Informacija

14.3: 7-TM receptoriai (susieti su G baltymu) – Biologija

14.3: 7-TM receptoriai (susieti su G baltymu) – Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Nenuostabu, kad 7 transmembraniniai receptoriai arba su G baltymu sujungti receptoriai yra baltymų šeima, kuri 7 kartus praeina per ląstelės membraną. Amino galas yra tarpląstelinis, o karboksilo galas yra tarpląstelinis. Paveiksle (PageIndex{2}) pavaizduotos transmembraninės sritys, išskirstytos siekiant aiškumo, tačiau transmembraniniai domenai iš tikrųjų susidaro kartu labiau cilindro pavidalu.

7-TM baltymai naudojami kaip receptoriai neuromediatoriams, tokiems kaip epinefrinas (β-adrenerginis receptorius), acetilcholinas (muskarino receptorius) ir serotoninas, taip pat hormonams, tokiems kaip gliukagonas ar skydliaukę stimuliuojantis hormonas, ir net nemolekuliniams ligandams, tokiems kaip šviesa. ! Rodopsinai yra 7-TM receptorių klasė, kurie aktyvuojami, kai sugeria fotoną ((PageIndex{5}) pav.). Šios receptorių šeimos aktyvinimas fotonu ar įprastesniu ligandų surišimu sukelia citoplazminio domeno konformacinį pokytį, kuris keičia receptorių ir baltymų komplekso, žinomo kaip heterotrimerinis G baltymas, sąveiką.

Heterotrimerinis G baltymas susideda iš a, b ir g subvienetų, kurių a subvienetas gali susieti arba GTP, arba GDP, ir gali hidrolizuoti GTP į BVP. Kai 7-TM receptorius yra neaktyvus, G baltymo kompleksas paprastai yra netoliese, susietas su membrana miristoilinant arba palmitoilinant a subvienetą ir farnezilinant arba geranilgeranilinant g subvienetą. Kai 7-TM receptorius suaktyvinamas, jis susijungia su heterotrimeriniu G baltymu, dėl kurio Ga atleidžia BVP ir prisijungia prie GTP. Tada Ga atsiskiria nuo kitų dviejų subvienetų. Tada jis gali susieti ir suaktyvinti fermentą, kad išplėstų signalizacijos kaskadą. Vienas iš dviejų klasikinių būdų prasideda adenilato (adenililo) ciklazės Ga aktyvavimu. Adenilato ciklazė (AC) paverčia ATP į cAMP. Kadangi ATP yra daug, o kintamoji srovė yra gana greitas fermentas, pirmasis signalo stiprinimas atsiranda generuojant „antrosios pasiuntinio“ molekulę cAMP. Tada kiekviena cAMP molekulė gali aktyvuoti kitus fermentus, kurių pirminė yra proteinkinazė A. Tada PKA gali fosforilinti įvairius substratus, kad pakeistų ląstelių aktyvumą genų ekspresija, molekuliniais varikliais arba metaboliniais pokyčiais.

Kitas klasikinis 7-TM receptorių būdas yra fosflipazės Cb aktyvinimas, taip pat Ga. PLCb iš tikrųjų gamina dvi antrąsias pasiuntinio molekules: hidrolizuoja fosfatidilinozitolį į diacilcilcerolį (DAG) ir inozitolio trifosfatą (IP).3). IP3 pirmiausia skatina Ca išsiskyrimą2+ iš endoplazminio tinklo. DAG gali aktyvuoti proteinkinazę C. PKC taip pat aktyvuoja Ca2+ ir abu Ca2+ ir DAG gali sinergiškai aktyvuoti PKC. Baltymų kinazė C yra svarbi centrinė kinazė, kuri, kaip įrodyta, fosforilina ir kontroliuoja daugelio kitų fermentų aktyvumą nuo citoskeleto elementų iki transkripcijos faktorių.

Įdomus klasikinių 7-TM būdų variantas prasideda nuo rodopsino receptorių lazdelės ląstelėse. Šie receptoriai suriša fotonus, kad juos suaktyvintų, ir prisijungia prie heterotrimerinio G baltymo. Tada Ga-GTP prisijungia prie fosfodiesterazės (PDE) g subvieneto, aktyvuodamas jį ir katalizuoja cGMP pavertimą GMP. Kai cGMP mažėja, jonų kanalai užsidaro, poliarizuoja membraną ir keičia signalą iš lazdelės ląstelės į smegenis (per jungiančius neuronus).

Antrieji pasiuntiniai turi turėti dvi savybes. Jie turi būti pakankamai maži, kad efektyviai išsisklaidytų, o ląstelė turi sugebėti juos greitai generuoti. Ca2+ ir cAMP patenka į šią kategoriją. Be to, jie abu gali būti gana greitai pašalinti iš apyvartos: pirmasis Ca2+ siurbliai ER ir Golgi, o pastarasis – fosfodiesterazės aktyvumu. Kai buvo atrastas G-baltymų kelias, lipidų antrųjų pasiuntinių naudojimas nustebino. Membraniniai fosfolipidai tuo metu buvo iš esmės ignoruojami kaip paprasti statiniai membranų komponentai. Dabar aišku, kad kai kurie fosfolipidai yra biochemiškai aktyvūs, juos modifikuoja keli fermentai, įskaitant fosfolipazes, fosfolipidines kinazes ir fosfolipidines fosfatazes. Kai kurie iš šių fermentų atlieka įvairias funkcijas, nes jų produkto substratas gali būti svarbi pasiuntinio molekulė. Pavyzdžiui, PI3K (fosfatidilinozitolio-3-kinazė) yra centrinė signalinė kinazė, nes jos produktas PIP3 (fosfatidilinozitolio (3,4,5)-trifosfatas) yra Akt/PKB ir kitų fermentų, galinčių suaktyvinti kelis signalizacijos kelius, aktyvatorius.

Aktyvinimas galiausiai turi baigtis, ir tai įvyksta, kai Ga hidrolizuoja su juo susietą GTP. Tokiu būdu Ga veikia kaip signalizacijos kaskados laikmatis. Tai svarbu, nes norint, kad signalizacija būtų veiksminga, ji turi būti griežtai kontroliuojama. Labai anksti šio kurso metu buvo pažymėta, kad Ca2+ yra labai maža koncentracija ląstelės citoplazmoje, nes norime Ca2+- jautrūs mechanizmai, kad galėtume greitai reaguoti į kalcio antplūdį, tačiau lygiai taip pat norime greitai išjungti signalą, kai reikia, o tai, be abejo, yra daug lengviau padaryti išskiriant nedidelį kiekį Ca.2+ nei daug jo. Panašiai, jei reikalingas nuolatinis recipiento ląstelės aktyvumas, tai pasiekiama nuolat aktyvuojant receptorių, o ne dėl ilgalaikio vieno aktyvavimo poveikio. Tai užtikrina, kad jei ląstelinis poveikis turi būti staigiai ir greitai nutraukiamas, jis gali būti pasiektas be reikšmingo vėlavimo laikotarpio tarp hormonų sekrecijos nutraukimo ir tarpląstelinio signalizacijos nutraukimo.

Receptorius taip pat yra kito uždarymo mechanizmo dalis: siekiant išvengti per didelio stimuliavimo, receptoriai trumpam po jų aktyvavimo yra desensibilizuojami. Su G baltymu sujungta receptorių kinazė (GRK) fosforilina 7-TM receptorių. Fosforilinimas sukuria arrestinų atpažinimo vietas. Arrestinai atlieka įvairias funkcijas, iš kurių paprasčiausia yra veikti kaip konkurencinis receptorių surišimo G baltymo inhibitorius. Tai gana trumpalaikis desensibilizavimas.

Ilgesniam desensibilizavimui arrestinas jungiasi prie AP2 ir klatrino, formuodamas klatrinu dengtą endocitinę pūslelę. Tai pašalina receptorius nuo ląstelės paviršiaus, desensibilizuoja ląstelę daug ilgesniam laikui nei paprasta konkurencija tarp arrestino ir G baltymo.

Sulaikytojai turi kitą galimą funkciją. Jie gali veikti kaip pastolių baltymai, atnešantys visiškai kitokį signalizacijos kompleksą į 7-TM receptorių. Paveiksle (PageIndex{8}) parodytas pavyzdys, kuriame 7-TM receptorius naudojamas Jun transkripcijos faktoriui suaktyvinti.

B-arrestinas atneša AJK-1, MKKY ir JNK-1, kad suaktyvintų JNK-1, kuris vėliau gali fosforilinti Jun. Tai leidžia fosfo-Jun perkelti į branduolį ir vėliau dimerizuoti, paverčiant jį aktyviu transkripcijos faktoriumi.

Kokie yra ląstelių veiksmai, kuriuos gali sukelti 7-TM receptorių aktyvinimas? Ca2+ dinamika bus nagrinėjama atskirame skyriuje. IP3 Įrodyta, kad jis sukelia lygiųjų ir griaučių raumenų susitraukimą, aktino polimerizaciją ir ląstelių formos pokyčius, kalcio išsiskyrimą iš intraląstelinių atsargų, kalio kanalų atidarymą ir membranos depoliarizaciją. cAMP buvo susijęs su glikogeno skilimo ir gliukoneogenezės, triaciglicerolio metabolizmo, kiaušidžių ląstelių estrogenų sekrecijos, gliukokortikoidų sekrecijos ir padidėjusio inkstų ląstelių pralaidumo vandeniui kontrolei.


Struktūrinės įžvalgos apie laktizolio darinių skirtumus slopinančiuose mechanizmus prieš žmogaus saldaus skonio receptorius

Laktizolis, žmogaus saldaus skonio receptorių inhibitorius, turi 2-fenoksipropiono rūgšties skeletą ir, kaip įrodyta, sąveikauja su receptorių T1R3 subvieneto (T1R3-TMD) transmembraniniu domenu. Buvo patvirtinta, kad kitas inhibitorius, 2,4-DP, turintis tą patį molekulinį skeletą kaip ir laktizolis, turi maždaug 10 kartų stipresnį slopinamąjį aktyvumą nei laktizolis, tačiau jų receptorių slopinimo mechanizmų struktūrinis pagrindas dar turi būti išaiškintas. Neseniai buvo pranešta apie metabotropinių glutamato receptorių TMD kristalines struktūras, kurios kartu su T1R priskiriamos prie C klasės G-baltymų susietų receptorių ir leido sukurti tikslų T1R3-TMD struktūrinį modelį. Šiame tyrime detalus struktūrinis mechanizmas, kuriuo grindžiamas saldaus skonio slopinimas, buvo apibūdintas lyginant laktizolio poveikį T1R3-TMD su 2, 4-DP poveikiu. Pirmiausia atlikome eksperimentų seriją, naudodami kultivuotas ląsteles, ekspresuojančias saldaus skonio receptorius su mutacijomis, ir ištyrėme sąveiką su šiais inhibitoriais. Remdamiesi rezultatais, mes atlikome prijungimo modeliavimą ir tada pritaikėme molekuline dinamika pagrįstą energijos mažinimą. Mūsų analizė aiškiai atskleidė, kad tiek laktizolio, tiek 2,4-DP (S)-izomerai sąveikavo su tomis pačiomis septyniomis T1R3-TMD liekanomis ir kad tų inhibitorių slopinamąjį poveikį daugiausia lėmė stabilizuojanti sąveika, kurią sukelia jų karboksilo grupės. vertikaliame T1R3-TMD ligando kišenės matmenyje. Be to, 2,4-DP dalyvauja hidrofobinėje sąveikoje, kurią skatina jo o-Cl grupė, ir ši sąveika gali būti daugiausia atsakinga už didesnį 2,4-DP slopinamąjį poveikį.

Interesų konflikto pareiškimas

Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojančių interesų.

Figūros

1 pav. Laktizolis ir 2,4-DP kaip saldūs…

1 pav. Laktizolis ir 2,4-DP kaip saldaus skonio inhibitoriai.

(A) (±)-laktizolio ir…

2 pav. MD modeliavimas ir jų išankstinis modeliavimas…

2 pav. MD modeliavimas ir jų išankstinis modeliavimas laktizoliui ir 2,4-DP.

3 pav. Rezultatų palyginimas…

3 pav. MD sumažinimo rezultatų palyginimas ( S )-laktizolis ir (…

4 pav. Saldų skonį slopinantis aktyvumas…

4 pav. Saldų skonį slopinantis ( S )-, ( R )-laktizolis ir (…


Abstraktus

Su G baltymu sujungti receptoriai (GPCR) yra pagrindiniai daugelio pagrindinių ląstelių signalizacijos takų. Jie perduoda signalus iš išorės į ląstelių vidų fiziologiniuose procesuose, pradedant regėjimu ir baigiant imuniniu atsaku. Labai sudėtinga pažvelgti į juos atskirai, naudojant įprastus eksperimentinius metodus. Neseniai pseudoatominis molekulinis modelis pasirodė kaip vertinga priemonė gauti informaciją apie GPCR, tiksliau apie jų sąveiką su aplinka jų gimtojoje ląstelių membranoje ir pasekmes jų supramolekulinei organizacijai. Šis metodas naudoja Martini šiurkščiavilnių grūdų (CG) modelį, kad apibūdintų receptorius, lipidus ir tirpiklį molekulinės dinamikos (MD) modeliavime ir pakankamai išsamiai, kad būtų galima išsaugoti skirtingų molekulių cheminį specifiškumą. Nereikalingų laisvės laipsnių pašalinimas atvėrė didelio masto lipidų sukeltos supramolekulinės GPCR organizacijos modeliavimą. Pristatę Martini CGMD metodą, apžvelgiame šiuos tyrimus, atliktus su įvairiais GPCR šeimos nariais, įskaitant rodopsiną (vizualinį receptorių), opioidų receptorius, adrenerginius receptorius, adenozino receptorius, dopamino receptorius ir sfingozino 1-fosfato receptorius. Šie tyrimai atskleidė įdomų naujų biofizinių principų rinkinį. Įžvalgos svyruoja nuo lokalizuotų ir nevienalyčių membranos dvigubo sluoksnio deformacijų atskleidimo baltymo paviršiuje, specifinės lipidų molekulių sąveikos su atskirais GPCR iki membranos matricos poveikio pasauliniam GPCR savaiminiam surinkimui. Apžvalga baigiama naudojant CGMD metodą išmoktų pamokų, biofizinių ir cheminių lipidų ir baltymų sąveikos rezultatų apžvalga.


Lefkowitz, R. J. Heptahelinių receptorių šeima. Nature Cell Biol. 2, E133–E136 (2000).Istorinė perspektyva, apibūdinanti 7TM receptorių signalizacijos srities ištakas aštuntajame ir devintajame dešimtmečiuose.

Dixon, R. A. ir kt. Geno ir cDNR klonavimas žinduolių β-adrenerginiam receptoriui ir homologija su rodopsinu. Gamta 321, 75–79 (1986).Šiame dokumente aprašomas β2-adrenerginio receptoriaus klonavimas, jo analogija ir 7TM homologija su rodopsinu ir spėjama, kad egzistuoja didelė tokių receptorių šeima.

Dohlman, H. G., Thorner, J., Caron, M. G. & Lefkowitz, R. J. Model Systems for the study of seven-transmembrane-segment receptors. Annu. kun. Biochem. 60, 653–688 (1991).

Lee, D. K., George, S. R. ir O'Dowd, B. F. Nauji su G baltymu susiję receptorių genai, išreikšti smegenyse: nuolatinis svarbių terapinių taikinių atradimas. Eksperto nuomonė. Ten. Taikiniai 6, 1–18 (2002).

Palczewski, K. ir kt. Rodopsino kristalinė struktūra: su G baltymu susietas receptorius. Mokslas 289, 739–745 (2000).Apibūdina vienintelio iki šiol išspręsto 7TM receptoriaus kristalinę struktūrą.

Rodbell, M., Birnbaumer, L., Pohl, S. L. ir Krans, H. M. Gliukagonui jautri adenilciklazės sistema žiurkių kepenų plazmos membranose. V. Privalomas guanilnukleotidų vaidmuo gliukagono veikloje. J. Biol. Chem. 246, 1877–1882 (1971).

Gilman, A. G. G baltymai: receptorių generuojamų signalų keitikliai. Annu. kun. Biochem. 56, 615–649 (1987).

Ballesteros, J. A. ir kt. β2-adrenerginio receptoriaus aktyvinimas apima joninio užrakto tarp 3 ir 6 transmembraninių segmentų citoplazminių galų sutrikimą. J. Biol. Chem. 276, 29171–29177 (2001).

Farahbakhsh, Z. T., Ridge, K. D., Khorana, H. G. & Hubbell, W. L. Nuo šviesos priklausomų struktūrinių pokyčių kartografavimas citoplazminėje kilpoje, jungiančioje rodopsino spiralę C ir D: į vietą nukreiptas sukimosi žymėjimo tyrimas. Biochemija 34, 8812–8819 (1995).

De Vries, L. ir kt. G baltymų signalizacijos šeimos reguliatorius. Annu. Rev. Pharmacol. Toksikolis. 40, 235–271 (2000).

Ross, E. M. & Wilkie, T. M. GTPazę aktyvuojantys baltymai heterotrimeriniams G baltymams: G baltymų signalizacijos (RGS) ir į RGS panašių baltymų reguliatoriai. Annu. kun. Biochem. 69, 795–827 (2000).

Klein, S., Reuveni, H. & amp Levitzki, A. Signalo perdavimas nesiskiriančiu heterotrimeriniu mielių G baltymu. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 97, 3219–3123 (2000).

Ferguson, S. S. Besivystančios G baltymo receptorių endocitozės koncepcijos: vaidmuo receptorių desensibilizacijoje ir signalizacijoje. Pharmacol. Rev. 53, 1–24 (2001).

Pitcher, J. A., Freedman, N. J. ir Lefkowitz, R. J. G proteinu sujungtos receptorių kinazės. Annu. kun. Biochem. 67, 653–692 (1998).Išsami su G baltymu susietų receptorių kinazių biochemijos ir reguliavimo apžvalga.

Daaka, Y., Luttrell, L. M. ir Lefkowitz, R. J. β2-adrenerginio receptoriaus sujungimo su skirtingais G baltymais pakeitimas baltymų kinaze A. Gamta 390, 88–91 (1997).Aprašomas naujas mechanizmas, kuriuo 7TM receptorių G-baltymų sujungimo specifiškumas gali būti reguliuojamas proteinkinazės-A tarpininkaujamu receptorių fosforilinimu.

Zamah, A. M., Delahunty, M., Luttrell, L. M. ir Lefkowitz, R. J. PKA sukeltas β2-adrenerginio receptoriaus fosforilinimas reguliuoja jo susiejimą su Gs ir Gi: demonstravimas atkurtoje sistemoje. J. Biol. Chem. (spaudoje).

Lawler, O. A., Miggin, S. M. ir Kinsella, B. T. Pelės prostaciklino receptoriaus serino 357 fosforilinimas, kurį sukelia baltymų kinazė A, reguliuoja jo susiejimą su Gs-, Gi- ir Gq susietu efektoriaus signalizavimu. J. Biol. Chem. 276, 33596–33607 (2001).

Krupnick, J. G. ir Benovic, J. L. Receptorių kinazių ir arrestinų vaidmuo reguliuojant su G baltymu susietus receptorius. Annu. Rev. Pharmacol. Toksikolis. 38, 289–319 (1998).Išsami šios universalios receptorių reguliavimo sistemos apžvalga.

Zhang, J. ir kt. Su G baltymu susietų receptorių signalizacijos molekuliniai mechanizmai: su G baltymu susietų receptorių kinazių ir arrestinų vaidmuo receptorių desensibilizacijai ir resensibilizacijai. Receptorių kanalai 5, 193–199 (1997).

Winstel, R. ir kt. Baltymų kinazės kryžminis pokalbis: β-adrenerginių receptorių kinazės nukreipimas į membraną, naudojant baltymų kinazę C. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 93, 2105–2109 (1996).

Cong, M. ir kt. Su G baltymu susietos receptoriaus kinazės 2 nukreipimo į membraną reguliavimas baltymų kinaze A ir ją tvirtinančiu baltymu AKAP79. J. Biol. Chem. 276, 15192–15199 (2001).

Krueger, K. M., Daaka, Y., Pitcher, J. A. ir Lefkowitz, R. J. Sekvestracijos vaidmuo resensibilizuojant su G baltymu susijusius receptorius. β2-adrenerginių receptorių defosforilinimo reguliavimas vezikuliniu rūgštėjimu. J. Biol. Chem. 272, 5–8 (1997).

Pitcher, J. A. ir kt. Su G baltymu sujungta receptorių fosfatazė: 2A tipo baltymų fosfatazė, turinti skirtingą tarpląstelinį pasiskirstymą ir substrato specifiškumą. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 92, 8343–8347 (1995).

Tsao, P. & von Zastrow, M. Sumažėjęs su G baltymu susietų receptorių reguliavimas. Curr. Nuomonė. Neurobiol. 10, 365–369 (2000).

Collins, S., Caron, M. G. ir Lefkowitz, R. J. Adrenerginių receptorių reagavimo reguliavimas moduliuojant receptorių genų ekspresiją. Annu. kun. Physiol. 53, 497–508 (1991).

Lyubarsky, A. L. ir kt. RGS9-1 reikalingas normaliam pelės kūgio fototransdukcijos inaktyvavimui. Mol. Vis. 7, 71–78 (2001).

Oliveira-Dos-Santos, A. J. ir kt. T ląstelių aktyvacijos, nerimo ir vyrų agresijos reguliavimas RGS2. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 97, 12272–12277 (2000).

Howardas, A. D. ir kt. Retkarčiais su G-baltymu susieti receptoriai ir natūralių ligandų atradimas. Trends Pharmacol. Sci. 22, 132–140 (2001).

Kobilka, B. K. ir kt. Introninis genas, koduojantis potencialų receptorių šeimos narį, susietą su guanino nukleotidą reguliuojančiais baltymais. Gamta 329, 75–79 (1987).

Fargin, A. ir kt. Genominis klonas G-21, panašus į β-adrenerginių receptorių seką, koduoja 5-HT1A receptorių. Gamta 335, 358–360 (1988).

Hsu, S. Y. ir kt. Relaksino hormono aktyvinimas našlaičių receptoriams. Mokslas 295, 671–674 (2002).

Lembo, P. M. ir kt. Proenkefalino A geno produktai aktyvuoja naują sensorinių neuronų specifinių GPCR šeimą. Nature Neurosci. 5, 201–209 (2002).

Chuang, D. M. & Costa, E. Įrodymai, kaip internalizuoti β-adrenerginių receptorių atpažinimo vietą receptorių jautrumo, kurį sukelia (-)-izoproterenolis, metu. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 76, 3024–3028 (1979).

Chuang, D. M. & Costa, E. Varlių eritrocitų β-adrenerginiai receptoriai. Biocheminės pasekmės po stimuliacijos izoproterenoliu. Neurochem. Res. 4, 777–793 (1979).

Daaka, Y. ir kt. Esminis su G baltymu sujungto receptorių endocitozės vaidmuo aktyvuojant mitogeno aktyvuotą baltymų kinazę. J. Biol. Chem. 273, 685–688 (1998).

Claing, A., Laporte, S. A., Caron, M. G. ir Lefkowitz, R. J. Su G baltymu susietų receptorių endocitozė: su G baltymu susietų receptorių kinazių ir β-arrestino baltymų vaidmenys. Prog. Neurobiol. 66, 61–79 (2002).Apžvelgiami sudėtingi mechanizmai, susiję su 7TM receptorių endocitoze.

Claing, A. ir kt. Keli su G baltymu susietų receptorių endocitiniai keliai, apibrėžti GIT1 jautrumu. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 97, 1119–1124 (2000).

Smart, E. J. ir kt. Caveolinai, skysčio tvarka sutvarkyti domenai ir signalo perdavimas. Mol. Ląstelė. Biol. 19, 7289–7304 (1999).

Lohse, M. J. ir kt. β-Arrestin: baltymas, reguliuojantis β-adrenerginių receptorių funkciją. Mokslas 248, 1547–1550 (1990).

Goodman, O. B., Jr ir kt. β-Arrestinas veikia kaip klatrino adapteris β2-adrenerginių receptorių endocitozei. Gamta 383, 447–450 (1996).

Laporte, S. A. ir kt. β-adrenerginių receptorių / β-arrestino kompleksas endocitozės metu įdarbina klatrino adapterį AP-2. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 96, 3712–3717 (1999).

Gaidarov, I. ir kt. Arrestino funkcijai esant G baltymo receptorių endocitozei reikalingas fosfoinositido surišimas. EMBO J. 18, 871–881 (1999).

Scott, M. G., Benmerah, A., Muntaner, O. & Marullo, S. Suaktyvintų su G baltymu susietų receptorių įdarbinimas į gyvų ląstelių duobutes, padengtas klatrinu. J. Biol. Chem. 277, 3552–3559 (2002).

Santini, F., Gaidarov, I. & Keen, J. H. G baltymo prijungto receptorių / arrestino3 moduliavimas endocitinėje mašinoje. J. Cell Biol. 156, 665–676 (2002).

Oakley, R. H. ir kt. Skirtingi vizualinio arrestino, β-arrestin1 ir β-arrestin2 afinitetai GPCR nusako dvi pagrindines receptorių klases. J. Biol. Chem. 275, 17201–17210 (2000).

Luttrell, L. M. ir kt. Nuo β-Arrestino priklausomas β2 adrenerginių receptorių ir Src proteinkinazės kompleksų susidarymas. Mokslas 283, 655–661 (1999).

Ahn, S. ir kt. Src sukeltas dinamino tirozino fosforilinimas reikalingas β2-adrenerginių receptorių internalizavimui ir mitogeno aktyvuotai baltymų kinazės signalizacijai. J. Biol. Chem. 274, 1185–1188 (1999).

Ahn, S. ir kt. Nuo c-Src priklausomas tirozino fosforilinimas reguliuoja dinamino savaiminį surinkimą ir receptorių sukeltą endocitozę. J. Biol. Chem. 277, 26642–26651 (2002).

Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A. & Lefkowitz, R. J. Receptorių likimo reguliavimas ubikvitinuojant aktyvuotus β2-adrenerginius receptorius ir β-arrestiną. Mokslas 294, 1307–1313 (2001).

Pickart, C. M. Mechanizmai, kuriais grindžiama ubikvitinacija. Annu. kun. Biochem. 70, 503–533 (2001).

McDonald, P. H. ir kt. NSF kaip β-arrestin1 jungiančio baltymo identifikavimas. Poveikis β2-adrenerginių receptorių reguliavimui. J. Biol. Chem. 274, 10677–10680 (1999).

Claing, A. ir kt. β-Arrestino tarpininkaujama ADP-ribosilinimo faktoriaus 6 aktyvacija ir β2-adrenerginių receptorių endocitozė. J. Biol. Chem. 276, 42509–42513 (2001).

Premont, R. T. ir kt. β2-adrenerginių receptorių reguliavimas naudojant GIT1, su G baltymu susietą receptorių kinazę susietą ADP ribosilinimo faktorių GTPazę aktyvinantį baltymą. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 95, 14082–14087 (1998).

Cong, M. ir kt. β2 adrenerginių receptorių prisijungimas prie N-Etilmaleimidui jautrus faktorius reguliuoja receptorių perdirbimą. J. Biol. Chem. 276, 45145–45152 (2001).

Seachrist, J. L. ir kt. Rab5 ryšys su angiotenzino II 1A tipo receptoriais skatina Rab5 GTP prisijungimą ir pūslelių susiliejimą. J. Biol. Chem. 277, 679–685 (2002).

Kohout, T. A. ir kt. β-Arrestin 1 ir 2 skirtingai reguliuoja heptahelinių receptorių signalizaciją ir prekybą žmonėmis. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 98, 1601–1606 (2001).

Marchese, A. & amp Benovic, J. L. Agonistų skatinama G baltymo susieto receptoriaus CXCR4 ubikvitinacija tarpininkauja lizosomų rūšiavimui. J. Biol. Chem. 276, 45509–45512 (2001).

Dodge, K. & Scott, J. D. AKAP79 ir AKAP modelio raida. FEBS Lett. 476, 58–61 (2000).

Fraser, I. D. ir kt. A kinazę tvirtinančio baltymo-β(2)-adrenerginių receptorių komplekso surinkimas palengvina receptorių fosforilinimą ir signalizaciją. Curr. Biol. 10, 409–412 (2000).

Shih, M. ir kt. Dinaminiai β-adrenerginių receptorių kompleksai su proteinkinazėmis ir fosfatazėmis bei gravino vaidmuo. J. Biol. Chem. 274, 1588–1595 (1999).

Diviani, D., Soderling, J. & amp Scott, J. D. AKAP-Lbc įtvirtina baltymų kinazę A ir atskleidžia Gα12 selektyvų Rho sukeltą streso skaidulų susidarymą. J. Biol. Chem. 276, 44247–44257 (2001).

Tsunoda, S. ir kt. Daugiavalentis PDZ domeno baltymas surenka signalizacijos kompleksus su G baltymu sujungtoje kaskadoje. Gamta 388, 243–249 (1997).

Brakeman, P. R. ir kt. Homeras: baltymas, selektyviai jungiantis metabotropinius glutamato receptorius. Gamta 386, 284–288 (1997).

Cao, W. ir kt. Norint suaktyvinti MAP kinazę, būtinas tiesioginis aktyvuoto c-Src prisijungimas prie β3-adrenerginio receptoriaus. J. Biol. Chem. 275, 38131–38134 (2000).

Marrero, M. B. ir kt. Tiesioginis Jak/STAT kelio stimuliavimas angiotenzino II AT1 receptoriais. Gamta 375, 247–250 (1995).

Hall, R. ir kt. β2-adrenerginis receptorius sąveikauja su Na + /H + keitiklio reguliavimo faktoriumi, kad kontroliuotų Na + /H + mainus. Gamta 392, 626–630 (1998).

Hall, R. A. ir kt. C-galo motyvas, randamas β2-adrenerginiuose receptoriuose, P2Y1 receptoriuose ir cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatoriuje, lemia prisijungimą prie PDZ baltymų Na + /H + šilumokaičio reguliavimo faktorių šeimos. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 95, 8496–8501 (1998).

Hu, L. A. ir kt. β1-adrenerginių receptorių ryšys su PSD-95. Receptorių internalizacijos slopinimas ir β1-adrenerginių receptorių sąveikos su N-metil-d-aspartato receptoriai. J. Biol. Chem. 275, 38659–38666 (2000).

Sheng, M. & amp Sala, C. PDZ domenai ir supramolekulinių kompleksų organizavimas. Annu. Kunigas Neurosci. 24, 1–29 (2001).Autoritetinga baltymų ir baltymų sąveikos mechanizmo, reguliuojančio keletą GPCR sąveikų, apžvalga.

Luttrell, L. M. ir kt. Nuo β-Arrestino priklausomas β2 adrenerginių receptorių Src proteinkinazės kompleksų susidarymas. Mokslas 283, 655–661 (1999).

Imamura, T. ir kt. β-Arrestino sukeltas Src šeimos kinazės įdarbinimas Taip tarpininkauja endotelino-1 stimuliuojamam gliukozės transportavimui. J. Biol. Chem. 276, 43663–43667 (2001).

Barlic, J. ir kt. Tirozino kinazės aktyvacijos ir granulių išsiskyrimo per β-arrestiną reguliavimas CXCR1. Gamta Immunol. 1, 227–233 (2000).

DeFea, K. A. ir kt. Nuo β-Arrestino priklausoma proteinazės aktyvuoto receptoriaus 2 endocitozė reikalinga aktyvuoto ERK1 / 2 intraceluliniam taikymui. J. Cell Biol. 148, 1267–1281 (2000).Aprašomas β-arrestino vaidmuo tarpininkaujant ERK aktyvacijai 7TM receptoriais.

Luttrell, L. M. ir kt. Ekstraląstelinių signalų reguliuojamų kinazių aktyvinimas ir nukreipimas naudojant β-arrestino pastolius. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 98, 2449–2454 (2001).

McDonald, P. H. ir kt. β-Arrestin 2: receptorių reguliuojamas MAPK karkasas, skirtas JNK3 aktyvuoti. Mokslas 290, 1574–1577 (2000).

Tohgo, A. ir kt. ERK kaskados β-Arrestin pastoliai padidina citozolinį ERK aktyvumą, bet slopina ERK sukeltą transkripciją po angiotenzino AT1a receptorių stimuliacijos. J. Biol. Chem. 277, 9429–9436 (2002).

Cerione, R. A. ir kt. Hormonams jautrios adenilato ciklazės sistemos atkūrimas. Grynas β-adrenerginis receptorius ir guanino nukleotidą reguliuojantis baltymas suteikia išspręstam kataliziniam blokui hormonų reakciją. J. Biol. Chem. 259, 9979–9982 (1984).

Cerione, R. A. ir kt. Žinduolių β2-adrenerginis receptorius: funkcinės sąveikos tarp gryno receptoriaus ir gryno stimuliuojančio nukleotidą surišančio baltymo adenilato ciklazės atkūrimas. Biochemija 23, 4519–4525 (1984).

Heldin, C. H. Ląstelių paviršiaus receptorių dimerizacija signalo transdukcijoje. Ląstelė 80, 213–223 (1995).

Jordan, B. A. ir Devi, L. A. G-baltymų prijungto receptoriaus heterodimerizacija moduliuoja receptorių funkciją. Gamta 399, 697–700 (1999).

Devi, L. A. G-baltymų prijungtų receptorių heterodimerizacija: farmakologija, signalizacija ir prekyba. Trends Pharmacol. Sci. 22, 532–537 (2001).

Salahpour, A., Angers, S. ir Bouvier, M. Funkcinė G-baltymų prijungtų receptorių oligomerizacijos reikšmė. Endokrinolio tendencijos. Metab. 11, 163–168 (2000).

Galvez, T. ir kt. Norint užtikrinti optimalią GABAB receptorių funkciją, reikalinga allosterinė GB1 ir GB2 subvienetų sąveika. EMBO J. 20, 2152–2159 (2001).

Nelsonas, G. ir kt. Aminorūgščių skonio receptorius. Gamta 416, 199–202 (2002).

Nelsonas, G. ir kt. Žinduolių saldaus skonio receptoriai. Ląstelė 106, 381–390 (2001).

McLatchie, L. M. ir kt. RAMP reguliuoja į kalcitonino receptorius panašių receptorių transportavimą ir ligando specifiškumą. Gamta 393, 333–339 (1998).

Kuwasako, K. ir kt. Kalcitonino receptorių panašaus receptoriaus ir jo receptorių aktyvumą modifikuojančių baltymų vizualizacija internalizacijos ir perdirbimo metu. J. Biol. Chem. 275, 29602–29609 (2000).

Hilairet, S. ir kt. Agonistų skatinamas trijų komponentų kompleksas tarp kalcitonino receptorių panašaus receptoriaus, receptorių aktyvumą modifikuojančio baltymo 1 (RAMP1) ir β-arrestino. J. Biol. Chem. 276, 42182–42190 (2001).

Deanas, M. K. ir kt. Su G baltymu susietų receptorių dimerizacija. J. Med. Chem. 44, 4595–4614 (2001).

Gilman, A. Patikrinkite EGO prie durų. Mol. Intervencijos 1, 14–21 (2001).

Brzostowski, J. A. ir Kimmel, A. R. Signaling ties nuline G: G-baltymų nepriklausomos funkcijos 7-TM receptoriams. Tendencijos Biochem. Sci. 26, 291–297 (2001).Apžvelgia nuo G baltymų nepriklausomą signalizaciją 7TM receptoriais.

Zheng, B. ir kt. RGS-PX1, GAP GαS ir neksino rūšiavimo vezikulinėje prekyboje. Mokslas 294, 1939–1942 (2001).

Ma, Y. C. ir kt. Src tirozino kinazė yra naujas tiesioginis G baltymų efektorius. Ląstelė 102, 635–646 (2000).

McLaughlin, S. K., McKinnon, P. J. ir Margolskee, R. F. Gustducin yra skonio ląstelėms specifinis G baltymas, glaudžiai susijęs su transducinais. Gamta 357, 563–569 (1992).

Kwok-Keung Fung, B. ir Stryer, L. Fotolizuotas rodopsinas katalizuoja GTP mainus į surištą BVP tinklainės lazdelių išoriniuose segmentuose. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 77, 2500–2504 (1980).

Meng, J., Glick, J. L., Polakis, P. & Casey, P. J. Funkcinė sąveika tarp Gαz ir Rap1GAP siūlo naują ląstelių kryžminio pokalbio formą. J. Biol. Chem. 274, 36663–36669 (1999).

Katada, T. ir kt. Slopinantis guanino nukleotidus surišantis adenilato ciklazės reguliavimo komponentas. Išgryninto baltymo savybės ir funkcija. J. Biol. Chem. 259, 3568–3577 (1984).

Bokoch, G. M. ir kt. Adenilato ciklazės slopinančio guanino nukleotidą surišančio reguliavimo komponento gryninimas ir savybės. J. Biol. Chem. 259, 3560–3567 (1984).

Chikumi, H. ir kt. Stiprus RhoA aktyvinimas Gαq ir Gq sujungtais receptoriais. J. Biol. Chem. 277, 27130–27134 (2002).

Booden, M. A., Siderovski, D. P. & amp Der, C. J. Su leukemija susijęs Rho guanino nukleotidų mainų faktorius skatina su Gαq susietą RhoA aktyvaciją. Mol. Ląstelė. Biol. 22, 4053–4061 (2002).

Smrcka, A. V., Hepler, J. R., Brown, K. O. & Sternweis, P. C. Polifosfoinositidui specifinio fosfolipazės C aktyvumo reguliavimas išgrynintu Gq. Mokslas 251, 804–807 (1991).

Meigs, T. E., Fields, T. A., McKee, D. D. ir Casey, P. J. Gα12 ir Gα13 sąveika su kadherino citoplazminiu domenu suteikia β-katenino išsiskyrimo mechanizmą. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 98, 519–524 (2001).

Kozasa, T. ir kt. p115 RhoGEF, GTPazę aktyvuojantis baltymas Gα12 ir Gα13. Mokslas 280, 2109–2111 (1998).

Boyer, J. L., Waldo, G. L. & Harden, T. K. G-baltymų reguliuojamos fosfolipazės C βγ subvieneto aktyvinimas. J. Biol. Chem. 267, 25451–25456 (1992).

Camps, M. ir kt. Izofermentinis selektyvus fosfolipazės C-β2 stimuliavimas G baltymo βγ-subvienetais. Gamta 360, 684–686 (1992).

Pitcher, J. A. ir kt. G baltymų βγ subvienetų vaidmuo nukreipiant β-adrenerginių receptorių kinazę į su membrana susijusius receptorius. Mokslas 257, 1264–1267 (1992).

Tang, W. J. ir Gilman, A. G. Tipui būdingas adenililciklazės reguliavimas G baltymo βγ subvienetais. Mokslas 254, 1500–1503 (1991).

Stephens, L. ir kt. Naują fosfoinositido 3 kinazės aktyvumą mieloidinėse ląstelėse aktyvuoja G baltymo βγ subvienetai. Ląstelė 77, 83–93 (1994).

Logothetis, D. E. ir kt. GTP surišančių baltymų βγ subvienetai aktyvina muskarininį K + kanalą širdyje. Gamta 325, 321–326 (1987).Pirmasis žinduolių sistemos demonstravimas apie tuometinę radikalią idėją, kad G-baltymo βγ dimerai gali tiesiogiai suaktyvinti efektorius.

Chen, C. K. ir kt. Nenormalūs fotoreakcija ir šviesos sukelta apoptozė lazdelėse, kuriose trūksta rodopsino kinazės. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 96, 3718–3722 (1999).

Jaber, M. ir kt. Esminis β-adrenerginių receptorių kinazės 1 vaidmuo širdies vystymuisi ir funkcijai. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 93, 12974–12979 (1996).

Rockman, H. A. ir kt. β-adrenerginio receptoriaus kinazės 1 inhibitoriaus ekspresija neleidžia vystytis miokardo nepakankamumui į genus nukreiptose pelėse. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 95, 7000–7005 (1998).

Peppel, K. ir kt. Su G baltymu susietos receptoriaus kinazės 3 (GRK3) geno sutrikimas praranda kvapo receptorių desensibilizaciją. J. Biol. Chem. 272, 25425–25428 (1997).

Walker, J. K. ir kt. Pasikeitę kvėpavimo takų ir širdies atsakai pelėms, kurioms trūksta su G baltymu susietos receptorių kinazės 3. Esu. J. Physiol. 276, R1214–R1221 (1999).

Gainetdinovas, R. R. ir kt. Muskarino jautrumas ir sutrikusi receptorių desensibilizacija su G baltymu susietose receptorių kinazės 5 trūkumo pelėse. Neuronas 24, 1029–1036 (1999).

Fong, A. M. ir kt. Defektinė limfocitų chemotaksė pelėms, kurioms trūksta β-arrestin2 ir GRK6. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 99, 7478–7483 (2002).

Conner, D. A. ir kt. β-Arrestin1 išmuštos pelės atrodo normalios, tačiau turi pakitusią širdies reakciją į β-adrenerginę stimuliaciją. Circ. Res. 81, 1021–1026 (1997).

Bohn, L. M. ir kt. Sustiprinta morfino analgezija pelėms, kurioms trūksta β-arrestino 2. Mokslas 286, 2495–2498 (1999).

Bohn, L. M. ir kt. μ-Opioidinių receptorių desensibilizavimas β-arrestinu-2 lemia morfino toleranciją, bet ne priklausomybę. Gamta 408, 720–723 (2000).

Dohlman, H. G. & Thorner, J. W. G baltymų inicijuotos signalo perdavimo mielėse reguliavimas: paradigmos ir principai. Annu. kun. Biochem. 70, 703–754 (2001).


7 TM G-baltymų susietų receptorių tikslinė šeima †

Ši apžvalga vėliau pasirodys kaip knygos skyrius Cheminė biologija – nuo ​​mažų molekulių iki sistemų biologijos ir vaistų projektavimo (Red.: S. Schreiber, T. Kapoor, G. Wess), Wiley-VCH, Weinheim, kurį planuojama išleisti 2006 m. lapkritį.

Abstraktus

Cheminės biologijos metodai turi ilgą istoriją tiriant G-baltymų prijungtų receptorių (GPCR) šeimą, kuri yra didžiausia ir svarbiausia terapijos taikinių grupė. Žmogaus genomo analizė atskleidė daug naujų narių, turinčių nežinomą fiziologinę funkciją, kuri šiandien yra daugelio atvirkštinės farmakologijos vaistų atradimo programų dėmesio centre. Kadangi septyni hidrofobiniai transmembraniniai segmentai yra apibrėžiantis bendras šių receptorių struktūrinis bruožas, o signalų perdavimas per heterotrimerinius G baltymus nėra įrodytas visais atvejais, šie baltymai taip pat vadinami septyniais transmembraniniais (7 TM) arba serpentino receptoriais. Šioje apžvalgoje apibendrinami svarbūs istoriniai GPCR tyrimų etapai nuo pat pradžių, kai farmakologija daugiausia buvo aprašomoji, iki šiuolaikinės molekulinės biologijos amžiaus, kai buvo klonuotas pirmasis receptorius ir dabar visas žmogaus GPCR repertuaras pagal seką ir baltymą. lygiu. Tai parodo, kaip GPCR nukreiptas vaistų atradimas iš pradžių buvo pagrįstas kruopščiu keleto specialiai pagamintų cheminių junginių testavimu, o šiandien jis vykdomas taikant šiuolaikinius vaistų atradimo metodus, įskaitant kombinatorinių bibliotekų dizainą, struktūrinę biologiją, molekulinę informatiką ir pažangias atrankos technologijas. naujų junginių, kurie specifiškai aktyvina arba slopina GPCR, nustatymas. Tokie junginiai, kartu su kitomis naujomis technologijomis, leidžia mums ištirti receptorių vaidmenį fiziologijoje ir medicinoje ir, tikimės, sukurs naujus gydymo būdus. Mes taip pat apibūdiname, kaip vyksta pagrindiniai GPCR signalizacijos ir reguliavimo mechanizmų tyrimai, leidžiantys atrasti naujus su GPCR sąveikaujančius baltymus ir taip atverti naujas vaistų kūrimo perspektyvas. Praktiniai pavyzdžiai iš GPCR ekspresijos tyrimų, HTS (didelio našumo atranka) ir su monoaminais susijusių GPCR orientuotų kombinatorinių bibliotekų kūrimo iliustruoja vykstančius GPCR cheminės biologijos tyrimus. Galiausiai apžvelgiame būsimą pažangą, kuri gali susieti šiandienos atradimus su naujų vaistų kūrimu.


Su vabzdžių G baltymu sujungti receptoriai ir signalo perdavimas

Su G baltymu sujungti receptoriai (GPCR) yra septynių transmembraninių baltymų (7-TM), kurie tarpląstelinius signalus paverčia fiziologiniais ląstelių atsakais, aktyvuodami heterotrimerinius guanino nukleotidus surišančius baltymus (αβγ subvienetus). Evoliucijos metu jų bendrosios savybės nepaprastai gerai išsaugomos. Nepaisant šio bendro panašumo, per šios kategorijos receptorius perduodama daug įvairių signalų. Several GPCR-(sub)families have an ancient origin that is situated before the divergence of Protostomian and Deuterostomian animals. Nevertheless, an enormous diversification has occurred since then. The availability of novel sequence information is growing very rapidly as a result of molecular cloning experiments and of metazoan genome (Caenorhabditis elegantiškas, Drosophila melanogaster, Homo sapiens) and EST (expressed sequence tags) sequencing projects. The Drosophila Genome Sequencing Project will certainly have an important impact on insect signal transduction and receptor research. In parallel, convenient expression systems and functional assay procedures will be needed to investigate insect receptor properties and to monitor the effects of natural and artificial ligands. The study of the evolutionary aspects of G protein–coupled receptors and of their signaling pathways will probably reveal insect-specific features. More insight into these features may result in novel methods and practical applications. Arch. Vabzdžių Biochem. Physiol. 48:1–12, 2001. © 2001 Wiley-Liss, Inc.


Abstraktus

Prostaglandins play a critical physiological role in both cardiovascular and immune systems, acting through their interactions with 9 prostanoid G protein-coupled receptors (GPCRs). These receptors are important therapeutic targets for a variety of diseases including arthritis, allergies, type 2 diabetes, and cancer. The DP prostaglandin receptor is of interest because it has unique structural and physiological properties. Most notably, DP does not have the 3–6 ionic lock common to Class A GPCRs. However, the lack of X-ray structures for any of the 9 prostaglandin GPCRs hampers the application of structure-based drug design methods to develop more selective and active medications to specific receptors. We predict here 3D structures for the DP prostaglandin GPCR, based on the GEnSeMBLE complete sampling with hierarchical scoring (CS-HS) methodology. This involves evaluating the energy of 13 trillion packings to finally select the best 20 that are stable enough to be relevant for binding to antagonists, agonists, and modulators. To validate the predicted structures, we predict the binding site for the Merck cyclopentanoindole (CPI) selective antagonist docked to DP. We find that the CPI binds vertically in the 1–2–7 binding pocket, interacting favorably with residues R310 7.40 and K76 2.54 with additional interactions with S313 7.43 , S316 7.46 , S19 1.35 , etc. This binding site differs significantly from that of antagonists to known Class A GPCRs where the ligand binds in the 3–4–5–6 region. We find that the predicted binding site leads to reasonable agreement with experimental Structure–Activity Relationship (SAR). We suggest additional mutation experiments including K76 2.54 , E129 3.49 , L123 3.43 , M270 6.40 , F274 6.44 to further validate the structure, function, and activation mechanism of receptors in the prostaglandin family. Our structures and binding sites are largely consistent and improve upon the predictions by Li et al. ( J. Am. Chem. Soc. 2007 , 129 (35), 10720) that used our earlier MembStruk prediction methodology.


Death Receptor Signaling Pathway

Death receptors are cell surface receptors that transmit apoptotic signals initiated by specific ligands and play a central role in instructive apoptosis. Death receptors belong to the tumor necrosis factor receptor (TNFR) gene superfamily. Eight members of the death receptor family have been characterized so far: TNFR1 (also known as DR1, CD120a, p55 and p60), CD95 (also known as DR2, APO-1 and Fas), DR3 (also known as APO-3, LARD, TRAMP and WSL1), TRAILR1 (also known as DR4 and APO-2), TRAILR2 (also known as DR5, KILLER and TRICK2), DR6, ectodysplasin A receptor (EDAR) and nerve growth factor receptor (NGFR). These death receptors are distinguished by a cytoplasmic region of

80 residues termed the death domain (DD). When these receptors are triggered by corresponding ligands, a number of molecules are recruited to the death domain and subsequently a signaling cascade is activated. Two types of death receptor signaling complex can be distinguished. The first group comprises the death-inducing signaling complexes (DISCs) that result in the activation of caspase-8, which plays the central role in transduction of the apoptotic signal. DISC is formed at the CD95 receptor, TRAILR1 or TRAILR2. The second group comprises the TNFR1, DR3, DR6 and EDAR. These recruit a different set of molecules, which transduce both apoptotic and survival signals.


The Molecular Basis of G Protein𠄼oupled Receptor Activation

G protein–coupled receptors (GPCRs) mediate the majority of cellular responses to external stimuli. Upon activation by a ligand, the receptor binds to a partner heterotrimeric G protein and promotes exchange of GTP for GDP, leading to dissociation of the G protein into α and βγ subunits that mediate downstream signals. GPCRs can also activate distinct signaling pathways through arrestins. Active states of GPCRs form by small rearrangements of the ligand-binding, or orthosteric, site that are amplified into larger conformational changes. Molecular understanding of the allosteric coupling between ligand binding and G protein or arrestin interaction is emerging from structures of several GPCRs crystallized in inactive and active states, spectroscopic data, and computer simulations. The coupling is loose, rather than concerted, and agonist binding does not fully stabilize the receptor in an active conformation. Distinct intermediates whose populations are shifted by ligands of different efficacies underlie the complex pharmacology of GPCRs.


REZULTATAI

Β1AR Disrupts Kv11.1/14-3-3ε Association

Figure 1A shows that Kv11.1 coimmunoprecipitated with cotransfected 14-3-3ε, a result that is consistent with the report of Kagan ir kt. (2002). Interestingly, coexpression of β1ARwt disrupts the interaction, both in basal and Iso stimulated conditions. A detailed electrophysiological analysis of Kv11.1 currents upon Iso β1AR stimulation was performed in CHO cells stably expressing Kv11.1 channels cotransfected or not with the cDNA encoding β1ARwt. Figure 1, B and E, shows families of current traces for control conditions and after 10-min exposure to 1 nM Iso, obtained by applying 5-s pulses, imposed in 20-mV increments between −80 and +60 mV. The holding potential was fixed at −80 mV, and tail currents were recorded upon repolarization to −60 mV. In nontransfected cells (which express low levels of endogenous βAR, unpublished data), Iso accelerated the time course of activation but did not modify the maximum outward current and the time course of deactivation (n = 6 Figure 1B, Table 1). In cells expressing β1ARwt, Iso decreased both the outward and the tail current and accelerated the time course of the initial phase of deactivation, without modifying the time course of activation (n = 6 Figure 1E, Table 1). Panels C, F and D, G show the current-voltage plots of steady-state current at the end of the depolarizing step and the activation curves obtained in the presence and the absence of Iso in nontransfected (C and D) and in β1ARwt-transfected (F and G) cells. In nontransfected cells, Iso did not significantly modify either the steady state current or the slope of the activation curve (Figure 1, C and D), whereas it slightly shifted the midpoint of the activation curve to more negative potentials (Table 1). Such minor Iso-induced changes in channel activity in the absence of transfected β1AR appear to be not receptor-mediated, because it was also observed in the presence of 1 μM propranolol (unpublished data). In cells expressing β1ARwt Iso significantly decreased the current amplitude at −20 and −10 mV (Figure 1F) and the tail current amplitude after pulses between −20 and +60 mV (Figure 1G), without modifying the voltage dependence of activation (n = 6, p > 0.05 Table 1).

Figure 1. β1AR disrupts Kv11.1/14-3-3ε association and Iso inhibits Kv11.1 currents. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of β1ARwt. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed by using specific channel antibodies. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in Medžiagos ir metodai. Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces obtained by applying 5-s pulses that were imposed in 20-mV increments between −80 mV and +60 mV. Deactivating Kv11.1 tail currents were recorded at −60 mV. Currents were obtained in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected (E) or not (B) with β1ARwt. (C and F) Mean Kv11.1 current-voltage relationship 5-s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated experimental conditions. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated conditions. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Table 1. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τf, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.

a p < 0.05 vs. data obtained in control conditions.

Β1AR Directly Interacts with 14-3-3ε

A possible explanation for the inhibition of Kv11.1/14-3-3ε interaction in the presence of β1AR may be a direct competition between Kv11.1 and β1AR for 14-3-3ε proteins. In this regard, in the third cytoplasmic loop and the C-terminal region of the β1AR there are PKA phosphorylation sites (Rapacciuolo ir kt., 2003 RRPSRLV and RPRASGCL, respectively) that exhibit certain homology with the consensus binding site of 14-3-3 proteins (Muslin ir kt., 1996 Yaffe ir kt., 1997). Therefore, we explored whether 14-3-3ε proteins bind to β1AR. To this end, HEK-293 cells were transiently transfected with tagged β1AR and 14-3-3ε constructs. Figure 2A shows that upon immunoprecipitation of β1AR, HA-tagged 14-3-3ε could be detected in the receptor complexes and that the presence of Iso promoted a marked increase in β1AR/14-3-3ε coimmunoprecipitation at 5 min of stimulation. These results suggest that activation of β1AR promotes conformational changes and/or triggers signaling pathways that facilitate the recruitment of 14-3-3 proteins to the receptor complex. The basal association of β1AR and 14-3-3ε in cotransfected cells is decreased upon incubation with the β-antagonist betaxolol (unpublished data), consistent with the idea that the reported basal β1AR activity associated with receptor overexpression (Engelhardt ir kt., 2001) also triggers to certain extent the mechanisms underlying the association. To more clearly visualize the modulation of β1AR/14-3-3 binding by different agents, cells were pretreated with betaxolol to lower such basal recruitment.

Figure 2. β1AR stimulation increases β1AR/14-3-3ε association in HEK-293 cells and guinea pig heart. (A) HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε and pretreated with betaxolol for 1 h were challenged with Iso, and the association between β1AR and 14-3-3 proteins was investigated by immunoprecipitation and Western blot analysis as detailed in Medžiagos ir metodai. Data indicate the amount of coprecipitated 14-3-3ε proteins, normalized by receptor immunoprecipitation and referred to association in basal (i.e., nonstimulated) conditions, and are mean ± SEM of four independent experiments. Representative gels are shown left. (B) Endogenous β1AR/14-3-3ε complexes are present in guinea pig heart extracts. After incubation of dissociated heart tissue with Iso 10 μM for the indicated periods of time, β1AR were partially purified from solubilized heart membrane extracts by affinity chromatography using alprenolol-Sepharose columns. After elution, fractions were assayed for the presence of receptor and 14-3-3ε proteins by Western blot using specific antibodies as detailed in Medžiagos ir metodai. In the case of the β1AR, two bands are apparent in some fractions likely due to different glycosylation patterns. Gels are representative of two independent experiments.

To validate this association in a more physiological setting, we searched for the occurrence of these molecular complexes in endogenous conditions. After exposure of guinea pig heart samples to Iso for different periods of time, β1AR were partially purified by affinity chromatography using the antagonist alprenolol. On elution of bound receptors and their associated proteins, fractions were analyzed for the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins by using specific antibodies. Figure 2B indicates that 14-3-3ε proteins coeluted with purified endogenous receptors and that such coelution is increased upon agonist stimulation. This result confirms that β1AR and 14-3-3ε proteins associate ”in situ“ in the heart in an agonist-dependent way.

Consistent with the idea that stimulation of the cAMP/PKA pathway is involved in triggering β1AR/14-3-3ε binding, their coimmunoprecipitation is rapidly promoted by incubating cells with forskolin, a well-known AC activator (Figure 3A). Conversely, both basal and agonist-induced association is blocked in the presence of the PKA inhibitor H-89 (Figure 3B), but not by protein kinase C or mitogen-activated protein kinase/ERK kinase (MEK) inhibitors (Ro-31-8220 and PD98059, respectively). Overall, these data clearly establish that PKA activity is directly or indirectly required for triggering the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins in the same molecular complex.

Figure 3. The association between β1AR and 14-3-3 proteins is direct and dependent on PKA activity. HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε were stimulated with forskolin (A) or Iso in the absence or presence of the indicated protein kinase inhibitors (B). The receptors were then immunoprecipitated and the presence of 14-3-3ε proteins analyzed and quantitated as in Figure 1. Gels representative of three independent experiments are shown. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, A and B. (C) Phosphorylation of β1AR cytoplasmic domain by PKA. The indicated GST fusion protein, encompassing the third intracellular loop of the β1AR, or GST as a control was incubated with PKA as detailed in Material and Methods, resolved by electrophoresis and analyzed by Coomassie blue staining or autoradiography ( 32 P). (D) The β1AR GST fusion protein (or GST as a control) was incubated in the absence or presence of PKA as in C. After washing, the GST proteins were incubated for 3 h in the presence of purified GST 14-3-3ε, and association to the latter protein was analyzed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies or a nonrelated IgG as a control. The immunoprecipitates were resolved by electrophoresis and blotted with 14-3-3ε or anti-GST antibodies to detect β1AR fusion protein, migration of which (including a GST-3il-β1AR proteolytic fragment) is shown with asterisks. Results are representative of two independent experiments.

To test if PKA phosphorylated β1AR would directly recruit 14-3-3 proteins, we next performed in vitro assays with purified 14-3-3ε and a β1AR cytoplasmic domain fusion protein. As shown in Figure 3C, a GST-fusion protein encompassing the third intracellular loop of the β1AR (GST-3il-β1AR) was readily phosphorylated in the presence of purified PKA. The GST-β1AR construct were subsequently incubated with purified GST-14-3-3ε, followed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies (or control nonrelated antibodies). Figure 3D shows a robust, specific interaction of 14-3-3ε with GST-3il-β1AR in a PKA phosphorylation–dependent way.

Mutation of PKA Phosphorylation Sites Renders β1AR Unable To Associate to 14-3-3ε and To Compete Its Interaction with Kv11.1

Overall, these results demonstrated a direct interaction between 14-3-3ε and PKA-phosphorylated β1AR. To further explore this point, we generated different β1AR mutants (β1ARS312A, β1ARS412A, and the double mutant β1ARS312,412A) in which serine residues 312 and 412 were substituted for alanines, a modification reported to prevent their phosphorylation by PKA upon receptor stimulation (Rapacciuolo ir kt., 2003). All these receptor constructs showed a similar pattern of adenylyl cyclase stimulation upon expression of comparable levels in HEK-293 cells and challenge with Iso (see Supplementary Figure S1). Despite such efficient activation of the cAMP signaling pathway, the ability of these mutants to associate to cotransfected 14-3-3ε isoforms, both in basal and agonist-stimulated conditions is completely lost in the double mutant β1ARS312,412A (Figure 4A) or markedly decreased for the individual mutants (Figure 4B), in comparison with β1ARwt. These results clearly indicate that PKA phosphorylation of the β1AR at these residues is required for the association of 14-3-3 proteins. In contrast, mutation of S312 to aspartate, which would mimic receptor phosphorylation, leads to an increased β1AR/14-3-3ε interaction even in basal conditions (Figure 4C).

Figure 4. Mutation of residues critical for PKA-mediated phosphorylation render β1AR unable to associate to 14-3-3ε proteins. HEK-293 cells were transiently transfected with HA-tagged 14-3-3ε and different Flag-tagged β1AR constructs. Cells were stimulated with Iso (10 μM) for the time indicated, and the association between the different receptors and 14-3-3ε proteins assessed as in previous figures. Gels are representative of 3–4 independent experiments. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to the wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, C–E.

Β1ARwt and Mutants Unable To Interact with 14-3-3ε Display a Different Pattern of Modulation of Kv11.1

Our data suggested that β1AR stimulation would sequentially lead to PKA activation, receptor phosphorylation, and recruitment of 14-3-3ε proteins to the complex, which would displace these molecules from their binding sites in Kv11.1 channels. To explore this hypothesis, we tested whether the presence of β1AR mutants, differing in their ability to recruit 14-3-3ε, had different effects on the interaction between Kv11.1 and 14-3-3ε.

In contrast to the disruption of binding observed with β1ARwt, the Kv11.1/14-3-3ε association is preserved upon expression of similar levels of β1ARS312,412A (Figure 5A). In this case the presence of Iso leads to an enhanced association, in agreement with the expected increase in PKA-phosphorylated Kv11.1. Consistently, the β1ARS312A mutant, which barely displays association with 14-3-3, is also unable to disrupt the Kv11.1/14-3-3 binding, whereas β1AR S312D markedly inhibits Kv11.1/14-3-3 coimmunoprecipitation, as the β1ARwt does (Figure 5A, right panel).

Figure 5. Modulation of Kv11.1/14-3-3ε interaction and Kv11.1 currents by expression of different β1AR mutants. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of the indicated β1AR constructs. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed as in Figure 1A. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in Medžiagos ir metodai. Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces were obtained and analyzed as detailed in Figure 1 in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected with β1ARS312,412A or β1ARS312D as indicated. (C and F) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Interestingly, in cells expressing β1ARS312,412A (Figure 5B) Iso increased the maximum outward current and accelerated the time course of activation but did not modify the time course of deactivation (Table 1). In contrast to the results obtained with β1ARwt (see Figure 1, E–G), Iso significantly increased the maximum outward current amplitude at negative potentials (Figure 5C) and markedly shifted the voltage-dependence of activation (Figure 5D), which may explain the increase in the tail and maximum outward currents observed at negative potentials (n = 6–9 p < 0.05 vs. control Table 1). It should be stressed that in cells expressing β1ARS312A or β1AR S412A the effects produced by Iso on current amplitude, as well as on the time- and voltage-dependent properties of the channels, were almost identical to those produced in cell expressing β1ARS312,S412A (Table 1). On the contrary, in cells expressing the β1ARS312D mutant (Figure 5, E–G), Iso accelerated the time course of the initial phase of deactivation (Table 1) and decreased the maximum outward current at potentials between −20 and +20 mV and the tail current elicited by applying pulses positive to −30 mV, without modifying the voltage-dependence of the activation (Figure 5G and Table 1), a situation reminiscent of the effects observed in cells expressing β1ARwt (Figure 1, E–G).

To better compare the effects induced by Iso, in Figures 6, I–K the percentages of change in the maximum outward current that elicited at −20 mV and in the amplitude of tail currents elicited after pulses to +60 mV or to −20 mV are shown. In cells expressing β1ARWt or β1ARS312D, Iso decreased the current amplitude at −20 mV by 19.9 ± 5.4% (n = 6) and by 23.5 ± 1.8% (n = 7), respectively (panel I), whereas in cells not transfected with β1AR, Iso increased the current by 13.9 ± 3.2% (n = 6). In cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A, Iso markedly increased the current amplitude (n = 6–9, p < 0.05 vs. increase in nontransfected cells panel I). In cells expressing β1ARwt or β1ARS312D, Iso inhibited the tail current after pulses to + 60 mV (panel J) by 30.1 ± 5.3 and 32.1 ± 12.3%, respectively. In contrast, the reduction of the tail currents induced by Iso in nontransfected cells and in cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A was significantly lower (p < 0.01, n = 6–9 panel J). Moreover, in these mutants again in contrast to the ≈20% inhibition observed in cells expressing β1ARwt or S312D, Iso significantly increased the tail current amplitude after pulses to −20 mV (n = 6–9 Figure 6K).

Figure 6. The differential effect of Iso on Kv11.1 currents mediated by β1ARwt or β1AR S312,412A is abolished in the presence of 14-3-3 inhibitors. (A, C, E, and G) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1AR wt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (A and C) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (E and G). (B, D, F, and H) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1ARwt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (B and D) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (F and H). (I–K) Percentage of change induced by 1 nM Iso in the different conditions in the amplitude of Kv11.1 currents elicited after 5-s pulses to −20 mV (I) and tail currents elicited on repolarization to −60 mV after 5-s pulses to +60 mV (J) and −20 mV (K). In I *p < 0.05 versus Kv11.1. In J, *p <0.05 versus data obtained in β1ARwt transfected cells, # p < 0.05 versus data obtained in β1ARS312,S412A-transfected cells. Each point or bar represents the mean ± SEM of ≥6 experiments.

To confirm that 14-3-3 proteins are involved in these differential effects of the β1AR phosphorylation deficient mutants on Kv11.1 current modulation, we next performed similar experiments in conditions where endogenous 14-3-3 function was inhibited. We first studied the effects of Iso in the presence of R-18 (200 nM), an unphosphorylated peptide that binds to all 14-3-3 isoforms with equal affinities producing a competitive inhibition (Wang ir kt., 1999). Because it can be presumed that the membrane diffusion of R-18 would be limited, this inhibitor was added to the internal solution that dialyzed the cells when the patch seals were broken. Kv11.1 currents recorded in R-18 dialyzed cells were of similar amplitude to those recorded in not dialyzed cells (p > 0.05) and exhibited the same time- and voltage-dependent properties. Interestingly, under these conditions, the differential effects produced by Iso on Kv11.1 currents in β1ARwt- and β1ARS312,412A-transfected cells were not observed. Iso similarly inhibited the maximum outward current elicited in cells expressing either β1ARwt or β1ARS312,S412A (Figure 6, A and C), as well as the tail currents elicited on return to −60 mV (Figure 6, B and D). Furthermore, Iso did not modify either the time course of channel activation and deactivation, or the voltage-dependence of activation (Table 2). Similar results were obtained when a different strategy of inhibition of 14-3-3 function based on cotransfection with a DN14-3-3 mutant was used (Figure 6, E–H, and Table 2). The effects of Iso on Kv11.1 channels in cells expressing β1AR wt or β1ARS312,S412A in the presence of 14-3-3 inhibitors, were qualitatively identical and not quantitatively different to those produced in cells expressing β1ARwt in the absence of inhibitors.

Table 2. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage-dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τf, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.


Žiūrėti video įrašą: Peptide bond formation. Macromolecules. Biology. Khan Academy (Birželis 2022).