molekulės veikia kaip adapterinės molės ir shyekulės, skirtos mRNR vertimui į baltymų sekas. tRN As dydį sumažina tam tikra ribonukleazių klasė. Kai kurių tRNR molekulių genai turi vieną 10–40 nukleotidų ilgio introną.

Šie intronai yra transkribuojami. Daugelio tRNR molekulių pirmtakų nuorašų apdorojimas turi apimti intronų pertvarkymą ir tinkamą antikodono srities sujungimą, kad būtų sukurta aktyvi adapterio molekulė baltymų sintezei ir šitezei.

ii. Tolesnis tRNR mol­ecules modifikavimas apima nukleotidų alkilinimą’ ir būdingo C-C-A terminalo prijungimą prie mol′ galo fermento nukleotidilo trans&šiferazės. A ribozės 3’OH yra specifinės aminorūgšties, kuri turi patekti į baltymų sintezės polimerizacijos reakciją, prisijungimo tašką.

Žinduolių tRNR pirmtakų metilinimas vyksta branduolyje, tačiau C-C-A skilimas ir prisitvirtinimas yra citoplazminės funkcijos. Aminorūgščių prijungimui prie C-C-A liekanų reikia žinduolių ląstelių citoplazmoje esančių fermentų.


Biologinis vaidmuo

Endogeniniai ir aplinkos veiksniai nuolat modifikuoja genominę DNR, todėl eukariotų ląstelėje susidaro fiziniai pažeidimai arba modifikacijos, dėl kurių nusistovi 50000� apurino/apirimidininių (AP) vietų. 4 AP vietos susidaro dėl spontaniškos depurinacijos arba pažeidimui būdingos fermentinės hidrolizės. N- glikozilo jungtis tarp dezoksiribozės ir bazės. Apskaičiuota, kad savaiminio depurinacijos greitis yra � 4 depurinacijos vienoje ląstelėje per dieną. 5 Bazinio ekscizijos taisymo (BER) kelias (​ pav. (1 pav.) 1 ) yra atsakingas už paprastų bazinių pažeidimų ir AP vietų pašalinimą DNR. Pol β prisideda prie dviejų fermentinių veiklų – DNR sintezės ir dezoksiribozės fosfato (dRP) liazės, taisant AP vietas.

Pagrindo ekscizijos remontas. Bazinio iškirpimo taisymas apima pažeisto nukleotido (raudonų rodyklių) pašalinimą iš DNR. Jis pakeičiamas nepažeistu nukleotidu (žaliomis rodyklėmis). Pažeistą bazę pašalina specifinė pažeidimo DNR glikozilazė (1), kuri hidrolizuoja N-glikozidinį ryšį tarp dezoksiribozės ir pažeistos bazės. Šiame paveikslėlyje uracilą pašalins uracilo DNR glikozilazė. AP endonukleazė 1 įpjauna cukraus𠄿osfato pagrindą 5′ iki AP vietos (2). Liazės domenas pol β (3) pašalina 5′-dRP grupę (raudonas žymeklis), o polimerazės domenas įterpia nukleotidą į nuo šablono priklausančią reakciją (žalias rodyklė). DNR ligazė (4) užsandarina įtrūkusią DNR, todėl atkuriama pradinė DNR struktūra.

AP vietos yra potencialiai pavojingi pažeidimai, nes jie gali būti mutageniški ir citotoksiški. AP endonukleazė 1 įpjauna AP vietą, todėl susidaro 3′-hidroksilas ir 5′-dRP galai. dRP grupę išskiria pol β liazės aktyvumas, todėl susidaro 5′-fosfatas ir vieno nukleotido tarpas (ty viena šablono bazė). Pol β užpildo šį vieno nukleotido spragą, todėl DNR yra įtrūkusi, kuri vėliau bus susieta, kad būtų atkurta natūrali DNR struktūra.

Kaip išsamiai aptarta toliau ir kitur, 6,7 pol β ir kiti DNR polimerazių X šeimos nariai išsivystė, kad užpildytų trumpas DNR spragas esminių ląstelių operacijų metu. Pelės modelio sistemoje dėl pol β praradimo atsiranda embriono mirtingumas, tačiau išauginti embrioniniai pelių fibroblastai yra gyvybingi. 8 Šios ląstelės yra itin jautrios genominiams toksiniams medžiagoms, nes jose kaupiasi citotoksiniai taisymo tarpiniai produktai. 9 Be savo fermentinės veiklos, pol β fiziškai sąveikauja su kitais pagrindiniais BER veiksniais, kurie pagreitina taisymą AP vietose. 10

Pagrindinis vaidmuo, kurį pol β atlieka BER ir didelio tikslumo spragas užpildančioje DNR sintezėje, reiškia, kad pol β ir BER yra naviko slopintuvai. 11,12 Šią idėją atitinka pastebėjimas, kad didelė dalis navikų turi pol β variantus. Jie dažnai turi pakitusią ištikimybę arba katalizinę veiklą ir gali sukelti ląstelių transformaciją. 13 Daugelyje šių variantų yra aminorūgščių pokyčių, kurie yra nutolę nuo polimerazės arba liazės aktyvių vietų. Dar reikia išsiaiškinti, ar šie pokyčiai turi įtakos kritinei baltymų ir baltymų sąveikai, reikalingai efektyviam BER arba kritiniam baltymų dinaminiam elgesiui, turinčiam įtakos kataliziniam aktyvumui ir (arba) tikslumui (žr. toliau).


Fosfodiesterio jungties susidarymas

Formuojantis fosfodiesteriui dvi hidroksilo (OH) grupės fosfato molekulėje jungiasi su 3' ir 5' anglies atomais ant dviejų nepriklausomų pentozės cukrų. Tai dvi kondensacijos reakcijos, todėl susidaro dvi vandens molekulės. Tada fosfatas su cukrumi sujungiamas dviem esterio ryšiais, taigi ir fosfodiesterio jungties nomenklatūra. Šią reakciją katalizuoja ligazės, tokios kaip DNR ligazė DNR replikacijos metu.

Reakcijos vaizdas parodytas žemiau esančioje diagramoje.


Fosfodiesterio jungtis

A fosfodiesterio jungtis įvyksta, kai lygiai dvi fosforo rūgštyje esančios hidroksilo grupės reaguoja su kitų molekulių hidroksilo grupėmis ir sudaro dvi esterio jungtis. „Ryšys“ apima šį ryšį C-O-PO2 − -O-C. [1] Diskusijoje apie fosfodiesterius dominuoja jų paplitimas DNR ir RNR, tačiau fosfodiesterių pasitaiko ir kitose biomolekulėse, pvz. acilo nešiklio baltymai.

Fosfodiesterio ryšiai sudaro DNR ir RNR stuburą. Konkrečiai, fosfodiesterio ryšys sujungia vienos cukraus molekulės 3' anglies atomą ir kitos 5' anglies atomą. Šios sacharidų grupės gaunamos iš dezoksiribozės DNR ir ribozės RNR. Fosfodiesteriai yra neigiamai įkrauti, kai pH 7. [2] Atstūmimas tarp šių neigiamų krūvių turi įtakos polinukleorūgščių konformacijai. Neigiamas krūvis pritraukia histonus, metalų katijonus, tokius kaip magnis, ir poliaminus.

Kad susidarytų fosfodiesterio jungtis ir susijungtų nukleotidai, nukleotidų statybinių blokų trifosfatinės arba difosfatinės formos suskaidomos, kad būtų gauta energija, reikalinga fermentų katalizuojamai reakcijai sukelti. [3]

Fosfodiesterinių jungčių hidrolizę katalizuoja fosfodiesterazės, kurios dalyvauja atkuriant DNR sekas. [4]

Fosfodiesterio ryšys tarp dviejų ribonukleotidų gali būti nutrauktas šarminės hidrolizės būdu, tuo tarpu ryšys tarp dviejų dezoksiribonukleotidų tokiomis sąlygomis yra stabilesnis. Santykinis RNR hidrolizės lengvumas yra 2' hidroksilo grupės buvimo poveikis.

Fosfodiesterazė yra fermentas, katalizuojantis fosfodiesterio jungčių hidrolizę, pavyzdžiui, jungties ciklinio AMP arba ciklinio GMP molekulėje.

Fermentas, vaidinantis svarbų vaidmenį atstatant oksidacinį DNR pažeidimą, yra 3'-fosfodiesterazė.

DNR replikacijos metu tarp fosfatų yra skylė, kurią palieka DNR polimerazė I. DNR ligazė gali sudaryti tarp nukleotidų fosfodiesterio ryšį.


Įterpimo sekos

Perkėlimo strategijos

Fosfodiesterio jungčių endonukleolitiniam skilimui IS galuose ir jų perkėlimui į tikslinę DNR molekulę paprastai reikia surinkti sinapsinį kompleksą, apimantį Tpazę, abu galus ir tikslinę DNR. Atliekant klasikinį perkėlimą, yra du pagrindiniai perkėlimo režimai – konservatyvus ir replikacinis, pagrįsti tuo, ar elementas nukopijuotas jo poslinkio metu, ar ne. Tai priklauso nuo skilimų galuose pobūdžio ir tvarkos ( 2 pav ): ar transpozonas yra išlaisvintas iš savo donoro stuburo dviejų grandžių skilimo būdu, ar jis lieka prijungtas po to, kai suskaidoma tik viena grandinė. Daugelio perkeliamų elementų DNR skilimo ir grandinių sujungimo reakcijos su DDE Tpazėmis yra nepaprastai panašios. Jie katalizuoja endonukleolitinį skilimą kiekviename 3′ transpozono gale, kad išlaisvintų 3′ OH grupes, kurios vėliau naudojamos suderintam nukleofiliniam išpuoliui prieš tikslinę molekulę.

2 pav. Pagrindinės perkėlimo strategijos. Transpozono DNR pažymėta atviromis arba tamsesnėmis dėžėmis naujai replikuotai transpozoninei DNR. Donoro DNR pažymėta brūkšnelėmis, o tikslinė DNR – paryškintomis linijomis. Sruogos skilimas rodomas kaip mažos vertikalios rodyklės. Nukleofilinė fosfodiesterio jungties P ataka, kurią sukelia aktyvus 3′ hidroksilas (3′OH), sukeliantis grandinės perkėlimą, taip pat pažymėtas rodyklėmis. Tikslinėje DNR parodyta dantyta sritis reiškia tikslinius dubliavimus, susijusius su įterpimu. DNR poliškumas rodomas kiekvienos plokštės viršuje. Atkreipkite dėmesį, kad IS atveju91 Manoma, kad perkėlimo mechanizmas atsiranda naudojant riedėjimo ratą. Tikslinės DNR poliškumas buvo apverstas, kad būtų lengviau nupiešti figūrą.

Svarbus perkėlimo bruožas yra 5′ galo (antrosios krypties) apdorojimo būdas. Replikacinis perkėlimas reiškia tik vienos grandinės skilimą kiekviename transpozono gale ir perkeliama į tikslinę vietą, kad būtų sukurta replikacijos šakutė ( 2 pav ). Atrodo, kad kai kurios IS neapdoroja antrosios krypties ir tiesiog atlieka replikacinį perkėlimą arba, tiksliau, replikacinę integraciją (2 pav.a)). Jei perkėlimas yra tarpmolekulinis, replikacija iš besiformuojančios (-ių) šakutės (-ių) generuoja kointegracijas (replikonų susiliejimą), kai donoro ir tikslinės replikonai yra sujungti, bet atskirti tiesiogiai pasikartojančia elemento kopija kiekvienoje sandūroje. Šių struktūrų išskyrimas, kad būtų atkurtos donorinės ir tikslinės molekulės, kurių kiekviena turi vieną elemento kopiją, pasiekiama rekombinuojant du elementus. This proceeds for some transposons by site-specific recombination using a specialized transposon-specific enzyme distinct from the Tpase, the resolvase (e.g., Tn3 family), or is taken in charge by the host homologous recombination system.

In conservative or cut-and-paste transposition, the element is excised from (or replicated out of) the donor site and reinserted into a target site. This implies cleavage of both DNA strands at the ends of the element and their rejoining to target DNA to generate a simple insertion. The original donor DNA molecule is either degraded or repaired by host-specified enzymes. Different IS elements have adopted various strategies to separate themselves from the donor DNA backbone. Some of these are shown in 2 pav .

It has been possible to experimentally convert the transposition pathway of some elements from a cut-and-paste mode to a cointegrate mode by simple mutation, illustrating the subtle flexibility of the reactions and providing some hints as to the evolution of these pathways.

Of those ISs not belonging to the DDE group, transposition of IS608 and ISDra2, both members of the IS200/IS605 family, is understood in detail ( 3 pav ). Their Tpases (TnpA) are Y1 Tpases of the HUH endonuclease superfamily. They use a single catalytic tyrosine as a nucleophile for strand cleavage and transfer. TnpA acts as a dimer, recognizes the subterminal hairpin structures at both ends on a specific strand (defined as the top strand). In contrast to the DDE enzymes, which do not form covalent enzyme–substrate intermediates, TnpA creates a 5′ phosphotyrosine covalent intermediate on DNA cleavage: with the left end of the IS and with the DNA flank at the right ends. Strand transfer then excises the IS as a single (top)-strand circle rejoining the left and right DNA donor flanks. The single-strand circle then integrates into a suitable target. This class of ISs, requiring single-strand DNA, shows preferential excision from and integration into the lagging strand of replication forks and other regions of single-strand DNA such as those produced during fragmentation and reassembly of the Deinococcus radiodurans genome following irradiation. Insertion occurs 3′ to a specific tetra- or pentanucleotide which is also required for further transposition.

YRA91 appears to have adopted a polarized rolling circle transposition mode (as suggested by the similarity of its Tpase with rolling-circle-type replicases). Like IS608 and ISDra2, it requires a specific tetranucleotide target sequence that abuts IRR ( 2 pav ). One-ended transposition products occur at high frequency in the absence of IRL. They carry a constant end defined by IRR and a variable end defined by a copy of the target consensus located in the donor plasmid. It is thought that donor strand cleavage results in a covalent complex between the 5′ IRR end and Tpase and is followed by single-strand transfer into the target DNA at a site containing a consensus tetranucleotide. The attached single strand of the IS is displaced by replication in the donor molecule. Termination is triggered when the complex reaches either the 3′ IRL end or a tetranucleotide consensus sequence in the donor ( 2 pav ). This scheme does not, however, address how the element is replicated into the target molecule.


Supplementary Figure 1 Kinetics of I-DmoI cleavage under single-turnover conditions.

A) pH 8/65ºC and B) pH6/40ºC. First-order rate constants (k*) are plotted against I-DmoI initial concentrations ([I-DmoI]0). The correlation coefficients (R) corresponding to the curve fitting to the equation describing k* as a function of [I-DmoI]0 and the estimated kinetic parameters k*maks ir K M* are shown in the chart. One gel for each assay is presented as an example of the experimental data.

Supplementary Figure 2 Superposition of the active centers of I-DmoI in the presence of Mg 2+ or Mn 2+ .

Each structure is colored according to the nature of the present divalent ions. A) The initial state of the reaction previously obtained in the presence of the non-catalytic metal Ca 2+ (PDB Code 2VS7) is superimposed with the initial experimental state obtained in this manuscript. The rmsd (root mean square deviation) of the atoms in the active centre is 0.2 Å. B) Detailed view of the active centre comparing the conformation of the state 2. The DNA phosphodiester bonds are still intact and sites A and B are occupied with the metal, Mg 2+ or Mn 2+ depending on the soaking. The rmsd of the atoms in the active centre is 0.1 Å. C) A similar detailed view of the enzyme catalytic centre in state 7. This is the final state where both DNA strands are cleaved in the same way independently of the metal used in the experiment (Mg 2+ or Mn 2+ ), and the metal is found in sites A and B. The rmsd of the atoms in the active centre is 0.1 Å. The Mg 2+ structures were solved at 2.20 and 2.35 Å resolution for states 2 and 7 respectively.

Supplementary Figure 3 PELE simulation results: interaction energies (kcal/mol) versus distance (Å) for the Mn 2+ ions’ entrance along the channel formed in the I-DmoI–DNA interface.

A different colour is used for the interaction energies obtained for the independent 127 PELE trajectories. Distances are relative to reference positions (i.e. in PDB structures). Positions of binding sites A, B and C are highlighted with blue circles. Graphs correspond to: A-B) modelling of Mn 2+ binding to site A when no ions are previously located in the active site C-D), modelling of Mn 2+ binding to site B when no ions are previously bound in the active site E-F), modelling of Mn 2+ binding to site B when there is an ion bound in site A and G-H), modelling of Mn 2+ binding to site C when there are ions bound in sites A and B. The green and grey spheres in Figures B, D, F. H are used to show the reference positions and the places visited by the Mn 2+ ions throughout the PELE ‘effective’ trajectories (.i.e. corresponding to simulations where the ions accessed the active site).

Supplementary Figure 4 PB calculations in the structure corresponding to the first stage of the catalytic process of I-DmoI.

A) Electrostatic potential visualization of the surface in complex I-DmoI/DNA. The arrow indicates the aperture of the channel in the protein/DNA interface where site A is located. The DNA double helix is highlighted in yellow. B) Calculated Molecular Interaction Potential (MIP) using Mn 2+ as probe for the structure corresponding to the initial stage of catalysis (state 1). The black mesh corresponds to the calculation assuming that no divalent ions are bound to I-DmoI. The red mesh corresponds to the calculation assuming that Mn 2+ ions were previously bound to sites A and B. The 100 points of highest interaction energy (electrostatic + Van der Waals) are depicted in each case. The Mn 2+ atoms are represented as black spheres and the residues involved in their coordination are shown. Notice that site C is predicted to bind Mn 2+ even when divalent ions are previously bound to sites A and B. Panels C and D depict the Potential Energy Surface (PES) at the QM(BP86/SVP)/MM(AMBER) level of theory corresponding to the movement of a divalent ion from site A or B to C. C) The divalent ion was modelled as Mg 2+ . The 90 atoms considered in the QM partition are highlighted. The starting structure in the calculations is depicted in D), where black and red arrows indicate the displacements modelled from site A to C or B to C, respectively. Note that only one ion was present in the calculations, which is initially bound to sites A or B. QM/MM calculations show that there would be an energy barrier of

15-20 kcal/mol associated with the displacement of the ion from A or B to C. Therefore, if an ion initially binds to A or B it would be probably trapped there instead of moving to C.

Supplementary Figure 5 Accumulation of the nicked product in the K120M mutant.

A) The K120M mutation disturbs double strand cleavage allowing the accumulation of nicked plasmid. 2 nM of supercoiled plasmid DNA target was incubated with 100 nM of wild type I-DmoI or 50, 100 nM of I-DmoI K120M mutant at pH 8, 65 ºC for 30 min. B) Nicked oligonucleotides labeled with 6-FAM (C and NC) were used to determine which DNA strand is affected by the K120M mutation in I-DmoI. Oligonucleotide and protein at 750 nM were incubated at pH 8, 65 ºC for 30 min. The left panel of the gel displays NC and C substrates in the absence of enzyme determining the non-cleaved status of the probes. In the right panel of the gel NC and C were incubated with I-DmoI K120M showing that the mutant activity to digest the intact coding strand in target C is normal however, the mutant activity was affected when the NC probe (containing the intact non-coding strand) was used in the assay.

Supplementary Figure 6 Potential energy surface at the QM(B3LYP/SVP) level, considering a direct nucleophilic attack of a hydroxyl ion on the target phosphate group.

The same model depicted in Supplementary Figure 7A was considered [RC: Reaction Coordinate (combination of interatomic distances considered to model the reaction of interest)]. After optimization of the initial structure, a penta-coordinated phosphorous intermediate (similar to the one obtained in first step of the mechanism depicted in Supplementary Figure 7) is obtained, later this intermediate easily evolves to the final hydrolytic products (reaction energy of -32.7 kcal/mol at the QM(B3LYP/6-311++G(d,p)//B3LYP/SVP) level of theory). However, the distance between the O3’ leaving atom and the phosphate group as well as the pattern of coordination of metals in sites B and C are inconsistent with the crystallographic structures corresponding to states 5 to 7 of the catalytic mechanism of I-DmoI.

Supplementary Figure 7 QM(B3LYP/SVP) calculations in a model of the I-DmoI active site, considering a proton transfer between the nucleophilic water molecule and the O3′ leaving group.

A) The model considered (110 atoms) was based on the structure corresponding to time 8h (state 3). B) Potential Energy Surface (PES) of a first step where the target phosphate group deprotonates the incoming water molecule and renders a penta-coordinated phosphorous intermediate. The associated energy barrier and reaction energy of this step at the QM(B3LYP/6-311++G(d,p)//B3LYP/SVP) level are 24.8 and 20.4 kcal/mol respectively. C) PES corresponding to the final nucleophilic attack of the resulting hydroxyl ion and the protonation of the O3’ leaving group. The reaction energy considering the final product and the reactants is 1.0 kcal/mol at the QM(B3LYP/6-311++G(d,p)//B3LYP/SVP) level of theory RC: Reaction Coordinate (combination of interatomic distances considered to model the reaction of interest). D) Superimposition of the structure corresponding to the last stage of the catalytic process (state 7) after replacing the water in site C by Mg 2+ and the same structure optimized at level QM(B3LYP/SVP)/MM(AMBER). The pre-optimized structure is depicted in dark gray. Notice that E117 is not coordinating the ion in C in the optimized structure, which negatively impacts its binding affinity.


Biotechnology Principles And Processes MCQ NEET Important Questions – Answer Keys

1) C. DNA ligase is genetic or DNA adhesive – a specific type of enzyme, a ligase, (EC 6.5.1.1) that facilitates the joining of DNA strands together by catalyzing the formation of a phosphodiester bond.

2) A. A selectable marker is a gene introduced into a cell, especially a bacterium or to cells in culture, that confers a trait suitable for artificial selection.

3) C. Recombinant human insulin has been produced predominantly using E. coli for therapeutic use in human.

4) D. DNA fingerprinting is a method used to identify an individual from a sample of DNA by looking at unique patterns in their DNA. restriction fragment length polymorphism, or RFLP, is a technique
that exploits variations in homologous DNA sequences. It refers to a difference between samples of homologous DNA molecules from differing locations of restriction enzyme sites

5) D. It acts in alkaline medium and binds to epithelial cells of midgut

6) A. Plasmids that can transfer foreign DNA into a living cell

8) C. Restriction endonucleases : Chemical knife and ligases: Genetic gum

9) A. Genes that confer resistance to various antibiotics are used as selective markers in cloning vectors. Normally the genes encoding resistance to antibiotics such as ampicillin, chloroamphenicol, tetracycline or kanamycin, etc., are considered useful selectable markers for E. coli.

10) A. The crude oil degradation –> Pseudomonas putida.

11) D. Bam HI, Eco RI & Hind III are restriction endonuclease pBR322 is plasmid of E.coli

12) A. Ti (tumor-inducing) plasmid based vectors are high efficiency vectors and were developed with the aim of introducing genes into plants.Agrobacterium tumefaciens causes crown gall disease
in plants in which cells grow in anundifferentiated and uncontrolled manner to form a tumor.

13) D. Retroviruses used as Vector

14) D. Plasmid used as vectors

15) C. rDNA technology is genetic engineering

16) A. Formation of phosphodiester bond between two DNA fragments

17) C. Entamoeba coli is a protozoa

18) C. Extension of primer end on the template DNA

19) A. Human gene may have intron which bacteria cannot process

20) C. A continuous culture system

23) A. A device in which substances are treated to stimulate biochemical transformation by living cells

24) C. It involves manipulation of two DNAs

25) D. The cell is treated with a specific concentration of a divalent cation such as calcium to increase pore size in cell wall.

26) D. All of these required for PCR

27) D. A phosphodiester bond within a specific sequence

28) B. Tetracycline resistance

29) C. It requires simultaneous plating on two plates having different antibiotics

30) A. The proteins involved in the replication of the plasmid

32) C. Chromogenic substrate gives blue colour The rDNA or recombinant DNA is inserted within the coding sequence of the enzyme galactosidase. This results in inactivation of the enzyme. In the presence of chromogenic substrate, blue coloured colonies are produced if the plasmid in the
bacteria doesn’t have the insert i.e. those are non recombinant.

36) B. Transformation of plant cells

37) A. As selectable markers

More Post Related to Biotechnology Principles And Processes MCQ NEET Important Questions

Must visit these page for more study materials.

Respiration In Plants Mcq Important questions For Neet Pdf – NCERT Biology Class 11 Chapter 14 For NEET, CBSE

Biotechnology And Its Applications MCQ Important Questions For NEET – Biology NCERT Class 12 Chapter 8


16.1. Determining the Nature of DNA

The isolation of Nuclein

Modern understandings of DNA have evolved from the discovery of nucleic acid to the development of the double-helix model. In the 1860s, Friedrich Miescher (Figure 16.2), a physician by profession, was the first person to isolate phosphate-rich chemicals from white blood cells or leukocytes. He named these chemicals (which would eventually be known as RNA and DNA) nuclein because they were isolated from the nuclei of the cells.

To see Miescher conduct an experiment step-by-step, click through this review of how he discovered the key role of DNA and proteins in the nucleus.

Griffith and Bacterial Transformation

A half century later, British bacteriologist Frederick Griffith was perhaps the first person to show that hereditary information could be transferred from one cell to another “horizontally,” rather than by descent. In 1928, he reported the first demonstration of bacterial transformacija, a process in which external DNA is taken up by a cell, thereby changing morphology and physiology. He was working with Streptococcus pneumoniae, the bacterium that causes pneumonia. Griffith worked with two strains, rough (R) and smooth (S). The R strain is non-pathogenic (does not cause disease) and is called rough because its outer surface is a cell wall and lacks a capsule as a result, the cell surface appears uneven under the microscope. The S strain is pathogenic (disease-causing) and has a capsule outside its cell wall. As a result, it has a smooth appearance under the microscope. Griffith injected the live R strain into mice and they survived. In another experiment, when he injected mice with the heat-killed S strain, they also survived. In a third set of experiments, a mixture of live R strain and heat-killed S strain were injected into mice, and—to his surprise—the mice died. Upon isolating the live bacteria from the dead mouse, only the S strain of bacteria was recovered. When this isolated S strain was injected into fresh mice, the mice died. Griffith concluded that something had passed from the heat-killed S strain into the live R strain and transformed it into the pathogenic S strain, and he called this the transforming principle (Figure 16.3). These experiments are now famously known as Griffith’s transformation experiments.

Scientists Oswald Avery, Colin MacLeod, and Maclyn McCarty (1944) were interested in exploring this transforming principle further. They isolated the S strain from the dead mice and isolated the proteins and nucleic acids, namely RNA and DNA, as these were possible candidates for the molecule of heredity. They conducted a systematic elimination study. They used enzymes that specifically degraded each component and then used each mixture separately to transform the R strain. They found that when DNA was degraded, the resulting mixture was no longer able to transform the bacteria, whereas all of the other combinations were able to transform the bacteria. This led them to conclude that DNA was the transforming principle.

DNA, Not Proteins, is the Genetic Material

Experiments conducted by Martha Chase and Alfred Hershey in 1952 provided confirmatory evidence that DNA was the genetic material and not proteins. Chase and Hershey were studying a bacteriophage, which is a virus that infects bacteria. Viruses typically have a simple structure: a protein coat, called the capsid, and a nucleic acid core that contains the genetic material, either DNA or RNA. The bacteriophage infects the host bacterial cell by attaching to its surface, and then it injects its nucleic acids inside the cell. The phage DNA makes multiple copies of itself using the host machinery, and eventually the host cell bursts, releasing a large number of bacteriophages. Hershey and Chase labeled one batch of phage with radioactive sulfur, 35 S, to label the protein coat. Another batch of phage were labeled with radioactive phosphorus, 32 P. Because phosphorous is found in DNA, but not protein, the DNA and not the protein would be tagged with radioactive phosphorus.

Each batch of phage was allowed to infect the cells separately. After infection, the phage bacterial suspension was put in a blender, which caused the phage coat to be detached from the host cell. The phage and bacterial suspension was spun down in a centrifuge. The heavier bacterial cells settled down and formed a pellet, whereas the lighter phage particles stayed in the supernatant. In the tube that contained phage labeled with 35 S, the supernatant contained the radioactively labeled phage, whereas no radioactivity was detected in the pellet. In the tube that contained the phage labeled with 32 P, the radioactivity was detected in the pellet that contained the heavier bacterial cells, and no radioactivity was detected in the supernatant. Hershey and Chase concluded that it was the phage DNA that was injected
into the cell and carried information to produce more phage particles, thus providing evidence that DNA was the genetic material and not proteins (Figure 16.4).

Nucleotide Experiments of Chargaff

Around this same time, Austrian biochemist Erwin Chargaff examined the content of DNA in different species and found that the amounts of adenine, thymine, guanine, and cytosine were not found in equal quantities, and that it varied from species to species, but not between individuals of the same species. He found that the amount of adenine equals the amount of thymine, and the amount of cytosine equals the amount of guanine, or A = T and G = C. This is also known as Chargaff’s rules. This finding proved immensely useful when Watson and Crick were getting ready to propose their DNA double helix model.


DNA Replication, Transcription & Translation

Whenever cells divide, they need to make an extra copy of their DNA through DNA replication. DNA gives our cells the ‘instructions’ to make proteins - the things which do the work in our cells and include enzymes, hormones and channel proteins. DNA is converted into protein in two processes which sound annoyingly similar - transcription and translation.

Semi-conservative DNA replication

During cell division, cells need to make a complete copy of their genetic information. When DNA is replicated, the new DNA molecule is made up of one strand of the original DNA whereas the other strand is made of freshly made DNA. Since half of the DNA is preserved from the previous round of DNA replication, we describe the process as semi-conservative. It takes place in the following stages:

DNA helicase unwinds the double helix, breaking the hydrogen bonds between complementary base pairs to separate the strands. One of the strands will act as a šabloną for synthesis of the other strand.

Complementary nucleotides will attach to the template strand by hydrogen bonding.

DNR polimerazė catalyses the formation of fosfodiesterio jungtys between nucleotides, forming a complementary strand alongside the template parent strand.

Du daughter DNA molecules are formed, each containing pusėoriginal DNA molecule.

It is important that DNA polymerase accurately copies the template strand to avoid placing the wrong DNA nucleotide in the incorrect position. To avoid this, DNA polymerase ‘proofreads’ the complementary strand as it moves along the DNA. If it detects a mismatch, it can ‘snip out’ the wrong nucleotide and replace it with the right one. DNA polymerase has an accuracy rate of about 99%, which means that mistakes do occur every once in a while. A mistake results in a change to the DNA base sequence, which is known as a mutacija. DNA mutations can have detrimental effects to the organism, since an altered base sequence can change the sequence of amino acids in a protein, causing it to fold differently and possibly lose its function.

Meselson and Stahl’s Experiment

The evidence that DNA replication is semi-conservative comes from a pretty clever experiment carried out by Matthew Meselson and Franklin Stahl. Before this, scientists were unsure whether DNA replication was conservative or semi-conservative. If DNA replicated conservatively, the original DNA strands would remain intact and the newly synthesised DNA would consist of two freshly-made strands.

To figure this out they used a heavy isotope of nitrogen (N-15) which has an extra neutron compared to the normal, lighter form of nitrogen (N-14). Jie grew bacteria in the presence of the heavy nitrogen and any new DNA that the bacteria made would incorporate this isotope and so would weigh heavier. If DNA replicates conservatively, Meselson and Stahl knew that they’d see some DNA made of just heavy nitrogen with the rest made of only light nitrogen, but if it replicated semi-conservatively it would be a mixture of the two isotopes. Here’s how they carried out the experiment in more detail:

Two populations of bacteria were grown - one in a solution containing heavy nitrogen and the other in a solution containing light nitrogen. As the bacteria grow and reproduce, they incorporate the nitrogen into their DNR.

DNA was extracted from the bacteria and centrifuged to separate the DNA according to its svorio. The DNA from the bacteria grown in N-15 separated at a higher density (a band lower down the test tube) compared to the DNA from the bacteria grown in N-14.

The scientists then took the bacteria that had been growing in N-15 (which now just contains heavy DNA) and grew them in the light isotope N-14. Again, they extracted their DNA and separated it using centrifugation.

Po to, kai first round of DNA replication, they saw just one band of DNA which was an intermediate weight between 14-N and 15-N. This indicates that the DNA was made up of both types of nitrogen isotopes (i.e. one old strand and one newly synthesised strand).

Po to, kai second round of DNA replication, there was now 2 bands of DNA. One band has an intermediate weight but further newly synthesised DNA is now only being made using the lighter isotope. This proved that DNA is replicated semi-conservatively.

If DNA replication is konservatyvus, Meselson and Stahl would have seen two bands of DNA (one heavy and one light) after both the first and second rounds of replication.



Komentarai:

  1. Brasho

    I cannot take part in the discussion now - no free time. Very soon, make sure your opinion.

  2. Fela

    This is just a wonderful answer.

  3. Akinozahn

    Pažiūrėsiu, kuo daugiau geros kokybės

  4. Saber

    Bravo, manau, kad šis sakinys yra puikus

  5. Callel

    Jus aplankė tiesiog nuostabi mintis

  6. Jugis

    I'm sorry, but in my opinion, you are wrong. Aš esu tikras. We need to discuss. Parašyk man pm.



Parašykite pranešimą