Informacija

Dimerų susidarymas – Fx Dimeras – Biologija

Dimerų susidarymas – Fx Dimeras – Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dimer Formation - Fx Dimer

Vienos molekulės analizė atskleidžia agonistui specifinį µ-opioidinių receptorių dimerų susidarymą

Su G baltymu sujungti receptoriai (GPCR) yra pagrindiniai signaliniai baltymai, kurie dažniausiai veikia kaip monomerai, tačiau kai kuriems receptoriams buvo aprašytas konstitucinis dimerų susidarymas ir kai kuriais atvejais yra būtinas funkcijai. Naudodami vienos molekulės mikroskopiją kartu su didelės skiriamosios gebos metodais nepažeistose ląstelėse, čia aprašome dinaminę µ-opioidinių receptorių (µOR) monomero ir dimero pusiausvyrą, kai dimerų susidarymą skatina specifiniai agonistai. Agonistas DAMGO, bet ne morfinas, sukelia dimero susidarymą procese, kuris koreliuoja tiek laike, tiek priklausomybe nuo agonisto ir fosforilinimo su β-arrestin2 prisijungimu prie receptorių. Ši dimerizacija nepriklauso nuo µOR internalizacijos, bet gali būti prieš ją. Šie duomenys rodo naują GPCR reguliavimo lygį, kuris susieja dimerų susidarymą su konkrečiais agonistais ir jų pasroviui signalais.


ĮVADAS

Klasikiniai kadherinai yra adhezinių transmembraninių receptorių, atsakingų už visų stuburinių gyvūnų kietųjų audinių struktūrinį vientisumą ir specifinę architektūrą, šeima. Kadherino adhezijos sistemos sutrikimai dažnai laikomi auglio ląstelių invazijos ir metastazių veiksniu (Takeichi, 1995 Provost ir Rimm, 1999 Patel ir kt., 2003 Gumbiner, 2005). Plačiai pripažįstama, kad ląstelių ir ląstelių adhezija susidaro homodimerizuojant kadherino molekules, veikiančias priešingose ​​ląstelėse. Ši sąveika akivaizdžiai lemia daugelį kritinių ląstelių ir ląstelių adhezijos parametrų, įskaitant jo stiprumą, plastiškumą ir stabilumą. Nors buvo atliktas platus darbas siekiant apibūdinti kadherino adhezijos sąveikos molekulines detales, daugelis pagrindinių šio proceso aspektų lieka nežinomi.

Pagrindinis klausimas, į kurį dar reikia atsakyti, yra atskirų kadherino sukibimo jungčių stiprumas. Neapibrėžtumas kyla dėl dviejų prieštaringų stebėjimų grupių (apžvelgta Troyanovsky, 2005 Mege ir kt., 2006). Viena vertus, daugybė biofizinių eksperimentų su rekombinantiniais kadherino fragmentais parodė, kad tokios jungties gyvavimo laikas yra apribotas milisekundžių diapazonu. Kita vertus, koimunoprecipitacijos eksperimentais kultivuojamose ląstelėse buvo įrodyta nepaprastai stabilūs kadherino homodimerai, kurių disociacijos greitis neaptinkamas. Vadinasi, yra du iš esmės skirtingi kadherino sukibimo modeliai. Mažo afiniteto kadherino adhezijos modelis rodo, kad ląstelių ir ląstelių adhezinio kontakto stiprumą lemia kadherino receptorių grupavimas per citoplazminę sąveiką (Yap). ir kt., 1998 Kusumi ir kt., 1999). Pagal šį modelį trumpalaikių klijų jungčių grupavimas užtikrina esminį stabilumą visai sankryžai. Tačiau mažai žinoma apie kadherino klasterizacijos molekulines detales. Be to, kai kurie duomenys aiškiai prieštarauja „grupavimo stabilumo“ hipotezei. Pavyzdžiui, kai kuriuose eksperimentuose E-kadherino mutantai, kuriems visiškai trūko tarpląstelinio regiono (ir todėl buvo atjungti nuo hipotetinio tarpląstelinio grupavimo mechanizmo), suteikdavo sukibimo jėgą, pakankamą ląstelėms agreguoti agregacijos tyrime (Ozawa ir Kemler, 1998). Tokie duomenys neabejotinai patvirtina alternatyvų, didelio afiniteto kadherino adhezijos modelį. Pagal šį modelį ląstelių ir ląstelių sukibimas pagrįstas nuolatiniu didelio afiniteto kadherino adhezinių dimerų susidarymu, kurie disocijuoja griežtai kontroliuojant ląsteles (Troyanovsky ir kt., 2006). Labiausiai neaiškus pastarojo modelio aspektas yra didelio afiniteto kadherino dimerizacijos mechanizmas: kodėl šis procesas niekada nebuvo aptiktas in vitro? Taip pat neaišku, kodėl, jei sukibimas pagrįstas stabiliais dimerais, ar kadherino pritraukimas į jungtis priklauso nuo tarpląstelinės kadherino ir katenino sąveikos?

Pagrindinis šio darbo tikslas buvo išsiaiškinti šiuos du klausimus, labai svarbius didelio afiniteto kadherino adhezijos modeliui. Pirmiausia paklausėme, ar stabilūs kadherino dimerai, identiški aptiktiems ląstelėse, gali būti surinkti in vitro. Norėdami atsakyti į šį klausimą, mes ištyrėme kadherino dimerizaciją agarozės granulių paviršiuje, naudodami konkrečios vietos kryžminio susiejimo testą. Visiškai sutinkant su paskelbtais in vitro eksperimentais, parodėme, kad fiziologinėmis sąlygomis kadherinas sudarė nestabilius homodimerus, kurie iškart išsiskyrė po kalcio jonų išeikvojimo. Tačiau destabilizuojančiomis sąlygomis (pvz., pH 5, esant kadmio jonams arba aukštoje temperatūroje) E-kadherinas gamino stabilius dimerus. Pagal visus parametrus šie dimerai nesiskyrė nuo aptiktų gyvose ląstelėse. Šie eksperimentai aiškiai parodė, kad dėl specifinės reakcijos gyvose ląstelėse susidaro stabilūs dimerai. Ši reakcija gali būti vienas iš svarbių kadherino pagrindo sukibimo reguliavimo etapų.

Tada ištyrėme beuodegį kadherino mutantą Ec1Δ(748-882)M. Šis mutantas, kuris negali sąveikauti su jokiais žinomais tarpląsteliniais kadherino partneriais, nėra įtraukiamas į tarpląstelines jungtis ir nesudaro lipnių dimerų (Chitaev ir Troyanovsky, 1998). Pagal mažo afiniteto kadherino adhezijos modelį toks fenotipas pagrįstas šio mutanto atjungimu nuo tarpląstelinės klasterizacijos mechanizmų. Tačiau dabar mes nustatėme, kad klatrino endocitozės inaktyvavimas keliomis skirtingomis mažomis trukdančiomis RNR (siRNR) visiškai atkūrė šio mutanto įtraukimą į ląstelių ir ląstelių jungtis. Be to, net visiška aktino gijų depolimerizacija latrunkulinu A neužkirto kelio šio mutanto grupavimui. Šie stebėjimai parodė, kad kadherino įdarbinimas į jungtis gali būti pagrįstas tik tarpląsteline sąveika. Apibendrinant, mūsų tyrimas pateikia naujų, kritinių įrodymų, patvirtinančių didelio afiniteto kadherino sukibimo modelį.


Abstraktus

In vivo molekulinis vaizdavimas su tiksliniais aktyvuojamais „protingais“ zondais, skleidžiančiais fluorescenciją tik numatytame taikinyje, leidžia jautriai ir konkrečiai aptikti vėžį. Įrodyta, kad dimerizacija ir fluorescencinis gesinimas vyksta koncentruotuose įvairių fluoroforų vandeniniuose tirpaluose. Čia mes iškėlėme hipotezę, kad fluoroforo dimerizacija ir gesinimas po konjugacijos su tiksliniais baltymais gali įvykti esant mažai koncentracijai. Ši dimerizacija gali būti panaudota kaip fluorescencijos aktyvavimo mechanizmas. Rodamino dariniai buvo konjuguoti su avidinu ir trastuzumabu, kurie atitinkamai nukreipia d-galaktozės receptorius ir HER2/neu antigeną. Po konjugacijos didelė dalis R6G ir TAMRA sudarė H tipo dimerus, net esant mažoms koncentracijoms, tačiau gali būti visiškai nuslopinti dimerams disociavus į monomerus. Norėdami parodyti fluorescencijos aktyvinimo efektą per in vivo fluorescencinis endoskopinis molekulinis vaizdas, labai užgesintas zondas, avidin-TAMRA arba minimaliai užgesintas zondas avidin-Alexa488, buvo skiriamas pelėms, turinčioms metastazių kiaušidėse į pilvaplėvę. Augliai buvo aiškiai vizualizuoti naudojant avidin-TAMRA, priešingai, su žema fono fluorescencija, o avidino-Alexa488 fono fluorescencija buvo didelė. Taigi H-dimero susidarymas kaip fluorescencijos gesinimo mechanizmas gali būti naudojamas kuriant fluorescencija aktyvuojamus zondus in vivo molekulinis vaizdavimas.


Rezultatai

Chromosomų dimerų susidarymas V. cholerae

Augimas V. cholerae padermių, kurioms trūksta CDR, lygis buvo tiesiogiai lyginamas su jų tėvų padermės augimu konkurencijos eksperimentuose turtingoje terpėje (2 pav.). Šie eksperimentai atskleidė 5,8% ir 3% Δ defektą vienoje ląstelėje per kartądif1 ir Δdif2 ląstelės, atitinkamai, palyginti su jų laukinio tipo kolegomis. Kadangi šie augimo defektai buvo visiškai nuslopinti a recFonas (2 pav.), jie tiesiogiai atspindi dimerų susidarymo greitį I ir II chromosomose, fdimeris Chr1 ir fdimeris Chr2 (žr. Medžiaga ir metodai). 8,6% augimo trūkumas xerC Vc ląstelės, kurios taip pat buvo slopinamos a recFonas atspindi bendrą chromosomų dimero susidarymo greitį V. cholerae, fdimeris Chr1+2 (2 pav.). Įdomu tai, kad fdimeris Chr1+2 lygus 1−(1−fdimeris Chr1 )(1−fdimeris Chr2), nurodant, kad dimeras susidaro ant dviejų V. cholerae chromosomos yra nepriklausomos.


REZULTATAI

FOXA1 sudaro labai bendradarbiaujantį homodimerą ant kompaktiško DNR elemento

Įvertindami kartu pasitaikančių pozicijų svorio matricų praturtinimą specifiniuose ląstelių tipui DNazei jautriuose (HS) regionuose 78 žmogaus ląstelių linijose, anksčiau nustatėme kandidatų TF dimerų konfigūracijas, kurios galėtų prisidėti prie jų ląstelių tipo specifinių funkcijų (28, 29). Du palindrominiai FOXA1 motyvai buvo geriausi šios analizės rezultatai. Pirma, buvo rastas kompaktiškas sudėtinis motyvas, vadinamas „skirtingu“ DIV (D0) motyvu, kur AT turtinga šakutė motyvas ( TA TTT ) sutampa taip, kad centrinis TA dinukleotidas būtų dalijamas gretimose pusėse (AAA TA TTT). Taip pat nustatėme mažiau kompaktišką sudėtinį motyvą šakutė motyvai, išdėstyti alternatyviomis kryptimis, kuriuos pavadinome „konverguojančiu“ arba CON (C0) motyvu (1A pav.). Mus domino abu motyvai dėl jų stipraus praturtėjimo krūties vėžio ląstelių linijoje MCF7 ir prostatos vėžio ląstelių linijoje LNCaP.

Norėdami patikrinti, ar FOXA1 homodimerizuojasi šiose sekose, nustatėme kiekybinius elektroforetinio mobilumo poslinkio tyrimus (EMSA), naudodami išgrynintą FOXA1 (toliau vadinamą FOXA1) DNR surišimo domeną (DBD). Nesant DNR, FOXA1 nedimerizuojasi, o sudaro monodispersinį monomerą, sprendžiant iš kalibruotų dydžio išskyrimo chromatogramų (papildomas paveikslas S1D). Pirmiausia atlikome EMSA su 1 nM DNR zondu, koduojančiu FOXA1 monomero elementą ir FOXA koncentracijos seriją, ir išmatavome vidurkį Kd_monomeras 2,4 ± 1,06 nM (n = 3, 1B pav.). Panašus titravimas, esant DIV DNR, parodė, kad dimerinės FOXA1 juostos pradeda formuotis esant mažiausioms FOXA1 koncentracijoms (0, 61 nM), o tai rodo dimerizaciją su stipriai teigiamu kooperatyvu (1C pav.). Akivaizdus surišimo giminingumas Kd_app nustatyta, kad FOXA1 prisijungimas prie DIV DNR yra 4,5 ± 1,6 nM, atsižvelgiant į monomerines ir dimerines būsenas kaip bendrą surištą DNR frakciją. Norėdami kiekybiškai įvertinti FOXA1 homodimerizacijos efektyvumą, mes įvertinome kooperatyvumo koeficientą (ω) pusiausvyros sąlygomis, kai DNR koncentracija yra 100 nM. Šie matavimai suteikia pusiausvyros surišimo konstantų santykį (ω = Kd_monomeras/Kd_dimer). Čia Kd_dimer reiškia disociacijos konstantą, skirtą antrosios FOXA1 molekulės prisijungimui prie iš anksto suformuoto FOXA1 / DNR komplekso. Taigi, bendradarbiavimo veiksniai rodo, kaip dvi TF molekulės įtakoja jų tarpusavio užimtumą tam tikrame DNR elemente su sudėtinėmis surišimo vietomis (34, 38). Jei ω > 1, TF jungiasi teigiamai, jei ω<1, TF jungiasi su neigiamu kooperatyvu arba, kitaip tariant, konkuruoja, o jei ω = 1, surišimas yra nepriklausomas arba nebendradarbiaujantis (49). Naudodami šiuos tyrimus, palyginome FOXA1 prisijungimą prie bendrų motyvų, praturtintų DNazės-HS regionuose (D0 / DIV ir C0 / CON motyvai) su kontroliniais elementais, kuriuose buvo pakeistas atstumas tarp pusių (D2, C1 ir C-1). ). FOXA1 jungiasi su DIV DNR labai teigiamu kooperatyvu (ω = 56,3 ± 11,9 1D-F pav., Papildomas S1E paveikslas, S1 papildoma lentelė). C0 DNR buvo išmatuotas žymiai mažesnis kooperatyvumo koeficientas (ω = 1,8 ± 1,3). Jei tarpas tarp vietos yra sutrikęs, abiejų DNR elementų konfigūracijų dimerizacija yra apsunkinta. Norėdami dar labiau išsklaidyti kooperacinio surišimo priklausomybę nuo atstumo tarp vietos, įterpėme tarpiklius nuo 1 iki 10 bp tarp DIV pusės vietų (1E ir F paveikslai, papildomas paveikslas S1F, papildoma lentelė S1). Šis eksperimentas atskleidė, kad bendra FOXA1 dimerizacija ant DNR griežtai priklauso nuo kompaktiško atstumo tarp vietos. Pridėjus tarpiklius, skiriančius FOXA1 šerdies motyvus, ω sumažėjo bent dydžiu, o D3 konfigūracijos atveju visiškai išnyko dimerinių kompleksų susidarymas. Kol šakutė DBD pakanka bendrai dimerizacijai, šis surišimo būdas taip pat išlaikomas rekombinantiniu būdu išgryninto pilno ilgio pelės FoxA1 baltymo kontekste (papildomas paveikslas S1G).

Struktūrinis modeliavimas siūlo alternatyvius dimerų susidarymo mechanizmus

Norėdami suprasti FOXA1 dimerizacijos DIV DNR pagrindą, sukūrėme FOXA1 DBD dimerų modelių seriją. Pirma, mes panaudojome paskelbtą FOXA3 DBD-DNR kristalų struktūrą (PDB ID 1VTN (22)), kad sukurtume FOXA1 homologijos modelius. FOXA3 DBD apima apie 25% viso ilgio baltymo ir penkiomis aminorūgštimis skiriasi nuo FOXA1 DBD. Be to, dimerų modeliai buvo sukurti sudedant du dvejetainius FOXA1 / DNR modelius ant idealių B-DNR šablonų, kuriuose yra DIV sekos (papildomas paveikslas S1A-C). Norėdami išlaikyti eksperimentinį DNR kreivumą, mes sujungėme eksperimentinius DNR fragmentus, po to pašalinome B-DNR šabloną. Galiausiai, sudėtingų modelių energija buvo sumažinta, todėl buvo galima struktūriškai koreguoti tiek baltymų, tiek DNR komponentus, todėl buvo sukurti modeliai su išlenkta DNR. Pažymėtina, kad 1VTN (CGTTG) modelio DNR elementas keliose pagrindinėse pozicijose skiriasi nuo šakutė konsensusas (TATTT) (papildomas S1B paveikslas). Todėl dvejetainio komplekso su FOXA1 DNR kreivumas gali būti netinkamai pavaizduotas šiuo metu turimuose modeliuose. Be to, dimerinių kompleksų surinkimą gali lydėti gilūs struktūriniai DNR pokyčiai.

Išsaugota funkcija šakutė DBD/DNR kompleksai yra dvidantis vandenilis, susietas su Asn165 su adeninu A’4 (5′-T1A2T3T4T5-3′/3′-A'1T'2A'3A'4A'5-5′) (papildomas S1A paveikslas). Pirmiausia atlikome superpozicijas, kurios palaiko Asn165 sąveiką su A'4 galutiniuose sudėtinguose modeliuose. Šiuose modeliuose negalėjome stebėti jokių tarpmolekulinių baltymų ir baltymų sąveikos tarp gretimų FOXA1 molekulių, o tai rodo, kad dimero susidarymą galima palengvinti allosteriškai per DNR (2A pav.). Tačiau kadangi DIV yra daug AT, manėme, kad dimerinio komplekso kontekste Asn165 gali būti paskatintas pakeisti adeninus ir prisijungti prie A'.3 arba A'5 vietoj to. Norėdami išbandyti šią galimybę, mes sukūrėme devynis alternatyvius modelius su visais įmanomais Asn165 ir adeninų 3–5 deriniais abiejose pusėse (papildomas paveikslas S1A, B). Iš devynių modelių trys yra simetriški, tai yra, Asn165 suriša tą patį adeniną bet kurioje iš dviejų pusių (2A–C pav.). Iš trijų simetriškų FOXA1 homodimero modelių D0-M4 modelis (kur Asn165 suriša A'5) parodyta ir didelė hidrofobinė baltymų ir baltymų kontaktinė sąsaja, kurią daugiausia sudaro Val229 ir Ala232 (2B paveikslas ir papildomas S1C paveikslas). Taip pat sukūrėme struktūrinius modelius visoms DIV valdymo motyvų konfigūracijoms, kurių tarpiklio ilgis yra 1–10 (papildomas paveikslas S2A, B). Šiame modelių rinkinyje buvo pastebėti sunkūs D3 konfigūracijos susidūrimai (papildomas S2B paveikslas), atitinkantis tai, kad EMSA nėra jokios dimerinės juostos (1E pav.). Likusios konfigūracijos parodė vidutinio sunkumo struktūrinius susidūrimus, kuriuos galbūt galėtų palengvinti konformaciniai baltymo koregavimai ir pakeista DNR forma (papildomas paveikslas S2A).

Dimerinių FOXA1/DNR kompleksų struktūrinis modelis. Struktūriniai modeliai buvo sukurti naudojant FOXA1 homologijos modelius, sukurtus naudojant FOXA3 / DNR kristalų struktūras (PDB ID 1VTN) kaip šabloną. Modeliavimo strategija aprašyta papildomame S1A – C paveiksle. Asn165 sąveika su adeninu yra svarbus DNR atpažinimo tarpininkas šakutė DBD. Remiantis suderinimu su dvejetainiu šakutė Tikimasi, kad DBD / DNR struktūros Asn165 sąveikaus su A4“ abiejuose 5′-T1A2T3T4T5-3′/3′-A'1T'2A'3A'4A'5-5′ DIV pusės svetainės (A, D0_M1). Mes manėme, kad homodimerinio komplekso kontekste Asn165 gali pakeisti adeninus ir sukurti alternatyvius modelius, kuriuose Asn165 kontaktuoja A.5’ (B, modelis D0_M4) arba A3“ (C, modelis D0_M7). Kairiajame skydelyje rodomos apžvalgos, o dešiniosiose skydeliai padidinami, išryškinant aminorūgštis V229 ir A232, veikiančias gretima molekulė, galinti tarpininkauti dimero susidarymui. DNR rodoma kaip pilkas vamzdelis, baltymų spiralės, lakštai arba kilpos yra atitinkamai raudonos, mėlynos ir geltonos karikatūros. Molekulinis paviršius rodomas skaidriai žaliai. Pasirinktos aminorūgštys yra pažymėtos ir rodomos kaip rutuliukai ir lazdelės. Rodoma DNR seka, naudojama modeliams sukurti, o nukleotidai (arba jų atvirkštinis komplementas), su kuriais susisiekė Asn165, yra raudonai.

Dimerinių FOXA1/DNR kompleksų struktūrinis modelis. Struktūriniai modeliai buvo sukurti naudojant FOXA1 homologijos modelius, sukurtus naudojant FOXA3 / DNR kristalų struktūras (PDB ID 1VTN) kaip šabloną. Modeliavimo strategija aprašyta papildomame S1A – C paveiksle. Asn165 sąveika su adeninu yra svarbus DNR atpažinimo tarpininkas šakutė DBD. Remiantis suderinimu su dvejetainiu šakutė Tikimasi, kad DBD / DNR struktūros Asn165 sąveikaus su A4“ abiejuose 5′-T1A2T3T4T5-3′/3′-A'1T'2A'3A'4A'5-5′ DIV pusinės svetainės (A, D0_M1). Mes manėme, kad homodimerinio komplekso kontekste Asn165 gali pakeisti adeninus ir sukurti alternatyvius modelius, kuriuose Asn165 kontaktuoja A.5’ (B, modelis D0_M4) arba A3“ (C, modelis D0_M7). Kairiajame skydelyje rodomos apžvalgos, o dešiniosiose skydeliai padidinami, išryškinant aminorūgštis V229 ir A232, veikiančias gretima molekule, kuri gali tarpininkauti dimero susidarymui. DNR rodoma kaip pilkas vamzdelis, baltymų spiralės, lakštai ar kilpos yra atitinkamai raudonos, mėlynos ir geltonos karikatūros. Molekulinis paviršius rodomas skaidriai žaliai. Pasirinktos aminorūgštys yra pažymėtos ir rodomos kaip rutuliukai ir lazdelės. Rodoma DNR seka, naudojama modeliams sukurti, o nukleotidai (arba jų atvirkštinis komplementas), su kuriais susisiekė Asn165, yra raudonai.

D0-M4 modelis (2B pav.) atrodo panašus į nebendradarbiaujantį D2 modelį, kuris buvo sukurtas atskiriant kitaip persidengiančias DIV FOXA1 pusės vietas (papildomas S2A paveikslas). Tačiau dviejų modelių superpozicija atskleidžia, kad FOXA1 monomerų beta lakštai yra arčiau vienas kito D2 modelyje, o tai gali sukelti neoptimalią sąveikos sąsają.Be to, DNR seka skiriasi tarp dviejų modelių, todėl atsiranda alternatyvių DNR formų, kurios gali pakeisti numatomą baltymų ir baltymų sąveikos sąsają (papildomas paveikslas S2A). Taigi D0_M4 modelis negali būti pripažintas negaliojančiu dėl teigiamo D2 elemento bendradarbiavimo trūkumo (1D–F pav.). Siūlome, kad D0_M1, D0_M4 ir D0_M7 būtų potencialiai galiojantys pradiniai FOXA1 dimerizacijos modeliai pagal DIV motyvą, remiantis šiuo metu turimais duomenimis. Pažymėtina, kad tik D0_M1 modelis turi tiesioginį DNR sekos nuskaitymą, panašų į tą, kuris stebimas konsensuso sekoje. Reikia tolesnio modelių patvirtinimo naudojant eksperimentus ir molekulinės dinamikos modeliavimą.

Pažymėtina, kad Ala232Val mutacija skatina prostatos vėžį (50). Nusprendėme išbandyti, ar Ala232 liekanos mutacijos turi įtakos kooperacinei DNR dimerizacijai. Tačiau mutacijos, susijusios su prostatos vėžiu ir 10 kitų pakeitimų, tik nežymiai veikia DIV sekos bendradarbiavimą (<1, 5 karto pokytis į ω, papildomas S2C paveikslas). Atlikdami griežtesnį testą, mes taip pat sukūrėme dvigubus mutantus, kuriuose abi tariamos sąsajos liekanos Val229 ir Ala232 buvo tuo pačiu metu mutuotos į rūgštinius glutamatus (Val229Glu / Ala232Glu ir Val229Arg / Ala232Arg). EMSA parodė, kad dviguba Val229Arg / Ala232Arg mutacija neturi įtakos DNR surišimui (papildomas paveikslas S2D). Tačiau stebėtina, kad Val229Glu / Ala232Glu dvigubos mutacijos žymiai padidina kooperatyvą, nors sumažėja afinitetas monomeriniam surišimui.

Nesant eksperimentinių trijų komponentų FOXA1 / DIV komplekso struktūrų, surištos DNR kreivumas, baltymo-DNR kontaktinė sąsaja ir struktūrinis dimerizacijos pagrindas išlieka hipotetinis. Bendradarbiavimo dimerų susidarymo mechanizmas gali būti dėl dviejų pagrindinių mechanizmų. Pirma, tiesioginė baltymų ir baltymų sąveika, kuriai reikėtų didelių struktūrinių koregavimų, įskaitant kontaktinės sąsajos perjungimą arba DNR deformaciją. Antra, DNR tarpininkaujantis allosterinis mechanizmas gali palengvinti FOXA1 bendradarbiaujantį DNR atpažinimą. Tokie mechanizmai buvo aprašyti vis didesniam TF dimerų porų skaičiui ir, atrodo, yra įprasta TF biologijos tema (51–53).

FOXA1 stipriai jungiasi su DIV lokusais žmogaus vėžio ląstelėse

FOXA1 yra pagrindinis endoderminių ląstelių ir audinių tipų reguliatorius, tačiau taip pat susijęs su kelių vėžio formų, įskaitant krūties, prostatos ir kepenų vėžį, navikogeneze ((9), apžvelgta (8)). Atitinkamai, FOXA1 ekspresija yra didžiausia normaliame kepenų ir žarnyno epitelyje, taip pat krūties, prostatos, virškinimo trakto ir kepenų vėžio ląstelių linijose tarp 562 mėginių, kuriuos ištyrė FANTOM5 konsorciumas (54) (3A pav.). Norėdami ištirti DIV svarbą nustatant FOXA1 genominius surišimo profilius, toliau apibrėžėme keturias surišimo vietų kategorijas viešai prieinamuose ChIP-seq duomenų rinkiniuose (3B pav.). Kategorijoje „D“ yra svetainės, atitinkančios DIV PWM smailės srityje (1,1e+5 atvejai žmogaus genome hg38, „D“). Kategorija „C“ yra kontrolinės dimerų vietos, atitinkančios motyvus, kuriuose dimero skatinamoji konfigūracija sutrinka įvedus 1–10 tarpiklių (D1-D10, 5.1e + 5 lokusai hg38, papildomas S3A paveikslas). Kategorija „C“ kontroliuoja konkrečios konfigūracijos pirmenybę, tačiau išlaiko pusę svetainių, panašių į DIV vietas, skaičių. Toliau apibrėžėme vietas, kuriose FOXA1 jungiasi tik kaip monomeras („M“). Galiausiai, likusios vietos yra pažymėtos „N“ – „motyvas nėra“, nes trūksta akivaizdžių atitikmenų bet kuriam iš trijų FOXA1 motyvų tipų (3B pav.). FOXA1 ChIP-seq duomenų rinkiniuose iš MCF7, T47D ir HepG2 ląstelių paprastai yra 1000–2000 atitikmenų su DIV ir jie rodo DIV praturtėjimą, palyginti su dimerio kontrole, atsižvelgiant į genomo DIV / kontrolės santykį (papildomas paveikslas S3B). . Kaip kooperatyvinės dimerizacijos tarpinį serverį ląstelių kontekste palyginome ChIP-seq signalus per keturias surišimo vietų klases. FOXA1 lokusai su DIV parašais T47D, MCF7 ir HepG2 ląstelėse turi žymiai stipresnį ChIP-seq skaitymo intensyvumą, palyginti su regionais, kuriuose yra alternatyvių motyvų atitikmenų (3C paveikslas, papildomas S3C). Kaip alternatyvią analizę įvertinome FOXA1 ChIP-seq smailes MCF7, T47D ir HepG2 ląstelėse pagal signalo stiprumą ir suskirstėme jas į decilius (3D pav.). Toliau kiekybiškai įvertinome keturių privalomų kategorijų dalinį pasireiškimą decilyje (3D pav.). Ši analizė rodo, kad FOXA1 / DIV smailės yra sutelktos aukščiausiuose deciliuose daugiau nei kitos trys rišamosios kategorijos.

FOXA1 stipriai jungiasi su DIV sekomis chromatino kontekste. (A) FOXA1 ekspresija, išmatuota FANTOM 5 konsorciumo 562 ląstelių ir audinių tipuose. Kiekvienas taškas žymi ląstelės ar audinio tipą, o pasirinkti mėginiai su didžiausia FOXA1 ekspresija yra pažymėti. (B) Schema, kaip ChIP-seq smailės buvo suskirstytos į kategorijas pagal monomero, DIV arba kontrolinio dimero (DIV1-10) motyvų nebuvimą / buvimą. (C) „Boxplot“, kad palygintumėte ChIP-seq balus (ENCODE siauros smailės signalo reikšmes) keturiose FOXA1 ChIP-seq smailių kategorijose, apibrėžtose (B), naudojant duomenis iš T47D, HepG2 ir MCF7 ląstelių. P-reikšmės apskaičiuojamos naudojant porinį palyginimą su nesuporuotu Wilcoxon rangų sumos testu (R funkcija pairwise.wilcox.test) ir koreguojamos Holmo metodu (***P < 0,001). (D) ChIP-seq smailės buvo suskirstytos pagal signalo reikšmes ir suskirstytos į decilius (viršutinis decilis = 1, apatinis decilis = 10, rodomas kaip langelio diagramos), o keturių rišamųjų kategorijų skaičius kiekviename decilyje rodomas kaip proporcingi barplotai.

FOXA1 stipriai jungiasi su DIV sekomis chromatino kontekste. (A) FOXA1 ekspresija, išmatuota FANTOM 5 konsorciumo 562 ląstelių ir audinių tipuose. Kiekvienas taškas žymi ląstelės ar audinio tipą, o pasirinkti mėginiai su didžiausia FOXA1 ekspresija yra pažymėti. (B) Schema, kaip ChIP-seq smailės buvo suskirstytos į kategorijas pagal monomero, DIV arba kontrolinio dimero (DIV1-10) motyvų nebuvimą / buvimą. (C) „Boxplot“, kad palygintumėte ChIP-seq balus (ENCODE siauros smailės signalo reikšmes) keturiose FOXA1 ChIP-seq smailių kategorijose, apibrėžtose (B), naudojant duomenis iš T47D, HepG2 ir MCF7 ląstelių. P-reikšmės apskaičiuojamos naudojant porinį palyginimą su nesuporuotu Wilcoxon rangų sumos testu (R funkcija pairwise.wilcox.test) ir koreguojamos Holmo metodu (***P < 0,001). (D) ChIP-seq smailės buvo suskirstytos pagal signalo reikšmes ir suskirstytos į decilius (viršutinis decilis = 1, apatinis decilis = 10, rodomas kaip langelio diagramos), o keturių rišamųjų kategorijų skaičius kiekviename decilyje rodomas kaip proporcingi barplotai.

Taip pat patikrinome ChIP-seq signalus dėl alternatyvių su chromatinu susijusių faktorių GATA3, koaktyvatoriaus Histono acetiltransferazės P300 (EP300), CTCF ir c-Jun (papildomas paveikslas S3E). Mes nepastebėjome padidėjusių signalų per DIV sekas, palyginti su kitomis surišimo vietų kategorijomis, o tai rodo, kad poveikis yra specifinis FOXA1. Darome išvadą, kad FOXA1 chromatino kontekste susieja su DIV stipriau nei su monomerinėmis ar alternatyviomis dimerinėmis vietomis, nes ši jungimosi vieta skatina labai bendradarbiauti. Toliau atlikome genų ontologijos analizę, naudodami genų rinkinius, susietus su FOXA1 / DIV surišimo įvykiais T47D arba MCF7 ląstelėse su pasikeitusios ekspresijos parašais po cheminio ar genetinio perturbacijos (papildomas paveikslas S3E). Tarp labiausiai praturtintų genų rinkinių, kuriuos suriša FOXA1 / DIV, yra genai, reguliuojami ksenografuose, atspariuose endokrininei terapijai (55), skirtingai reguliuojami luminalinėje arba mezenchiminėje krūties vėžio ląstelių linijoje (56), kuri yra sumažinta krūties reguliavimu. vėžio ląstelės, kuriose išeikvota ESR1 (57) ir kiti genų rinkiniai, susiję su atsaku į branduolinių receptorių signalizaciją ir onkogeninius kelius. Tai rodo, kad genai, susiję su FOXA1 / DIV vietomis, yra jautrūs vėžio progresavimui svarbių takų sutrikimams, ypač krūties vėžio modeliuose.

FOXA1 homodimerizuojasi ant DIV motyvų, kad reguliuotų stipriklius šalia genų, susijusių su vėžio progresavimu

Toliau atrinkome penkis FOXA1 / DIV lokusus, susijusius su genais, reaguojančiais į perturbacijos tyrimus, kurie atkuriamai parodė stiprius ChIP-seq signalus MCF7 ląstelėse (4A paveikslas, papildomas S3E paveikslas). Šie lokusai yra arba intronuose, arba 50 kb atstumu prieš srovę nuo genų TSS, turinčių stiprią ekspresiją MCF7 ląstelėse ir kituose atitinkamuose ląstelių ir audinių tipuose (papildomas paveikslas S4A ir B). Be to, buvo pranešta, kad šie genai atlieka svarbų vaidmenį vėžyje arba esminiuose ląstelių procesuose, įskaitant ESR1 ( 58), PVT1/MYC ( 59), ATP9A ( 60), QSOX1 ( 61) ir KAT6B ( 62) (papildomas S4A paveikslas). PVT1 koduoja ilgą nekoduojančią RNR, esančią 8q24 lokuse, bendrame su onkogenu MANO C (63). Šis lokusas yra stipriai išplitęs piktybinių vėžio formų grupėje ir yra prastos prognozės žymuo (64, 65). Mes atlikome EMSA naudodami seką, gautą iš šių penkių endogeninių lokusų, taip pat dviejų tipų mutantus (4B – D pav.). Pirma, šiuos lokusus sukūrėme įvesdami 3 bp tarpiklius tarp pusinių vietų, primenančių D3 elementą, nesuderinamą su dimeriniu surišimu (1E pav., „Monomer“, papildoma lentelė S1). Be to, mutavome abi puses, kad sukurtume DNR elementus su visiškai sunaikintu FOXA1 konsensusu („Neprisirišimas“, papildoma S1 lentelė). Rezultatai rodo labai teigiamą FOXA1 homodimerizacijos bendradarbiavimą visose penkiose DIV sekose, kurių ω vertė yra didžiausia. PVT1/MYC lokusas (4B–E pav.). 3 bp tarpiklio įvedimas sunaikina dimerinį surišimą, bet nepaveikia afiniteto monomeriniam surišimui (4C pav.). Abiejų FOXA1 pusinių vietų degeneracija beveik visiškai panaikina FOXA1 surišimą tirtomis koncentracijomis (4D pav.). Norėdami patikrinti, ar jungimasis su išgrynintais komponentais yra susijęs su genų reguliavimu ląstelių ir chromatino kontekste, sukūrėme du reporterių tyrimus, kad patvirtintume šių lokusų stipriklio aktyvumą. Pirma, mes klonavome ~ 500 bp fragmentus, apimančius FOXA1 surištas DIV sekas, kurias išbandė EMSA, į Tol2 vektorius. Tol2 sistema įgalina transpozazės sukeltą integraciją į MCF7 ląstelių, kurios stipriai ekspresuoja FOXA1, genomą (papildomas S4C paveikslas). Be to, sukūrėme luciferazės reporterio tyrimą. Pastarasis buvo atliktas T47D ląstelėse, ekspresuojančiose FOXA1 endogeniškai, ir gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijoje HCT116, kur FOXA1 paprastai nėra ekspresuojamas (66) (papildomas paveikslas S4C). Tol2-GFP reporterių ekspresijos lygiai, kuriuos skatina įvairios stiprinimo konstrukcijos, buvo kiekybiškai įvertinti MCF7 ląstelėse naudojant FACS, o ekspresija buvo įvertinta atsižvelgiant į GFP teigiamų ląstelių frakciją ir vidutinį GFP signalą (papildomas paveikslas S4D). Šie ekspresijos lygiai rodo, kad sekos, kuriose yra DIV motyvų, pasižymi stipriu stiprintuvu (4F pav., „Dimer“). GFP reporterių ekspresija, kai DIV buvo mutavęs, kad FOXA1 gali jungtis tik monomeriškai („monomeras“) arba su dviem sutrikusiomis pusinėmis vietomis („nėra surišimo“), parodė, kad reporterio aktyvumas labai sumažėjo, o tai rodo, kad norint visiškai aktyvuoti reporterį, reikalinga bendra dimerizacija ( 4F pav.). Analogiškai luciferazės reporterio aktyvumas buvo sumažintas T47D ląstelėse 4 iš 5 sekų, kai buvo sutrikęs homoderiminis surišimas (4G pav.). Galiausiai, HCT116, kuriame nėra endogeninio FOXA1, luciferazės reporterio aktyvumas buvo stipriai padidėjęs dėl egzogeninio FOXA1 tiekimo, o tai rodo, kad reporterio aktyvacija priklauso nuo FOXA1 (4H pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad FOXA1 dimerizuojasi bendradarbiaujant endogeninėse DNR sekose ir kad norint efektyviai suaktyvinti šias stiprinimo sekas, reikalinga dimerinė FOXA1 / DIV konfigūracija.

FOXA1 / DIV surišimas reguliuoja genų ekspresiją vėžio ląstelėse. (A) FOXA1 ChIP-seq smailės MCF7 ląstelėse (nurodytas prisijungimo numeriai) penkiuose DIV lokusuose šalia genų, turinčių galimą vaidmenį onkogenezėje (taip pat žr. papildomą S4A ir B paveikslą). (B) EMSA, naudojantys Cy5 pažymėtus DNR elementus, gautus iš penkių endogeninių DIV lokusų. (C) EMSA, kur penki DIV DNR elementai buvo mutuoti į monomero surišimo vietas, pridedant 3 bazių porų tarpiklį, kuris sunaikina dimerinį surišimą, bet paliko monomerinį surišimą nepažeistą ("monomeras"). (D) EMSA, kur abi pusės DIV elementų vietos buvo mutavusios, panaikinant surišimą („nesusirišimas“). (E) Homodimerio kooperatyvumo vertė (⁠|$omega$|⁠) parodyta kaip vidurkis ± SD nuo n |$geq$| 3 išmatavimai. (F) Bendra GFP fluorescencija, kiekybiškai įvertinta FACS analize, naudojant Tol2 konstrukcijas, turinčias DIV stiprintuvų arba dviejų tipų mutavusių DIV vietų („Monomeras“ arba „No Binding“), integruotas į MCF7 ląstelių genomus. FACS brėžiniai ir ląstelių nuotraukos yra papildomame S4D paveiksle. (G) Dvigubo liuciferazės reporterio tyrimas naudojant T47D ląstelių liniją, endogeniškai ekspresuojančią FOXA1. (H) Dvigubas liuciferazės tyrimas HCT116 ląstelėse, kurios kartu buvo transfekuotos FOXA1 ekspresijos plazmidėmis (užpildytos juostos) arba pcDNA3 kontrole (tuščios juostos). Tuščias vektorius yra luciferazės reporteris be įterpto DIV stipriklio. Reporterio signalai (F) ir (G) buvo normalizuoti iki „monomero“ verčių. Liuciferazės ir Tol2 reporteriai buvo sukurti taip, kaip nurodyta papildomame S4C paveiksle. Trijų biologinių pakartojimų vidurkis ± SD parodytas (F), (G) ir (H). P-vertės buvo apskaičiuotos naudojant nesuporuotą dviejų uodegų Studento vertes t-testas (***P< 0,001**P< 0,01*P< 0,05).

FOXA1 / DIV surišimas reguliuoja genų ekspresiją vėžio ląstelėse. (A) FOXA1 ChIP-seq smailės MCF7 ląstelėse (nurodytas prisijungimo numeriai) penkiuose DIV lokusuose šalia genų, turinčių galimą vaidmenį onkogenezėje (taip pat žr. papildomą S4A ir B paveikslą). (B) EMSA, naudojantys Cy5 pažymėtus DNR elementus, gautus iš penkių endogeninių DIV lokusų. (C) EMSA, kur penki DIV DNR elementai buvo mutuoti į monomero surišimo vietas, pridedant 3 bazių porų tarpiklį, kuris sunaikina dimerinį surišimą, bet paliko monomerinį surišimą nepažeistą ("monomeras"). (D) EMSA, kur abi pusės DIV elementų vietos buvo mutavusios, panaikinant surišimą („nesusirišimas“). (E) Homodimerio kooperatyvumo vertė (⁠|$omega$|⁠) parodyta kaip vidurkis ± SD nuo n |$geq$| 3 išmatavimai. (F) Bendra GFP fluorescencija, kiekybiškai įvertinta FACS analize, naudojant Tol2 konstrukcijas, turinčias DIV stiprintuvų arba dviejų tipų mutavusių DIV vietų („Monomer“ arba „No Binding“), integruotas į MCF7 ląstelių genomus. FACS brėžiniai ir ląstelių nuotraukos yra papildomame S4D paveiksle. (G) Dvigubo liuciferazės reporterio tyrimas naudojant T47D ląstelių liniją, endogeniškai ekspresuojančią FOXA1. (H) Dvigubas liuciferazės tyrimas HCT116 ląstelėse, kurios kartu buvo transfekuotos FOXA1 ekspresijos plazmidėmis (užpildytos juostos) arba pcDNA3 kontrole (tuščios juostos). Tuščias vektorius yra luciferazės reporteris be įterpto DIV stipriklio. Reporterio signalai (F) ir (G) buvo normalizuoti iki „monomero“ verčių. Liuciferazės ir Tol2 reporteriai buvo sukurti taip, kaip nurodyta papildomame S4C paveiksle. Trijų biologinių pakartojimų vidurkis ± SD parodytas (F), (G) ir (H). P-vertės buvo apskaičiuotos naudojant nesuporuotą dviejų uodegų Studento vertes t-testas (***P< 0,001**P< 0,01*P< 0,05).

DIV sekos tarpininkauja chromatino atidarymui vietose, kurias iš anksto suriša FOXA1, slopindamos PI3K kelią

Kadangi FOXA1 yra pažymėtas kaip TF pradininkas, mes paklausėme, ar FOXA1 / DIV konfigūracija yra susijusi su chromatino prieinamumo reguliavimu. Norėdami išspręsti šį klausimą, susidomėjome tyrimu, kuriame buvo tiriami chromatino pokyčiai krūties vėžio ląstelių linijoje T47D, reaguojant į gydymą fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) inhibitoriumi BYL719 (toliau vadinamas BYL) (67). PI3K kelias yra hiperaktyvus maždaug 70 % krūties navikų, todėl yra patrauklus priešvėžinės terapijos tikslas (68). Tačiau PI3K kinazės slopinimas gali sukelti stiprų kompensacinį atsaką ir vėžio atkrytį, kurį tikriausiai palengvina su ERα susijusios reguliavimo programos. Norėdami ištirti šio proceso molekulinį mechanizmą, Toska ir kolegos palygino FOXA1 surišimo profilį ir chromatino prieinamumą, išmatuotą pagal ATAC-seq, nesant ir esant BYL (67). Įdomu tai, kad autoriai pranešė apie motyvą, praturtinantį FOXA1 rišamąjį kraštovaizdį po apdorojimo BYL719 ir puikiai atitinkantį DIV. Tačiau autoriai šį motyvą vadina „Homeobox“ motyvu, nes bendrų motyvų duomenų bazėse trūksta DIV anotacijų. Todėl nusprendėme ištirti, ar FOXA1 / DIV konfigūracijos prisideda prie kompensacinio chromatino remodeliavimo, reaguojant į PI3K kelio slopinimą.

DIV kategorijos smailės („D“) rodo stipresnius ChIP-seq signalus nei lokusai su monomerinėmis vietomis („M“), vietomis su sutrikusia dimerų konfigūracija („C“) ir vietomis be aptinkamo FOXA1 konsensuso elemento („N“). tiek DMSO, tiek BYL sąlygos (5A ir B pav.). Genomines vietas sugrupavome pagal uždarą-atvirą dinamiką, išmatuotą ATAC-seq, nesant PI3K slopinimo arba jo nėra. Nuolat atviros (PO) aikštelės yra atviros ir DMSO, ir BYL sąlygomis. Arti atviros (CO) vietos tampa prieinamos, o atviros iki uždaros (OC) vietos praranda prieigą, reaguojant į gydymą BYL (5C pav.). Mes nustatėme, kad dauguma lokusų priklauso OC kategorijai, o tai rodo, kad gydymas BYL prarastas. Tačiau FOXA1 ChIP-seq signalas daugiausia siejamas su PO arba CO kategorijomis, bet vos aptinkamas OC kategorijoje (5C pav.). Tai rodo, kad FOXA1 nebuvimas padidina genomo vietų uždarymą, o FOXA1 buvimas gali turėti du vaidmenis. Pirma, FOXA1 galėtų veikti, kad išlaikytų atvirą PO vietų chromatino būseną. Antra, uždaros vietos, iš anksto surištos FOXA1, gali tapti atviros reaguojant į PI3K slopinimą. Toliau tikrinome ATAC-seq signalus vietose, kurias iš anksto susiejo FOXA1 DMSO sąlygomis. Mes nustatėme, kad vietos be atitikmenų šakutė rišamieji motyvai („N“) dažniausiai yra iš anksto atidaryti DMSO sąlygomis ir rodo tik nedidelį ATAC-seq signalų padidėjimą po gydymo BYL (5D ir E paveikslai, papildomas S5A paveikslas). Tačiau stebėtina, kad FOXA1 / DIV vietos, iš anksto susietos DMSO sąlygomis, dažniausiai yra uždarytos, tačiau po PI3K kelio slopinimo labai padidėja ATAC-seq signalas (5D ir E paveikslai, papildomas S5A paveikslas).Nuosekliai didelė dalis FOXA1 / DIV svetainių, susietų DMSO sąlygomis, atitinka CO kategorijos vietas (5F pav.). Nors FOXA1 / C ir FOXA1 / M svetainės taip pat teikia pirmenybę CO vietoms, ši sąsaja yra reikšmingesnė FOXA1 / DIV vietoms (Fišerio tikslus testas P = 2,4e–05 (DIV prieš kontrolinį dimerį)). Darome išvadą, kad vietose, kurias iš anksto surišo FOXA1 DMSO sąlygomis, PI3K slopinimo metu vyksta perėjimas nuo uždaro iki atviro, ir šis poveikis yra stipriausias FOXA1 / DIV vietos pogrupyje. The PVT1/MYC ir KAT6B lokusai iliustruoja šį poveikį vienodai stipriais ChIP-seq signalais DMSO ir BYL719 sąlygomis, tačiau stipriai padidina ATAC-seq signalą po PI3K slopinimo (5G pav.). Toliau išbandėme, ar DIV lokusai yra šalia PVT1/MYC ir KAT6B genai reaguoja į PI3K slopinimą mūsų luciferazės reporterio tyrime. Sekos su nepažeistais DIV elementais rodo padidėjusį reporterio aktyvumą reaguojant į gydymą BYL, o vietose su mutavusiais DIV elementais reikšmingo atsako nerodo (5H pav.). Tačiau mažai tikėtina, kad plazmidės pagrindu sukurtos reporterių konstrukcijos tiksliai panašios į endogeninių lokusų chromatino konfigūracijas. Todėl negalime būti tikri, kad pastebėti reporterio aktyvumo pokyčiai atsirado dėl tos pačios chromatino uždaros ir atviros dinamikos, matomos ATAC-seq duomenyse. Nepaisant to, ši analizė rodo, kad PI3K kelio blokavimas sukelia chromatino remodeliavimą iš anksto susietose FOXA1 / DIV vietose, kurios gali paveikti transkripcijos išvestį.

FOXA1 surištos DIV vietos yra susijusios su chromatino dinamika. (A, B) ChIP-seq balų langelis (fragmentų krūvos viršūnės aukštis) iš FOXA1 duomenų T47D ląstelėse, lyginant smailių kategorijas pogrupiams, kuriuose yra DIV motyvų (D), kontrolinių motyvų (C), monomero motyvų (M) ir be FOXA1 motyvo (N). ) (žr. 2B pav.). T47D ląstelės buvo veikiamos DMSO (A) arba PI3K kelio inhibitoriumi BYL719 (B) (67). (C). ATAC-seq nuskaitymo šilumos žemėlapis, taip pat FOXA1 ChIP-seq nuskaitymas DMSO arba BYL719 gydymo sąlygomis trimis prieinamumo modelių kategorijomis: PO (nuolat atidarytas DMSO ir BYL), CO (uždarytas DMSO, bet atidarytas BYL) ir OC ( atidaryta DMSO, bet uždaryta BYL). (D) ATAC-seq nuskaitė karščio žemėlapius DMSO arba BYL719 gydymo sąlygomis, išryškintus keturiomis FOXA1 ChIP-seq smailių kategorijomis, apibrėžtomis DMSO sąlygoje. Apatinės plokštės yra agreguotos ATAC-seq signalų krūvos. (E) Santykio tarp ATAC-seq skaitymo skaičiaus tarp BYL719 apdorotų T47D ląstelių ir neapdorotų (DMSO) T47D ląstelių keturiose FOXA1 surišimo vietų kategorijose diagrama. (F) Daliniai stulpelių diagramos, rodančios santykines FOXA1 smailių kategorijų ir su FOXA1 nesusietų vietovių proporcijas („Neribotas“), susijusių su PO, OC arba CO vietomis, apibrėžtomis pagal prieinamumo modelius, išmatuotus pagal ATAC-seq (žr. C skydelį). (G) Genomo naršyklės pateikia ChIP-seq ir ATAC-seq signalų pavyzdžius FOXA1 / DIV svetainėse šalia PVT1/MYC ir KAT6B loci. Juodos dėžutės žymi vietas su DIV motyvu, o žalias langelis rodo alternatyvią vietą, rodančią ATAC-seq signalų išnykimą. (H) Liuciferazės / Renilla signalo stulpelis, išmatuotas T47D ląstelėse, apdorotose DMSO (raudona) arba BYL719 (mėlyna), naudojant DIV elementą, kuriame yra luciferazės reporteris iš PVT1/MYC ir KAT6B lokusai ir mutavusios „nesusirišančios“ kontrolės. Rodomas 3 biologinių pakartojimų vidurkis ± SD. P-reikšmės (H) buvo apskaičiuotos naudojant nesuporuotą dviejų uodegų Studento vertes t-testas (***P< 0,001**P< 0,01*P< 0,05). P- (A), (B) ir (E) reikšmės apskaičiuojamos naudojant Wilcoxon rangų sumos testą ir koreguojamos naudojant Holmo metodą (***P< 0,001).

FOXA1 surištos DIV vietos yra susijusios su chromatino dinamika. (A, B) ChIP-seq balų langelis (fragmentų krūvos viršūnės aukštis) iš FOXA1 duomenų T47D ląstelėse, lyginant smailių kategorijas pogrupiams, kuriuose yra DIV motyvų (D), kontrolinių motyvų (C), monomero motyvų (M) ir be FOXA1 motyvo (N). ) (žr. 2B pav.). T47D ląstelės buvo veikiamos DMSO (A) arba PI3K kelio inhibitoriumi BYL719 (B) (67). (C). ATAC-seq nuskaitymo šilumos žemėlapis, taip pat FOXA1 ChIP-seq nuskaitymas DMSO arba BYL719 gydymo sąlygomis trimis prieinamumo modelių kategorijomis: PO (nuolat atidarytas DMSO ir BYL), CO (uždarytas DMSO, bet atidarytas BYL) ir OC ( atidaryta DMSO, bet uždaryta BYL). (D) ATAC-seq nuskaitė karščio žemėlapius DMSO arba BYL719 gydymo sąlygomis, išryškintus keturiomis FOXA1 ChIP-seq smailių kategorijomis, apibrėžtomis DMSO sąlygoje. Apatinės plokštės yra agreguotos ATAC-seq signalų krūvos. (E) Santykio tarp ATAC-seq skaitymo skaičiaus tarp BYL719 apdorotų T47D ląstelių ir neapdorotų (DMSO) T47D ląstelių keturiose FOXA1 surišimo vietų kategorijose diagrama. (F) Daliniai stulpelių diagramos, rodančios santykines FOXA1 smailių kategorijų ir su FOXA1 nesusietų vietovių proporcijas („Neribotas“), susijusių su PO, OC arba CO vietomis, apibrėžtomis pagal prieinamumo modelius, išmatuotus pagal ATAC-seq (žr. C skydelį). (G) Genomo naršyklės pateikia ChIP-seq ir ATAC-seq signalų pavyzdžius FOXA1 / DIV svetainėse šalia PVT1/MYC ir KAT6B loci. Juodos dėžutės žymi vietas su DIV motyvu, o žalias langelis rodo alternatyvią vietą, rodančią ATAC-seq signalų išnykimą. (H) Liuciferazės / Renilla signalo stulpelis, išmatuotas T47D ląstelėse, apdorotose DMSO (raudona) arba BYL719 (mėlyna), naudojant DIV elementą, kuriame yra luciferazės reporteris iš PVT1/MYC ir KAT6B lokusus ir mutavusius „nesusirišimo“ kontrolę. Rodomas 3 biologinių pakartojimų vidurkis ± SD. P-reikšmės (H) buvo apskaičiuotos naudojant nesuporuotą dviejų uodegų Studento vertes t-testas (***P< 0,001**P< 0,01*P< 0,05). P- (A), (B) ir (E) reikšmės apskaičiuojamos naudojant Wilcoxon rangų sumos testą ir koreguojamos naudojant Holmo metodą (***P< 0,001).

Su liga susiję SNP, esantys DIV motyve, sukelia aleliui specifinį dimero susidarymą ir ekspresijos aktyvumą

Manėme, kad norint pasiekti funkcinį rezultatą genominių lokusų pogrupyje, būtina bendradarbiaujanti FOXA1 homodimerizacija DIV sekose. Jei dimerio motyvas yra sutrikęs, lokusas gali prarasti galimybę efektyviai įdarbinti FOXA1. Arba, nepaisant veiksmingo įdarbinimo, monomerinis FOXA1 gali nesugebėti sukelti reguliavimo atsako. Dėl to gali atsirasti nenormalus ląstelių atsakas, prisidedantis prie žmonių ligų. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes apklausėme genomo masto asociacijos tyrimus (GWAS) dėl variantų, turinčių įtakos FOXA1 dimerizacijai. Mes apsvarstėme 25 218 su liga susijusių SNP, prieinamų iš viešųjų išteklių (http://www.gwascentral.org, duomenys paskelbti 2016 m. sausio mėn.), ir išskyrėme kitus SNP, kai su jais buvo disbalansas (tarpiniai LD SNP), naudodami Haploreg (http://archive). .broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) su parametru r 2 > 0,8 Europos gyventojų. Tokiu būdu mes gavome 606 094 kandidatų SNP rinkinį. Tada mes susikirtėme SNP koordinates su genomo pločio DIV koordinatėmis, turinčiomis įtakos centrinei TA vietai (AAA TA TTT), kurios, mūsų manymu, yra svarbiausios bendrai FOXA1 homodimerizacijai. Tokiu būdu mes gavome 23 kandidatus SNP, kurių nedidelis alelis gali sutrikdyti FOXA1 homodimerizaciją ir šakutė-priklausomi transkripcijos tinklai. Norėdami nustatyti, ar FOXA1 turi alelių dimerų susidarymo skirtumus, atlikome EMSA visiems 23 SNP kandidatams su pagrindinėmis arba nedidelėmis alelių sekomis. Naudodami šią strategiją nustatėme 15 SNP, kurie labai trikdo FOXA1 dimerizaciją (6A pav., 1 lentelė, papildomas S6A paveikslas). Toliau apžiūrėjome kiekvieną iš 15 SNP duomenų rinkinyje, kurį pateikė genotipo audinių ekspresijos (GTEx) konsorciumas (https://gtexportal.org/) ir nustatėme, kad šeši iš SNP arba jų LD SNP sudaro GTEx ekspresijos kiekybinio požymio lokusą (eQTL). 6A pav., 1 lentelė). Kai kuriais atvejais, pvz. rs2097744, kuris yra susijęs su nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu, nedidelis alelis visiškai sutrikdė dimerinį FOXA1 surišimą (6B pav.). Kitais atvejais smulkūs aleliai sumažino FOXA1 dimerizacijos bendradarbiavimą (papildoma S1 lentelė). Toliau mes sutelkėme dėmesį į SNP, palaikomus genominėmis anotacijomis audiniuose, kurie priklauso nuo FOXA1 ar susijusių šakutė šeimos baltymai.

Su liga susiję SNP trikdo dimerizaciją ir genų ekspresiją. (A) Struktūrinė schema, skirta funkciniam vertinimui pasirinkti SNP. (B) EMSA rs2097744 lokusui, kur mažas alelis visiškai sutrikdo dimerizaciją. (C) ChIP-seq histono ženklų profiliai rs2941742 lokuse įvairiose ląstelių linijose. (D) EMSA lygina rs2941742 pagrindinių ir mažesnių alelių dimerų susidarymą. (E) EMSA kooperatyvumo koeficientas D (vidurkis ± SD, n = 5). (F) Dvigubas luciferazės tyrimas naudojant išoriškai tiekiamą FOXA1 HCT116 ląstelėse, naudojant abu rs2941742 alelius (vidurkis ± SD, n = 5). (G) FOXA1 ChIP-seq profiliai iš kelių žmogaus vėžio ląstelių linijų rs5414555835 lokuse (alternatyvus to paties lokuso ID yra rs67668514). (H) EMSA, naudojantys pagrindinį ir mažąjį rs5414555835 alelį. I. Dviejų rs5414555835 lokuso alelių HCT116 ląstelėse dviejų luciferazės tyrimas. Užpildytos juostos skirtos išoriniam viso ilgio FOXA1 ir tuščios juostos pcDNA3 vektoriaus kontrolei (vidurkis ± SD, n = 3 biologiniai pakartojimai). P-vertės buvo apskaičiuotos naudojant nesuporuotą dviejų uodegų Studento vertes t-testas (**P< 0,01).

Su liga susiję SNP trikdo dimerizaciją ir genų ekspresiją. (A) Struktūrinė schema, skirta funkciniam vertinimui pasirinkti SNP. (B) EMSA rs2097744 lokusui, kur mažas alelis visiškai sutrikdo dimerizaciją. (C) ChIP-seq histono ženklų profiliai rs2941742 lokuse įvairiose ląstelių linijose. (D) EMSA lygina rs2941742 pagrindinių ir mažesnių alelių dimerų susidarymą. (E) EMSA kooperatyvumo koeficientas D (vidurkis ± SD, n = 5). (F) Dvigubas luciferazės tyrimas naudojant išoriškai tiekiamą FOXA1 HCT116 ląstelėse, naudojant abu rs2941742 alelius (vidurkis ± SD, n = 5). (G) FOXA1 ChIP-seq profiliai iš kelių žmogaus vėžio ląstelių linijų rs5414555835 lokuse (alternatyvus to paties lokuso ID yra rs67668514). (H) EMSA, naudojantys pagrindinį ir mažąjį rs5414555835 alelį. I. Dviejų rs5414555835 lokuso alelių HCT116 ląstelėse dviejų luciferazės tyrimas. Užpildytos juostos skirtos išoriniam viso ilgio FOXA1 ir tuščios juostos pcDNA3 vektoriaus kontrolei (vidurkis ± SD, n = 3 biologiniai pakartojimai). P-vertės buvo apskaičiuotos naudojant nesuporuotą dviejų uodegų Studento vertes t-testas (**P< 0,01).

SNP ID. Vieta (hg38) . Genas . Ligos asociacija. Anotacija . Liuciferazė. GTEx .
. . . . . majoras . Nedidelis . eQTL .
rs2858870 chr6: 32604474 HLA-DRB1 Mazginė sklerozė Hodžkino limfoma Limfoblastoidinių ląstelių, kraujo ir gleivinių ląstelių promotorių histonų žymės, sustiprintojo histono žymės ir DNazės žymuo N
rs2097744 chr7: 118382988 LSM8, ANKRD7 Atsakas į chemoterapiją platinos pagrindu sergant nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu ++ ++ Y
rs767441 chr15: 48613619 FBN1 Krūties vėžys Adipocitų, raumenų ir plaučių ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės N
rs2104047 chr14: 68287700 RAD51B Pirminė tulžies cirozė Kraujo ląstelių, raumenų ląstelių, užkrūčio liaukos ir kraujodaros kamieninių ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ ++ N
rs2941742 chr6: 151691853 ESR1 Kaulų mineralinis tankis (klubo) Osteoblastų ląstelių, raumenų ląstelių, kraujo ląstelių ir kepenų ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ + N
rs541455835 (rs67668514 *) chr17: 46099939 KANSL1, MAPT Parkinsono liga Smegenų ląstelių, kepenų ląstelių ir kraujo ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ +++ Y
rs281038 chr5: 156653467 SGCD Antropometriniai bruožai Apyvarpės melanocitų pirminių ląstelių histono žymių stiprinimas + Y (rs157350)
rs6990531 chr8:80483511 ZBTB10 Valgymo sutrikimai Smegenų, raumenų ir kraujo ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės + ++ N
rs7697634 chr4: 17965123 LCORL Aukštis Kepenų histono ženklas ir kasos salelių histono ženklas ++ + Y
rs7957274 chr12: 21197462 SLCO1B1 kraujo metabolito matavimas ESC ir kraujo ląstelių skatinančios histono žymės ir sustiprinančios histono žymės + ++ N
rs11716984 chr3: 121643560 HCLS1 neuropsichologinis testas ESC, iPSC ir kraujo ląstelių skatintojo histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ Y
rs62288111 chr3: 190946175 SNAR-I, GMNC Alzheimerio liga Suaugusiųjų kepenų audinio promotoriaus histono žymė ir hESC išvestinių CD56+ ektoderminių ląstelių stiprintuvo histono žymė + ++ N
rs34466261 chr7: 104835293 LHFPL3 Nutukimas HUES48 ESC ląstelių stiprinimo histono ženklas + N
rs2149943 chr10:107811551 SORCS1 Prionų ligos ES-UCSF4 ląstelių ir kasos salelių histono ženklas ++ + N
rs7007731 chr8:76783496 ZFHX4 amžius menarche Mezenchiminių ląstelių histono ženklas ++ Y (rs4735738)
SNP ID. Vieta (hg38) . Genas . Ligos asociacija. Anotacija . Liuciferazė. GTEx .
. . . . . majoras . Nedidelis . eQTL .
rs2858870 chr6: 32604474 HLA-DRB1 Mazginė sklerozė Hodžkino limfoma Limfoblastoidinių ląstelių, kraujo ir gleivinių ląstelių promotorių histonų žymės, histono stiprinimo žymės ir DNazės žymuo N
rs2097744 chr7: 118382988 LSM8, ANKRD7 Atsakas į chemoterapiją platinos pagrindu sergant nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu ++ ++ Y
rs767441 chr15: 48613619 FBN1 Krūties vėžys Adipocitų, raumenų ir plaučių ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės N
rs2104047 chr14: 68287700 RAD51B Pirminė tulžies cirozė Kraujo ląstelių, raumenų ląstelių, užkrūčio liaukos ir kraujodaros kamieninių ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ ++ N
rs2941742 chr6: 151691853 ESR1 Kaulų mineralinis tankis (klubo) Osteoblastų ląstelių, raumenų ląstelių, kraujo ląstelių ir kepenų ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ + N
rs541455835 (rs67668514 *) chr17: 46099939 KANSL1, MAPT Parkinsono liga Smegenų ląstelių, kepenų ląstelių ir kraujo ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ +++ Y
rs281038 chr5: 156653467 SGCD Antropometriniai bruožai Apyvarpės melanocitų pirminių ląstelių histono žymių stiprinimas + Y (rs157350)
rs6990531 chr8:80483511 ZBTB10 Valgymo sutrikimai Smegenų, raumenų ir kraujo ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės + ++ N
rs7697634 chr4: 17965123 LCORL Aukštis Kepenų histono ženklas ir kasos salelių histono ženklas ++ + Y
rs7957274 chr12: 21197462 SLCO1B1 kraujo metabolito matavimas ESC ir kraujo ląstelių skatinančios histono žymės ir sustiprinančios histono žymės + ++ N
rs11716984 chr3: 121643560 HCLS1 neuropsichologinis testas ESC, iPSC ir kraujo ląstelių skatintojo histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ Y
rs62288111 chr3: 190946175 SNAR-I, GMNC Alzheimerio liga Suaugusiųjų kepenų audinio promotoriaus histono žymė ir hESC išvestinių CD56+ ektoderminių ląstelių stiprintuvo histono žymė + ++ N
rs34466261 chr7: 104835293 LHFPL3 Nutukimas HUES48 ESC ląstelių stiprinimo histono ženklas + N
rs2149943 chr10:107811551 SORCS1 Prionų ligos ES-UCSF4 ląstelių ir kasos salelių histono ženklas ++ + N
rs7007731 chr8:76783496 ZFHX4 amžius menarche Mezenchiminių ląstelių histono ženklas ++ Y (rs4735738)

15 SNP, kurie rodo alelinius skirtumus tarp homodimerinio FOXA1 prisijungimo prie vietų su DIV motyvais. „+“ rodo, kad luciferazės ekspresijos lygis padidėjo, palyginti su tuščiu vektoriumi, o „–“ reiškia, kad jis sumažėjo. žymi anksčiau naudotą alternatyvą

SNP ID. Vieta (hg38) . Genas . Ligos asociacija. Anotacija . Liuciferazė. GTEx .
. . . . . majoras . Nedidelis . eQTL .
rs2858870 chr6: 32604474 HLA-DRB1 Mazginė sklerozė Hodžkino limfoma Limfoblastoidinių ląstelių, kraujo ir gleivinių ląstelių promotorių histonų žymės, histono stiprinimo žymės ir DNazės žymuo N
rs2097744 chr7: 118382988 LSM8, ANKRD7 Atsakas į chemoterapiją platinos pagrindu sergant nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu ++ ++ Y
rs767441 chr15: 48613619 FBN1 Krūties vėžys Adipocitų, raumenų ir plaučių ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės N
rs2104047 chr14: 68287700 RAD51B Pirminė tulžies cirozė Kraujo ląstelių, raumenų ląstelių, užkrūčio liaukos ir kraujodaros kamieninių ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ ++ N
rs2941742 chr6: 151691853 ESR1 Kaulų mineralinis tankis (klubo) Osteoblastų ląstelių, raumenų ląstelių, kraujo ląstelių ir kepenų ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ + N
rs541455835 (rs67668514 *) chr17: 46099939 KANSL1, MAPT Parkinsono liga Smegenų ląstelių, kepenų ląstelių ir kraujo ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ +++ Y
rs281038 chr5: 156653467 SGCD Antropometriniai bruožai Apyvarpės melanocitų pirminių ląstelių histono žymių stiprinimas + Y (rs157350)
rs6990531 chr8:80483511 ZBTB10 Valgymo sutrikimai Smegenų, raumenų ir kraujo ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės + ++ N
rs7697634 chr4: 17965123 LCORL Aukštis Kepenų histono ženklas ir kasos salelių histono ženklas ++ + Y
rs7957274 chr12: 21197462 SLCO1B1 kraujo metabolito matavimas ESC ir kraujo ląstelių skatinančios histono žymės ir sustiprinančios histono žymės + ++ N
rs11716984 chr3: 121643560 HCLS1 neuropsichologinis testas ESC, iPSC ir kraujo ląstelių skatintojo histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ Y
rs62288111 chr3: 190946175 SNAR-I, GMNC Alzheimerio liga Suaugusiųjų kepenų audinio promotoriaus histono žymė ir hESC išvestinių CD56+ ektoderminių ląstelių histono stiprintuvo ženklas + ++ N
rs34466261 chr7: 104835293 LHFPL3 Nutukimas HUES48 ESC ląstelių stiprinimo histono ženklas + N
rs2149943 chr10:107811551 SORCS1 Prionų ligos ES-UCSF4 ląstelių ir kasos salelių histono ženklas ++ + N
rs7007731 chr8:76783496 ZFHX4 amžius menarche Mezenchiminių ląstelių histono ženklas ++ Y (rs4735738)
SNP ID. Vieta (hg38) . Genas . Ligos asociacija. Anotacija . Liuciferazė. GTEx .
. . . . . majoras . Nedidelis . eQTL .
rs2858870 chr6: 32604474 HLA-DRB1 Mazginė sklerozė Hodžkino limfoma Limfoblastoidinių ląstelių, kraujo ir gleivinių ląstelių promotorių histonų žymės, sustiprintojo histono žymės ir DNazės žymuo N
rs2097744 chr7: 118382988 LSM8, ANKRD7 Atsakas į chemoterapiją platinos pagrindu sergant nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu ++ ++ Y
rs767441 chr15: 48613619 FBN1 Krūties vėžys Adipocitų, raumenų ir plaučių ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės N
rs2104047 chr14: 68287700 RAD51B Pirminė tulžies cirozė Kraujo ląstelių, raumenų ląstelių, užkrūčio liaukos ir kraujodaros kamieninių ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ ++ N
rs2941742 chr6: 151691853 ESR1 Kaulų mineralinis tankis (klubo) Osteoblastų ląstelių, raumenų ląstelių, kraujo ląstelių ir kepenų ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ + N
rs541455835 (rs67668514 *) chr17: 46099939 KANSL1, MAPT Parkinsono liga Smegenų ląstelių, kepenų ląstelių ir kraujo ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ +++ Y
rs281038 chr5: 156653467 SGCD Antropometriniai bruožai Apyvarpės melanocitų pirminių ląstelių histono žymių stiprinimas + Y (rs157350)
rs6990531 chr8:80483511 ZBTB10 Valgymo sutrikimai Smegenų, raumenų ir kraujo ląstelių histono žymės ir sustiprinančios histono žymės + ++ N
rs7697634 chr4: 17965123 LCORL Aukštis Kepenų histono ženklas ir kasos salelių histono ženklas ++ + Y
rs7957274 chr12: 21197462 SLCO1B1 kraujo metabolito matavimas ESC ir kraujo ląstelių skatinančios histono žymės ir sustiprinančios histono žymės + ++ N
rs11716984 chr3: 121643560 HCLS1 neuropsichologinis testas ESC, iPSC ir kraujo ląstelių skatintojo histono žymės ir sustiprinančios histono žymės ++ Y
rs62288111 chr3: 190946175 SNAR-I, GMNC Alzheimerio liga Suaugusiųjų kepenų audinio promotoriaus histono žymė ir hESC išvestinių CD56+ ektoderminių ląstelių histono stiprintuvo ženklas + ++ N
rs34466261 chr7: 104835293 LHFPL3 Nutukimas HUES48 ESC ląstelių stiprinimo histono ženklas + N
rs2149943 chr10:107811551 SORCS1 Prionų ligos ES-UCSF4 ląstelių ir kasos salelių histono ženklas ++ + N
rs7007731 chr8:76783496 ZFHX4 amžius menarche Mezenchiminių ląstelių histono ženklas ++ Y (rs4735738)

15 SNP, kurie rodo alelinius skirtumus tarp homodimerinio FOXA1 prisijungimo prie vietų su DIV motyvais. „+“ rodo, kad luciferazės ekspresijos lygis padidėjo, palyginti su tuščiu vektoriumi, o „–“ reiškia, kad jis sumažėjo. žymi anksčiau naudotą alternatyvą

Mes ypač susidomėjome SNP rs2941742, esančiu introno regione ESR1 genas (6C pav.). Šis SNP susietas su regionu, kuriame yra stipriklio ženklas H3K27ac ir promotoriaus ženklas H3K4me3 osteoblastuose, taip pat H3K27ac žymės raumenų ir kaulų čiulpų ląstelėse (6C pav.). SNP rs2941742 yra LD su rs2941740 (r 2 = 0,98 Europos populiacijoje), susijęs su nenormaliu kaulų mineraliniu tankiu (KMT) – požymiu, naudojamu klinikoje osteoporozei diagnozuoti ir lūžių rizikai įvertinti (69). Įdomu, ESR1 yra genas, svarbus kaulų apykaitai, nes osteoporoze dažniausiai serga moterys po menopauzės, kurioms yra sumažėjęs jo aktyvuojančio ligando estrogeno kiekis (70). EMSA parodė, kad nedidelis alelis sumažino FOXA1 homodimerinį bendradarbiavimą iki rs2941742 lokuso 20 kartų, o monomerinis surišimas nebuvo paveiktas (6D ir E paveikslai). Be to, luciferazės tyrimai atskleidė sumažėjusį reporterio aktyvumą nepilnamečiui, palyginti su pagrindiniu aleliu, kuris priklauso nuo egzogeninio FOXA1 pridėjimo (6F pav.). Todėl galima manyti, kad FOXA1 dimerų ar susijusių šakutė Keičiasi RS2941742 lokuso TF ESR1 reguliuoti ir prisideda prie osteoporozės etiologijos.

rs5414555835 (taip pat pažymėtas ID rs67668514) susieja lokusą, susietą su FOXA1 įvairiose vėžio ląstelių linijose (6G pav.), ir rodo aktyvius histono ženklus kepenų ir smegenų ląstelėse (1 lentelė). Šis SNP yra LD su rs17577094 adresu r 2 = 0,97 Europos populiacijoje ir atitinka chr17q21,31/MAPT pranešta, kad lokusas (71) yra stipriai susijęs su Parkinsono liga (PD) (72). MAPT koduoja Tau baltymą, kurio dereguliavimas ir nenormalus sulankstymas yra pagrindinė ligos progresavimo priežastis. Įdomu tai, kad rs541455835 yra GTEx eQTL, susijęs su specifiniais alelio pokyčiais MAPT ekspresija įvairiuose audiniuose (papildomas paveikslas S6B). Be to, rs541455835 rodo didelį surišimo ir reporterio genų ekspresijos skirtumą alelio specifiniu ir nuo FOXA1 priklausomu būdu (6H ir I paveikslai). Pažymėtina, kad FOXA1 ir FOXA2 yra labai svarbūs suaugusiųjų dopaminerginių neuronų funkcijai (73). Pavyzdžiui, FOXA2 genų pristatymas pelės modelyje PD apsaugojo vidurinių smegenų dopaminerginius neuronus ir sumažino motorinius trūkumus (74). Todėl FOXA1/2 dimerizacijos moduliavimas ant MAPT lokusas gali trukdyti neuroprotekciniams FOXA1 / 2 vaidmenims ir prisidėti prie PD. Apskritai, 10 iš 15 patikrintų SNP (papildomas S6C paveikslas), iš kurių penki taip pat yra eQTL, pastebėjome reikšmingus reporterio ekspresijos skirtumus tarp pagrindinių ir mažųjų alelių sekų.


MEDŽIAGOS IR METODAI

Reagentai ir antikūnai

Žmogaus rekombinantinis EGF buvo nupirktas iš Boehringer-Mannheim Co. (Indianapolis, IN). Triušio anti-EGFR antikūnas, pelės anti-Cbl monokloninis antikūnas (mAb), triušio anti-hemagliutinino antikūnas, triušio anti-myc antikūnas ir triušio anti-signalinis keitiklis ir transkripcijos aktyvatorius (STAT) 5 buvo įsigyti iš Santa Cruz. Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Pelės anti-EGFR mAb (klonas LA1) buvo nupirktas iš Upstate Biotechnology Inc. (Charlottesville, VA), pelės anti-EGFR mAb (klonas EGFR.1) iš Neo Markers, krienų peroksidaze (HRP) konjuguotas ožkos antipelės imunoglobulinas G (IgG) ) iš Zymed Laboratories Inc. (San Franciskas, Kalifornija), HRP konjuguotas ožkų anti-triušio IgG iš Chemicon International Inc. (Temecula, CA), pelės antifosfotirozino mAb (6D12) iš MBL Co (Nagoja, Japonija) ir pelės anti-Flag mAb (M2) iš Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Triušio anti-mitogenu aktyvuota proteinkinazė (MAPK) ir fosfo-MAPK antikūnai buvo įsigyti iš New England Biolabs Inc. (Beverly, MA).

Plazmidžių konstrukcija

Plazmidė, koduojanti glutationą S-transferazės (GST) sulietas baltymas, turintis į EGF panašų proHB-EGF domeną, atitinkantį žmogaus proHB-EGF 106–149 aminorūgštis, buvo sukurtas įterpiant atitinkamas proHB-EGF cDNR sekas į EcoRI/BampGEX-3X plazmidės HI vietos (Pharmacia). Įterptas DNR fragmentas, koduojantis proHB-EGF, buvo pagamintas polimerazės grandininės reakcijos būdu, naudojant plazmidę pRTHG-1 (Mitamura ir kt., 1995) kaip šabloną. Gautas GST sulietas baltymas, vadinamas HB1, apima visą į EGF panašų domeną. Tada buvo pagamintas HB2, GST sulietas baltymas, turintis mutuotą į EGF panašų proHB-EGF domeną: koduojanti proHB-EGF cDNR seka buvo mutuota iš 379 CGGAAA į CTTTCA ir iš 388 AAG į GAC. Dėl šių pakeitimų aminorūgščių pakitimai iš 110 Arg-111 Lys į Leu-Ser ir 113 Lys į Asp. Gauto mutanto proHB-EGF, atitinkančio 106–149 aminorūgštis ir turinčio aukščiau nurodytus pakeitimus, cDNR buvo įterpta įEcoRI/BampGEX-3X plazmidės HI vietos. Sukonstruoti sutrumpinti EGFR mutantai: pRc/CMV-HA buvo sukonstruotas įterpiant DNR fragmentą, koduojantį HA žymės epitopą.XbaI vieta pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA). EGFR delecija buvo sukurta polimerazės grandinine reakcija naudojant pTJNEO-EGFR (Gotoh ir kt., 1992) kaip šablonas, o susintetinti produktai buvo įterpti tarp HindIII irXbaI vietos pRc/CMV-HA. Kiekvieno EGFR mutanto seka buvo patvirtinta sekos analize.

GST Fusion Protein valymas

GST sulieti baltymai buvo išgryninti glutationu Sepharose 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) pagal gamintojo instrukcijas. GST-HB1 ir GST-HB2, eliuuoti iš glutationo Sefarozės, buvo dializuojami prieš HEPES buferinį fiziologinį tirpalą (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2), kad būtų galima naudoti šiuose eksperimentuose. Baltymų koncentracija buvo nustatyta Bradfordo metodu, naudojant BSA kaip standartą.

Ląstelių kultūra ir transfekcija

Ba/F3 ląstelės buvo kultivuojamos RPMI 1640 terpėje, kurioje yra 10 % veršelio vaisiaus serumo (FCS) ir 5 % WEHI-3 ląstelėje kondicionuotos terpės kaip interleukino 3 (IL-3) šaltinis. Stabilūs Ba/F3 ląstelių, ekspresuojančių EGFR arba EGFR-EpoR, transformantai buvo gauti atrankos būdu terpėje, kurioje yra G418, kaip aprašyta anksčiau (Iwamoto ir kt., 1999). COS-7 ląstelės buvo palaikomos DMEM su 10% FCS. Kininio žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląstelės buvo kultivuojamos Ham's F12 terpėje su 10% FCS. Transfekcija buvo atlikta elektroporacijos būdu (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA) pagal gamintojo instrukcijas.

Gydymas EGF ligandais

Prieš kryžminio susiejimo ir koimunoprecipitacijos tyrimus nurodytos ląstelės buvo inkubuojamos su 100 nM EGF arba rekombinantinėmis HB-EGF formomis 3 minutes, plaunamos PBS ir vėliau naudojamos tolesnei analizei.

Cheminis kryžminis susiejimas

Cheminis kryžminis sujungimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau, su nedideliais pakeitimais (Iwamoto ir kt., 1994). Trumpai tariant, ląstelės buvo plaunamos PBS (137 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4) tris kartus ir 30 minučių inkubuojamas 4 °C temperatūroje su 1 mM ditiobis-(sulfosukcinimdilpropionatu) (DTSSP) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) PBS, po to tris kartus plaunamas Tris-buferiniu fiziologiniu tirpalu (TBS) ( 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7,5), prieš naudojant tolesniuose tyrimuose.

Imunoprecipitacija ir imunoblotingas

Ląstelės buvo lizuojamos 1% Triton X-100 lizės buferyje (0,15 M NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridas, 1 mM NaVO4, 50 mM Tris pH 7,5), tada centrifuguojamas 20 min 15 000 × g. Supernatantai buvo nuvalyti Sepharose 4B 1 valandą, o po to 2 valandas inkubuojami su pirminiu antikūnu, po to buvo pridėtas Sepharose 4B konjuguotas antrinis antikūnas. Sefarozės granulės tris kartus plaunamos lizės buferiu ir vieną kartą dejonizuotu vandeniu, o po to 5 minutes virinamos SDS-PAGE mėginio buferyje su 50 mM ditiotreitoliu arba be jo. Mėginiai buvo paleisti SDS-PAGE ir elektrotransliuoti į Immobilon membraną. Membrana buvo užblokuota 3% nugriebtu pienu TBS (20 mM Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,5) 37 ° C temperatūroje 1 valandą, po to 1 valandą inkubuojama su pirminiu antikūnu TBS, kuriame yra 1% nugriebto pieno, kambario temperatūroje. Tada membrana keturis kartus buvo plaunama TTBS (TBS, kurioje yra 0, 05% Tween 20), inkubuojama su HRP konjuguotu antriniu antikūnu ir galiausiai analizuojama naudojant ECL-Western blotting rinkinį (Amersham International plc, Bekingemšyras, Anglija).

DNR sintezės tyrimas

Ląstelės buvo pasėtos į 24 šulinėlių plokšteles, kurių tankis 5 × 104 ląstelės/šulinėlyje su kiekvienu EGF ligandu arba be jo šviežioje RPMI 1640 terpėje, turinčioje 10 % serumo, po to kultivuojamos 37 °C temperatūroje 24 valandas ir inkubuojamos su [ 3 H. ]timidino (37 kBq/ml) 4 val. Ląstelės buvo surinktos, o radioaktyvumas, įtrauktas į DNR, buvo nustatytas, kaip aprašyta anksčiau (Iwamotoir kt., 1999). DNR sintezės greitis buvo išreikštas procentais nuo didžiausios vertės vidurkio (40 000 cpm).

Fab fragmento paruošimas

Anti-EGFR mAb (EGFR.1), 1 mg/ml, buvo inkubuojamas su papainu (0,1 mg/ml) PBS 37 °C temperatūroje 18 valandų, tada buvo pridėta jodoacetamido (30 mM), kad sustabdytų reakciją. Mišinys buvo dializuojamas PBS 4 ° C temperatūroje 12 valandų, o po to išgrynintas ožkos antipelės IgG Fc antikūnu, konjuguotu su Sepharose 4B. Fab fragmento dydis buvo patikrintas SDS-PAGE, o Fab koncentracija buvo nustatyta matuojant absorbciją esant 280 nm.


Kokie yra karšto paleidimo technologijos pranašumai?

  • Neleidžia išplėsti pradmenų, kurie prisijungia prie mažos homologijos šablonų sekų (netinkamas pradėjimas)
  • Apsaugo nuo pradmenų išplėtimo, kad jie susijungtų vienas su kitu (susidarytų pradmenys-dimeriai) reakcijos nustatymo metu
  • Padidina norimų tikslinių fragmentų jautrumą ir išeigą
  • Įgalina PGR nustatymą didelio našumo arba automatizuotose skysčių tvarkymo platformose, nes reakcijos kambario temperatūroje yra stabilios, nepakenkiant specifiškumui

Dimeris

A dimeris yra molekulė, sudaryta iš dviejų tarpusavyje sujungtų subvienetų. Tai ypatingas polimero atvejis. Tarp labiausiai paplitusių dimeriss yra tam tikrų rūšių cukraus sacharozė, pavyzdžiui, yra a dimeris gliukozės molekulės ir fruktozės molekulės.

Gruntas dimeris
Peršokti į: navigaciją, paiešką
Gruntas dimeris (PD) yra galimas PGR, bendro biotechnologinio metodo, šalutinis produktas. Kaip rodo pavadinimas, PD susideda iš pradmenų molekulių, kurios prisijungė (hibridizavosi) viena prie kitos dėl papildančių bazių stygų pradmenyse.

Dimeriskaprolis
Dimeriskaprolis yra sintetinis junginys, gaminamas liuzitui (arseno pagrindu pagamintam cheminiam ginklui) ir apsinuodijimui sunkiaisiais metalais gydyti. DimerisPats kaprolis yra toksiškas vaistas, tačiau galima naudoti mažas terapines dozes.

ic /die-MARE-ick/ adj. Chemijoje, sudarytas iš dviejų dalių.
dimetilsulfatas (DMS) /die-METH-əl/ Bespalvis aliejinis skystis su svogūnų aromatu. Dažniausiai naudojamas kaip aminų, fenolių ir tiolių metilinimo reagentas.

Trans-dimerų sintezė
Procesas, leidžiantis įterpti nukleotidus priešais pirimidiną

. Kadangi šis procesas nėra pagrįstas papildomu bazių poravimu, gali būti įterptos netinkamos bazių poros, todėl gali atsirasti mutacija.

kaptopropanolis – priešnuodis apsinuodijus arsenitu, kuris reaguoja su sumažinta lipoine rūgštimi.
Grįžti į paieškos puslapį
Jei žinote kokių nors šiame žodyne praleistų terminų, kuriuos, jūsų nuomone, būtų naudinga įtraukti, atsiųskite išsamią informaciją į GenScript redakciją.

Suaktyvinimas suaktyvina tirozino kinazės sekciją receptoriuose, kurių kiekvienas prideda fosfato iš ATP į kito polipeptido tirozino uodegą.
Visiškai aktyvuoti receptorių baltymai aktyvuoja įvairius specifinius relinius baltymus, kurie jungiasi prie specifinių fosforilintų tirozino molekulių.

modelis.[35] Šiame modelyje buvo daroma prielaida, kad viena PrPSc molekulė jungiasi prie vienos PrPC molekulės ir katalizuoja jos konversiją į PrPSc.

s
Laimei, dauguma ląstelių gali atstatyti pažeistą DNR. Tai galima pasiekti dviem būdais: remonto fermentai, vadinami fotoliaze, gali nutraukti kovalentinį ryšį, naudodami šviesą kaip energijos šaltinį ryšiui skaidyti.

- DNR pažeidimo forma, atsirandanti dėl radiacijos. Gretimi timinai toje pačioje DNR grandinėje sudaro ryšį, dėl kurio susidaro tūrinis aduktas, kuris gali trukdyti DNR replikacijai.

ir, priklausomai nuo savo partnerio tapatybės, suaktyvins skirtingą genų rinkinį.

su kita etileno molekule, tada dvigubi anglies ryšiai toje etileno molekulėje nutrūksta ir susiraskite kitą etileno molekulę, su kuria sąveikautų ir sudarytų trimerį, arba trijų vienetų molekulę, ir taip toliau, kol susidaro labai ilgas polimeras.

Du iš monomerų vienetų sudaro ritę

Nukleotidų ekscizijos taisymas yra ypač svarbus koreguojant timiną

, du timino nukleotidai, esantys vienas šalia kito vienoje grandinėje, yra kovalentiškai sujungti vienas su kitu, o ne su viena kitą papildančiomis bazėmis.

Kinetiniai tyrimai parodė, kad EI veikia kaip a

, hidrolizuoti PEP į piruvatą ir neorganinį fosfatą, nors ir ne taip efektyviai kaip viso ilgio EI.

Leucino užtrauktuko baltymai DNR surišančių baltymų šeima, kuriai reikia a

dėl alfa spiralinės srities, kurioje leucino yra kas septintoje padėtyje. Nes 3.

domeną ir N-galinį DNR surišimą
domenas.
Cinko pirštas - konservuotas DNR surišimo motyvas, sudarytas iš sulankstytų baltymų domenų.

sudėtyje yra alfa ir beta tubulino). Mikrotubulai vaidina ląstelių dalijimąsi, jie yra blakstienų ir žvynelių komponentai, taip pat sudaro centrioles.
Citoskeletas ir ląstelių judėjimas – vaizdų įvairovė: mikrotubuliai tubulinas .

Cisteinas gali reaguoti su savimi, sudarydamas oksiduotą

Kai kuriose bendras struktūrinis motyvas

surišimo domeną ir N-galinį DNR surišantį domeną. (10-43 pav.)
leukemija
Baltųjų kraujo kūnelių ir jų pirmtakų vėžys.

Struktūrinis motyvas, žinomas kaip leucino užtrauktukas, susideda iš leucino pasikartojimo srities, kuri sudaro alfa spiralę su hidrofobine sritimi, atsakinga už

34 kD subvienetų. Suriša aktiną su maždaug 25M Kd.
Gauta iš ""
Reklamos užklausos .

Baltymai, kurie sudaro mikrotubulus, 55 kd α-tubulino (alfa-) ir β-tubulino (beta-) polipeptidai sudaro a

, kuris yra pagrindinis mikrotubulių subvienetas. Trečiojo tipo tubulino γ-tubulinas (gama-) yra centrosomoje. Citoskeletas 2 mikrovamzdeliai
naviko nekrozės faktorius
(naviko nekrozės faktorius, TNF).

Dominuojanti neigiama mutacija: (heterozigotinė) dominuojanti vieno alelio mutacija, blokuojanti laukinio tipo baltymo, vis dar koduojamo normalaus alelio (dažnai

su juo) sukeliantis funkcijos praradimo fenotipą. Fenotipo negalima atskirti nuo homozigotinės dominuojančios mutacijos.

Ekscizijos taisymas Priemonės, kuriomis ląstelės gali atitaisyti tam tikros rūšies pažeidimus (

pirimidinai) jų DNR.
sužadinimas Elektronų judėjimas, kurį sukelia šviesa, patekusi į chlorofilo molekulę.

[L. anglis, anglis + vanduo, vanduo]
Cukrus (monosacharidas) arba vienas iš jo

s (disacharidai) arba polimerai (polisacharidai).
anglies ciklas.

AP-1 iš tikrųjų yra c-fos baltymo ir c-jun baltymo kompleksas arba kartais yra tik c-jun.

s. AP-1 vietos konsensuso seka yra (C/G)TGACT(C/A)A. Taip pat žinomas kaip TPA atsako elementas (TRE). [TPA yra forbolio esteris, tetradekanoilforbolo acetatas, kuris yra cheminis naviko promotorius].

Mikrovamzdeliai yra maži tuščiaviduriai cilindrai (25 nm skersmens ir nuo 200 nm iki 25 ir 181 m ilgio). Šie mikrovamzdeliai sudaryti iš rutulinio baltymo tubulino. „Assembly“ sujungia dviejų tipų tubulinus (alfa ir beta).

s, kurios išsidėsto eilėmis.

taisantys fermentai, pavyzdžiui, ultravioletinė spinduliuotė gali padaryti žalą, nes dėl jos du gretimi DNR sekos timinai susijungia vienas su kitu, o ne susijungia su priešais esančiais adeninais, o tada, kai remonto fermentai išpjauna tuos du sujungtus timinai arba timinas


DISKUSIJA

Šiame tyrime mes parodome, kad FOXA1 gali sudaryti nuo DNR priklausomą homodimerį, esant palindrominiam DNR elementui su persidengiančiais puslankiais. Skirtingai nuo kai kurių kitų TF, tokių kaip SOX9, kurie sudaro dimerus ant lanksčiai išdėstytų kompozitinių elementų (39), FOXA1 dimerizacija priklauso nuo tikslaus atstumo tarp vietos. Įdomu tai, kad DIV motyvas taip pat buvo aptiktas, bet nepatvirtintas naudojant metil-SELEX su viso ilgio FOXA1 (33) ir didelio našumo SELEX (32) FOXC pošeimos nariams. Be to, pastebėjome, kad neseniai praneštoje DNR kristalinėje struktūroje su FOXO1 yra kristalografiškai sukrautų DNR spiralių išdėstymas, panašus į DIV konfigūraciją (papildomas S7 paveikslas) (75). Tačiau autoriai neišbandė kooperatyvo dimero susidarymo ant tokio elemento. Galiausiai, ChIP-egzonukleazės sekos tyrimai parodė, kad yra įvairių kompozito formų šakutė elementai. Pirma, buvo pranešta apie dvi sugrupuotas šakių galvučių vietas (vadinamas mesas), panašias į plačiai išdėstytą CON elementą (1A pav.) (31). Antra, DIV parašas buvo pastebėtas gliukokortikoidų receptorių (GR) ChIP-exo duomenyse, rodančiuose kooperatyvo surišimo parašus ir reiškiantį DIV vaidmenį GR įdarbinant chromatiną (30).Bendrai DIV motyvas galėtų būti plačiai naudojamas šakutė atpažinimo seka, svarbi TF už FOXA1 ribų. Dėl šios priežasties čia aprašyti dimerą modifikuojantys GWAS SNP gali sukelti jų fenotipines pasekmes, trikdydami bet kurios šalies reguliavimo programas. šakutė baltymas. SNP rs2941742 ir rs541455835 yra įdomiausi kandidatai į šakutė susijusios ligos mechanizmas. Jie lokalizuojasi į distalinį stipriklį ESR1 ir MAPT genų, kurie yra susiję atitinkamai su osteoporoze arba Parkinsono liga. Dėl rs2941742 [G] osteoporozės rizikos alelio beveik 100 kartų sumažėja FOXA1 homodimerų kooperatyvas ir sumažėja reporterio geno ekspresija. Nors, mūsų žiniomis, FOXA1 nebuvo susijęs su osteoporoze, FOXO grupė vaidina svarbų vaidmenį kaulų metabolizme, reguliuodama redokso pusiausvyrą, baltymų sintezę ir diferenciaciją osteoblastų linijoje (apžvelgta (76)). Panašiai rs541455835 rizikos aleliai skatina genų ekspresijos moduliavimą trikdydami FOXA1 homodimerizaciją. Keletas tyrimų parodė, kad originalūs GWAS SNP, susieti su dimerą modifikuojančiais SNP (rs2941740 rs2941742 rs17577094 rs67668514), buvo susiję su eQTL (77, 78). Svarbu tai, kad rs17577094 ne tik paveikia MAPT genų ekspresija smegenyse, bet ir kituose audiniuose, įskaitant krūtį, kur rs67668514 lokusas rodo stiprius FOXA1 ChIP-seq signalus. Mes taip pat nustatėme, kad rs767441 [C], kuris yra vienas iš su krūties vėžio rizika susijusių SNP, apie kuriuos pranešė Cowper-Sallari. ir kt (26), sunaikino dimerinį surišimą, nekeičiant afiniteto monomeriniam surišimui. Genomo redagavimo tyrimai suteikia galimybę patikrinti, ar tai trikdo šakutė DBD dimerizacija su liga susijusiuose lokusuose daro įtaką ligos progresavimui. Kartu su liga susijusių SNP identifikavimas reguliuojamuose genomo regionuose, kurie mažina FOXA1 dimerizaciją ir trikdo reporterio geno ekspresiją, patvirtina mūsų hipotezę, kad FOXA1 dimerizacija yra labai svarbi jos reguliavimo funkcijai ir prisideda prie ligos progresavimo.

Nors parodėme, kad FOXA1 / DIV konfigūracijos yra susietos su labai išreikštais genais, neatrodo, kad šie surišimo įvykiai veiktų kaip paprastas transkripcijos stiprintuvas. Atitinkamai, tiriamų SNP nedidelių alelių poveikis yra įvairus. Reporterio tyrimai parodė, kad nedidelių alelių buvimas gali sukelti padidėjusį, sumažintą arba nepakitusią ekspresijos lygį, palyginti su pagrindiniais aleliais (6E, F ir I pav.). Panašiai, kai lyginama eQTL ekspresija audiniuose, nedidelis alelis gali būti siejamas su padidėjusiu ekspresijos lygiu viename audinyje, bet su sumažėjusiu ekspresijos lygiu kitame (papildomas S6B paveikslas). Tai reiškia, kad FOXA1 / DIV kompleksų reguliavimo rezultatai priklauso nuo bendros sekos ir ląstelių konteksto. Pavyzdžiui, ar FOXA1 / DIV kompleksas įdarbina koaktyvatorius ar represorius, gali turėti įtakos periferinės sekos ir pasikeitimas iš vienos ląstelės į kitą. DIV sekų susiejimas su chromatino atvira ir uždara dinamika rodo FOXA1 / DIV komplekso vaidmenį chromatino remodeliavime. Svarbus klausimas yra tai, ar FOXA1 dimerų reguliavimo pasekmės DIV motyvams skiriasi nuo kitų konfigūracijų, tokių kaip monomerai, heterodimerai ar homodimerai CON sekose. Aišku, mes nustatėme stipriklius, kurių veikla priklauso nuo FOXA1 / DIV dimerų. Intriguojanti galimybė yra ta, kad DIV motyvas ne tik veikia įrišimo stiprumą ir dinamiką, bet ir turi kokybinį poveikį. Galimas mechanizmas yra tas, kad tik prisijungęs prie DIV sekų FOXA1 įdarbintų kofaktorių rinkinį, kuris savo ruožtu gali sukelti transaktyvaciją, chromatino kilpą arba epigenetinių ženklų nustatymą priklausomai nuo ląstelės tipo. Priešingai, alternatyvios FOXA1 konfigūracijos, sukeltos kitų DNR motyvų, gali sukelti skirtingus branduolinius procesus. Toks mechanizmas galėtų paaiškinti specifinę pagrindinių TF, tokių kaip FOXA1, veiklą, leidžiančią jiems reguliuoti skirtingus genų rinkinius daugelyje ląstelių ir skirtinguose vystymosi etapuose. Apskritai homodimerinis FOXA1 labai prisideda prie jo genomo surišimo kraštovaizdžio ir jo reguliavimo aktyvumo, greičiausiai darydamas įtaką chromatino dinamikai ir moduliuodamas jo sąveiką.