Informacija

2.3: Mikroskopijos instrumentai – biologija

2.3: Mikroskopijos instrumentai – biologija



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Įgūdžiai ugdytini

  • Nustatykite ir apibūdinkite šviesaus lauko mikroskopo dalis
  • Apskaičiuokite bendrą sudėtinio mikroskopo padidinimą
  • Apibūdinkite įvairių tipų šviesos mikroskopų, elektroninių mikroskopų ir skenuojančių zondų mikroskopų skiriamuosius bruožus ir tipinius naudojimo būdus.

Ankstyvieji mikroskopijos pradininkai atvėrė langą į nematomą mikroorganizmų pasaulį. Tačiau vėlesniais šimtmečiais mikroskopija toliau tobulėjo. 1830 m. Josephas Jacksonas Listeris sukūrė iš esmės modernų šviesos mikroskopą. XX amžiuje buvo sukurti mikroskopai, kurie panaudojo nematomą šviesą, pavyzdžiui, fluorescencinė mikroskopija, kurioje naudojamas ultravioletinės šviesos šaltinis, ir elektroninė mikroskopija, kuri naudoja trumpo bangos ilgio elektronų pluoštus. Dėl šios pažangos gerokai pagerėjo padidinimas, skiriamoji geba ir kontrastas. Palyginimui, palyginti elementarūs van Leeuwenhoeko ir jo amžininkų mikroskopai buvo daug mažiau galingi nei patys paprasčiausi šiandien naudojami mikroskopai. Šiame skyriuje apžvelgsime platų šiuolaikinių mikroskopinių technologijų spektrą ir įprastus kiekvieno tipo mikroskopo pritaikymus.

Šviesos mikroskopija

Daugelis mikroskopų tipų patenka į šviesos mikroskopų kategoriją, kurie naudoja šviesą vaizdams vizualizuoti. Šviesos mikroskopų pavyzdžiai yra šviesaus lauko mikroskopai, tamsaus lauko mikroskopai, fazinio kontrasto mikroskopai, diferencialiniai interferenciniai kontrastiniai mikroskopai, fluorescenciniai mikroskopai, konfokaliniai skenuojantys lazeriniai mikroskopai ir dviejų fotonų mikroskopai. Šie įvairių tipų šviesos mikroskopai gali būti naudojami vienas kitam papildyti atliekant diagnostiką ir tyrimus.

Brightfield mikroskopai

Ryškaus lauko mikroskopas, bene dažniausiai naudojamas mikroskopo tipas, yra sudėtinis mikroskopas su dviem ar daugiau lęšių, kurie sukuria tamsų vaizdą šviesiame fone. Kai kurie šviesaus lauko mikroskopai yra monokuliniai (turi vieną okuliarą), nors dauguma naujesnių šviesaus lauko mikroskopų yra žiūronai (turi du okuliarus), kaip parodyta paveikslėlyje (PageIndex{1}); bet kuriuo atveju kiekviename okuliare yra lęšis, vadinamas akies lęšiu. Akių lęšiai paprastai padidina vaizdą 10 kartų (10⨯). Kitame korpuso vamzdžio gale yra objektyvų rinkinys ant besisukančio antgalio. Šių objektyvų padidinimas paprastai svyruoja nuo 4⨯ iki 100⨯, o kiekvieno objektyvo padidinimas nurodytas ant metalinio objektyvo korpuso. Akių ir objektyvo lęšiai veikia kartu, kad sukurtų padidintą vaizdą. Bendras padidinimas yra akies padidinimo ir objektyvo padidinimo sandauga:

[ ekstas{okuliarinis padidinimas×objektyvus didinimas akies didinimas}; laikai; ekstas{objektyvus padidinimas}]

Pavyzdžiui, jei pasirinktas 40⨯ objektyvas, o akies lęšis yra 10⨯, bendras padidinimas būtų

(40×)(10×)=400×

Paveikslas (PageIndex{1}): Tipiško šviesaus lauko mikroskopo komponentai.

Tipiško šviesaus lauko mikroskopo komponentai.

Apžiūrima prekė vadinama pavyzdžiu. Mėginys dedamas ant stiklinio objektinio stiklelio, kuris po to užfiksuojamas ant mikroskopo scenos (platformos). Pritvirtinus stiklelį, ant stiklelio esantis mėginys uždedamas virš šviesos, naudojant x-y mechanines scenos rankenėles. Šios rankenėlės judina čiuožyklą ant scenos paviršiaus, bet nekelia ir nenuleidžia scenos. Kai bandinys yra centre virš šviesos, scenos padėtį galima pakelti arba nuleisti, kad vaizdas būtų sufokusuotas. Šiurkščiavilnių fokusavimo rankenėlė naudojama atliekant didelio masto judesius su 4⨯ ir 10⨯ objektyvais; smulkaus fokusavimo rankenėlė naudojama atliekant nedidelius judesius, ypač su 40⨯ arba 100⨯ objektyvais.

Padidinus vaizdus, ​​jie tampa blankesni, nes vaizdo ploto vienete yra mažiau šviesos. Todėl labai padidintus vaizdus, ​​gautus naudojant mikroskopus, reikia intensyvaus apšvietimo. Ryškaus lauko mikroskope šią šviesą suteikia apšvietimas, kuris paprastai yra didelio intensyvumo lemputė, esanti po scena. Šviesa iš iliuminatoriaus patenka į viršų per kondensatoriaus lęšį (esantį žemiau scenos), kuris sufokusuoja visus šviesos spindulius į bandinį, kad apšvietimas būtų kuo didesnis. Kondensatoriaus padėtį galima optimizuoti naudojant pritvirtintą kondensatoriaus fokusavimo rankenėlę; Nustačius optimalų atstumą, norint reguliuoti ryškumą, kondensatoriaus negalima judinti. Jei reikalingas mažesnis nei maksimalus šviesos lygis, į bandinį patenkančios šviesos kiekį galima lengvai reguliuoti atidarant arba uždarant diafragmą tarp kondensatoriaus ir bandinio. Kai kuriais atvejais ryškumą taip pat galima reguliuoti naudojant reostatą, šviesos reguliatoriaus jungiklį, kuris kontroliuoja apšvietimo intensyvumą.

Šviesaus lauko mikroskopas sukuria vaizdą nukreipdamas šviesą iš iliuminatoriaus į bandinį; šią šviesą skirtingai perduoda, sugeria, atspindi arba laužia skirtingos struktūros. Skirtingos spalvos gali elgtis skirtingai, nes sąveikauja su chromoforais (pigmentais, kurie sugeria ir atspindi tam tikro ilgio šviesą) bandinio dalyse. Dažnai chromoforai yra dirbtinai pridedami prie mėginio naudojant dėmes, kurios padeda padidinti kontrastą ir skiriamąją gebą. Apskritai bandinio struktūros įvairiu mastu atrodys tamsesnės nei šviesus fonas, sukuriant maksimaliai ryškius vaizdus, ​​kai padidinimas yra iki maždaug 1000⨯. Tolesnis padidinimas sukurtų didesnį vaizdą, bet be padidintos skiriamosios gebos. Tai leidžia mums pamatyti tokius mažus objektus kaip bakterijos, kurie matomi maždaug 400⨯ atstumu, bet ne mažesnius objektus, tokius kaip virusai.

Esant labai dideliam padidinimui, raiška gali būti pažeista, kai šviesa prasiskverbia pro nedidelį oro kiekį tarp bandinio ir objektyvo. Taip yra dėl didelio oro ir stiklo lūžio rodiklių skirtumo; oras išsklaido šviesos spindulius, kol objektyvas gali juos sufokusuoti. Norint išspręsti šią problemą, galima užpildyti tarpą tarp bandinio ir alyvos imersinio lęšio, specialaus lęšio, skirto naudoti su imersinėmis alyvomis, užpildyti alyvos lašą. Kadangi alyvos lūžio rodiklis labai panašus į stiklo, jis padidina didžiausią kampą, kuriuo šviesa, išeinanti iš bandinio, gali patekti į objektyvą. Tai padidina surenkamą šviesą, taigi ir vaizdo skiriamąją gebą ((PageIndex{2}) pav.). Įvairių tipų šviesai gali būti naudojami įvairūs aliejai.

Paveikslas (PageIndex{2}): a) Alyvos panardinimo lęšiai, tokie kaip šis, naudojami skyrai pagerinti. (b) Kadangi imersinės alyvos ir stiklo lūžio rodikliai yra labai panašūs, lūžis yra minimalus, kol šviesa pasiekia objektyvą. Be imersinės alyvos šviesa išsisklaido, kai ji praeina per orą virš skaidrės, todėl pablogėja vaizdo raiška.

Netgi labai galingas mikroskopas negali pateikti didelės raiškos vaizdų, jei jis nėra tinkamai išvalytas ir prižiūrimas. Kadangi lęšiai yra kruopščiai suprojektuoti ir pagaminti taip, kad laužytų šviesą labai tiksliai, net šiek tiek nešvarus ar subraižytas lęšis laužys šviesą neplanuotai ir pablogins bandinio vaizdą. Be to, mikroskopai yra gana subtilūs instrumentai, todėl reikia labai atsargiai nepažeisti dalių ir paviršių. Be kitų dalykų, tinkama mikroskopo priežiūra apima:

  • lęšių valymas lęšių popieriumi
  • neleisti lęšiams liestis su skaidrėmis (pvz., greitai keičiant židinį)
  • apsaugoti lemputę (jei tokia yra) nuo lūžių
  • nestumiant objektyvo į skaidrę
  • nenaudokite grubios fokusavimo rankenėlės, kai naudojate 40⨯ ar didesnius objektyvus
  • tik naudojant imersinę alyvą su specialiu alyvos objektyvu, paprastai 100⨯ objektyvu
  • imersinių lęšių valymas po mikroskopo naudojimo
  • nuvalykite bet kokią alyvą, netyčia patekusią iš kitų lęšių
  • uždengti mikroskopą arba padėti jį į spintelę, kai jis nenaudojamas

Darkfield mikroskopija

Tamsaus lauko mikroskopas yra šviesaus lauko mikroskopas, turintis nedidelę, bet reikšmingą kondensatoriaus modifikaciją. Nedidelis, nepermatomas diskas (apie 1 cm skersmens) dedamas tarp iliuminatoriaus ir kondensatoriaus lęšio. Šis nepermatomas šviesos sustojimas, kaip vadinamas diskas, blokuoja didžiąją dalį šviesos iš iliuminatoriaus, kai ji praeina per kondensatorių pakeliui į objektyvo lęšį ir sukuria tuščiavidurį šviesos kūgį, kuris sufokusuojamas ant bandinio. Vienintelė šviesa, pasiekianti objektyvą, yra šviesa, kuri buvo lūžusi arba atspindėta nuo bandinio struktūrų. Gautame vaizde paprastai rodomi šviesūs objektai tamsiame fone ((PageIndex{3}) pav.)

Paveikslas (PageIndex{3}): Tamsaus lauko vaizdui sukurti naudojamas nepermatomas šviesos stabdys, įdėtas į šviesaus lauko mikroskopą. Šviesos stabdiklis blokuoja šviesą, sklindančią tiesiai iš iliuminatoriaus į objektyvo lęšį, todėl į akį patenka tik nuo mėginio atsispindėjusi arba lūžusi šviesa.

Tamsaus lauko vaizdui sukurti naudojamas nepermatomas šviesos stabdys, įdėtas į šviesaus lauko mikroskopą. Šviesos stabdiklis blokuoja šviesą, sklindančią tiesiai iš iliuminatoriaus į objektyvo lęšį, todėl į akį patenka tik nuo mėginio atsispindėjusi arba lūžusi šviesa.

Tamsaus lauko mikroskopija dažnai gali sukurti didelio kontrasto, didelės skiriamosios gebos mėginių vaizdus nenaudojant dėmių, o tai ypač naudinga norint peržiūrėti gyvus egzempliorius, kuriuos dėmės gali nužudyti ar kitaip pažeisti. Pavyzdžiui, plonos spirochetos mėgsta Blyški treponema, sifilio sukėlėją, geriausiai galima apžiūrėti naudojant tamsaus lauko mikroskopą ((PageIndex{4}) pav.).

Paveikslas (PageIndex{4}): Tamsaus lauko mikroskopo naudojimas leidžia apžiūrėti gyvus, nedažytus spirochetos Treponema pallidum pavyzdžius. Panašiai kaip fotografinis negatyvas, tamsiame fone spirochetos atrodo ryškios. (kreditas: Ligų kontrolės ir prevencijos centrai)

Tamsaus lauko mikroskopo naudojimas leidžia apžiūrėti gyvus, nedažytus spirochetos pavyzdžius Blyški treponema. (kreditas: Ligų kontrolės ir prevencijos centrai / C. W. Hubbard)

Pratimas (PageIndex{1})

Nustatykite pagrindinius šviesaus ir tamsiojo lauko mikroskopijos skirtumus.

Žaizdų infekcijas, tokias kaip Cindy, gali sukelti daugybė skirtingų bakterijų tipų, kai kurios iš jų gali greitai plisti ir sukelti rimtų komplikacijų. Nustatyti konkrečią priežastį labai svarbu pasirinkti vaistus, kurie gali nužudyti arba sustabdyti bakterijų augimą.

Paskambinusi vietiniam gydytojui dėl Cindy atvejo, stovyklos slaugytoja siunčia mėginį iš žaizdos į artimiausią medicinos laboratoriją. Deja, kadangi stovykla yra atokioje vietovėje, artimiausia laboratorija nedidelė ir prastai įrengta. Šiuolaikiškesnė laboratorija greičiausiai naudotų kitus metodus bakterijoms kultivuoti, augti ir identifikuoti, tačiau tokiu atveju technikas nusprendžia iš mėginio padaryti šlapią laikiklį ir apžiūrėti jį šviesaus lauko mikroskopu. Naudojant šlapią laikiklį, į stiklelį įlašinamas nedidelis vandens lašas, o ant bandinio uždedamas dengiantis stiklelis, kad jis liktų vietoje, prieš padėdamas jį po objektyvo lęšiu.

Po šviesaus lauko mikroskopu technikas vos mato bakterijų ląsteles, nes jos yra beveik skaidrios šviesiame fone. Norėdami padidinti kontrastą, technikas virš apšvietimo įtaiso nepermatomą šviesos stabdiklį. Gautas tamsaus lauko vaizdas aiškiai rodo, kad bakterijų ląstelės yra sferinės ir sugrupuotos į grupes, kaip vynuogės.

  • Kodėl svarbu nustatyti mėginio ląstelių formą ir augimo modelius?
  • Kokie kiti mikroskopijos tipai galėtų būti efektyviai naudojami šiam mėginiui apžiūrėti?

Faziniai kontrastiniai mikroskopai

Fazinio kontrasto mikroskopai naudoja refrakciją ir trukdžius, kuriuos sukelia bandinio struktūros, kad būtų sukurti didelio kontrasto, didelės raiškos vaizdai be dėmių. Tai seniausias ir paprasčiausias mikroskopo tipas, kuris sukuria vaizdą keičiant pro bandinį sklindančių šviesos spindulių bangos ilgį. Norint sukurti pakitusio bangos ilgio kelius, kondensatoriuje naudojamas žiedinis stabdys. Žiedinis stabdys sukuria tuščiavidurį šviesos kūgį, kuris sufokusuojamas į bandinį prieš pasiekiant objektyvo lęšį. Objektyve yra fazinė plokštė su faziniu žiedu. Dėl to šviesa, sklindanti tiesiai iš iliuminatoriaus, praeina per fazės žiedą, o šviesa, lūžusi arba atspindėta bandinio, praeina per plokštelę. Dėl to per žiedą sklindančios bangos yra maždaug puse bangos ilgio, nesuderintos su tomis, kurios sklinda per plokštelę. Kadangi bangos turi smailes ir dugnelius, jos gali susidėti (jei fazėje yra kartu) arba panaikinti viena kitą (jei nefazė). Kai bangos ilgiai yra nefaziniai, bangų dugnai panaikins bangų smailes, o tai vadinama destruktyviais trukdžiais. Struktūros, laužančios šviesą, tada atrodo tamsios šviesiame tik nelūžusios šviesos fone. Apskritai, struktūros, kurios skiriasi tokiomis savybėmis kaip lūžio rodiklis, skirsis tamsumo lygiais ((PageIndex{5}) pav.).

Paveikslas (PageIndex{5}): Ši fazinio kontrasto mikroskopo diagrama iliustruoja fazių skirtumus tarp šviesos, praeinančios per objektą, ir fono. Šie skirtumai susidaro leidžiant spindulius per skirtingas fazinės plokštės dalis. Šviesos spinduliai yra uždėti vaizdo plokštumoje, todėl dėl jų trukdžių susidaro kontrastas.

Ši fazinio kontrasto mikroskopo diagrama iliustruoja fazių skirtumus tarp šviesos, praeinančios per objektą, ir fono. Šviesos spinduliai yra uždėti vaizdo plokštumoje, todėl dėl jų trukdžių susidaro kontrastas.

Kadangi tai padidina kontrastą nereikalaujant dėmių, fazinio kontrasto mikroskopija dažnai naudojama gyviems mėginiams stebėti. Tam tikros struktūros, tokios kaip organelės eukariotinėse ląstelėse ir endosporos prokariotinėse ląstelėse, ypač gerai vizualizuojamos naudojant fazinio kontrasto mikroskopiją ((PageIndex{6}) pav.).

Paveikslas (PageIndex{6}): Šiame paveiksle lyginamas šviesaus lauko vaizdas (kairėje) su tų pačių nedažytų paprastų plokščiųjų epitelio ląstelių fazinio kontrasto vaizdu (dešinėje). Ląstelės yra kiekvienos nuotraukos centre ir apačioje dešinėje (netaisyklingas elementas virš ląstelių yra neląstelinės šiukšlės). Atkreipkite dėmesį, kad nedažytos ląstelės šviesaus lauko vaizde fone beveik nematomos, o fazinio kontrasto vaizde esančios ląstelės fone šviečia ir atskleidžia daug daugiau detalių.

Šiame paveiksle lyginamas šviesaus lauko vaizdas (kairėje) su tų pačių nedažytų paprastų plokščiųjų epitelio ląstelių fazinio kontrasto vaizdu (dešinėje). Atkreipkite dėmesį, kad nedažytos ląstelės šviesaus lauko vaizde fone beveik nematomos, o fazinio kontrasto vaizde esančios ląstelės fone šviečia ir atskleidžia daug daugiau detalių. (kreditas: „Aiškiai kefyras“ / „Wikimedia Commons“)

Diferencialiniai interferenciniai kontrastiniai mikroskopai

Diferencialinio interferencinio kontrasto (DIC) mikroskopai (taip pat žinomi kaip Nomarski optika) yra panašūs į fazinio kontrasto mikroskopus, nes juose naudojami trukdžių modeliai, siekiant padidinti kontrastą tarp skirtingų bandinio savybių. DIC mikroskopu sukuriami du šviesos pluoštai, kuriuose bangų judėjimo (poliarizacijos) kryptis skiriasi. Kai pluoštai praeina per bandinį arba erdvę be bandinio, jie yra sujungiami ir dėl bandinių poveikio skiriasi trukdžių modeliai, atsirandantys sujungiant pluoštus. Dėl to gaunami didelio kontrasto trimačiai gyvų organizmų vaizdai. Šie mikroskopai ypač naudingi atskiriant gyvų, nedažytų mėginių struktūras. ((PageIndex{7}) pav.).

Paveikslas (PageIndex{7}): Fonsecaea pedrosoi DIC vaizdas, užaugintas ant modifikuoto Leoniano agaro. Šis grybelis sukelia chromoblastomikozę – lėtinę odos infekciją, paplitusią tropiniame ir subtropiniame klimate.

DIC vaizdas Fonsecaea pedrosoi auginami ant modifikuoto Leoniano agaro. Šis grybelis sukelia chromoblastomikozę – lėtinę odos infekciją, paplitusią tropiniame ir subtropiniame klimate.

Pratimas (PageIndex{2})

Kokie yra fazinio kontrasto ir DIC mikroskopijos pranašumai?

Fluorescenciniai mikroskopai

Fluorescencinis mikroskopas naudoja fluorescencinius chromoforus, vadinamus fluorochromais, kurie gali sugerti energiją iš šviesos šaltinio ir išspinduliuoti šią energiją kaip matomą šviesą. Fluorochromai apima natūraliai fluorescencines medžiagas (pvz., chlorofilus), taip pat fluorescencines dėmes, kurios pridedamos prie mėginio kontrastui sukurti. Dažai, tokie kaip Teksaso raudona ir FITC, yra fluorochromų pavyzdžiai. Kiti pavyzdžiai yra nukleorūgščių dažai 4’,6’-diamidino-2-fenilindolas (DAPI) ir akridino oranžinė spalva.

Mikroskopas bandinio link perduoda sužadinimo šviesą, paprastai trumpo bangos ilgio EMR formą, pvz., ultravioletinę arba mėlyną šviesą; chromoforai sugeria sužadinimo šviesą ir skleidžia matomą šviesą ilgesnio bangos ilgio. Tada sužadinimo šviesa išfiltruojama (iš dalies todėl, kad ultravioletinė šviesa kenkia akims), kad pro akies lęšį prasiskverbtų tik matoma šviesa. Taip gaunamas ryškių spalvų mėginio vaizdas tamsiame fone.

Fluorescenciniai mikroskopai ypač naudingi klinikinėje mikrobiologijoje. Jie gali būti naudojami patogenams nustatyti, tam tikroms rūšims aplinkoje arba tam tikrų molekulių ir struktūrų vietai ląstelėje rasti. Taip pat buvo sukurti metodai, skirti atskirti gyvas ląsteles nuo negyvų, naudojant fluorescencinę mikroskopiją pagal tai, ar jos sugeria tam tikrus fluorochromus. Kartais tam pačiam mėginiui naudojami keli fluorochromai, siekiant parodyti skirtingas struktūras ar savybes.

Vienas iš svarbiausių fluorescencinės mikroskopijos taikymo būdų yra metodas, vadinamas imunofluorescencija, kuris naudojamas identifikuoti tam tikrus ligas sukeliančius mikrobus, stebint, ar prie jų jungiasi antikūnai. (Antikūnai yra imuninės sistemos gaminamos baltymų molekulės, kurios prisijungia prie specifinių patogenų, kad juos nužudytų arba slopintų.) Yra du šio metodo būdai: tiesioginis imunofluorescencinis tyrimas (DFA) ir netiesioginis imunofluorescencinis tyrimas (IFA). DFA specifiniai antikūnai (pvz., tie, kurie nukreipti į pasiutligės virusą) yra nudažyti fluorochromu. Jei mėginyje yra tikslinis patogenas, fluorescenciniu mikroskopu galima stebėti, kaip antikūnai jungiasi prie patogeno. Tai vadinama pirminiu antikūnų dėme, nes nudažyti antikūnai tiesiogiai prisitvirtina prie patogeno.

IFA atveju antriniai antikūnai dažomi fluorochromu, o ne pirminiais antikūnais. Antriniai antikūnai tiesiogiai neprisijungia prie patogeno, tačiau prisijungia prie pirminių antikūnų. Kai nedažyti pirminiai antikūnai prisijungia prie patogeno, galima stebėti fluorescencinių antrinių antikūnų prisijungimą prie pirminių antikūnų. Taigi antriniai antikūnai yra netiesiogiai prijungti prie patogeno.Kadangi prie pirminio antikūno dažnai gali prisijungti keli antriniai antikūnai, IFA padidina fluorescencinių antikūnų, prijungtų prie mėginio, skaičių, todėl lengviau vizualizuoti mėginio ypatybes ((PageIndex{8}) pav.).

Paveikslas (PageIndex{8}): a) Neisseria gonorrhoeae, gonorėją sukeliančios bakterijos, vizualizavimui naudojama tiesioginė imunofluorescencinė dėmė. (b) Netiesioginis imunofluorescencinis dažymas naudojamas Schistosoma mansoni, parazitinio kirmino, sukeliančio šistosomiazę, tropikuose paplitusią žarnyno ligą, lervoms vizualizuoti. c) Tiesioginės imunofluorescencijos metu dėmę sugeria pirminis antikūnas, kuris jungiasi su antigenu. Esant netiesioginei imunofluorescencijai, dėmę sugeria antrinis antikūnas, kuris jungiasi su pirminiu antikūnu, kuris, savo ruožtu, jungiasi su antigenu. (a kreditas: Ligų kontrolės ir prevencijos centrų darbo pakeitimas; b kreditas: Ligų kontrolės ir prevencijos centrų darbo pakeitimas)

a) Vizualizavimui naudojama tiesioginė imunofluorescencinė dėmė Neisseria gonorrhoeae, bakterija, sukelianti gonorėją. b) lervoms vizualizuoti naudojamas netiesioginis imunofluorescencinis dažymas Schistosoma mansoni, parazitinis kirminas, sukeliantis šistosomiazę – tropikuose paplitusią žarnyno ligą. (a kreditas: Ligų kontrolės ir prevencijos centrų darbo pakeitimas; b kreditas: Ligų kontrolės ir prevencijos centrų darbo pakeitimas / dr. Sulzeris)

Pratimas (PageIndex{3})

Kodėl mėginiui tirti fluorescenciniu mikroskopu turi būti naudojami fluorochromai?

Konfokaliniai mikroskopai

Kitos šviesos mikroskopijos formos sukuria vaizdą, kuris yra maksimaliai sufokusuotas vienu atstumu nuo stebėtojo (gylio arba z plokštumos), o konfokalinis mikroskopas naudoja lazerį kelioms z plokštumoms iš eilės nuskaityti. Taip gaunama daug dvimačių didelės raiškos vaizdų įvairiuose gyliuose, kuriuos kompiuteriu galima sukurti į trimatį vaizdą. Kaip ir naudojant fluorescencinius mikroskopus, kontrastui ir skyrai padidinti paprastai naudojamos fluorescencinės dėmės. Vaizdo aiškumą dar labiau padidina siaura diafragma, kuri pašalina bet kokią šviesą, kuri nėra iš z plokštumos. Taigi konfokaliniai mikroskopai yra labai naudingi tiriant storus mėginius, pvz., bioplėveles, kurias galima ištirti gyvas ir nefiksuotas ((PageIndex{9}) pav.).

Paveikslas (PageIndex{9}): Konfokalinė mikroskopija gali būti naudojama struktūroms, tokioms kaip ši ant stogo esanti melsvadumblių bioplėvelė, vizualizuoti. (kreditas: Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo modifikavimas).

Konfokalinė mikroskopija gali būti naudojama struktūroms, tokioms kaip ši ant stogo esanti melsvadumblių bioplėvelė, vizualizuoti. (kreditas: Amerikos mikrobiologijos draugija)

Dviejų fotonų mikroskopai

Nors originalūs fluorescenciniai ir konfokaliniai mikroskopai leido geriau vizualizuoti unikalias mėginių savybes, vis tiek buvo problemų, kurios neleido optimaliai vizualizuoti. Veiksmingą fluorescencinės mikroskopijos jautrumą žiūrint storus mėginius paprastai ribojo nefokusuotas blyksnis, dėl kurio skyra buvo prasta. Šis apribojimas buvo labai sumažintas naudojant konfokalinį mikroskopą, naudojant konfokalinę skylutę, kad būtų atmesta nefokusuota fono fluorescencija su plonomis (<1 μm), neryškiomis optinėmis pjūviais. Tačiau net konfokaliniams mikroskopams trūko skiriamosios gebos, reikalingos storų audinių mėginiams peržiūrėti. Šios problemos buvo išspręstos sukūrus dviejų fotonų mikroskopą, kuriame mėginiams vizualizuoti naudojama skenavimo technika, fluorochromai ir ilgos bangos šviesa (pvz., infraraudonoji). Maža energija, susijusi su ilgos bangos ilgio šviesa, reiškia, kad du fotonai turi smogti į vietą tuo pačiu metu, kad sužadintų fluorochromą. Maža sužadinimo šviesos energija mažiau kenkia ląstelėms, o ilgas sužadinimo šviesos bangos ilgis lengviau prasiskverbia giliai į storus mėginius. Dėl to dviejų fotonų mikroskopas yra naudingas tiriant gyvas ląsteles nepažeistuose audiniuose – smegenų skilteles, embrionus, ištisus organus ir net ištisus gyvūnus.

Šiuo metu dviejų fotonų mikroskopai naudojami tik pažangiose klinikinėse ir tyrimų laboratorijose dėl didelių instrumentų sąnaudų. Vienas dviejų fotonų mikroskopas paprastai kainuoja nuo 300 000 iki 500 000 USD, o lazeriai, naudojami dažams, naudojamiems bandiniuose, taip pat yra labai brangūs. Tačiau tobulėjant technologijoms, dviejų fotonų mikroskopai gali tapti lengviau prieinami klinikinėje aplinkoje.

Pratimas (PageIndex{4})

Kokių tipų mėginius geriausia ištirti naudojant konfokalinę arba dviejų fotonų mikroskopiją?

Elektroninė mikroskopija

Maksimalią teorinę šviesos mikroskopų sukurtų vaizdų skiriamąją gebą galiausiai riboja matomos šviesos bangos ilgiai. Dauguma šviesos mikroskopų gali padidinti tik 1000⨯, o kai kurie gali padidinti iki 1500⨯, tačiau tai neprilygsta elektroninio mikroskopo (EM), kuris padidinimui padidinti naudoja trumpų bangų ilgio elektronų pluoštus, o ne šviesą. ir rezoliucija.

Elektronai, kaip ir elektromagnetinė spinduliuotė, gali veikti kaip bangos, tačiau 0,005 nm bangos ilgiai gali sukurti daug geresnę skiriamąją gebą nei matoma šviesa. EM gali sukurti ryškų vaizdą, kuris padidinamas iki 100 000⨯. Taigi, EM gali išspręsti tarpląstelines struktūras, taip pat kai kurias molekulines struktūras (pvz., atskiras DNR grandines); tačiau elektroninė mikroskopija negali būti naudojama gyvoms medžiagoms, nes mėginiams paruošti reikalingi metodai.

Yra du pagrindiniai EM tipai: perdavimo elektroninis mikroskopas (TEM) ir skenuojantis elektroninis mikroskopas (SEM) ((PageIndex{10}) pav.). TEM savo veikimo būdu yra šiek tiek analogiškas šviesaus lauko šviesos mikroskopui. Tačiau jis naudoja elektronų pluoštą iš virš bandinio, kuris sufokusuojamas naudojant magnetinį lęšį (o ne stiklinį lęšį) ir projektuojamas per bandinį į detektorių. Elektronai praeina pro mėginį, o detektorius užfiksuoja vaizdą ((PageIndex{11}) pav.).

Paveikslas (PageIndex{10}): a) Perdavimo elektronų mikroskopas (TEM). b) skenuojantis elektroninis mikroskopas (SEM). (a kreditas: „Deshi“ / Wikimedia Commons kūrinio modifikavimas; b kreditas: „ZEISS Microscopy“ / „Flickr“ kūrinio modifikavimas)

Paveikslas (PageIndex{11}): Elektroniniai mikroskopai naudoja magnetus, kad sufokusuotų elektronų pluoštus, panašiai kaip šviesos mikroskopai naudoja lęšius šviesai sufokusuoti.

Kad elektronai praeitų per bandinį TEM, mėginys turi būti itin plonas (20–100 nm storio). Vaizdas susidaro dėl skirtingo neskaidrumo įvairiose bandinio dalyse. Šį neskaidrumą galima padidinti nudažant bandinį tokiomis medžiagomis kaip sunkieji metalai, kurie yra elektronų tankūs. TEM reikalauja, kad spindulys ir mėginys būtų vakuume, o mėginys būtų labai plonas ir dehidratuotas. Konkretūs žingsniai, kurių reikia norint paruošti mėginį stebėjimui pagal EM, išsamiai aptariami kitame skyriuje.

SEM formuoja bandinių paviršių vaizdus, ​​dažniausiai iš elektronų, kuriuos nuo bandinių atmuša elektronų pluoštas. Taip galima sukurti labai detalius trimačius vaizdus, ​​kurie rodomi monitoriuje ((PageIndex{12}) pav.). Paprastai bandiniai džiovinami ir paruošiami naudojant fiksatorius, kurie sumažina artefaktus, pvz., susitraukimą, kuris gali atsirasti džiovinant, prieš padengiant juos plonu metalo, pavyzdžiui, aukso, sluoksniu. Kadangi transmisijos elektronų mikroskopija reikalauja labai plonų pjūvių ir leidžia matyti vidines struktūras, tokias kaip organelės ir membranų vidus, skenuojanti elektronų mikroskopija gali būti naudojama didesnių objektų (pvz., žiedadulkių) paviršiams apžiūrėti, taip pat labai maži pavyzdžiai ((PageIndex{13}) pav.). Kai kurie EM gali padidinti vaizdą iki 2 000 000⨯.1

Paveikslas (PageIndex{12}): Šiose scheminėse iliustracijose lyginami perdavimo elektronų mikroskopų ir skenuojamųjų elektroninių mikroskopų komponentai.

Paveikslas (PageIndex{13}): (a) Šis ląstelių TEM vaizdas bioplėvelėje rodo tiksliai apibrėžtas vidines ląstelių struktūras dėl skirtingo mėginio neskaidrumo. (b) Šis spalvomis patobulintas bakterijos Staphylococcus aureus SEM vaizdas iliustruoja skenuojančios elektroninės mikroskopijos gebėjimą pateikti trimačius ląstelių paviršiaus struktūros vaizdus. (a kreditas: Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo pakeitimas; b kreditas: Ligų kontrolės ir prevencijos centrų darbo pakeitimas)

Pratimas (PageIndex{5})

  1. Kokie yra elektroninės mikroskopijos, o ne šviesos mikroskopijos, privalumai ir trūkumai tiriant mikrobiologinius mėginius?
  2. Kokius mėginius geriausia ištirti naudojant TEM? SEM?

Mikroskopijos naudojimas bioplėvelėms tirti

Bioplėvelė yra sudėtinga vienos ar kelių mikroorganizmų rūšių bendruomenė, kuri paprastai susidaro kaip gleivėta danga, pritvirtinta prie paviršiaus, nes susidaro ekstrapolimerinė medžiaga (EPS), kuri prisitvirtina prie paviršiaus arba paviršių sąsajoje (pvz., tarp oro). ir vanduo). Gamtoje bioplėvelės yra gausios ir dažnai užima sudėtingas nišas ekosistemose ((PageIndex{14}) pav.). Medicinoje bioplėvelės gali padengti medicinos prietaisus ir egzistuoti organizme. Kadangi bioplėvelės pasižymi unikaliomis savybėmis, tokiomis kaip padidėjęs atsparumas imuninei sistemai ir antimikrobiniams vaistams, bioplėvelės yra ypač svarbios mikrobiologams ir gydytojams.

Kadangi bioplėvelės yra storos, jų negalima labai gerai stebėti naudojant šviesos mikroskopiją; bioplėvelės pjaustymas siekiant sukurti plonesnį mėginį gali nužudyti arba sutrikdyti mikrobų bendruomenę. Konfokalinė mikroskopija suteikia aiškesnius bioplėvelių vaizdus, ​​nes vienu metu galima sufokusuoti vieną z plokštumą ir gauti trimatį storo mėginio vaizdą. Fluorescenciniai dažai gali būti naudingi nustatant ląsteles matricoje. Be to, gali būti naudojami tokie metodai kaip imunofluorescencija ir fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH), kai fluorescenciniai zondai naudojami prisijungimui prie DNR.

Elektroninė mikroskopija gali būti naudojama stebėti bioplėveles, tačiau tik po mėginio dehidratacijos, dėl kurios susidaro nepageidaujami artefaktai ir iškreipiamas mėginys. Be šių metodų, naudojant fluorescencine danga padengtų granulių judėjimo vaizdo įrašą, galima stebėti vandens sroves per bioplėvelių formas (pvz., kūgius ir grybus) ((PageIndex{15}) pav.).

Paveikslas (PageIndex{14}): Bioplėvelė susidaro, kai vienos ar kelių rūšių planktoninės (laisvai plūduriuojančios) bakterijos prilimpa prie paviršiaus, gamina gleives ir sudaro koloniją. (kreditas: Viešoji mokslo biblioteka).

Paveikslas (PageIndex{15}): Šiame paveikslėlyje daugybė bakterijų rūšių auga nerūdijančio plieno bioplėvelėje (dažyta DAPI epifluorescencinei mikroskopijai). (kreditas: Ricardo Murga, Rodney Donlan).

Nuskaitymo zondo mikroskopija

Nuskaitymo zondo mikroskopas nenaudoja šviesos ar elektronų, o labai aštrių zondų, kurie perduodami per bandinio paviršių ir tiesiogiai su juo sąveikauja. Taip gaunama informacija, kurią galima sujungti į vaizdus su padidinimu iki 100 000 000⨯. Tokius didelius padidinimus galima naudoti atskiriems atomams ant paviršių stebėti. Iki šiol šie metodai pirmiausia buvo naudojami tyrimams, o ne diagnostikai.

Yra dviejų tipų nuskaitymo zondo mikroskopai: skenuojantis tunelinis mikroskopas (STM) ir atominės jėgos mikroskopas (AFM). STM naudoja zondą, kuris praleidžiamas tiesiai virš bandinio, nes nuolatinis įtampos poslinkis sukuria elektros srovės potencialą tarp zondo ir bandinio. Ši srovė atsiranda per kvantinį elektronų tuneliavimą tarp zondo ir bandinio, o srovės intensyvumas priklauso nuo atstumo tarp zondo ir bandinio. Zondas perkeliamas horizontaliai virš paviršiaus ir išmatuojamas srovės stiprumas. Skenuojanti tunelinė mikroskopija gali efektyviai atvaizduoti paviršių struktūrą tokia skiriamąja geba, kuria galima aptikti atskirus atomus.

Panašiai kaip STM, AFM turi ploną zondą, kuris praleidžiamas tiesiai virš bandinio. Tačiau užuot matęs srovės svyravimus pastoviame aukštyje virš bandinio, AFM nustato pastovią srovę ir matuoja zondo galiuko aukščio svyravimus, kai jis praeina virš bandinio. Kai zondo galas perkeliamas per bandinį, jėgos tarp atomų (van der Waals jėgos, kapiliarinės jėgos, cheminis ryšys, elektrostatinės jėgos ir kitos) priverčia jį judėti aukštyn ir žemyn. Zondo galiuko įlinkis nustatomas ir matuojamas naudojant Huko elastingumo dėsnį, o ši informacija naudojama bandinio paviršiaus vaizdams sudaryti su skiriamąja geba atominiu lygiu ((PageIndex{16}) pav.).

Paveikslas (PageIndex{16}): STM ir AFM leidžia žiūrėti vaizdus atominiu lygiu. (a) Šis gryno aukso paviršiaus STM vaizdas rodo atskirus aukso atomus, išdėstytus stulpeliais. (b) Šiame AFM vaizde pavaizduotos ilgos, į sruogą panašios nanoceliuliozės, laboratorijoje sukurtos medžiagos, gautos iš augalų pluoštų, molekulės. (kreditas a: „Erwinrossen“/Wikimedia Commons kūrinio modifikacija).

Pratimas (PageIndex{6})

  1. Kuris turi didesnį padidinimą, šviesos mikroskopą ar skenuojamojo zondo mikroskopą?
  2. Nurodykite vieną skenuojančio zondo mikroskopijos pranašumą ir apribojimą.

Paveikslas (PageIndex{17}): (kreditas „Brightfield“: Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo modifikavimas; kreditas „Darkfield“: Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo modifikavimas; kreditas „Fazinis kontrastas“: Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo modifikavimas; kreditas „DIC“: modifikavimas Amerikos mikrobiologijos draugijos darbas; kreditas „Fluorescence“: Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo modifikavimas; kreditas „Confocal“: Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo modifikavimas; kreditas „Two-photon“: Alberto Diaspro darbo modifikavimas, Paolo Bianchini, Giuseppe Vicidomini, Mario Faretta, Paola Ramoino, Cesare Usai).

Paveikslas (PageIndex{18}): (kreditas „TEM“: Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo pakeitimas; kreditas „SEM“: Amerikos mikrobiologijos draugijos darbo modifikavimas)

Paveikslas (PageIndex{19}): Mikroskopijos metodai zondo mikroskopams nuskaityti.

Pagrindinės sąvokos ir santrauka

  • Daugelio tipų mikroskopai naudoja įvairias technologijas mikrografams kurti. Dauguma jų yra naudingi tam tikro tipo mėginiams ar pritaikymui.
  • Šviesos mikroskopija naudoja lęšius, kad sufokusuotų šviesą į mėginį, kad būtų gautas vaizdas. Dažniausiai naudojami šviesos mikroskopai yra šviesaus lauko, tamsaus lauko, fazinio kontrasto, diferencinio interferencinio kontrasto, fluorescenciniai, konfokaliniai ir dviejų fotonų mikroskopai.
  • Elektronų mikroskopija sufokusuoja elektronus ant bandinio naudojant magnetus, todėl sukuriamas daug didesnis padidinimas nei šviesos mikroskopija. Transmisijos elektronų mikroskopas (TEM) ir skenuojantis elektroninis mikroskopas (SEM) yra dvi įprastos formos.
  • Nuskaitymo zondo mikroskopija sukuria dar didesnio padidinimo vaizdus, ​​​​matuojant grįžtamąjį ryšį iš aštrių zondų, kurie sąveikauja su bandiniu. Zondų mikroskopai apima skenuojantį tunelinį mikroskopą (STM) ir atominės jėgos mikroskopą (AFM).

Žodynėlis

atominės jėgos mikroskopas
skenuojantis zondo mikroskopas, kuriame naudojamas plonas zondas, praleidžiamas tiesiai virš bandinio, kad būtų galima išmatuoti jėgas tarp atomų ir zondo
žiūronas
turintis du okuliarus
šviesaus lauko mikroskopas
sudėtinis šviesos mikroskopas su dviem lęšiais; jis sukuria tamsų vaizdą šviesiame fone
grubi fokusavimo rankenėlė
mikroskopo rankenėlė, kuri atlieka santykinai didelius judesius fokusavimui reguliuoti
chromoforai
pigmentai, kurie sugeria ir atspindi tam tikrus šviesos bangos ilgius (suteikia jiems spalvą)
kondensatoriaus objektyvas
lęšis ant mikroskopo, kuris fokusuoja šviesą iš šviesos šaltinio į bandinį
konfokalinis mikroskopas
skenuojantis lazerinis mikroskopas, kuriame trimačiams vaizdams sukurti naudojami fluorescenciniai dažai ir sužadinimo lazeriai
tamsaus lauko mikroskopas
sudėtinis šviesos mikroskopas, sukuriantis ryškų vaizdą tamsiame fone; paprastai modifikuotas šviesaus lauko mikroskopas
diafragma
mikroskopo komponentas; paprastai susideda iš disko po scena su įvairaus dydžio skylutėmis; galima reguliuoti, kad daugiau ar mažiau šviesos iš šviesos šaltinio pasiektų bandinį
Diferencialinis interferencinis-kontrastinis mikroskopas
mikroskopas, kuris naudoja poliarizuotą šviesą kontrastui padidinti
elektroninis mikroskopas
mikroskopo tipas, kuris naudoja trumpų bangų elektronų pluoštus, o ne šviesą, kad padidintų padidinimą ir skiriamąją gebą
tiksli fokusavimo rankenėlė
mikroskopo rankenėlė, kuri atlieka palyginti nedidelius judesius fokusavimui reguliuoti
fluorescencinis mikroskopas
mikroskopas, kuriame kontrastui padidinti naudojami natūralūs fluorochromai arba fluorescencinės dėmės
fluorochromai
chromoforai, kurie fluorescuoja (sugeria ir skleidžia šviesą)
šviestuvas
šviesos šaltinis ant mikroskopo
imunofluorescencija
metodas, kai naudojamas fluorescencinis mikroskopas ir specifiniai antikūnams fluorochromai, siekiant nustatyti specifinių patogenų buvimą mėginyje
monokuliarinis
turintis vieną okuliarą
objektyvus
ant šviesos mikroskopo arčiausiai mėginio esantys lęšiai, paprastai esantys bokštelių galuose
akies lęšis
mikroskopu – arčiausiai akies esantis lęšis (taip pat vadinamas okuliaru)
panardinamasis lęšis
specialus objektyvas ant mikroskopo, skirtas naudoti su imersine alyva, siekiant pagerinti skiriamąją gebą
fazinio kontrasto mikroskopas
šviesos mikroskopas, kuriame naudojamas žiedinis atramas ir žiedinė plokštelė kontrastui padidinti
reostatas
pritemdymo jungiklis, valdantis apšviestuvo intensyvumą šviesos mikroskopu
skenuojantis elektroninis mikroskopas (SEM)
elektroninis mikroskopas, kuris atmuša elektronus nuo bandinio, sudarydamas paviršiaus vaizdą
skenuojančio zondo mikroskopas
mikroskopas, kuriame naudojamas zondas, sklindantis per bandinio paviršių pastoviu atstumu, o srovė, kuri yra jautri tarpo dydžiui, matuojama
skenuojantis tunelinis mikroskopas
mikroskopas, kuriame naudojamas zondas, praleidžiamas tiesiai virš bandinio, nes nuolatinis įtampos poslinkis sukuria elektros srovės potencialą tarp zondo ir bandinio
etapas
mikroskopo platforma, ant kurios dedami stikleliai
bendras padidinimas
šviesos mikroskopu yra vertė, apskaičiuojama padauginus akies padidinimą iš objektyvo lęšių padidinimo
perdavimo elektronų mikroskopas (TEM)
tam tikro tipo elektroninis mikroskopas, kuriame naudojamas elektronų pluoštas, sufokusuotas magnetais, kuris praeina per ploną bandinį
dviejų fotonų mikroskopas
mikroskopas, kuris naudoja ilgos bangos arba infraraudonųjų spindulių šviesą, kad fluorescuotų fluorochromus mėginyje
x-y mechaninės scenos rankenėlės
mikroskopo rankenėlės, naudojamos bandinio padėčiai ant scenos paviršiaus reguliuoti, paprastai siekiant jį centruoti tiesiai virš šviesos

Pagalbininkas

  • Nina Parker (Shenandoah universitetas), Markas Schneegurtas (Vičitos valstijos universitetas), Anh-Hue Thi Tu (Georgia Southwestern State University), Philipas Listeris (Centrinės Naujosios Meksikos bendruomenės koledžas) ir Brianas M.Forster (Saint Joseph's University) su daugeliu autorių. Originalus turinys per Openstax (CC BY 4.0; nemokama prieiga https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction)


Fluorescencinė mikroskopija, programos

Fluorescencinės mikroskopijos principai

Fluorescencinė mikroskopija yra metodas, kai fluorescencinės medžiagos tiriamos mikroskopu. Jis turi daug privalumų, palyginti su kitomis mikroskopijos formomis, pasižymintis dideliu jautrumu ir specifiškumu.

Atliekant fluorescencinę mikroskopiją, mėginys apšviečiamas (sužadinamas) santykinai trumpo bangos ilgio šviesa, dažniausiai mėlyna arba ultravioletine (UV). Mėginys tiriamas per barjerinį filtrą, kuris sugeria trumpos bangos šviesą, naudojamą apšvietimui, ir perduoda fluorescenciją, todėl ji matoma kaip šviesi tamsiame fone (1 pav.). Kadangi fluorescencija stebima kaip šviesumas tamsiame fone, fluorescencinės bandinio sudedamosios dalys gali būti matomos net labai mažais kiekiais. Yra keletas skirtingų fluorescencinės mikroskopijos režimų, iš kurių svarbiausia yra konfokalinė fluorescencinė mikroskopija.

Figūra 1 . Augalo stiebo pjūvio fluorescencinės mikrofotografijos, išpjautos išilgai (pagrindinis paveikslėlis) ir skersai (įdėtas, didesniu padidinimu). Audinys buvo nudažytas fluorochromu, anilino mėlyna spalva, kad būtų parodytas cukrui laidus audinys (floemas). Anilino mėlyna nudažo specializuotus ląstelių sienelių regionus. Intensyvi fluorescencija labiausiai pastebima pailgų ląstelių skersinėse (galinėse) sienelėse. Galinėse sienelėse yra porų, todėl tarp ląstelės į ląstelę vyksta tęstinumas, sudarydamos ištisinį vamzdelį, kuriame cukrus gali būti perkeltas žemyn augalu iš lapų. Vienos iš galinių sienelių vaizdas iš veido parodytas įdėkle. Aplink kiekvieną porą yra fluorescencinis žiedas. Taip pat yra daug mažesnio laipsnio fluorescencinis dažymas ant išilginių sienų. Tai supa poras, kurios leidžia cukrui transportuoti tarp gretimų vamzdelių. Anilino mėlynos dėmės 1 → 3β– gliukanai. Čia jis nudažo kaliozę, gliukaną, kuris nusėda, kad užkimštų poras, jei vamzdeliai būtų pažeisti, kaip ir perpjaunant audinį. Manoma, kad tai blokuoja nupjautą vamzdelių dalį, sumažindama cukraus praradimą iš nupjautų vamzdelių galų, taip pat gali sumažinti mikroorganizmų, kuriuos pritrauktų nutekėjęs cukrus, patekimą. Pagrindiniame paveikslėlyje pavaizduoti vamzdžiai yra 70 μm skersmens. Pagrindinės nuotraukos lauko dydis apytiksliai 500 × 1000 μm (0,5 × 1 mm), įdėklo maždaug 100 × 100 μm.

Nuotraukos suteiktos Naujojo Pietų Velso universiteto profesoriaus AE Ashfordo.

Daugumoje šiuolaikinių fluorescencinių mikroskopų naudojamas epi-apšvietimas. Tai reiškia, kad šviesa, naudojama sužadinimui, atsispindi ant bandinio per objektyvą, kuris veikia kaip kondensatorius. Nepermatomus ar labai storus objektus galima apžiūrėti naudojant epišvietimą, net ir gyvų žmonių odą.

Fluorescencinės mikroskopijos padėtis kitų metodų atžvilgiu apibendrinta 1 lentelėje. Įprasta, praleidžiamos šviesos, sugerties mikroskopija yra tinkama spalvotiems objektams, kurių dydis yra išskiriamas, ir instrumentiniu požiūriu yra paprasčiausia mikroskopijos forma. Bespalviai, skaidrūs objektai gali būti tiriami tik retardavimo metodais (poliarizacija, fazinis kontrastas, trukdžiai) šie metodai priklauso nuo fazių sulėtėjimo pavertimo akiai matomais intensyvumo pokyčiais. Išimtis yra tamsus apšvietimas, kuris gali atskleisti bespalvius skaidrius objektus atspindėdamas arba lūždamas skirtingų lūžio rodiklių sąsajose. Tamsaus pagrindo mikroskopija yra tinkama daugiausia kietosioms dalelėms ir (kaip ir fluorescencinė mikroskopija) gali atskleisti dalelių, per mažų, kad jas būtų galima atskirti, padėtis. Fluorescencinė mikroskopija savo taikymo srityje yra glaudžiai susijusi su perdavimo (absorbcijos) mikroskopija, tačiau turi ypatingų pranašumų: didelį jautrumą aptikti ir kiekybiškai nustatyti mažus fluorescencinių medžiagų ar mažų dalelių kiekius ir galimybę naudoti nepermatomuose objektuose. Kadangi fluorescencija apima dvi bangos ilgio juostas (sužadinimą ir emisiją), optinį specifiškumą galima žymiai padidinti kruopščiai parenkant filtrų derinius, kad būtų skatinamas tam tikro fluoroforo sužadinimas ir emisija, o šiuolaikiniai pokyčiai taip pat leidžia nustatyti fluorescencijos gyvavimo laiką.

1 lentelė. Fluorescencinės mikroskopijos pritaikomumas, palyginti su kitais metodais

Mikroskopijos tipas
PavyzdysFluorescencijaAbsorbcija (perdavimas)Atsilikimas (DIC, Pol ir kt.)Atspindys (įskaitant tamsią žemę)
SpalvotasTinkaTinkaNetinkamasTinka
SkaidrusNeįmanomasNeįmanomasTinkaNeįmanomas
NepermatomasTinkaNeįmanomasTinkaTinka
DinamiškasTinkaNeįmanomasNeįmanomasNeįmanomas
Dalelės žemiau skiriamosios gebos ribosTinkaNeįmanomasNetinkamasTinka

Absorbcinė mikroskopija yra įprastas skleidžiamos šviesos tipas. Sulėtėjimo mikroskopija apima Nomarski interferencinį kontrastą (DIC), fazės kontrastą ir poliarizaciją. Atspindžioji mikroskopija apima tamsų pagrindą.

Fluorescencinė mikroskopija dėl savo sudėtingumo suteikia daugiau sunkumų nei įprastai interpretuojant vaizdą. Veiksniai, galintys turėti įtakos vaizdo išvaizdai fluorescenciniame mikroskope, yra susiję su bandiniu, mikroskopo optine sistema (ypač filtrų deriniu) ir paties stebėtojo optinėmis bei neurologinėmis savybėmis. Visų pirma, siaurajuosčio barjerinio filtro naudojimas gali būti klaidinantis, nes viskas atrodo tam tikra spalva, o plataus dažnio arba ilgo (bangos ilgio) pralaidumo filtras leidžia atskirti skirtingas spalvas. Netgi fotografija, matyt, objektyvi, gali būti klaidinanti, jei interpretuojama neteisingai.

Dabartiniai galutiniai tekstai apie fluorescencinę mikroskopiją yra Rosto tekstai (žr. Tolesnį skaitymą). Taip pat yra keletas įvadinių kūrinių, pavyzdžiui, Abramowicziaus, ir didžiulė specializuota literatūra. Pagrindiniai tekstai apie konfokalinę fluorescencinę mikroskopiją yra Pawley ir Wilson.


USB kompiuteriniai mikroskopai, dar vadinami kompiuteriu arba prie kompiuterio prijungtais mikroskopais, jungiami prie kompiuterio ar televizoriaus USB prievado. Užuot žiūrėjęs okuliaru, žiūrovas tiria pavyzdį per kompiuterio monitorių arba televizoriaus ekraną, pavyzdžiui, internetinę kamerą su objektyvu. Dauguma šių mikroskopų yra nešiojami ir gali išsaugoti vaizdus kaip failus ar vaizdo įrašus. Tačiau dauguma jų turi tik žemą padidinimo lygį, todėl tinkamas apšvietimas gali būti problema.

Kišeniniai mikroskopai yra rankiniai, patvarūs ir naudingi lauko darbams. Dydžiai skiriasi, o kai kurie yra rašalo rašiklio dydžio. Dauguma naudoja natūralią šviesą arba yra maitinami baterijomis, padidinant 25–100 kartų. Nešiojamieji mikroskopai taip pat gali būti skaitmeniniai.


Mikroskopų istorija

1590: Du olandų akinių kūrėjai ir tėvo ir sūnaus komanda, Hansas ir Zachariasas Janssenai, sukurkite pirmąjį mikroskopą.

1667 m.: Robertas Hukasgarsus "Mikrografija" paskelbtas, kuriame aprašomi įvairūs Hooke'o tyrimai naudojant mikroskopą.

1675: Įeikite Antonas van Leeuwenhoekas, kuris naudojo mikroskopą su vienu lęšiu vabzdžiams ir kitiems egzemplioriams stebėti. Leeuwenhoekas pirmasis pastebėjo bakterijas. XVIII amžius: tobulėjant technologijoms, mikroskopija tapo populiaresnė tarp mokslininkų. Iš dalies tai lėmė atradimas, kad dviejų tipų stiklo derinimas sumažino chromatinį efektą.

1830 m.: Džozefas Džeksonas Listeris atranda, kad naudojant silpnus lęšius kartu įvairiais atstumais, gaunamas aiškus padidinimas.

1878: Išrado matematinę teoriją, siejančią skiriamąją gebą su šviesos bangos ilgiu Ernstas Abbe.

1903 m.: Richardas Zsigmondy iišrado ultramikroskopą, kuris leidžia stebėti bandinius, esančius žemiau šviesos bangos ilgio.

1932: Pirmą kartą naudojant tiriamos skaidrios biologinės medžiagos Fritsas Ksernikasfazinio kontrasto mikroskopo išradimas.

1938: Praėjus vos šešeriems metams po fazinio kontrasto mikroskopo išradimo, atsiranda elektroninis mikroskopas, kurį sukūrė Ernstas Ruska, kurie suprato, kad elektronų naudojimas mikroskopijoje padidino skiriamąją gebą.

1981: Išradus skenuojantį tunelinį mikroskopą galima gauti 3D mėginių vaizdus Gerdas Binnigas ir Heinrichas Rohreris.

Kilmė: Žodžio mikroskopas kilmė pagal internetinį etimologijos žodyną yra tokia: 1656 m., iš Mod.L. mikroskopinis, liet. „priemonė, skirta žiūrėti, kas maža“, iš Gk. mikro- (k.v.) + -skopinas. „žiūrėjimo priemonė“, iš skopein „pažiūrėk“. Mikroskopinis „minutės dydžio“ patvirtintas 1760 m.

Sudėtinio mikroskopo istorija

Kaip graikai turėjo visiškai veikiančią spinduliuojančią šildymo sistemą, kuri veikė prieš du tūkstančius metų prieš tokias, kurios tik dabar buvo pristatytos JAV, taip sudėtinio šviesos mikroskopo ištakos, atrodo, siejamos ne Olandijoje, Anglijoje ar Prancūzijoje, o Kinijoje, turbūt tinkama, atsižvelgiant į dabartinę Kinijos dominavimą tiekiant sudėtinius šviesos mikroskopus!

Vandens mikroskopas

Remiantis senovės kinų tekstu, kinai žiūrėjo padidintus egzempliorius per lęšį vamzdžio gale, kuris buvo pripildytas įvairaus vandens lygio, atsižvelgiant į norimą padidinimo laipsnį. Išradingas, efektyvus ir pakartojamas namuose šiandien. Gana nuostabu, kad tai įvyko maždaug prieš 4000 metų Čau-Fu dinastijoje ir daugiau nei 3500 metų iki „šiuolaikinės mikroskopijos tėvo“ gimimo.

Tai, kad šie Kinijos senovės žmonės pasiekė 150 kartų didinimo lygį, viršijantį šiandienos standartą, arba 100 moou, gniaužia kvapą. Atrodo, kad jie sukūrė miesto automobilį, kuris pasiekė Mach II. Jei jie ir pastatė tokį automobilį, jokia nuoroda į jį nebuvo rasta. Taip pat nėra jokios žinomos nuorodos į tokį sudėtinį mikroskopinį įrenginį, kol vėl negrįšime prie graikų.

Ne mažiau žmogus nei Aristotelis smulkiai aprašo mikroskopo veikimą. Graikai tikrai gerai naudojo lenktus lęšius, kurie yra esminis bet kurio stereo ar sudėtinio mikroskopo komponentas. Senovės Graikijos berniukai tikriausiai dalijosi kiekvienu amerikiečių berniuku, kaip pergalę naudojant lenktą lęšį arba didinamąjį stiklą, kad užkurtų ugnį. Tačiau graikai taip pat naudojo jį chirurginėms procedūroms, o ne skruzdėms, kaip įpratę daryti maži berniukai, o žmonėms – raupsų sukeltas žaizdas ir pažeidimus ir pan.

Senovės egiptiečiai ir romėnai taip pat naudojo įvairius lenktus lęšius, nors nuorodos į sudėtinį mikroskopą nerasta. Tačiau graikai mums davė žodį „mikroskopas“. Jis kilęs iš dviejų graikiškų žodžių „uikpos“, mažas ir „okottew“, vaizdas. Tačiau, nors senovės kinai, graikai ir romėnai visi taikė savo begalinę išmintį šiuo klausimu, nėra žinomos nuorodos nei į dirbtinės šviesos, nei apie kelių lęšių naudojimą. Kitaip tariant, galime labai dėkoti Seniesiems už jų įžvalgumą ir pasiekimus, tačiau turime ieškoti kitur, kad atskleistume pirmąjį šviesos ir sudėtinį mikroskopą.

Neįtikėtina, kad kitos istorinės nuorodos, susijusios su mikroskopais arba, tiksliau, optika, yra praėjus 1200 metų po Romos atleidimo, ir net tada kalbama tik apie lęšių naudojimą išrandant akinius. Kitaip tariant, kai kurie iš protingiausių planetos žmonių, kuriuos kada nors gamino, žaidė ir dirbo su atskirais objektyvais kelis tūkstančius metų, nesiimdami to toliau.

Akiniai

Tada, vos per keletą trumpų metų Toskanoje, Italijoje, du vyrai pareiškė, kad savarankiškai išrado akinius. Įkalčiai? Jų antkapiai! vienas, Salvano d'Aramento degli Amati mirė 1284 m. Florencijoje ir teigė, kad šį procesą laikė paslaptyje. Kitas, Alessandro della Spina mirė 1317 m. ir teigė atskleidęs savo procesą. Piza ir Florencija yra vos už kelių žingsnių. Sutapimas? Tu nuspręsk.

Bet kokiu atveju vietinis vienuolis, Girodina da Rivalta 1306 m. pasakė pamokslą, kuriame entuziastingai palaikė akinius kaip siaubingą išradimą ir praeityje nurodė, kad jie buvo naudojami apie 20 metų. Galiausiai, 1289 m., kitas vietos gyventojas iš Popozo šeima apgailestavo, kad „esu taip nusilpęs dėl amžiaus, kad be akinių, vadinamų akiniais, nebegalėčiau nei skaityti, nei rašyti“.

Teleskopai

Maždaug tuo pačiu metu atrodo, kad lęšiai buvo naudojami ankstyvuosiuose teleskopuose. XIII amžiuje anglas, Rogeris Baconas ilgai juos aptaria. Tiek akiniai, tiek mikroskopai yra svarbūs mikroskopams, nes jie atskleidė vis sudėtingesnį lęšių naudojimą – esminį bet kurio mikroskopo optinį komponentą.

Tada, praėjus vos 200–300 metų, randame daugybę nuorodų ir tvirtų įrodymų apie teleskopus ir mikroskopus. Atėjo Renesansas, o su juo – gausus meno ir mokslo žydėjimas. Svarbiausia, kad išradus spaudos rūdą, idėjas ir pokyčius būtų galima skleisti lengvai ir greitai. Kaip rezultatas, Tomas Digesas“ darbas su teleskopu Anglijoje XVI amžiaus viduryje ir Hansas Lippersheydarbai, įskaitant paraišką teleskopo patentui gauti, buvo perduoti kitiems, įskaitant ne mažiau genijus nei Galilėjus.

„Galileo“ iš karto pradėjo dirbti su objektyvais. Per trumpą laiką jis sukūrė patobulintą teleskopą su fokusavimo įtaisu ir toliau užkariavo žvaigždes. Be to, mes taip pat turėtume pagerbti Seras Izaokas Niutonas kuris maždaug tuo pačiu metu JK išrado atspindintį teleskopą.

Sudėtiniai mikroskopai

Bet kaip su mikroskopais?Na, tas pats Hansas Lippershey ir jo sūnus, Zacharijus Hanssenas eksperimentavo su įvairiais objektyvais. 1590-ųjų pabaigoje jie naudojo kelis lęšius vamzdyje ir nustebo pamatę, kad vamzdžio gale esantis objektas buvo žymiai padidintas, nei padidina padidinamasis stiklas. Jie ką tik išrado sudėtinį mikroskopą. Tai reiškia, kad jie atrado, kad vaizdas, padidintas vienu objektyvu, gali būti dar padidintas antruoju ar daugiau objektyvų.

Tada, XVII amžiaus viduryje, anglas, Robertas Hukas ir olandas, Anthony Van Leeuwenhoekas pakėlė mikroskopą į naujus lygius. Hukas buvo liguistas genijus, mėgęs eksperimentuoti. Jis tai padarė įvairiose mokslinių studijų srityse ir su vaisinga sėkme. Jis išrado universalųjį jungtį, rainelės diafragmą (kitą pagrindinį daugelio šiuolaikinių šviesos mikroskopų komponentą), respiratorių, inkaro ištraukimą ir laikrodžių balansavimo spyruoklę.

Jis taip pat parengė teisingą degimo teoriją ir sukūrė elastingumą apibūdinančią lygtį, kuri vis dar naudojama ("Huko dėsnis") ir išrado ar patobulino meteorologinius prietaisus, tokius kaip barometras, anemometras, higrometras ir pan. Tačiau labiausiai jis žinomas dėl Mikrografija, jo tyrimai su mikroskopu, paskelbti 1665 m. Mikrografija tapo vienu nakties sensacija ne tik dėl to, ką jis aprašė, bet ir dėl nuostabių piešinių, kuriuos jis padarė.

Jis aprašė naują pasaulį kartu su išskirtiniais dilgėlių, blusų ir, visų pirma, korio struktūros arba kamštienos „ląstelių“ piešiniais. Tai buvo Hooke'as, kuris sukūrė terminą „ląstelės“, apibūdindamas gyvus audinius. Įdomu tai, kad nors Hukas naudojo sudėtinį mikroskopą, jis pastebėjo, kad jis labai įtempė ir susilpnino jo regėjimą. Savo Micrographia jis norėjo naudoti paprastą, vieno lęšio mikroskopą, pagamintą iš aukso ir odos ir apšviestą žvake. Galbūt pirmasis šviesos mikroskopas?

Antonie van Leeuwenhoek - mikroskopo tėvas

Tačiau tai buvo Leeuwenhoek, kuris gyveno tuo pačiu metu kaip Hooke ir rėmėsi Hooke'o darbais, siekdamas pakelti mikroskopo dizainą į naujus rafinuotumo lygius. Kaip draperis, jis naudojo paprastą mikroskopą, kad ištirtų audinį. Kaip mokslininkas, siekdamas pagerinti optinę kokybę, jis pradėjo eksperimentuoti su naujais lęšių šlifavimo būdais. Iš viso jis nušlifavo apie 550 lęšių, kai kurių linijinis didinimo galia siekė 500, o skiriamoji geba – viena milijonoji colio – tai stulbinantis pasiekimas.

Leeuwenhoekas išsamiai išdėstė šiuos pasiekimus beveik 200 laiškų Karališkajai draugijai Londone, kur juos patvirtino ne mažesnis asmuo nei Robertas Hukas. Viso šio darbo rezultatas buvo paprastas, vieno lęšio, rankinis mikroskopas. Pavyzdys buvo sumontuotas ant rodyklės viršaus, virš kurio gulėjo išgaubtas lęšis, pritvirtintas prie metalinio laikiklio. Tada mėginys buvo peržiūrėtas per skylę kitoje mikroskopo pusėje ir buvo sufokusuotas naudojant varžtą.

Bene garsiausias jo eksperimentas įvyko 1674 m., kai jis žiūrėjo ežero vandenį:

„Dabar aš labai aiškiai pamačiau, kad tai buvo maži unguriai arba kirmėlės, gulintys visi susigūžę ir besisukantys taip, lyg matytum, suplika akimi, visas kubilas mažų ungurių ir vandens, su unguriais, besisukančiomis vienas su kitu, ir atrodė, kad visas vanduo buvo gyvas su šiais įvairiais gyvūnais.

Tai buvo man, tarp visų stebuklų, kuriuos atradau gamtoje, pats nuostabiausias iš visų ir, savo ruožtu, turiu pasakyti, kad mano akyse dar nėra buvę malonesnio vaizdo, kokį matė šie tūkstančiai gyvų būtybių. visi gyvi mažame vandens lašelyje, judėdami vienas tarp kito, kiekvienas sutvėrimas turi savo tinkamą judėjimą.

Jis atrado bakterijas. Jis buvo užsitarnavęs mikroskopo tėvo titulą. Įdomu tai, kad praėjo iki 1839 m., beveik po dviejų šimtų metų, kol ląstelės pagaliau buvo pripažintos pagrindiniais gyvybės vienetais.

XVIII/XIX a

Kitas svarbus žingsnis mikroskopo istorijoje įvyko dar po 100 metų, kai buvo išrastas achromatinis lęšis. Karolio salė, 1730 m. Jis išsiaiškino, kad naudodamas antrąjį skirtingos formos ir lūžio savybių lęšį, jis gali iš naujo suderinti spalvas su minimaliu poveikiu pirmojo objektyvo padidinimui.

Tada 1830 m. Josephas Listeris išsprendė sferinės aberacijos (šviesos posūkiai skirtingais kampais, priklausomai nuo to, kur jis patenka į objektyvą) problemą, pastatydamas objektyvus tiksliais atstumais vienas nuo kito. Kartu šie du atradimai žymiai pagerino vaizdo kokybę. Anksčiau dėl prastos stiklo kokybės ir netobulo lęšio mikroskopininkai žiūrėdavo tik iškraipytus vaizdus – panašiai kaip pirmieji radijo imtuvai buvo itin traškūs.

Verta prisiminti, kad iki šiol kiekvienas naujas žingsnis buvo susijęs su lęšių kokybe ar pritaikymu. Tada, 1863 m., vienas iš kelių naujų mikroskopų gamintojų Ernstas Leitzas bendrovė išsprendė mechaninę problemą, pristatydama pirmąjį besisukantį bokštelį su ne mažiau kaip penkiais tikslais.

Šis patobulinimas buvo greitai pasektas 1866 m., Kai Carl Zeiss įdarbintas Ernstas Abbe kaip jo tyrimų direktorius Zeiss Optical Works. Abbe išdėstė pagrindą, kuris taptų šiuolaikiniu kompiuterinės optikos kūrimo metodu. Jis aiškiai paaiškino skirtumą tarp padidinimo ir skiriamosios gebos ir kritikavo praktiką naudoti okuliarus su per dideliu padidinimu kaip „tuščią padidinimą“. Iki 1869 m. jo darbas sukūrė naują patentuotą apšvietimo įrenginį - Abbe kondensatorių.

Abbe kondensatorius: Abbe darbas su mikroskopinio vaizdo bangų teorija (Abbe Sine sąlyga) leido sukurti naują septyniolikos mikroskopo objektyvų diapazoną – trys iš jų buvo pirmieji panardinami objektyvai ir visi buvo sukurti remiantis matematiniu modeliavimu. Kaip pažymėjo Abbe, jo kūriniai buvo „pagrįsti tiksliu naudotų medžiagų tyrimu, atitinkami dizainai yra patikslinti apskaičiuojant iki paskutinės smulkmenos – kiekvieną lęšio kreivumą, storį, kiekvieną objektyvo diafragmą – kad bet koks bandymų ir klaidų metodas būtų tinkamas. neįtrauktas“.

Nuo šiol mikroskopai buvo sukurti remiantis patikimais fizikos dėsniais, o ne bandymais ir klaidomis, kurie apibūdino pradininkus. Tuo pat metu nemažai įmonių įkūrė specializuotas gamybos gamyklas, orientuotas į tiksliųjų mikroskopų gamybą. Tyrimai ir plėtra ir toliau davė vaisių.

1880 m. buvo pradėti naudoti pirmieji mikrotomai, kurie leido paruošti žymiai plonesnius mėginius, siekiant pagerinti mėginį. 1893 m. kitas Zeiss darbuotojas Augustas Kohleris sugalvojo neprilygstamą apšvietimo sistemą, kuri vis dar žinoma kaip Kohler apšvietimas. Naudodama dvigubas diafragmas, sistema suteikia tris vienodai apšviesto mėginio, ryškaus vaizdo ir minimalaus akinimo pranašumus. Kitaip tariant, Kohleris pasiekė beveik tobulą įvaizdį.

Masinė mikroskopų rinka atsirado tuo pačiu metu kaip tikslioji inžinerija, ir nenuostabu, kad buvo gauta daugybė stulbinančių rezultatų: 1879 m. Walteris Flemmingas atrado ląstelių mitozę ir chromosomas – pasiekimą, pripažintą vienu iš 100 svarbiausių mokslinių tyrimų. visų laikų pasiekimai.

20-asis amžius

XIX–XX amžių sandūroje Louisas Pasteuras išrado pasterizaciją Robertas Kochas atrado savo garsiuosius ar liūdnai pagarsėjusius postulatus: juodligės bacilą, tuberkuliozės bacilą ir choleros vibrio.

UV ir fazė: Iki 1900 m. buvo pasiekta teorinė regimosios šviesos mikroskopų skiriamosios gebos riba (2000 angstremų). 1904 m. Zeiss įveikė šį apribojimą pristatydamas pirmąjį komercinį UV mikroskopą, kurio skiriamoji geba yra dvigubai didesnė nei matomos šviesos mikroskopo. 1930 metais Fritzas Zernike atrado, kad gali matyti nedažytas ląsteles naudodamas spindulių fazės kampą. Zeisso atstumtas, jo fazinio kontrasto naujovė buvo pristatyta tik 1941 m., nors 1953 m. jis laimėjo Nobelio premiją už savo darbą.

Elektroniniai mikroskopai: 1931 metais Maksas Knollas ir Ernstas Ruska išrado pirmąjį elektroninį mikroskopą, kuris viršijo optinius šviesos apribojimus. Fizika diktuoja, kad šviesos mikroskopus apriboja šviesos fizika iki 500 arba 1000 kartų padidinimo ir 0,2 mikrometro skiriamosios gebos.

Knoll ir Ruska pastatė perdavimo elektronų mikroskopą (TEM) – tokį, kuris per bandinį perduoda elektronų spindulį (priešingai nei šviesą). Vėlesnė elektronų pluošto sąveika su bandiniu užfiksuojama ir paverčiama vaizdu. Tada, 1942 m., Ruska patobulino TEM, pastatydamas pirmąjį skenuojantį elektronų mikroskopą (SEM), kuris perduoda elektronų spindulį per bandinį.

Ruskos principai vis dar yra šiuolaikinių elektroninių mikroskopų pagrindas – mikroskopai, galintys pasiekti iki 2 milijonų kartų padidinimo lygį! Antroji svarbi mikroskopų raida XX amžiuje buvo masinės rinkos raida. Prasidėjusi XIX amžiuje, kai Leitzas teigė eksportavęs 50 000 mikroskopų į JAV, ši tendencija paspartėjo XX amžiuje. Dėl to atsirado daugybė gamintojų, siūlančių alternatyvas konkurencingesnėmis kainomis nusistovėjusioms Europos įmonėms, tokioms kaip Zeiss ir Leitz.

Kinija: Kinija tapo pagrindine kasdieniam naudojimui skirtų mikroskopų tiekėja ir, tobulėjant jų optinėms gamybos galimybėms, dabar tiekia optinius komponentus kai kuriems pagrindinių mikroskopų prekių ženklams. Ši rinkos tendencija turėjo teigiamą poveikį mikroskopų kainai, o tai leido mikroskopams išplisti už mokslininko veiklos ribų ir kasdieniniam komerciniam ir individualiam naudojimui.

Nauji šviesos šaltiniai – halogeninis, fluorescencinis ir LED – visi patobulino arba padidino šviesos mikroskopo universalumą, o atsiradus strėlės stovams, buvo atlikta daug komercinių patikrinimų, kurių negalima atlikti naudojant standartinį mikroskopo pagrindą. Tačiau naujausia naujovė buvo skaitmeninio mikroskopo atsiradimas.

Skaitmeniniai mikroskopai: Skaitmeniniai mikroskopai leidžia tiesiogiai perduoti vaizdą į televizoriaus ar kompiuterio ekraną ir padėjo pakeisti mikrofotografiją. Skaitmeniniai mikroskopai tiesiog integruoja skaitmeninio mikroskopo kamerą į standartinio mikroskopo trinokulinį prievadą. Alternatyvus ir lankstesnis sprendimas yra tiesiog uždėti skaitmeninio mikroskopo kamerą ant trinokulinio mikroskopo!

Dino-Lite: Viena originaliausių XXI amžiaus naujovių buvo Dino-Lite Digital mikroskopai. Dino-Lite yra rankiniai skaitmeniniai mikroskopai, ne daug didesni už storą rašiklį. Jie siūlo mažos galios priartinimo galimybę ir padidinimą iki 500 kartų. Jie turėjo didelį poveikį pramonės tikrinimo programoms.


Aberacija

Įvairios aberacijos turi įtakos vaizdo ryškumui arba kokybei. Chromatinės aberacijos sukuria spalvotus pakraščius apie didelio kontrasto vaizdo sritis, nes ilgesni šviesos bangos ilgiai (pvz., raudona) sufokusuojami šiek tiek toliau nuo objektyvo nei trumpesni bangos ilgiai (pvz., mėlyna). Sferinė aberacija sukuria vaizdą, kuriame matymo lauko centras yra sufokusuotas, kai periferijos gali nebūti, ir tai yra lęšių su sferiniais (o ne nesferiniais ar asferiniais) paviršiais naudojimo pasekmė. Iškraipymas sukuria išlenktus vaizdus iš tiesių objekto linijų. Matomo iškraipymo tipas ir laipsnis yra glaudžiai susiję su galima didintuvo sferine aberacija ir dažniausiai yra stipriausia naudojant didelės galios objektyvus.


Kaip veikia skenuojantis elektroninis mikroskopas

  • Elektronų šaltinis
  • Stulpeliu žemyn, kurie elektronai keliauja su elektromagnetiniais lęšiais
  • Elektronų detektorius
  • Mėginių kamera
  • Kompiuteris ir ekranas vaizdams peržiūrėti

Elektronai gaminami kolonėlės viršuje, pagreitinami žemyn ir praleidžiami per lęšių ir angų derinį, kad susidarytų sufokusuotas elektronų pluoštas, kuris atsitrenkia į mėginio paviršių. Mėginys montuojamas ant scenos kameros srityje ir, nebent mikroskopas suprojektuotas veikti esant žemam vakuumui, tiek kolonėlė, tiek kamera evakuojami siurblių deriniu. Vakuumo lygis priklausys nuo mikroskopo konstrukcijos.

Skenuojančio elektroninio mikroskopo schema

Elektronų pluošto padėtis ant mėginio kontroliuojama skenavimo ritėmis, esančiomis virš objektyvo. Šios ritės leidžia nuskaityti spindulį per mėginio paviršių. Šis pluošto rastravimas arba skenavimas, kaip rodo mikroskopo pavadinimas, leidžia surinkti informaciją apie apibrėžtą mėginio sritį. Dėl elektronų ir mėginių sąveikos susidaro daug signalų. Tada šiuos signalus aptinka atitinkami detektoriai.


ELEKTRONINIŲ MIKROSKOPŲ PASTEBĖJIMAI APIE SUBMIKROSKOPIJĄ TINKLINIŲ LAIDŲ ORGANIZAVIMĄ

Eduardo De Robertis ELEKTRONINIO MIKROSKOPO PASTEBĖJIMAI APIE SUBMIKROSKOPIJĄ TINKLINIŲ STRAIPSNIŲ ORGANIZAVIMĄ . J Biophys ir Biochem Cytol 1956 m. gegužės 25 d. 2 (3): 319–330. doi: https://doi.org/10.1083/jcb.2.3.319

Submikroskopinė triušio tinklainės lazdelių struktūra buvo ištirta naudojant didelės skiriamosios gebos elektroninę mikroskopiją plonu išilginiu ir skerspjūviu. Išorinis strypo segmentas susideda iš suplotų maišelių arba cisternų krūvos, kiekvieną iš jų riboja plona vienalytė maždaug 30 A membrana. Strypo maišelių membrana yra pritvirtinta prie paviršiaus membranos ir taip pat yra ištisinė su trumpais maždaug 30 A vamzdiniais koteliais. nuo 100 iki 150 A, kurie, matyt, baigiasi jungiamuoju ciliumu.

Gijų pluoštas, sudarantis ryšį tarp išorinio ir vidinio segmentų, yra aprašytas pavadinimu jungiantis ciliumas. Šio pluoštinio komponento struktūra yra labai panaši į ciliumo struktūrą. Jame pavaizduotos 9 poros maždaug 160 A skersmens periferinių gijų, matricos medžiaga ir paviršiaus membrana. Labai retai pastebimi du centriniai atskiri siūlai. Jungiamoji blakstiena turi tipišką bazinį korpusą vidiniame segmente, jo distalinis galas prasiskverbia į išorinį segmentą, kur sukuria tam tikrą struktūrinį ryšį su strypo maišeliais. Buvo tiriami jungiamojo blakstienų ryšiai ir submikroskopinė organizacija išilginiuose ir skersiniuose pjūviuose, einančiais skirtingais strypo segmentų lygiais.

Vidinis strypo segmentas rodo dvi skirtingas sritis: distalinę ir proksimalinę. Distalinis regionas, atitinkantis klasikinės histologijos elipsoidą, daugiausia susideda iš išilgai supakuotų mitochondrijų. Jame taip pat yra bazinis žievės kūnas, endoplazminio tinklo vakuolės, tankios dalelės ir tarpinė matrica su labai smulkiais siūlais.

Vidinio segmento proksimalinėje srityje trūksta mitochondrijų ir matricoje galima atpažinti Golgi komplekso elementus, endoplazminio tinklo vakuoles, tankias daleles ir daugybę 160–200 A skersmens neuroprotofibrilių, kurios surenka ir sudaro aiškus pluoštas prie strypo pluošto išėjimo.

Aptariamas jungiamųjų skaidulų, kaip blakstienų dalies, ir išorinio segmento kaip primityviojo žievės distalinės dalies diferenciacijos aiškinimas. Pabrėžiama išorinio segmento, jungiančio ciliumą ir vidinį segmentą paviršinių membranų tęstinumo svarba ir aptariamas galimas fiziologinis jos vaidmuo.


Mikroskopai

„Olympus“ yra pirmaujanti gyvosios gamtos mokslams ir pramonei skirtų mikroskopų gamintoja. Turėdami daugiau nei 100 metų patirtį kuriant mikroskopus, siūlome naujoviškus optinius sprendimus daugeliui pritaikymų. Naršykite mūsų mikroskopus, skirtus švietimui, mokymui, laboratorijoms ir pažangiems tyrimams gyvosios gamtos mokslų srityse, pvz., patologijos ir citologijos srityse. Peržiūrėkite mūsų naujausias lazerinio skenavimo, itin didelės raiškos, stereo, vertikalių, apverstų ir makro priartinimo mikroskopo sistemas spustelėdami toliau pateiktas nuorodas.


2.3: Mikroskopijos instrumentai – biologija

Mikroskopai yra prietaisai, skirti sukurti padidintus vaizdinius ar fotografinius objektus, per mažus, kad juos būtų galima pamatyti plika akimi. Mikroskopas turi atlikti tris užduotis: sukurti padidintą bandinio vaizdą, atskirti vaizdo detales ir padaryti detales matomas žmogaus akiai ar fotoaparatui. Šiai instrumentų grupei priskiriami ne tik kelių lęšių (sudėtiniai mikroskopai) dizainai su objektyvais ir kondensatoriais, bet ir labai paprasti vieno lęšio instrumentai, kurie dažnai laikomi rankoje, pavyzdžiui, lupa ar didinamasis stiklas.

1 paveiksle pavaizduotas mikroskopas yra paprastas sudėtinis mikroskopas, kurį 1660-aisiais išrado britų mikroskopas Robertas Hukas. Šis gražiai pagamintas mikroskopas turi objektyvo lęšį, esantį šalia mėginio, ir sufokusuojamas sukant mikroskopo korpusą, kad objektyvas būtų arčiau arba toliau nuo mėginio. Mikroskopo viršuje įkišamas okuliaro lęšis, o daugeliu atvejų cilindre yra vidinis „lauko lęšis“, kad padidėtų matymo laukas. 1 paveiksle pavaizduotas mikroskopas apšviečiamas per alyvos lempą ir vandens pripildytą sferinį rezervuarą, taip pat parodytą 1 paveiksle. Šviesa iš lempos išsklaidoma, kai ji praeina per rezervuarą, o tada sufokusuojama į bandinį su prie rezervuaro pritvirtintu lęšiu. . Šis ankstyvasis mikroskopas patyrė chromatinę (ir sferinę) aberaciją, o visuose baltoje šviesoje matomuose vaizduose buvo mėlynos arba raudonos spalvos „halos“.

Kadangi tiek daug mikroskopo naudotojų pasikliauja tiesioginiu stebėjimu, svarbu suprasti ryšį tarp mikroskopo ir akies. Mūsų akys gali atskirti spalvas matomoje spektro dalyje: nuo violetinės iki mėlynos iki žalios iki geltonos iki oranžinės iki raudonos akis negali suvokti ultravioletinių ar infraraudonųjų spindulių. Akis taip pat gali pajusti ryškumo ar intensyvumo skirtumus nuo juodos iki baltos ir visus pilkus atspalvius tarp jų. Taigi, kad vaizdas matytų akis, vaizdas turi būti pateikiamas akiai matomo spektro spalvomis ir (arba) įvairaus šviesos intensyvumo laipsniais. Tinklainės akių receptoriai, naudojami spalvai pajusti, yra kūginės ląstelės, ląstelės, skirtos atskirti intensyvumo lygius, o ne spalvą, yra lazdelės ląstelės. Šios ląstelės yra tinklainėje, akies vidinės dalies gale. Priekinė akies dalis (žr. 2 pav.), įskaitant rainelę, išlenktą rageną ir lęšį, yra atitinkamai šviesos patekimo ir jos fokusavimo tinklainėje mechanizmai.

Kad vaizdas būtų aiškiai matomas, jis turi plisti tinklainėje pakankamu regėjimo kampu. Jei šviesa nepatenka į negretimas tinklainės ląstelių eiles (atsižvelgiant į padidinimo ir vaizdo sklaidos funkciją), mes negalime atskirti arti gulinčių detalių kaip atskirų (išspręstų). Be to, turi būti pakankamai kontrasto tarp gretimų detalių ir (arba) fono, kad padidintas, išspręstas vaizdas būtų matomas.

Interaktyvi Java pamoka
Žmogaus akies pritaikymas Akies pritaikymas reiškia fiziologinį kristalinių lęšių elementų reguliavimo veiksmą, siekiant pakeisti lūžio jėgą ir sufokusuoti arčiau akies esančius objektus. Šioje pamokoje nagrinėjami lęšio struktūros pokyčiai, kai objektai perkeliami akies atžvilgiu.

Dėl riboto akies lęšiuko gebėjimo keisti formą, objektai, priartinti prie akies, negali būti nukreipti į tinklainę. Priimtas įprastas žiūrėjimo atstumas yra 10 colių arba 25 centimetrai.

Daugiau nei prieš penkis šimtus metų buvo sukurti paprasti stiklo didintuvai. Tai buvo išgaubti lęšiai (storesni centre nei periferija). Tada mėginys ar objektas gali būti sufokusuotas naudojant didintuvą, esantį tarp objekto ir akies. Šie „paprasti mikroskopai“ gali paskleisti vaizdą tinklainėje padidindami, padidindami tinklainės regėjimo kampą.

"Paprastas mikroskopas" arba didinamasis stiklas pasiekė aukščiausią tobulumo būseną 1600-aisiais, kai Antonas von Leeuwenhoekas sugebėjo pamatyti vienaląsčius gyvūnus (kuriuos jis pavadino "gyvūnais") ir net kai kurias didesnes bakterijas su paprastas mikroskopas, panašus į pavaizduotą 3 paveiksle. Tokio didintuvo sukurtas vaizdas, laikomas arti stebėtojo akies, atrodo taip, tarsi būtų toje pačioje objektyvo pusėje kaip ir pats objektas. Toks vaizdas, matomas tarsi dešimties colių atstumu nuo akies, yra žinomas kaip virtualus vaizdas ir negali būti užfiksuotas juostoje.

Maždaug 1600-ųjų pradžioje, atlikus darbus, priskirtus broliams Jansenams (žr. mikroskopą 4 paveiksle) Nyderlanduose ir Galileo Italijoje, buvo sukurtas sudėtinis mikroskopas. Paprasčiausia forma jį sudarė du nuosekliai išdėstyti išgaubti lęšiai: objekto stiklas (objektyvas) arčiau objekto arba mėginio ir okuliaras (okuliaras), esantis arčiau stebėtojo akies (su priemonėmis, leidžiančiomis reguliuoti bandinio padėtį ir mikroskopo lęšiai). Sudėtiniu mikroskopu pasiekiamas dviejų pakopų padidinimas. Objektyvas projektuoja padidintą vaizdą į mikroskopo korpuso vamzdelį, o okuliaras dar labiau padidina objektyvo projektuojamą vaizdą.

Sudėtiniams mikroskopams, sukurtiems XVII ir XVIII amžiuje, trukdė optinė aberacija (tiek chromatinė, tiek sferinė), o tai dar labiau pablogėja naudojant kelis lęšius. Dėl šių artefaktų šie mikroskopai iš tikrųjų buvo prastesni už to laikotarpio vieno lęšio mikroskopus. Jų sukurti vaizdai dažnai buvo neryškūs ir turėjo spalvingų aureolių, susijusių su chromatinėmis aberacijomis, kurios ne tik pablogina vaizdo kokybę, bet ir stabdo skiriamąją gebą. 1700-ųjų viduryje objektyvų gamintojai atrado, kad sujungus du stiklinius lęšius su skirtingomis spalvų dispersijomis, galima sumažinti arba visiškai panaikinti chromatinę aberaciją. Šis atradimas pirmą kartą buvo panaudotas teleskopuose, kurių lęšiai yra daug didesni nei mikroskopų. Tik 1800-ųjų pradžioje chromatiškai koreguoti lęšiai tapo įprasta sudėtiniuose mikroskopuose.

Interaktyvi pamoka
Praleidžiamos mikroskopinės šviesos keliai Ištirkite pagrindinius šviesos kelius per skleidžiamos šviesos mikroskopą.

XVIII ir XIX amžiuje labai pagerėjo sudėtinių mikroskopų mechaninė ir optinė kokybė. Staklių pažanga leido gaminti sudėtingesnes dalis, o iki XX a. amžiaus vidurio žalvaris buvo pasirinktas lydinys aukštos kokybės mikroskopams gaminti. Šiuo laikotarpiu klestėjo nemažai britų ir vokiečių mikroskopų gamintojų. Jų mikroskopų dizainas ir gamybos kokybė labai skyrėsi, tačiau bendrieji principai, apibrėžiantys jų optines savybes, išliko gana pastovūs. Mikroskopą, pavaizduotą 5 paveiksle, pagamino Hugh Powell ir Peter Lealand apie 1850 m. Trikojo pagrindas buvo tvirtas mikroskopo atrama, kurį daugelis žmonių laiko pažangiausiu savo laikotarpiu.

Iki XIX amžiaus pabaigos tarp mikroskopų gamintojų kilo didelė konkurencija, o mikroskopų kūrimo ir gamybos sąnaudos tapo svarbiu veiksniu. Žalvaris, medžiaga, kurią renkasi mikroskopų gamintojai, yra labai brangi, todėl apdirbti, poliruoti ir lakuoti mikroskopo korpusus ir kitas iš šio metalo apdirbtas dalis buvo ilga užduotis. Siekdami sumažinti išlaidas, mikroskopo gamintojai pirmiausia pradėjo dažyti išorinę mikroskopo korpuso ir stovo dalį, taip pat sceną ir kitas nejudančias dalis.

Dvidešimtojo amžiaus pirmąjį ketvirtį daugelis mikroskopų gamintojų mikroskopų rėmuose ir etapuose žalvarį pradėjo keisti ketaus. Geležis buvo daug pigesnė ir nudažyta juodai neatskirta nuo žalvario. Jie taip pat pradėjo galvanizuoti daugelį svarbių žalvario komponentų, tokių kaip rankenėlės, objektyvo vamzdžiai, antgaliai, okuliarai ir mechaniniai scenos mazgai (pavaizduota 6 paveiksle). Šie dvidešimtojo amžiaus pradžios mikroskopai vis dar turėjo bendrą dizaino motyvą. Jie buvo vienpusiai su apatiniu veidrodžiu, kuris buvo naudojamas su išorine lempa bandiniui apšviesti. Tipiškas to laikotarpio mikroskopas yra Zeiss Laboratory mikroskopas, pavaizduotas 6 paveiksle. Šio tipo mikroskopai yra labai funkcionalūs ir daugelis jų vis dar naudojami šiandien.

Šiuolaikiniai mikroskopai gerokai viršija projektavimo specifikacijas tų, kurie buvo pagaminti iki XX amžiaus XX amžiaus vidurio. Stiklo formulės yra labai patobulintos, leidžiančios geriau nei bet kada anksčiau ištaisyti optinę aberaciją, o sintetinės lęšių dangos, apsaugančios nuo akinimo, dabar yra labai pažangios. Integrinių grandynų technologija leido gamintojams gaminti „išmaniuosius“ mikroskopus, kurių mikroprocesorių į mikroskopo stovą įtaisyti.Mikrofotografija XX amžiaus pabaigoje yra paprastesnė nei bet kada anksčiau, naudojant pagalbinius priedus, kurie stebi šviesos intensyvumą, apskaičiuoja ekspoziciją pagal filmo greitį ir automatiškai atlieka sudėtingas užduotis, tokias kaip fotografavimas serijomis, daugkartinė ekspozicija ir fotografavimas su laiko intervalu.

Interaktyvi pamoka
Mikroskopo surinkimas Sužinokite, kaip įvairios dalys surenkamos į moderniausią mikroskopą naudodami šią mokymo programą.

7 paveiksle pavaizduotas mikroskopas yra Olympus Provis AX70 tiriamasis mikroskopas. Šis mikroskopas reprezentuoja naujausią moderniausią dizainą, apimantį kelis apšvietimus (episkopinius ir diaskopinius), analizatorius ir poliarizatorius, DIC prizmes, fluorescencinius priedus ir fazinio kontrasto galimybes. Fotomikrografijos sistema yra aukščiausios kokybės ir našumo, pasižyminti taškų matavimu, automatiniu ekspozicijos valdymu ir priartinimo didinimu, kad būtų galima lanksčiai ir lengvai kadruoti. Y formos rėmas sukurtas taip, kad būtų patogus naudoti, nes operatoriui būtų patogus ir patogus naudoti.

Ankstesnėje diskusijoje buvo aptarta pagrindinė samprata, kas yra mikroskopas, ir palietė sutrumpintą istoriją, prasidedančią XVII amžiuje ir besitęsiančią šiais laikais. Yra keletas papildomų temų, kurios yra nepaprastai svarbios norint visiškai suprasti mikroskopus ir mikroskopiją. Šios temos bus aptariamos tolesniuose pradmenų skyriuose.

Beveik kiekvienas žmogus vienu ar kitu metu yra matęs pasaulį pro optinį mikroskopą. Daugumai žmonių ši patirtis atsiranda per biologijos mokymus vidurinėje mokykloje ar kolegijoje, nors kai kurie mokslininkai verslininkai įsigijo savo mikroskopus atskirai arba kaip mokslo rinkinio dalį. Fotografija per mikroskopą arba, dažniau, fotomikrografija, jau seniai buvo naudinga priemonė mokslininkams. Daugelį metų biologijos ir medicinos mokslai labai rėmėsi mikroskopija, kad išspręstų problemas, susijusias su bendromis morfologinėmis mėginių savybėmis, taip pat kiekybine priemone specifinėms optinėms savybėms ir duomenims įrašyti. Šiuo atžvilgiu optinis mikroskopas pasirodė naudingas atliekant daugybę gyvenimo paslapčių tyrimų.

Interaktyvi pamoka
Atspindėtos mikroskopinės šviesos keliai Ištirkite pagrindinius šviesos kelius per atspindėtos (episkopinės) šviesos mikroskopą.

Visai neseniai mikroskopija sparčiai išaugo kaip fizinių ir medžiagų mokslų bei puslaidininkių pramonės įrankis, nes reikia stebėti naujų aukštųjų technologijų medžiagų ir integrinių grandynų paviršiaus ypatybes. Mikroskopija taip pat tampa svarbia priemone teismo medicinos mokslininkams, kurie nuolat tiria plaukus, pluoštus, drabužius, kraujo dėmes, kulkas ir kitus su nusikaltimais susijusius daiktus. Šiuolaikiniai fluorochromo dėmių ir monokloninių antikūnų metodų pažanga paskelbė apie staigų fluorescencinės mikroskopijos naudojimo biomedicininėje analizėje ir ląstelių biologijoje augimą.

Interaktyvi pamoka
Fluorescencinės mikroskopijos šviesos keliai Ištirkite atspindėtos šviesos kelius ir dichroinį filtravimą fluorescencinėje mikroskopijoje.

Pagrindiniai biomedicininės ir medžiagų mikroskopijos skirtumai yra tai, kaip mikroskopas projekuoja šviesą ant mėginio. Atliekant klasikinę biologinę mikroskopiją, paruošiami labai ploni mėginiai ir šviesa praleidžiama arba perduodama per mėginį, sufokusuojama su objektyvu, o po to perduodama į mikroskopo okuliarus. Norint stebėti integrinių grandynų paviršių (kurie apima šiuolaikinių kompiuterių vidinį veikimą), šviesa praeina pro objektyvą ir atsispindi nuo mėginio paviršiaus į mikroskopo objektyvą. Mokslinėje nomenklatūroje perduodamos ir atspindėtos šviesos mikroskopija atitinkamai vadinama diaskopine ir episkopine apšviesta mikroskopija. Mūsų nuotraukų galerijose esančios mikrofotografijos yra gautos iš perduodamų ir atspindėtų optinių mikroskopinių mokslinių tyrimų.

Viena iš rimčiausių mikroskopijos problemų yra prastas kontrastas, atsirandantis, kai šviesa praeina per labai plonus bandinius arba atsispindi nuo paviršių, turinčių didelį atspindžio laipsnį. Siekdami apeiti šį kontrasto trūkumą, mokslininkai ištobulino įvairius optinius „gudrybes“, kad padidintų kontrastą ir suteiktų egzempliorių spalvų variacijų. Mikroskopuotojo maišelio technikų asortimentas apima: poliarizuotą šviesą, fazinio kontrasto vaizdą, diferencinį interferencinį kontrastą, fluorescencinį apšvietimą, tamsaus lauko apšvietimą, Rheinbergo apšvietimą, Hoffmano moduliacijos kontrastą ir įvairių želatinos optinių filtrų naudojimą. Išsamus šių metodų aptarimas pateiktas šio grunto skyriuje Specializuotos mikroskopijos metodai. Nuorodos pateikiamos tiek klasikine bibliografine forma, tiek kaip interneto nuorodos mikroskopijos pradmenų priekiniame puslapyje. Jie turėtų padėti suinteresuotiems skaitytojams pateikti daugiau informacijos apie mikroskopiją ir fotomikrografiją, taip pat nuorodas į papildomą medžiagą žiniatinklyje.

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, Niujorkas, 11747.

Michaelas W. Davidsonas – Nacionalinė didelio magnetinio lauko laboratorija, 1800 East Paul Dirac Dr., Floridos valstijos universitetas, Talahasis, Florida, 32310.


2.3: Mikroskopijos instrumentai – biologija

ŠIAI LABORATORIJAI REIKALINGOS FORMOS

Daugumoje mokyklų randami modeliai naudoja sudėtinius lęšius ir šviesą, kad padidintų objektus. Lęšiai išlenkia arba laužia šviesą, todėl po jais esantis objektas atrodo arčiau.

Šis mikroskopas leidžia žiūronu (dviem akimis) matyti didesnius egzempliorius. (Šio puslapio viršuje esantis besisukantis mikroskopas yra stereoskopas)

Skenuojantis elektroninis mikroskopas (SEM)

Šis mikroskopas leidžia mokslininkams apžiūrėti per mažą visatą, kad ją būtų galima pamatyti šviesos mikroskopu. SEM nenaudoja šviesos bangų, jie naudoja elektronus (neigiamai įkrautas elektrines daleles), kad padidintų objektus iki dviejų milijonų kartų.

Transmisijos elektronų mikroskopas (TEM)

Šis mikroskopas taip pat naudoja elektronus, tačiau užuot nuskaitęs paviršių (kaip SEM), elektronai praleidžiami per labai plonus bandinius.

Mikroskopas šimtus metų buvo vienas iš pagrindinių biologo naudojamų instrumentų. Per pirmuosius du ar tris šimtmečius po jų išradimo šviesos mikroskopai buvo patobulinti. Tačiau nuo šimtmečio pradžios didelių patobulinimų nebuvo. Mėginių paruošimo ir analizės metodai buvo nuolat tobulinami. Taip pat buvo modifikuoti šviesos mikroskopai, leidžiantys naudoti naujus analizės metodus (fazinis kontrastas, fluorescencija, konfokalinis lazerinis skenavimas ir kt.) ir įdiegtas elektroninis mikroskopas, galintis perkelti mikroskopinę analizę į molekulinį lygį.

Pagrindinis mikroskopo tikslas yra padidinti ir padidinti mažo objekto matomumą. Ant jo visada išgraviruotas objektyvo padidinimas. Jūs naudosite sudėtinį mikroskopą, kuriame yra lęšių sistema. Iš viso
apimties padidinimas yra objektyvo lęšio ir okuliaro (arba akies lęšio) padidinimo rezultatas. Pavyzdžiui, naudojant mažos galios objektyvą (didinimas = 3,4X) ir standartinį okuliarą (didinimas = 10X), bendras padidinimas yra 34X.

Rezoliucija yra svarbi mikroskopo savybė. Optinės sistemos skiriamosios gebos riba yra mažiausias atstumas, per kurį du objektai gali būti atskirti ir vis tiek suvokiami kaip skirtingi. Du taškai, esantys arčiau šios ribos, bus laikomi vienu. Didesnė raiška leidžia ryškiau matyti objektą ir išskirti vidines detales.

Tinkamas apšvietimas leis jums gauti geriausią įmanomą skiriamąją gebą. Kiekvieną kartą keičiant objektyvą, reikia reguliuoti apšvietimą. Koregavimai, kurie turės įtakos jūsų mikroskopo apšvietimui, apima rainelės diafragmos pakeitimą. Rainelės diafragma naudojama siekiant suderinti diafragmą (angą) su objektyvo diafragma. Jis neturėtų būti naudojamas apšvietimo intensyvumui reguliuoti. Kai kurie nedažyti arba skaidrūs mėginiai gali prireikti šiek tiek uždaryti rainelę, kad pagerėtų kontrastas. Tai visada daroma sprendimo sąskaita. Per daug šviesos per diafragmą išplaus žiūrimą mėginį, kaip ir žiūrint objektą su ryškia šviesa fone.

1 ESKIAS
** Nubraižykite sudėtinio šviesos mikroskopo eskizą ir pažymėkite: E okuliaras, tikslas, scena,
Tikslus reguliavimas, grubus reguliavimas, diafragma

Žemiau esančioje nuorodoje galite sužinoti apie sudėtinio šviesos mikroskopo dalis. Tu darai ne turite pateikti viktorinos atsakymus kartu su savo laboratorijos ataskaita.

Alternatyvi nuoroda į Microcope vaizdo įrašą pateikta žemiau.


/>
1.10 pav
Alveolių ląstelių karcinoma

Jungtinėse Amerikos Valstijose plaučių vėžys yra pagrindinė vyrų ir moterų mirties nuo vėžio priežastis. Paprastai manoma, kad rūkomojo tabako populiarumas XX amžiuje yra susijęs su šios ligos paplitimu, nes cigaretės buvo susijusios su maždaug 90 procentų vyrų ir 80 procentų moterų plaučių vėžio atvejų. Tačiau atrodo, kad alveolinių ląstelių karcinoma nėra susijusi su rūkymu. Taip pat žinoma kaip bronchoalveolinė karcinoma, atrodo, kad alveolinių ląstelių karcinoma greičiausiai išsivystys asmenims, kurių plaučius randai randai dėl kitų ligų, tokių kaip sklerodermija, tuberkuliozė ar fibrozė. Šios rūšies karcinomos progresavimas gali būti labai lėtas, o šia liga sergantiems pacientams prognozė dažnai būna geresnė nei žmonėms, sergantiems kitų rūšių plaučių vėžiu. Peržiūrėkite aukščiau esantį mikroskopinį alvolinių ląstelių karcinomos vaizdą. Tamsesnės violetinės spalvos organelės, kurias matote atskirose ląstelėse, yra plaučių alveolinių ląstelių branduoliai. Normalūs branduoliai turi būti apvalios arba pailgos formos. Atkreipkite dėmesį, kad daugelis branduolių yra netinkamos formos (trikampiai arba kuboidiniai). Šie netinkamai suformuoti branduoliai rodo nenormalias karcinomos ląsteles. Spustelėkite toliau esančią nuorodą, kad pamatytumėte tą patį aukščiau esantį vaizdą su daugybe vėžio ląstelių, pažymėtų žaliai.

I) Bakterijos

Stebėkite šį paveikslėlį, kuriame iliustruojami trys skirtingi bakterijų tipai. Norėdami peržiūrėti kiekvienos iš trijų bakterijų formų mikroskopines skaidres, naudokite toliau pateiktas nuorodas.

2 ESKIAS
** Eskize nurodykite skirtingas bakterijų formas: Baccilus, Cocci, Spirillum

Baccilus (Laiko formos)

Cocci (Sferos formos)

Spirillum (spiralės formos)

II) Riebalinis audinys

Vaizdas dešinėje yra 100X mikroskopinis riebalinio audinio skerspjūvio vaizdas. Didelės baltos struktūros yra riebalinės (riebalinės) ląstelės. Mažesnės tamsiai raudonos struktūros yra atskirų ląstelių branduoliai.

3 ESKIAS
**Nubraižykite tik keletą langelių paveikslėlyje dešinėje. Tamsiai raudoni objektai, kuriuos matote, yra ląstelių branduoliai

Vaizdo įrašas, kuriame matyti 100 kartų mikroskopinis tvenkinio vandens lašo vaizdas. Norėdami peržiūrėti vaizdo įrašą, spustelėkite rodyklę.

Čia matomų organizmų įvairovė būtų būdinga daugumai gėlo vandens tvenkinių. Maži sferiniai organizmai, plūduriuojantys aplinkui, yra bakterijos. Dideli ir maži, greitai judantys, žali organizmai, kurie veržiasi aplinkui, yra parameciumas, mintantis bakterijomis. Skrybėlės formos organizmai yra sūkuriai, kurie vėl maitinasi bakterijomis. Tamsesnės žalsvai rudos masės yra bakterijų kolonijos ir dumbliai. Žalieji stačiakampiai organizmai yra žalieji dumbliai. Ilgos plonos sruogos, išsibarsčiusios visame mėginyje, yra melsvadumbliai.

Alternatyvią nuorodą galite rasti žemiau:

Kai kurie įdomūs filmai naudojant šviesos mikroskopiją

Spustelėkite toliau pateiktas nuorodas, kad pamatytumėte vandens lokį, judantį mikroskopine 250 kartų galia

Vandens lokys 1

Vandens lokys 2

Ameba praryja maisto produktą procese, vadinamame fagocitoze, padidindama 400 kartų

Pseudopodijos arba netikros pėdos išsiplečia ir atsitraukia, kai ši ameba juda per mikroskopo lauką padidindama 100 kartų

Iš arti ir asmeniškai pažiūrėkite į vidinį paramecio veikimą, padidinus 400 kartų

Plaukiančių paramečių (mažesnių organizmų) grupė, labiau panaši į krūvą su buferiniais automobiliais, kai jie susiduria ir atsimuša vienas nuo kito.

Mikroskopo naudojimas norint pamatyti skirtumus tarp normalių ir vėžinių ląstelių

1) Kokia yra diafragmos funkcija?
2) Apibūdinkite didžiausios skiriamosios gebos mikroskopo pranašumą.
3) Apskaičiuokite lęšių sistemos padidinimą:
a) Ocular-10X Objective-10X
b) Ocular-10X Objective-43X
c) Ocular-10X Objective-1X
d) Ocular-10X Objective-2X
4) Kokia yra svarbiausia mikroskopo savybė?

Spustelėkite čia, jei norite gauti MS WORD klausimų versiją

Spustelėkite čia, jei norite gauti klausimų PDF versiją

**Eikite į šią svetainę, kad pateiktumėte nuorodą į virtualų šviesos mikroskopą. Virtualaus mikroskopo svetainėje turėsite atlikti pamoką, kad išmoktumėte naudotis mikroskopu. Viršutiniame kairiajame kampe spustelėkite nuorodą PRADŽIA. Išmokę naudotis mikroskopu ir peržiūrėję mėginius, atsakykite į toliau pateiktus virtualios šviesos mikroskopijos klausimus.


VIRTUALUS ŠVIESOS MIKROSKOPAS

A) Atlikite mokymo programą (Pradžia), kad išmoktumėte naudotis mikroskopu
B)
Galima peržiūrėti keturias skaidres. Pasirinkite norėdami peržiūrėti skruostų tepinėlio skaidrė. Jei norite, galite peržiūrėti kitus, tačiau klausimai bus susiję tik su skruostų tepinėlio skaidrė.
C) Naudosite 10X, 40X ir 100X objektyvo galias
D) Norėdami geriau matyti skruostų ląsteles, naudokite fokusavimo ir apšvietimo slankiojančias juostas.
E) Atsakyti Virtualios šviesos mikroskopijos klausimai pateikta žemiau.

Galite naudoti toliau pateiktą puslapio nuorodą, kad pasiektumėte pažymėtą mikroskopo vaizdą

1) Kiek atskirų langelių galite suskaičiuoti esant toliau nurodytoms objektyvo didinimo galioms?
a) 10X
b) 40X
c) 100X
2)
Jei okuliaro galia yra 10 kartų, koks yra bendras padidinimas, kai stebite ląsteles, kai objektyvo galia yra 40 kartų?
3)
Kokia galia jūs galite atskirti ląstelių branduolį? (Branduolys yra didelė, tamsesnė organelė, esanti netoli ląstelės centro)
4)
Apibūdinkite, kas atsitiks, jei bus per daug apšvietimo.

Spustelėkite čia, jei norite gauti MS WORD klausimų versiją

Spustelėkite čia, jei norite gauti klausimų PDF versiją

Žemiau rasite nuorodas į kitas virtualios šviesos mikroskopijos svetaines

Per pastarąjį pusę amžiaus buvo sukurti dviejų tipų elektroniniai mikroskopai: transmisijos elektroninis mikroskopas (TEM) ir elektroninis elektroninis mikroskopas (SEM). Šiuose instrumentuose yra magnetiniai lęšiai, kurie sufokusuoja elektronų spindulį į mėginį. Šiuo būdu naudojami elektronai sukuria bangos ilgį, kuris gali būti 100 000 kartų trumpesnis nei matomos šviesos. Dėl to elektroninių mikroskopų skiriamoji geba yra net 400 kartų didesnė nei šviesos mikroskopų ir 200 000 kartų didesnė nei žmogaus akies.

TEM bombarduoja ploną bandinį elektronais. Priklausomai nuo jų sudėties, bandinio komponentai elektronus perduoda, sugeria arba nukreipia. Fotografinėje plokštelėje sukurtas vaizdas yra vizualinis šios elektronų sąveikos su bandiniu vertimas. Perdavimo elektroninis mikroskopas leido mokslininkams pirmą kartą pažvelgti į virusų pasaulį, nematomą šviesos mikroskopu, ir šiandien leidžia mums pamatyti molekules ir atomus.

SEM labai skiriasi nuo TEM. Jis skirtas trimačiams paviršiaus detalių vaizdams generuoti. Šis mikroskopas perkelia elektronų pluoštą pirmyn ir atgal metalu dengto bandinio paviršiumi, sukeldamas antrinių elektronų emisiją iš bandinio. Antriniai elektronai sukuria stulbinančius vaizdus, ​​būdingus skenuojančiai elektronų mikroskopijai.

Vaizdo įrašas, kaip veikia elektroninis mikroskopas. Norėdami peržiūrėti vaizdo įrašą, spustelėkite rodyklę.

Alternatyvią nuorodą galite rasti žemiau:


1.16 pav
Transmisijos elektronų mikrografas
nuo poliomielito viruso

1.17 pav
Transmisijos elektronų mikrografas
Ebolos viruso

Vaizdo įrašas su daugybe nuskaitančių elektronų mikroskopinių ląstelių vaizdų iš žmogaus kūno. Norėdami peržiūrėti vaizdo įrašą, spustelėkite rodyklę.

Alternatyvią nuorodą galite rasti žemiau:

Norint stebėti (išspręsti) mažesnius nei 0,2 m objektus, reikia naudoti elektronų mikroskopiją (EM). Užuot naudoję matomą šviesą, elektroniniai mikroskopai sufokusuoja elektronų spindulį į labai ploną biologinės medžiagos atkarpą, kuri buvo chemiškai konservuota (fiksuota) ir įdėta į plastiką. Elektronai turi daug trumpesnį bangos ilgį nei naudojami matomos šviesos fotonai LM. Kadangi skiriamoji geba yra atvirkščiai susijusi su bangos ilgiu, šiuolaikiniai elektroniniai mikroskopai gali išskirti maždaug 0,2 m objektus. Būtent šis didžiulis raiškos padidėjimas leido biologams įžvelgti tikslias ląstelės struktūros detales. Nors ir galingas įrankis, su juo galima stebėti tik chemiškai konservuotas ląsteles EM. Įprastas gyvų ląstelių stebėjimas elektroniniais mikroskopais yra tikslas, kurį dar reikia pasiekti.

Aukščiau aprašytas elektroninės mikroskopijos tipas paprastai vadinamas perdavimo elektronų mikroskopija.TEM). Į TEM, elektronų spindulys praeina tiesiai per mėginį, išskyrus atvejus, kai elektronus nukreipia sunkiųjų metalų (švino ir (arba) urano) atomai, kurie buvo naudojami bandiniui „dažyti“, perduodami elektronai sufokusuojami ant fotografinės juostos, kurioje vaizdas vizualizuojamas ir įrašytas.

Šio metodo variantas yra skenuojanti elektroninė mikroskopija (SEM). Į SEM, elektronų pluoštas nuskaito mėginio paviršių, kuris buvo padengtas plonu aukso sluoksniu. Elektronų spindulys sužadina mėginio atomus, todėl jie išstumia elektronus, kurie surenkami ir paverčiami vaizdu, rodomu monitoriuje. Sukurtas vaizdas turi didelį lauko gylį, todėl atrodo, kad jis yra trimatis. SEM naudojamas įvairių tipų ląstelių paviršiaus detalėms atskleisti.

**Eikite į šią svetainę ir eksperimentuokite su virtualiu skenuojančiu elektroniniu mikroskopu. Atsakykite į žemiau pateiktus klausimus apie virtualią elektroninę mikroskopiją.
VIRTUALUS ELEKTRONINIS MIKROSKOPAS

A) Kairėje pusėje galite peržiūrėti tris pavyzdžius
B) Norėdami priartinti savo mėginį, galite naudoti mašinos mygtuką DIDINYTI
C) Toliau atsakykite į klausimus apie savo patirtį šioje svetainėje.

1) Kiek kamieninių ląstelių galite suskaičiuoti?
2) Kuri iš ląstelių yra didesnė už kamienines ląsteles ar T ląsteles
3) Kuri ląstelė yra didžiausia?
4) Apibūdinkite raudonųjų kraujo kūnelių formą
5) Kaip manote, kokios rausvos sruogos yra aplink nervines skaidulas
6) Ar elektroninis mikroskopas leidžia didinti didesnį laipsnį nei šviesos mikroskopas? Kodėl?

Spustelėkite čia, jei norite gauti MS WORD klausimų versiją

Spustelėkite čia, jei norite gauti klausimų PDF versiją

Nuoroda į kitą virtualų elektroninį mikroskopą

Kažkas įdomaus apie matavimus

Pažiūrėkite į Paukščių Taką 10 milijonų šviesmečių atstumu nuo Žemės.Tada judėkite kosmosu link Žemės nuosekliomis eilėmis, kol pasieksite aukštą ąžuolą, esantį šalia Nacionalinės didelio magnetinio lauko laboratorijos pastatų Talahasis mieste, Floridoje. Po to pradėkite judėti iš tikrojo lapo dydžio į mikroskopinį pasaulį, kuriame atskleidžiamos lapų ląstelių sienelės, ląstelės branduolys, chromatinas, DNR ir galiausiai į subatominę elektronų ir protonų visatą.

Matavimai Filmas

Išbandykite šią puikią interaktyvią matavimų animaciją. Slinkite slankiklį sąveikos apačioje, kad peržiūrėtumėte mažesnius ar didesnius elementus.

Kokio dydžio yra bakterijos ir virusai?

Naudokitės šia svetaine norėdami peržiūrėti santykinį amebų, odos ląstelių, chromosomų, bakterijų ir kt. dydį. Norėdami priartinti mažesnius objektus, naudokite puslapio apačioje esančią slankiąją juostą.

Skalė


Žiūrėti video įrašą: Biologijos pamoka (Rugpjūtis 2022).


1.18 pav
Skenuojanti elektroninė mikrografija
ŽIV, užaugintas kultivuotuose limfocituose


1.19 pav
Skenuojanti elektroninė mikrografija
Blyški treponema
(sifilio sukėlėjas)