Informacija

6.1: replikonas – biologija

6.1: replikonas – biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Labai svarbu, kad visa ląstelėje esanti DNR būtų pakartota vieną kartą ir tik vieną kartą per ląstelės ciklą. Jokūbas, Brenneris ir Cuzinas apibrėžė a replikonas kaip vienetas, kuriame ląstelė kontroliuoja atskirus replikacijos veiksmus. Jie pasiūlė, kad an iniciatorius baltymas sąveikauja su DNR seka, vadinama a replikatorius, kad pradėtumėte replikaciją. Replikatorius gali būti genetiškai identifikuojamas kaip DNR seka, reikalinga replikacijai, tuo tarpu kilmės apibrėžiamas fiziniais arba biocheminiais metodais kaip DNR seka, nuo kurios prasideda replikacija. Daugeliui replikonų, tokių kaip E. coli oriC ir autonomiškai replikuojančios sekos (arba ARS) mielėse replikatorius taip pat yra kilmė. Tačiau tai nebūtinai turi būti: šilkakandžių amplifikuotų choriono genų replikono kilmė yra artima replikatoriui, bet nuo jo atskiriama. Dabar buvo nustatyti kai kurių replikonų, tokių kaip DnaA baltymas, iniciatoriai E. coli ir Kilmės atpažinimo kompleksas mielėse Saccharomyces cerevisiae. Abiem atvejais jie jungiasi prie replikatorių, kurie taip pat yra šių dviejų rūšių kilmės.

Replikatorius yra DNR seka, reikalinga likusios DNR dalies sintezei replikone. Tai yra valdymo elementas, veikiantis chromosomą, ant kurios ji yra. Sakome, kad šis elementas veikia cis, nes replikatorius ir replikonas yra toje pačioje chromosomoje. Priešingai, iniciatorius yra baltymas, kuris gali būti užkoduotas bet kurioje ląstelės chromosomoje. Taip vyksta aktai vert, nes jis neturi būti užkoduotas toje pačioje chromosomoje kaip ir jo valdomas replikonas. Apskritai, a vert- veikiantis faktorius yra darinys, dažniausiai baltymas, kuris gali pasklisti per ląstelę ir veikti reguliuodamas tam tikrą taikinį, tuo tarpu cis-veikianti DNR seka yra toje pačioje chromosomoje kaip ir kontrolės taikinys. Šis modelis a vert-veikiančio baltymo, prisijungiančio prie a cis-DNR veikianti vieta taip pat matoma transkripcijos kontrolėje.

6.1 pav. Replikono komponentai, vienetas, kuriame ląstelė kontroliuoja replikaciją.

Pratimas

Nors E. coli turi vieną kilmę viename replikone, eukariotinės chromosomos turi kelias kilmes ir kelis replikonus. Apsvarstykite žinduolių ląstelių, augančių kultūroje, liniją, kurios S fazė yra 5 valandos, ty visas genomas replikuojamas per 5 valandas. Haploidinio genomo dydis yra 3 x 109 bp. Jei replikacijos šakutės judėjimo greitis šiose ląstelių linijose yra 2000 bp per min., kiek replikacijos ištakų reikalaujama pakartoti visą haploidas genomas S fazės metu? Tarkime, kad iš kiekvienos pradžios atsiranda dvi replikacijos šakės (tai yra dvikryptis replikavimas, žr. toliau).

Eksperimentiniai metodai, skirti nustatyti replikacijos pradžią ir galus bei atskirti vienakryptį ir dvikryptį replikavimą

Buvo sukurti keli eksperimentiniai metodai, skirti nustatyti, kur replikacija prasideda ir baigiasi chromosomose, ir atskirti vienakryptį ir dvikryptį replikaciją. Apžvelgsime dvi pagrindines technologijas.


CONTIGuator: bakterijų genomų apdailos įrankis, skirtas struktūrinėms įžvalgoms apie genomus

Naujausi sekos nustatymo technologijų pokyčiai suteikė galimybę nustatyti daugybę bakterijų genomų su ribotomis sąnaudomis ir darbo jėga, palyginti su ankstesniais metodais. Tačiau ribojantis genomo sekos nustatymo žingsnis yra baigiamasis procesas, reikalingas norint nustatyti santykinę kiekvieno kontiginio padėtį ir uždaryti sekos spragas. Papildomą sudėtingumo laipsnį suteikia bakterijų rūšys, turinčios daugiau nei vieną replikoną, kurios nėra numatytos šiuo metu turimose programose. Didelis bakterijų genomų skaičius leidžia genetikams naudoti pilnus genomus (galbūt iš tos pačios rūšies) kaip kontigų kartografavimo šablonus.

Čia pristatome „CONTIGuator“ – programinės įrangos įrankį, skirtą kontigų atvaizdavimui per pamatinį genomą, leidžiantį vizualizuoti kontigų žemėlapį, pabrėžti genetinių elementų praradimą ir (arba) padidėjimą ir leidžiantį užbaigti daugiadalius genomus. „CONTIGuator“ funkcionalumas buvo išbandytas naudojant keturis genomus, rodančius, kad jo veikimas yra geresnis, palyginti su šiuo metu turimomis programomis.

Mūsų metodas atrodo efektyvus, turintis aiškią vizualizaciją, leidžiančią vartotojui atlikti lyginamąją struktūrinės genomikos analizę su juodraščiais genomais. „CONTIGuator“ yra „Python“ scenarijus, skirtas „Linux“ aplinkoms ir gali būti naudojamas įprastuose staliniuose kompiuteriuose. Jį galima atsisiųsti iš http://contiguator.sourceforge.net.


Projekto ataskaita apie DNR replikaciją

Išskirtinė projekto ataskaita apie DNR replikaciją. Ši projekto ataskaita padės jums sužinoti apie: 1. Įvadas į DNR replikaciją 2. Pusiau konservatyvaus replikavimo metodo įrodymai 3. DNR replikacijos mechanizmas 4. Bakterijų DNR replikacija.

Projekto ataskaita Nr. 1. Įvadas į DNR replikaciją:

Tai procesas, kurio metu ląstelė kopijuoja savo DNR. Replikacija yra būtina, kad ląstelėse esanti informacija apie genus ir šydą galėtų būti perduota dukterinėms ląstelėms po ląstelių dalijimosi. Delbruckas pasiūlė, kad Watson-Crick DNR modeliai teoriškai galėtų replikuotis trimis režimais: konservatyvus, pusiau konservatyvus ir dispersinis (4.10 pav.).

i. Pagal konservatyvųjį režimą susidarė dvi dvigubos spiralės, kurių viena būtų visiškai ir nedrąsiai iš senos medžiagos, o kita - visiškai iš naujos.

ii. Pagal pusiau konservatyvųjį režimą, kiekviena susidariusių dviejų dvigubų spiralių grandinė turėtų po vieną seną ir vieną naują.

iii. Pagal dispersinį replikacijos būdą,. DNR dviguba spiralė nutrūktų keliuose taškuose ir susidarytų daug gabalėlių. Kiekvienas gabalas kartojasi, tada dalys atsitiktinai susijungdavo ir susijungdavo. Taigi dvi susidariusios dvigubos spiralės sudarytų senų ir naujų dalių kratinys.

Tačiau, kadangi įrodyta, kad pusiau konservatyvus replikacijos būdas yra bendras replikacijos modelis, šis metodas buvo aptartas toliau.

Watson ir Crick parengtas dvigubos spiralės DNR modelis turi replikacijos savybę. Dvi dvigubos spiralės gijos, kurios laikomos kartu sujungiant dvi pagrindas A-T, G-C, išsivynioja ir atsiskiria į dvi atskiras sruogas. Dvi spiralės gijos yra suvyniotos viena kitai lygiagrečiai.

Prasidėjus atsivyniojimui, Kornbergo atrasto fermento DNR polimerazės pagalba pradedama naujų gijų sintezė arba dubliavimasis (4.11 pav.).

Kadangi dvi sruogos yra viena kitą papildančios, viena kitą papildančios bazės yra pritvirtintos seserinėse gijose prieš tėvinę (4.12 pav.). Iš dviejų naujai susintetintos dvigubos spiralės gijų viena yra pirminė, o kita – naujai susintetinta. Taigi replikacija vadinama pusiau konservatyvia.

Jei yra viena sruogelė, galima sukurti seserinės gijos sudėtį, remiantis kom&syplementarumu. Tėvų pluoštas tarnauja kaip naujų gijų sintezės forma arba šablonas.

Kombinuotai replikacijai kartojama ta pati pro­cess, kai abi dvigubos spiralės gijos yra naujų dvigubų spiralių sintezės šablonas. Visas procesas yra palyginamas su spaudinių gamyba iš negatyvo fotografijoje, kai tamsesnės negatyvo sritys atrodo kaip šviesesnės pozicijos ir silpnos vietos.

Esminis skirtumas tarp nuotraukų ir šigrafinio apdorojimo ir DNR replikacijos yra tas, kad fotografuojant negatyvas išlieka toks pat neigiamas ir niūrus, o iš to paties negatyvo galima paimti daugybę atspaudų, o atspaudai negali būti kaip negatyvas, kaip replikuojant DNR grandines.

DNR replikacijos metu, nors dvi naujai susintetintos dvigubos spiralės grandinės, kurios teoriškai ir droviai turi neigiamą ir teigiamą, abi gali būti neigiamos kitame replikacijos ir šlifavimo cikle.

Projekto ataskaita Nr. 2. Pusiau konservatyvaus atkartojimo metodo įrodymai:

Yra pakankamai įrodymų, įrodančių, kad dvigrandė DNR replikuojasi puskonserio ir šyvavimo metodu.

Meselson ir Stahl’ eksperimentas:

Meselsonas ir Stahlas 1958 m. pranešė apie eksperimento, kurio tikslas buvo patikrinti, ar dvigrandė DNR replikuojasi pusiau ir droviai, rezultatus.

Buvo naudojami šie du pagrindiniai principai:

(i) DNR buvo paženklinta sunkiuoju azotu (N15) ir po to buvo leista daugintis terpėje, kurioje yra N15. Jei replikacija yra pusiau konservatyvi, po pirmosios kartojimo ir šlifavimo kartos viena iš dviejų gijų turėtų nor­mal azoto (N 14 ).

Gautos molekulės tankis būtų tarpinis tarp N 14 DNR ir. Šis tankis laipsniškai mažės sekančių ciklų replikacijos metu ir priartėtų prie N14 DNR.

(ii) Kitas naudojamas principas buvo cezio chlorido tankio gradiento paruošimas ir drėkinimas. Šis tankio gradientas paruošiamas laipsniškai skiedžiant sunkiosios druskos tirpalą. Kai ši medžiaga yra ultracentrifuguojama su medžiaga, kurios tankis yra šio gradiento diapazone, ši medžiaga atsidurs savo tankio lygyje. Tai leidžia aptikti labai nedidelius tankio skirtumus.

Meselsonas ir Stahlas leido Escherichia coli ląstelėms augti N 15 auginimo terpėje maždaug 14 ląstelių kartų, todėl beveik visas azotas (N 14 ) DNR buvo pakeistas N 14 . Tada ląstelės buvo staigiai perkeltos į N14 auginimo terpę.

Kadangi nustatytas laikas, reikalingas vienai ląstelių kartai, yra apie 30 minučių, ląsteles buvo galima pašalinti po vienos ar daugiau žinomų kartų replikacijos. Tada buvo galima išanalizuoti jų DNR ir gauti tokie rezultatai.

DNR mėginys, gautas vienai ląstelių kartai po perkėlimo į N14 auginimo terpę, parodė tik vieną tankio juostą, kaip buvo pastebėta per ultra-shyviolet absorbcijos modelį. Ši juosta rodė vienodą homogeninį DNR tankį po vienos ląstelės kartos.

Juosta buvo tiksliai tarp juostų, sudarytų iš N 14 DNR ir N 15 DNR, o tai rodo, kad visos DNR, rastos po pirmojo geno­ration, turi tarpinį tankį (4.13 pav.). To galima tikėtis, jei DNR replikuotųsi pusiau konservatyviai.

Po dviejų kartų, kai DNR buvo išanalizuota, buvo pastebėtos dvi juostos, kaip ir galima tikėtis pagal pusiau konservatyvų replikacijos metodą. Šios dvi juostos buvo vienodo intensyvumo po antrosios kartos. Kitose kartose, nors atsirado tos pačios dvi juostos, hibridinės tankio juostos intensyvumas palaipsniui mažėjo, o šviesos tankio juostos intensyvumas palaipsniui didėjo.

Taigi Meselsono ir Stahlo eksperimentas yra klasikinis eksperimentas, kuris pirmasis parodė, kad DNR replikuojasi pusiau konservatyviai (4.14 pav.).

Eksperimente su Vicia faba, kurį atliko Taylor ir kt. (1957), augalų ląstelės pirmiausia buvo auginamos radioaktyvų timidiną turinčioje terpėje, o vėliau perkeltos į normalią terpę. S fazės branduoliai į DNR įtraukė timidiną, o tie, kurie baigė DNR replikaciją, nebuvo pažymėti. Po metafazės sustabdymo naudojant kolchiciną, X1 padalijus, abi chromatidės pasirodė paženklintos, kaip ištirta autoradiografijos būdu. Kitoje ląstelių kartoje X1, normalioje augimo terpėje viena kiekvienos chromosomos grandinė buvo paženklinta, o kita – ne.

Buvo padaryta išvada, kad prieš replikaciją kiekviena chromosoma elgiasi taip, lyg joje būtų du DNR vienetai. S fazės metu pusiau konservatyviu metodu išilgai originalių DNR gijų yra pastatyti du nauji pažymėti vienetai. Taigi kiekviena chromatidė turi originalią nepažymėtą grandinę ir naują, ją papildančią pažymėtą grandinę.

Antroje S fazėje, kadangi terpėje nėra izotopų, pažymėtos ir nepažymėtos gijos išsiskiria į pažymėtas ir nežymėtas seserines chromatides (4.15 pav.).

Projekto ataskaita Nr. 3. DNR replikacijos mechanizmas:

Daugumoje organizmų DNR replikacijos mechanizmas yra labai panašus. Skirtumai egzistuoja tik dėl dalyvaujančių fermentų ir baltymų (4.3 lentelė). Prokariotuose, tokiuose kaip E. coli, fermentai, DNR polimerazės I ir III, yra atsakingi už DNR sintezę, o DNR polimerazė II dalyvauja replikacijoje.

Eukariotuose DNR replikuoja įvairios DNR polimerazės (α, β, γ, δ, ԑ, к ir kt.). Replikacija turi būti labai tiksli, nes net ir dėl nedidelės klaidos po kelių ląstelių dalijimosi gali būti prarasta svarbi genų ir šlykštimo informacija.

Tikslumą užtikrina DNR polimerazių gebėjimas patikrinti, ar į naujai susintetintą grandinę įterptos tinkamos bazės. Tai pasiekiama dėl atvirkštinio (3′ > 5′) fermentų egzonukleazės aktyvumo, kuris leidžia jiems pašalinti iš naujai susintetintos DNR neteisingai įterptas bazes ir pakeisti jas tinkama baze. Tai vadinama įrodinėjimo ir skaitymo gebėjimu.

DNR replikacijos ir šukavimo metu visa DNR dviguba spiralė palaipsniui išvyniojama, gaminant vienos grandinės DNR segmentus, kuriuos gali kopijuoti DNR polimerai ir šydžiai. Dvigubos spiralės išvyniojimas prasideda atskiroje vietoje, vadinamoje replikacijos pradžia, ir palaipsniui vyksta išilgai molekulės, paprastai abiem kryptimis (dvikrypčiai) arba gali būti vienakryptis (4.16A pav.).

Vienakrypčiu režimu viena replikacijos šakutė palieka pradinį tašką ir eina išilgai DNR, o dvikrypčiu režimu susidaro dvi replikacijos šakės, kurios priešingomis kryptimis nutolsta nuo pradžios (4.16B pav.).

Replikacijos pradžioje paprastai yra sekos, kuriose gausu silpnų A-T bazių porų. Regionas, kuriame spiralė išsivynioja ir susintetinama nauja DNR, vadinama replikacijos šakute. Replikacijos šakėje, veikiant skirtingiems fermentams ir baltymams, įvyksta keletas skirtingų įvykių (4.17 pav.):

i) dvigubos spiralės atskyrimas:

Tai pasiekiama veikiant helikazės fermentui. Po sruogų atskyrimo prie DNR prisitvirtina vienos grandinės surišimo (SSB) baltymas ir neleidžia dvigubai spiralei persitvarkyti.

ii) pirmaujančių ir atsiliekančių gijų sintezė:

DNR sintezė DNR polimerazėmis vyksta tik 5′ → 3′ kryptimi. Kadangi dvi dvigubos spiralės gijos eina priešingomis kryptimis (viena grandinė eina 5′ → 3′, o kita 3′ → 5′), kiekvienai atkartoti reikia šiek tiek skirtingų mechanizmų. Viena juosta, vadinama pirmaujančia, nukopijuojama ta pačia kryptimi kaip ir išsivyniojanti spiralė, todėl gali būti sintezuojama nuolat (4.18A pav.).

Kita kryptis, žinoma kaip atsiliekanti kryptis, yra sintezuojama priešinga kryptimi ir turi būti kopijuojama nepertraukiamai. Atsiliekanti grandis sintezuojama kaip segmentų, žinomų kaip Okazaki fragmentai, serija (4.18A pav.).

DNR polimerazėms reikia trumpos dvigubos grandinės srities, kad būtų pradėta arba pradėta DNR sintezė. Ją gamina RNR polimerazė, vadinama primaze, kuri gali inicijuoti vienos grandinės DNR sintezę. Primasė sintezuoja trumpą RNR pradmenų seką DNR šablone, sukurdama trumpą dvigrandę sritį.

E. coli DNR poli&šimerazė III sintezuoja DNR, pradedant nuo RNR pradmens. Atsiliekančioje grandinėje sintezė baigiasi, kai atsiranda kitas RNR pradmuo. Šiuo metu DNR polimerazė I perima ir pašalina RNR pradmenį, pakeisdama jį DNR (4.18B pav.). Su eukariotais situacija kitokia.

DNR polimerazė α, kuri turi vientisą primazės aktyvumą, yra atsakinga už DNR sintezės inicijavimą. DNR replikuoja DNR polimerazės α ir δ, sintetindamos atsiliekančią grandinę, o δ sintetindamos pirmaujančią grandinę. Kitos polimerazės atlieka pagalbinius vaidmenis. DNR polimerazė e dalyvauja DNR atstatyme, o DNR polimerazė γ replikuoja mitochondrijų DNR.

Paskutinis žingsnis, kurio reikia norint sujungti atsiliekančios grandinės sintezę, yra Okazaki fragmentai sujungti fosfodiesterio jungtimis. Tai atlieka DNR ligazės fermentas (4.18B pav.).

Projekto ataskaita Nr. 4. Bakterijų DNR replikacija:

Nors DNR replikacijos mechanizmas yra panašus visuose organizmuose, bendras procesas skiriasi priklausomai nuo kopijuojamos DNR molekulės pobūdžio. Reikalingos skirtingos strategijos, skirtos žiedinėms DNR molekulėms, esančioms bakterijose, ir linijinėms chromosomų DNR molekulėms, esančioms eukariotuose, replikuoti.

Paprasčiausia ir labiausiai paplitusi žiedinės DNR replikacijos forma apima vieną replikacijos pradžią, iš kurios dvi replikacijos šakės juda priešingomis kryptimis. Dėl to susidaro tarpinė forma (4.19 pav.). Replikacijos šakės tolygiai susitinka ir susilieja, o replikacija baigiasi.

DNR molekulių replikacijai reikia išvynioti dvigubą DNR spiralę. Dėl to spiralė, esanti prieš replikacijos šakutę, sukasi. Apvalioms DNR molekulėms, neturinčioms laisvų galų, tai sukelia DNR superspiralizaciją ir neleidžia replikacijos šakutei progresuoti.

Šią problemą įveikia fermentai, vadinami girazėmis arba topoizomerazėmis. DNR topoizomerazė I sukelia trumpalaikį vienos iš DNR grandinių polinukleotido stuburo lūžį, trumpą atstumą prieš replikacijos šakutę, todėl DNR gali laisvai suktis aplink kitą nepažeistą grandinę, pašalindama superspiralę.

Tada fermentas vėl sujungia nutrūkusios grandinės galus. Pasibaigus bakterijų chromo ir shysomų replikacijai, susidaro dvi žiedinės dukterinės molekulės, kurios yra tarpusavyje sujungtos.

Jie yra atskirti veikiant DNR topoi ir izomerazei II, kuri sukelia laikinus pertraukas abiejose vienos iš DNR molekulių grandinėse, leidžiančiai praeiti kitai DNR molekulei, taip atskiriant dvi dukterines molekules. Tada topoizomerazės II fermentas vėl sujungia sulaužytas grandines.

DNR replikacija eukariotuose:

Dėl ypatingo eukariotinių chromosomų ilgio DNR replikacija turi būti inicijuota keliose kilmės vietose, siekiant užtikrinti, kad procesas būtų baigtas per pagrįstą laikotarpį. Replikacijos šakės eina bet kuria kryptimi iš kiekvienos replikacijos pradžios, sudarydamos replikacijos burbulus, kurie net ir stropiai susitinka ir susilieja.

DNR, replikuota iš vienos kilmės, vadinama replikonu. Ne visos DNR kartojasi vienu metu. S fazės metu apibrėžtuose taškuose vienu metu pradeda veikti maždaug 50 replikonų grupės. Sritys, kuriose yra trans ir šikripcija aktyvių genų, pirmiausia yra replikuojamos, o neaktyvūs regionai replikuojami vėliau.

DNR eukariotų chromosomose yra supakuota kaip DNR ir baltymų kompleksai, vadinami nukleozomomis. Kai replikacijos šakutė progresuoja, DNR turi atsijungti nuo nukleosomos, kad įvyktų replikacija. Tai sulėtina replikacijos šakių progresą ir gali paaiškinti trumpą Okazaki fragmentų ilgį atsiliekančioje grandinėje eukariotuose (100–200 bazių), palyginti su prokariotais (1000–2000 bazių).

Pasibaigus replikacijos šakutei, nukleosomos reformuojasi. Linijinių eukariotų chromosomų ir šizomų replikacija kelia problemų, su kuriomis nesusiduriama su žiedinėmis bakterijų chromosomomis.Kraštinis 5′ atsiliekančios grandinės galas linijinėje DNR negali būti replikuotas, nes RNR pradmeniui nėra vietos replikacijai inicijuoti.

Tai sukuria galimybę chromosomoms sutrumpėti po kiekvieno replikacijos raundo ir dėl to prarandama genetinė informacija.

Problemą išsprendžia specializuota chro­mosomų galo struktūra, žinoma kaip telomeras, kurioje yra tandeminiai paprastos nekoduojančios sekos pasikartojimai. Be to, priekinės gijos 3′ galas tęsiasi už atsiliekančios gijos 5′ galo.

Fermento telomerazėje yra RNR molekulė, kuri iš dalies sutampa su pasikartojančia seka priekinėje grandinėje ir prie jos prisijungia. Tada fermentas pratęsia pagrindinę grandinę, naudodamas RNR kaip šabloną.

Tada telomerazė išsisklaido ir jungiasi prie naujojo telomero galo, todėl pirmaujanti grandis vėl pratęsiama. Šis pratęsimo pro&sycesas gali įvykti šimtus kartų, kol telomerazė galutinai atsiskiria. Tada naujai išplėsta pirmaujanti juosta veikia kaip šablonas atsiliekančios grandinės 5′ galo replikacijai (4.20 pav.).

Du procesai, kurių metu DNR trumpėja normalios replikacijos metu ir pailgėja veikiant telomerazei, yra apytiksliai subalansuoti, todėl bendras chromosomos ilgis išlieka beveik toks pat.


Įvadas

Hepatito C virusas (HCV) yra flaviviridae šeimos viengrandinis teigiamo pojūčio RNR virusas su apvalkalu (Lindenbach ir Rice, 2001). ~9,6 kb genomas paverčiamas vienu poliproteinu, kuris vėliau perdirbamas į mažiausiai 10 struktūrinių ir nestruktūrinių baltymų, kurie yra būtini viruso RNR replikacijai ir naujų virionų surinkimui (Lindenbach ir Rice, 2001). Istoriškai HCV gyvavimo ciklo tyrimas buvo sunkus, nes HCV nesugebėjo daugintis. in vitro audinių kultivuojamose ląstelėse (Lindenbach ir Rice, 2005). Tačiau sukūrus viso ilgio ir subgenominius replikonus, kurie išreiškia HCV baltymus, kurių pakanka virusinės RNR replikacijai hepatomos (Huh-7) ląstelėse, labai pagerino mūsų supratimą apie HCV biologiją ir viruso bei šeimininko sąveiką (Lohmann). ir kt, 1999 m ir kt, 2000 ).

Kritinė viruso ir šeimininko sąveika, reikalinga HCV replikacijai, yra su membrana susijęs kompleksas, sudarytas iš viruso ir šeimininko baltymų bei pakitusių ląstelių membranų, vadinamas membraniniu tinklu (Eggeris ir kt, 2002 Gosert ir kt, 2003). Šis ryšys su šeimininko membranomis pasirodė esąs naudinga HCV strategija, nes membranos gali būti fiksuotas objektas, nuo kurio galima pririšti viruso baltymus. FBL2 buvo nustatytas kaip 50 kDa geranilgeranilintas šeimininko baltymas, kuris yra būtinas HCV replikacijos komplekso lokalizacijai dėl glaudaus ryšio su HCV baltymu NS5A ir yra labai svarbus HCV replikacijai (Wang ir kt, 2005). Yra žinoma, kad FBL2 geranilgeranilinimo mastas turi įtakos HCV replikacijai. Pavyzdžiui, baltymo geranilgeraniltransferazės I (PGGT), fermento, pernešančio geranilgeranilo pirofosfatą (GGPP) į ląstelių baltymus, kad būtų galima pritvirtinti membraną, slopinimas neigiamai veikia HCV replikaciją (taip ir kt, 2003). Ir atvirkščiai, cheminės medžiagos, didinančios intracelulinę GGPP koncentraciją, skatina viruso replikaciją (Kapadia ir Chisari, 2005). Atsižvelgiant į šeimininko membranų svarbą HCV replikacijai, nenuostabu, kad šių kelių metabolitai veikia HCV RNR replikaciją.

Ši HCV ir šeimininko membranų sąveika yra dabartinių kandidatų terapijos, skirtos HCV infekcijoms gydyti naudojant statinus, pagrindas. Ląstelės šeimininko membranos sudėtis gali būti tiesiogiai modifikuojama sterolių kelio, kuris yra gyvybiškai svarbus cholesterolio ir izoprenoidų tarpinių produktų sintezei, ir riebalų rūgščių biosintezės kelio produktai (Goldstein ir Brown, 1990). Nustatyta, kad cheminis fermentų slopinimas bet kuriame iš šių būdų teigiamai ir neigiamai veikia viruso replikaciją (Su ir kt, 2002 Taip ir kt, 2003 Kapadia ir Chisari, 2005 Sagan ir kt, 2006 Amemiya ir kt, 2008). Pavyzdžiui, statinų junginiai slopina 3-hidroksi-3-metilglutarilo kofermento A reduktazę (HMGCR), greitį ribojantį fermentą sterolio kelyje (Goldstein ir Brown, 1990), ir buvo pasiūlyta, kad jie slopina HCV replikaciją, galiausiai sumažindami ląstelių skaičių. GGPP fondas (Ye ir kt, 2003 Kapadia ir Chisari, 2005 Ikeda ir kt, 2006 ).

Tačiau šiuo metu hipercholesterolemijai gydyti vartojamų statinų klinikinės dozės nėra pakankamai didelės, kad slopintų geranilo lipidų sintezę. Tikėtina, kad statinų naudojimą HCV gydymui dar labiau apsunkins kompensacinis HMGCR ekspresijos padidėjimas. in vitro ir in vivo (Akmuo ir kt, 1989 Cohen ir kt, 1993), kaip atsakas į gydymą. Naujausias atradimas, kad HCV RNR replikacija didėja gydant fluvastatinu ŽIV/HCV koinfekuotų pacientų (Milazzo) ir kt, 2009) atitinka HMGCR ekspresijos padidėjimą. Fermentus sterolių kelyje transkripcijos lygiu reguliuoja sterolius reguliuojančius elementus surišantys baltymai (SREBP), ypač SREBP-2, kuris yra su ER membrana susietas transkripcijos faktorius (Hua). ir kt, 1993 Brown ir Goldstein, 1997). Kai cholesterolio atsargos ląstelėse išeikvojamos, SREBP-2 palydimas iš ER į Golgi kompleksą SREBP skilimą aktyvinančio baltymo, sterolius jautraus palydos baltymo (Hua). ir kt, 1996 Brown ir Goldstein, 1999). Vėliau SREBP-2 skaido Golgi lokalizuotos proteazės S1P ir S2P, taip išlaisvindamos N-galo bazinį spiralės-kilpos-spiralės domeną, kuris migruoja į branduolį ir aktyvuoja sterolio kelyje esančių genų, kuriuose yra sterolių atsako elementų, transkripciją. jų stiprikliai (Smith ir kt, 1988 , 1990 Sakai ir kt, 1996 Brown ir Goldstein, 1999). Gerai apibūdinti tiksliniai genai apima HMGCR, HMG-CoA sintazę, farnezilo pirofosfato (FPP) sintazę, skvaleno sintazę (SQLS) ir MTL receptorius (Horton). ir kt, 2002). Papildomų sterolio kelio metabolitų poreikis HCV replikacijai nebuvo visiškai išaiškintas.

Cheminė genetika yra veiksmingas būdas nustatyti vaistų mechanizmus (Stockwell, 2004), kai paprasčiausia forma pavieniai cheminiai trikdžiai gali išsiaiškinti, kurie sistemos komponentai yra būtini tam tikram fenotipui. Tačiau funkcinius ryšius tarp sistemos komponentų geriausia nustatyti pagal tiesioginės sąveikos duomenis arba matuojant derinio efektus (Boone ir kt, 2007). Vienas sėkmingų būdų yra cheminių perturbagenų naudojimas kartu (Lehár ir kt, 2007, 2008). Atliekant tokius kombinuotus cheminius genetinius tyrimus, sąveiką reikia palyginti su atskiro vieno agento poveikiu, kad būtų galima nustatyti, ar yra „sinergija“, kai agentai bendradarbiauja siekdami fenotipo, arba „antagonizmas“, kai jie trukdo vienas kito veiklai (Greco). ir kt, 1995). Taigi mechaninis dėmesys gali būti perkeltas nuo atskirų taikinių į sąveiką tarp jų.

Čia pristatome cheminį genetinį ekraną, skirtą geriau suprasti sterolių kelio ir jo reguliavimo poveikį HCV replikono replikacijai, naudojant kombinuotą didelio našumo atrankos platformą (cHTS) (Borisy). ir kt, 2003). Taikydami šį metodą nustatėme keletą veiksmingų antivirusinių taikinių, įskaitant SREBP-2, taip pat taikinius, esančius pasroviui nuo HMGCR sterolio kelyje, tokius kaip oksidoskvaleno ciklazė (OSC) arba lanosterolio demetilazė. Pažymėtina, kad deriniai tarp zondų, nukreiptų į fermentus pasroviui nuo OSC, sukūrė tvirtą sinergiją tarpusavyje arba su PGGT inhibitoriumi. Be to, mūsų duomenys rodo, kad sterolių kelio slopinimas neslopinant reguliavimo grįžtamojo ryšio mechanizmų galiausiai padidina replikono replikaciją. Todėl taikinių, esančių prieš OSC, inhibitorių deriniai pasirodė antagonistiški ir dominuoja epistatinis poveikis, palyginti su pasroviui esančių taikinių inhibitoriais.


Filialai

Biologijos katedra, Bergeno universitetas, Thor Møhlens gate 55, Bergenas, 5020, Norvegija

Marius Karlsen ir amp Are Nylund

Intervet Norbio, Thor Møhlens gate 55, Bergenas, 5008, Norvegija

Norvegijos veterinarijos mokslų mokykla, Thor Møhlens gate 55, Oslas, Norvegija

Taip pat galite ieškoti šio autoriaus PubMed Google Scholar

Taip pat galite ieškoti šio autoriaus PubMed Google Scholar

Taip pat galite ieškoti šio autoriaus PubMed Google Scholar

Taip pat galite ieškoti šio autoriaus PubMed Google Scholar

Autorius susirašinėjimui


Abstraktus

Biologinės sistemos veikia per dinamines genų ir jų produktų, reguliavimo grandinių ir medžiagų apykaitos tinklų sąveikas. Mūsų „Pathway Tools“ programinės įrangos kūrimas buvo paskatintas poreikio sukurti biologinių žinių išteklius, kuriuose būtų sujungti šie daugelio tipų duomenys ir kurie leistų vartotojams kuo greičiau rasti ir suprasti dominančius duomenis naudojant užklausų ir vizualizacijos įrankius. Be to, siekėme paremti medžiagų apykaitos srauto modelių kūrimą iš kelių duomenų bazių ir panaudoti kelio informaciją, kad būtų galima geriau interpretuoti didelio našumo duomenų rinkinius.

Per pastaruosius 4 metus patobulinome jau plačią Pathway Tools programinę įrangą keliais aspektais. Dabar jis gali palaikyti medžiagų apykaitos modelio vykdymą žiniatinklyje, suteikia tikslesnį medžiagų apykaitos modelių spragų užpildymą, palaiko organizmų bendruomenių modelių, paskirstytų erdviniame tinklelyje, kūrimą, o modelio rezultatus galima vizualizuoti grafiškai. „Pathway Tools“ palaiko keletą naujų omikos duomenų analizės įrankių, įskaitant „Omics“ prietaisų skydelį, kelių takų diagramas, vadinamas kelio koliažais, kelią apimantį metabolomikos duomenų analizės algoritmą ir algoritmą, skirtą daugiafunkcinių duomenų mechaniniams paaiškinimams generuoti. Taip pat patobulinome pagrindines programinės įrangos kelio / genomo duomenų bazių valdymo galimybes, suteikdami naujus kelių organizmų paieškos įrankius organizmų bendruomenėms, patobulinome grafikos atvaizdavimą, greitesnį našumą ir perkurtus genų bei metabolitų puslapius.


II AUTOLOGINĖS IPSC PAGRĮSTOS LĄSTELIŲ TERAPIJA PLĖTRA PAŽANGA

Nuo 2014 m., kai 2014 m. buvo atlikta pirmoji autologinių iPSC gautų ląstelių transplantacija žmogui, pastaruoju metu padaugėjo pastangų į kliniką pritaikyti autologinius iPSC pagrindu veikiančius gydymo būdus (1 pav.). Šiame skyriuje ir 1 lentelėje pateikiami šiuo metu kuriamų autologinių iPSC pagrindu veikiančių ląstelių terapijų pavyzdžiai ir nėra baigtinis sąrašas (1 lentelė).

Vargonai Indikacija Ląstelių produktas Pradinės medžiagos ir pasirinktos technikos perprogramavimas Scena Tyrėjas, institucija Šalis
Akis Sausa su amžiumi susijusi geltonosios dėmės degeneracija Tinklainės pigmento epitelio ląstelių lapas ant PLGA pastolių CD34+ ląstelės, epizominės plazmidės I/IIa etapas Kapil Bharti, NIH / NEI JAV
Akis Drėgna su amžiumi susijusi geltonosios dėmės degeneracija Tinklainės pigmento epitelio ląstelių lapas Fibroblastai, epizominės plazmidės 1 pacientas gavo dozę (2014 m.) Masayo Takahashi, RIKEN Japonija
Smegenys Parkinsono liga Dopaminerginės progenitorinės ląstelės Fibroblastai, epizominės plazmidės 1 pacientas gavo dozę (2018 m.) Kwang-Soo Kim, McLean ligoninė / Harvardo medicinos mokykla JAV
Smegenys Parkinsono liga Dopaminerginiai neuronai Fibroblastai, pasirinktas metodas nenurodytas leidinyje Pasiruošimas IND Jeanne Loring, Aspen Neuroscience JAV
Smegenys Parkinsono liga Dopaminerginiai neuronai Pasirinkta metodika, skirta tyrimams su žmonėmis, publikacijoje nenurodyta Paskelbti nežmoginių primatų tyrimai, ruošiantis IND Ole Isacson ir Penny Hallett, McLean ligoninės / Harvardo medicinos mokyklos neuroregeneracijos tyrimų institutas JAV
Kraujas Trombocitopenija Trombocitai Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės, epizominės plazmidės 1 pacientas gavo kartotines dozes (2019–2020 m.) Koji Eto, Kioto universitetas Japonija
Oda Recesinė distrofinė buliozinė epidermolizė Genų redaguoti keratinocitai ir fibroblastai Fibroblastai, RNR Vykdomi pelių tyrimai, ruošiamasi IND Dennisas Roopas, Gateso regeneracinės medicinos centras Ganna Bilousova ir Igoris Kogutas, Kolorado universiteto medicinos mokykla JAV
Oda Recesinė distrofinė buliozinė epidermolizė Genų redaguoti keratinocitai ir fibroblastai Fibroblastai, epizominės plazmidės Paskelbti pelių tyrimai, ruošiamasi IND Angela Christiano, Kolumbijos universitetas JAV
Oda Recesinė distrofinė bullosa epidermolizė Genų redaguoti keratinocitai ir fibroblastai Fibroblastai ir keratinocitai, akcizais apmokestinamas lentivirusinis metodas perprogramavimui, akcizuojamas AAV metodas genų redagavimui Paskelbti pelių tyrimai, ruošiamasi IND Anthony Oro iš Stanfordo universiteto JAV
Oda Plaukų slinkimas Iš nervinio keteros kilusios odos papilės Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės, Sendai virusas Paskelbti pelių tyrimai, ruošiamasi IND Alexey Terskikh, Sanford Burnham Prebys medicinos atradimų institutas / Stemson Therapeutics JAV
Raumuo Raumenų distrofijos Miogeninės kamieninės ląstelės Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės Iš FDA gavo retųjų vaistų paskyrimą, ruošiamasi IND Douglasas Falkas, Vita Therapeutics JAV
Akis Degeneraciniai tinklainės sutrikimai (pvz., pigmentinis retinitas) Fotoreceptorių pirmtakai Fibroblastai, Sendai virusas Paskelbti pelių tyrimai Budd Tucker iš Ajovos universiteto JAV
  • a 1 lentelėje pateiktas autologinių iPSC pagrindu sukurtų ląstelių terapijų pavyzdys. Čia parodytos perprogramavimo pradinės medžiagos ir pasirinkti perprogramavimo metodai yra pagrįsti turimais leidiniais ir gali keistis programoms tobulinant klinikos link.

A Indikacijos, skirtos autologiniam iPSC ląstelių persodinimui žmogui

I iPSC gautos tinklainės pigmento epitelio ląstelės, skirtos su amžiumi susijusiai geltonosios dėmės degeneracijai

Iš iPSC gautos tinklainės pigmento epitelio ląstelės (RPE) buvo pirmasis autologinis iš iPSC gautas ląstelių tipas, persodintas žmogui, kurį 2014 m. atliko Masayo Takahashi komanda RIKEN vystymosi biologijos centre Japonijoje (Mandai ir kt., 2017 Schweitzer). ir kt., 2020). Ši transplantacija buvo atlikta siekiant gydyti su amžiumi susijusią geltonosios dėmės degeneraciją (AMD), lėtinę ligą, kuriai būdingas RPE ląstelių degeneracija ir kuri yra pagrindinė vyresnių nei 60 metų asmenų regėjimo praradimo priežastis (Sharma, Bose, Maminishkis ir Bharti, 2020). Yra trys pagrindinės priežastys, kodėl RPE buvo pirmasis iš iPSC gautas persodinimas: (1) akį gana lengva atvaizduoti ir pasiekti chirurginiu būdu (2) RPE buvo pirmasis akies ląstelių tipas, kuris buvo atskirtas nuo iPSC. 2009 m. po žymaus publikacijos, demonstruojančios iPSC generavimą (Buchholz ir kt., 2009), ir (3) ankstesni chirurginiai eksperimentai parodė koncepciją, palaikančią AMD autologinę ląstelių terapiją. Šių eksperimentų metu RPE iš sveikos AMD paciento akies srities buvo pašalintos ir persodintos į degeneruotą tos pačios akies sritį (Van Meurs ir kt., 2004 Van Zeeburg, Maaijwee, Missotten, Heimann ir Van Meurs, 2012 m. ). Tai buvo sudėtingos operacijos, reikalaujančios didelių įgūdžių ir tikslumo, kurios galiausiai lėmė dalinį regėjimo atsigavimą.

Atlikdama novatorišką tyrimą, Takahashi komanda persodino 1,3 × 3 mm dydžio iPSC-RPE lapą po 77 metų moters, sergančios neovaskuline („šlapia“) AMD, dešinės akies duobe (Mandai ir kt., 2017). . iPSC buvo perprogramuoti iš fibroblastų naudojant neintegruojančius epizominius vektorius, diferencijuoti į RPE 6 savaičių procesu, naudojant nukreiptų ir spontaniškų diferenciacijos metodų derinį, o po to išgryninti ir išplėsti per 6 savaites (Kamao ir kt., 2014). Mandai ir kt., 2017 Osakada, Ikeda, Sasai ir Takahashi, 2009 Osakada ir kt., 2009). Per 8 savaites pasirinktos RPE kolonijos buvo pasėtos ant kolagenu padengto transwell, kad susidarytų RPE lapas, kuris buvo iškeltas iš transwell apdorojant kolagenu IV. Nuo odos audinių surinkimo iki RPE ląstelių lakštų išsiuntimo procesas truko ~10 mėnesių (Mandai ir kt., 2017). 4 metų stebėjimas parodė, kad iš iPSC gautas RPE lapas išliko ir buvo normalios morfologijos (Takagi ir kt., 2019). Pacientas nepatyrė jokių rimtų nepageidaujamų reiškinių, o tai rodo daug žadantį iPSC-RPE transplantacijų saugumo profilį. Nors regėjimas nepagerėjo, po operacijos paciento regėjimas išliko stabilus, nepaisant to, kad metais prieš operaciją jis nuolat mažėjo.

Nacionalinio sveikatos instituto Nacionalinio akių instituto Kapil Bharti komanda tęsė pastangas, kad pacientams būtų suteikta autologinė iPSC-RPE ląstelių terapija. Bharti komanda sukūrė klinikinio lygio iPSC gautus RPE pleistrus ant biologiškai skaidžių poli(pieno-ko-glikolio) rūgšties (PLGA) pastolių. PLGA pastoliai, unikalūs Bharti metodui, tarnauja keliems tikslams, įskaitant galimybę RPE sudaryti susiliejantį, teisingai poliarizuotą vienasluoksnį sluoksnį ir užtikrinti struktūrinį vientisumą, kad būtų lengviau transplantuoti. Pleistrai buvo sėkmingai persodinti į Karališkojo chirurgų koledžo (RCS) žiurkių ir lazeriu sukeltų RPE sužalojimų kiaulių modelius (Sharma ir kt., 2019). iPSC buvo sukurti iš CD34+ ląstelių, išskirtų iš pacientų periferinio kraujo, naudojant klinikinio lygio epizominio perprogramavimo protokolą (Mack, Kroboth, Rajesh ir Wang, 2011). Tada jie buvo diferencijuoti iki subrendusių RPE naudojant 11 savaičių trifazio vienasluoksnio diferenciacijos protokolą. RPE pirmtakai buvo praturtinti ir pasėti ant PLGA pastolių, kad subręstų paskutines 35 dienas. Vaizdo įrašymas praėjus 10 savaičių po transplantacijos patvirtino, kad PLGA pastoliai buvo veiksmingai susilpnėję. iPSC-RPE pleistras integruotas ir į žiurkių, ir į kiaulių modelius, netgi demonstruodamas funkcionalumą fagocituodamas fotoreceptorių išorinius lazdelės segmentus ir užkertant kelią viršutinių fotoreceptorių degeneracijai kiaulių modeliuose (Sharma ir kt., 2019). Nustačiusi iPSC-RPE ant PLGA karkaso tinkamumą ir veiksmingumą dideliame gyvūnų modelyje, 2020 m. NIH komanda pradėjo I/IIa fazės klinikinius tyrimus, siekdama patikrinti autologinės iPSC-RPE transplantacijos saugumą 20 sausų. AMD pacientai (nacionalinio klinikinio tyrimo numeris: NCT04339764). Šis klinikinis tyrimas yra pirmasis ir šio publikavimo metu vienintelis I/IIa fazės klinikinis tyrimas JAV, kurio metu tiriamos autologinės iPSC gautos ląstelės pacientams ir tuo pat metu atveriamos durys kitiems pastolių palaikomiems transplantacijos metodams naudojant iPSC- gautos ląstelės.

Ii iPSC gauti dopaminerginiai neuronai, skirti Parkinsono ligai

Antroji autologinė iš iPSC gauta ląstelių terapija, persodinta žmogui, buvo sudaryta iš iPSC gautų vidurinių smegenų dopaminerginių (mDA) progenitorinių ląstelių (mDAP), persodintų į 69 metų vyro, 10 metų sirgusio Parkinsono liga, putameną. PD) (Schweitzer ir kt., 2020). PD yra progresuojanti neurodegeneracinė liga, kuria serga maždaug 7–10 milijonų pacientų visame pasaulyje (Dorsey, Sherer, Okun ir Bloemd, 2018). Dopaminerginių neuronų degeneracija sukelia motorinius simptomus, tokius kaip drebulys ir bradikinezija. Iki to laiko, kai simptomai tampa pakankamai ryškūs, kad būtų galima nustatyti diagnozę, maždaug 60 % mDA neuronų yra išsigimę (Engelender ir Isacson, 2017 Osborn ir kt., 2020).Šiandieninė PD ląstelių terapijos plėtra grindžiama 30 ir daugiau metų eksperimentų istorija, kai vaisiaus mDA neuronai buvo persodinti PD sergantiems pacientams (Freed ir kt., 1992 Hagell ir kt., 2000 Hallett ir kt., 2014 Kefalopoulou ir kt.). , 2014 Kordower ir kt., 1998 Li ir kt., 2016 Lindvall ir kt., 1990 Mendez ir kt., 2005 Piccini ir kt., 1999 Redmond, Vinuela, Kordower ir Isacson, 2008). Ilgalaikiai stebėjimai ir duomenų rinkimas yra būtini norint įvertinti tokių transplantacijų saugumą ir veiksmingumą, nes ląstelėms gali prireikti mėnesių ar metų integruotis į paciento nervinius kelius (Barker, Barrett, Mason ir Björklund, 2013 m. Politis ir Piccini). , 2012 Politis ir kt., 2010). Vadinasi, tokių tyrimų, kaip Politis ir kt., vertė. vertinant saugumą ir veiksmingumą pacientams po 15+ metų po transplantacijos (Politis & Piccini, 2012 Politis ir kt., 2010). Nors stebimi pacientai vis dar kentė nuo kai kurių nemotorinių PD simptomų, susijusių su miego ir emocijų reguliavimu, motorinių simptomų palengvėjimas buvo ilgalaikis. Teigiamas pagerėjimas buvo įvertintas atliekant dopamino įsisavinimo PET neurovizualizaciją ir sumažintus balus pagal vieningą Parkinsono ligos vertinimo skalę (UPDRS). Be to, pacientų, kuriems prieš 4–14 metų buvo persodinti vaisiaus audiniai, smegenų audinių pomirtinis vaizdavimas atitiko šiuos klinikinius rezultatus, rodančius, kad persodintas audinys buvo sveikas, neatrofuotas ir išreiškė svarbius dopamino pernešėjus (DAT) (Hallett ir kt. ., 2014). Nors šios išvados yra daug žadančios, vaisiaus transplantaciją riboja etiniai ir praktiniai rūpesčiai, todėl pacientams reikia imunosupresijos. Šiuos iššūkius išspręstų autologinis iPSC pagrįstas požiūris į mDA ląstelių terapijos kūrimą.

2018 m. autologiniai iPSC gauti mDAP buvo persodinti pirmiausia į 69 metų PD sergančio paciento kairįjį pusrutulį, o po 6 mėnesių – į dešinįjį pusrutulį (Schweitzer ir kt., 2020). Šiam tyrimui vadovavo Kwang-Soo Kim McLean ligoninėje (Harvardo medicinos mokykloje), bendradarbiaudamas su Bobo Carterio ir Jeffo Schweitzerio komandomis Masačusetso bendrojoje ligoninėje. iPSC buvo sukurti iš fibroblastų, paimtų iš odos biopsijos ir diferencijuoti iki mDAP, naudojant geros gamybos praktikos (GMP) lygio 28 dienų protokolą (Song ir kt., 2020). 9 dieną ląstelės buvo apdorotos kvercetinu, kad būtų pašalinti visi nediferencijuoti iPSC. Pacientui būdingi iPSC-mDAP ir alogeniniai žmogaus ESC gauti mDAP buvo persodinti į alogenines humanizuotas peles ir pacientų humanizuotas peles, abi grupes be imunosupresijos. Pelės smegenų sekcijų vaizdavimas praėjus 2 savaitėms po transplantacijos parodė abiejų tipų transplantatų atmetimą alogeninėse humanizuotose pelėse ir tik pacientui būdingų iPSC-mDAP išgyvenimą pacientų humanizuotose pelėse. PD sergančio paciento klinikiniai matavimai buvo atlikti praėjus 1, 3, 6, 9 ir 12 mėnesių po transplantacijos, o vėliau – kas 6 mėnesius. Pats paciento nurodytas UPDRS balas sumažėjo nuo 60 implantacijos metu iki 2 per 24 mėnesių stebėjimą, o tai rodo simptomų pagerėjimą. Autoriai atsakingai perspėja nedaryti plataus masto išvadų iš vieno paciento tyrimo rezultatų. Vis dėlto, nesant rimtų nepageidaujamų reiškinių iki šiol, šis tyrimas yra svarbus žingsnis į priekį kuriant autologinį iPSC gautą ląstelių terapiją PD.

Autologines iPSC-mDA ląstelių terapijas PD taip pat kuria Ole Isacson ir Penelope Hallett, McLean ligoninės (Harvardo medicinos mokyklos) Neuroregeneracijos tyrimų instituto direktoriai, taip pat Aspen Neuroscience. 2015 m. Isacson ir Hallett komanda paskelbė pirmąjį funkcinių autologinių iPSC gautų dopamino neuronų demonstravimą po transplantacijos į nežmoginį primatų PD modelį (Hallett ir kt., 2015). Autologiniai iPSC buvo gauti iš trijų parkinsoninių cynomolgus beždžionių (CM). Norint patikrinti dviejų diferenciacijos protokolų veiksmingumą, vienas CM ląstelių mėginys buvo diferencijuojamas naudojant Cooper ir kt. 49 dienų protokolą. (2010), o likę du CM ląstelių mėginiai buvo diferencijuoti naudojant Sundberg ir kt. 30 dienų protokolą. (2013). Ląstelės buvo persodintos į parkinsonizmo CM putameną be imunosupresijos. Į PD panašių motorinių simptomų pagerėjimas buvo pastebėtas jau praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos ir iki 2 metų. PET neurovizualizavimas parodė DAT surišimo vietų padidėjimą (Hallett ir kt., 2015). Smegenų pomirtinė analizė praėjus 2 metams po operacijos parodė įskiepytų dopaminerginių neuronų išgyvenimą ir svarbių žymenų ekspresiją. Isacson ir Hallett komanda taip pat pademonstravo funkcinį pagerėjimą po transplantacijos nežmoginių primatų modeliuose su 8 metų lėtine PD, kaip dalį ikiklinikinių tyrimų, skirtų autologinei iPSC pagrįstai ląstelių terapijai PD gydyti (Osborn ir kt., 2020). Jiems neseniai buvo suteikta 6 mln. USD dotacija iš NIH, skirta paremti jų žmogaus atliekamus tyrimus, kuriuose bus naudojami autologiniai iPSC kaip pradinė ląstelių terapijos produkto medžiaga.

Jeanne Loring iš Scripps tyrimų instituto 2018 m. įkūrė Aspen Neuroscience, kuri surinko 70 mln. USD A seriją, kad sukurtų autologinę iPSC pakaitinę neuronų terapiją PD (Loring, 2018). Aspen Neuroscience generuoja iPSC iš odos fibroblastų, naudodama patentuotą dirbtiniu intelektu (AI) pagrįstą modelį pluripotencijai įvertinti (Müller ir kt., 2011). Aspen turi du iPSC gautus ląstelių tipus: autologinį iPSC-DA neuronų terapiją, skirtą idiopatinei PD, kuria serga 85–90% PD, ir autologinį genų modifikuotą iPSC-DA neuronų terapiją genetiniam PD. kuris paveikia 10–15 % PD gyventojų ir atitinka JAV maisto ir vaistų administracijos (FDA) retųjų vaistų priskyrimą (Federoff, 2020). Loringo komanda naudoja dopamino neuronų diferenciacijos protokolus ir genomika pagrįstą kokybės kontrolės (QC) analizę, kad įvertintų paciento specifinių iPSC linijų ir iPSC gautų ląstelių saugumą (Bhutani ir kt., 2016 Loring, 2018). Rengdamasi naujojo tiriamojo vaisto (IND) pateikimui, kad būtų pradėti klinikiniai tyrimai, Loringo komanda sukūrė iPSC iš 10 pacientų ir sukūrė galutinio ląstelių produkto QC išleidimo kriterijus (Loring, 2018).

Iii iš iPSC gauti trombocitai trombocitopenijai gydyti

Trečioji autologinių iPSC ląstelių transplantacija žmogui buvo vieno paciento tyrimas, kuriam vadovavo Koji Eto komanda CiRA, bendradarbiaudama su Kioto universitetine ligonine, 2019 m. (klinikinio tyrimo identifikavimo numeris: jRCTa050190117). Pacientas sirgo aplazine anemija – reta liga, kuriai iš dalies būdinga trombocitopenija (mažas trombocitų skaičius) ir komplikuotas trombocitų perpylimo atsparumas (PTR) (Hod & Schwartz, 2008 Stasi, 2012). Kraujo donorų trombocitų alotransfuzija yra standartinis trombocitopenijos gydymas (Estcourt ir kt., 2018). Tačiau nuo 5 % iki 15 % pacientų, kuriems atliekama trombocitų perpylimas, išsivysto atsparumas ugniai, kai dėl aloimuninio atsako atmetami su imunitetu nesuderinami trombocitai (Pavenski ir kt., 2013 Saito ir kt., 2002 Stanworth, Navarrete, Estcourt). ir Marsh, 2015).

Pacientas gavo tris autologinių iPSC gautų trombocitų dozes: 1 × 10 10 trombocitų, 3 × 10 10 trombocitų po 3 mėnesių ir 1 × 10 11 trombocitų praėjus 5 mėnesiams po antrosios dozės. iPSC buvo sukurti naudojant periferinio kraujo mononuklearines ląsteles (PBMC) ir epizomines plazmides. Tada iPSC buvo diferencijuoti į megakariocitus, kurie buvo išplėsti ir užšaldyti kaip pagrindinis ląstelių bankas (MCB). Tada megakariocitai gali būti atšildyti, padauginti iki 10 9–10 10 ląstelių ir diferencijuoti į trombocitus bioreaktoriuje prieš pat perpylimą. Ruošiantis transfuzijai, iPSC gauti trombocitai buvo išgryninti, sukoncentruoti, nuplauti ir apšvitinti. 2021 m. pradžioje planuojamas 1 metų stebėjimas, kuriuo bus įvertintas vieno paciento tyrimo saugumas ir veiksmingumas (klinikinio tyrimo identifikavimo numeris: jRCTa050190117 Klinikinis tyrimas, skirtas autologinių iPS ląstelių kilmės trombocitų perkėlimui trombocitopenija sergančiam pacientui, 2020).

B Indikacijos ankstesnėse (ikiklinikinėse) vystymosi stadijose

I iPSC gauti keratinocitai ir fibroblastai, skirti epidermolizei bullosa

Paveldima epidermolizė bullosa (EB) yra retų, nepagydomų, gyvybei pavojingų odos ligų, kurioms būdingas didelis pūslių susidarymas ir randai, grupė (Fine, 2010). Lėtinės odos žaizdos yra panašios į terminius ar cheminius nudegimus. Simptomų sunkumas skiriasi įvairiuose potipiuose ir tarp jų, kai kurie iš jų baigiasi mirtimi ankstyvoje kūdikystėje. Didžioji dalis galimo gydymo yra orientuota į skausmo valdymą, tačiau keli in vitro ir in vivo tyrimai, naudojant pelių modelius, palaiko ląstelinį terapinį metodą (Bilousova ir Roop, 2014 Jacków ir kt., 2019 Sebastiano ir kt., 2014 Shinkuma, 2015 Tolar). ir kt., 2014 Torkelson ir kt., 2019 Umegaki-Arao ir kt., 2014 Vanden Oever, Twaroski, Osborn, Wagner ir Tolar, 2018 Wenzel ir kt., 2014). Oda yra idealus organas kuriant ląstelinę terapiją: panašiai kaip akis, ji lengvai pasiekiama ir lengvai stebima. Kiekvienas EB potipis yra susijęs su įvairiomis genetinėmis mutacijomis, kurias reikėtų koreguoti taikant autologinių ląstelių terapiją (Fine, 2010). Kelios tyrimų grupės kuria autologinius genais redaguotus iPSC išvestus ląstelių terapijos būdus EB gydymui (Jacków ir kt., 2019 Roop, Bilousova ir Kogut, 2019 Sebastiano ir kt., 2014).

Angelos Christiano komanda Kolumbijos universitete naudojo epizominius vektorius, kad gautų iPSC iš dviejų pacientų, sergančių recesyviniu distrofiniu EB (RDEB), fibroblastų. RDEB yra sunkus potipis, kuriam būdingos mutacijos, turinčios įtakos VII tipo kolageno gamybai (Jacków ir kt., 2019). Jacków ir kolegos išbandė ir plazmidės, ir ribonukleoproteinų pagrindu sukurtus CRISPR-Cas9 metodus, skirtus genų redagavimui, ir diferencijavo genų koreguotus iPSC tiek keratinocitams, tiek fibroblastams, naudodami atitinkamai 60 ir 30 dienų protokolus. 3D žmogaus odos ekvivalentams (HSE) sukurti buvo naudojami iPSC gauti keratinocitai ir fibroblastai. Įskiepytos į imunodeficito turinčias peles, HSE parodė funkcinį kolageno ekspresijos atkūrimą ir normalią odos morfologiją. Praėjus 9 mėnesiams po persodinimo, auglių nebuvo pastebėta, o tai yra daug žadantis rezultatas kuriant saugią ląstelių terapiją.

Anthony Oro komandai Stanfordo universitete Kalifornijos regeneracinės medicinos institutas (CIRM) gavo 5 mln. USD dotaciją, skirtą autologiniam genų redaguotai iPSC pagrįstai RDEB ląstelių terapijai išversti į kliniką (Oro, n.d.). Savo 2014 m. publikacijoje Oro komanda naudojo akcizais apmokestinamo lentivirusinio perprogramavimo metodą, kad sukurtų GMP lygio iPSC iš paciento specifinių odos biopsijų (Sebastiano ir kt., 2014). Mutuotas genas buvo pataisytas naudojant akcizais pagrįstą adeno-associated viruso (AAV) metodą. ∼ 110 dienų protokolas buvo naudojamas norint diferencijuoti genų pakoreguotus iPSC į keratinocitus, kurie sėkmingai suformavo odos lakštus in vitro. Iš iPSC gauti keratinocitai taip pat galėjo atstatyti subrendusią odą, kai buvo skiepytos pelėms, kurių imunitetas susilpnėjęs, ir transplantatai išgyveno 3 savaites po transplantacijos. Finansavimas iš CIRM dotacijos bus naudojamas papildomiems tyrimams in vivo atlikti ruošiantis susitikimui su FDA prieš IND.

Gannos Bilousovos ir Igorio Koguto komandos Kolorado universiteto medicinos mokykloje, bendradarbiaudamos su Dennisu Roopu, Gateso regeneracinės medicinos centro direktoriumi, taip pat verčia autologinę iPSC pagrįstą terapiją į RDEB kliniką. Kogut ir jo kolegos sukūrė kliniškai svarbią RNR technologiją, galinčią perprogramuoti ~90% individualiai padengtų žmogaus pirminių fibroblastų, o tai yra precedento neturinti aukšta, atsižvelgiant į tai, kad perprogramavimo efektyvumas paprastai yra procentinės dalys arba vienženkliai (Kogut ir kt., 2018). Bilousova ir jo kolegos buvo pirmieji, kurie paskelbė demonstraciją apie pelių iPSC diferenciaciją į keratinocitus, o tai yra svarbus žingsnis siekiant iPSC gautų EB ląstelių terapijų tobulinimo klinikoje. Kolorado universiteto komanda šiuo metu kuria sudėtinius odos transplantatus iš paciento specifinių iPSC gautų keratinocitų ir fibroblastų transplantacijai (Roop ir kt., 2019). Perprogramavimas ir genų korekcija atliekami vienu metu naudojant patentuotą RNR technologiją. Gauti genų redaguoti iPSC yra diferencijuojami į keratinocitus ir fibroblastus (Kogut ir kt., 2018 Roop ir kt., 2019). Kolorado universiteto komanda šiuo metu tiria AVITA Medical purškiamo aplikatoriaus, skirto iPSC gautų keratinocitų ir fibroblastų pristatymui RDEB pelių modeliuose, galimybes (Roop ir kt., 2019 Sood et al., 2015).

Ii iPSC / iš nervinio keteros išvestos odos papilės alopecijai gydyti

Plaukų slinkimas arba alopecija yra rimta problema, kuri paveikia beveik 20 % gyventojų. Tyrimai, vertinantys plaukų slinkimo įtaką gyvenimo kokybei, atskleidžia ilgalaikį neigiamą poveikį, įskaitant žemą pasitikėjimą savimi, padidėjusią savimonę ir padidėjusį depresijos paplitimą (Marks ir kt., 2019 Schmitt, Ribeiro, Souza, Siqueira, ir Bebberis, 2012 Williamson, Gonzalez ir Finlay, 2001). Folikulų vieneto išskyrimas (FUE), kai atskiri folikuliniai vienetai paimami iš vieno paciento galvos odos regiono ir persodinami į kitą to paties paciento galvos odos dalį, yra minimaliai invazinis plaukų persodinimo sprendimas (Rassman ir kt., 2002). Ši procedūra leidžia patvirtinti autologine ląstelių terapija pagrįstą plaukų slinkimo metodą. Tačiau pacientams, kuriems yra stiprus plaukų slinkimas, gali neužtekti folikulų FUE transplantacijai. Autologinis iPSC pagrįstas metodas išsprendžia šią problemą, todėl galima sukurti didelius kiekius pacientui būdingų plaukų folikulų, skirtų pacientams, kenčiantiems nuo stipraus plaukų slinkimo, gydyti. Stemson Therapeutics, pagrįsta technologija, sukurta Aleksejaus Terskicho laboratorijoje Sanford Burnham Prebys medicinos atradimų institute, laikosi tokio požiūrio (Gnedeva ir kt., 2015). Gnedeva ir kolegos sukūrė dviejų fazių 28 dienų protokolą, skirtą ESC ir iPSC diferencijuoti, kad priliptų prie plaukus sukeliančių odos papilių (DP) ląstelių per tarpinę nervų keteros (NC) ląstelių stadiją (Gnedeva ir kt., 2015). 5 × 10 5 ESC-DP ląstelių suspensijos buvo sujungtos su 5 × 10 5 epidermio ląstelių suspensijomis ir sėkmingai persodintos į imunodeficitą turinčias peles, parodydamos gebėjimą indukuoti plaukų folikulų susidarymą in vivo, o tai yra įdomus žingsnis link iPSC gautų plaukų transplantacijų. pacientų.

Iii iš iPSC gautos miogeninės kamieninės ląstelės raumenų distrofijoms gydyti

Raumenų distrofijos – tai grupė genetinių sutrikimų, kuriems būdingas raumenų nykimas: raumenų susilpnėjimas ir susitraukimas dėl raumenų masės praradimo (Emery, 2002). Raumenų ląstelių transplantacijos į raumenų distrofijos pelių modelius datuojamos 1989 m., o teigiami rezultatai patvirtina ląstelių terapijos metodą (Partridge, Morgan, Coulton, Hoffman ir Kunkel, 1989 Tedesco ir kt., 2012). Tačiau heterologinė mioblastų transplantacija žmonėms nepagerino funkcinių patobulinimų, šiuos rezultatus iš dalies lemia imuninis atmetimas, o tai rodo, kad autologinis metodas gali būti perspektyvesnis (Skuk ir Tremblay, 2003 Sun, Serra, Lee ir Wagner, 2020). Įvairioms distrofijoms būdingos specifinės genetinės mutacijos, o tai reiškia, kad autologiniam metodui reikėtų redaguoti genus (Emery, 2002 Ghaoui ir kt., 2015). Vita Therapeutics, įkurta Johnso Hopkinso universitete ir remiantis technologijomis, kurias sukūrė Gabsang Lee iš Johns Hopkins medicinos mokyklos ir Kathryn Wagner iš Kennedy Krieger instituto, kuria genų modifikuotų ląstelių terapiją, skirtą ligotiems ir prarastiems raumenų audiniams regeneruoti (JAV patentas Nr. 15/781 709, 2016). Naudojant iPSC technologijos ir genomo redagavimo derinį, pacientui būdingos ląstelės diferencijuojamos į miogenines kamienines ląsteles, galinčias asimetriškai dalytis, kad susidarytų papildomos palydovinės ląstelės ir mioblastai (Choi ir kt., 2016 Sun ir kt., 2020). Tada mioblastai gali susilieti, efektyviai regeneruodami raumenų skaidulas (Sun ir kt., 2020). „Vita Therapeutics“ siekia nukreipti į konkrečius raumenų distrofijų tipus, įskaitant galūnių juostos raumenų distrofijas (LGMD), kurios yra labiausiai nevienalytės raumenų distrofijos, ir neseniai iš FDA gavo retųjų vaistų pavadinimą, kad būtų pradėtas klinikinis tyrimas, kuriame būtų vertinamas iPSC gautos medžiagos naudojimas. miogeninės kamieninės ląstelės, skirtos Diušeno raumenų distrofijai (DMD), kuri yra dažniausia raumenų distrofijos forma ir paprastai paveikia jaunus berniukus (Emery, 2002 Sun ir kt., 2020).

Iv iPSC gauti fotoreceptorių pirmtakai tinklainės degeneraciniam aklumui gydyti

Tinklainės degeneraciniams sutrikimams, tokiems kaip pigmentinis retinitas, Stargardt liga ir įgimta Leberio amaurozė, būdingas nepagydomas aklumas, atsirandantis dėl šviesos jutimo fotoreceptorių disfunkcijos arba praradimo (den Hollander, Roepman, Koenekoop ir Cremers, 2008 Hartong, Berson ir & Dryja, 2006 Tsang & Sharma, 2018). Daugeliu atvejų tinklainės vidinio sluoksnio neuronai, kurių užduotis yra sujungti fotoreceptorius su smegenimis, lieka nepažeisti po fotoreceptorių degeneracijos, skatinant fotoreceptorių transplantacija pagrįstą ląstelių terapijos metodą (Cideciyan ir kt., 2007). Mullins ir kt., 2012). Mažiausiai du tyrimai parodė, kad lavoninių fotoreceptorių transplantacijos žmonėms, sergantiems pigmentiniu retinitu, techninis įgyvendinamumas ir saugumas, jei ne veiksmingumas (Berger, Tezel, Del Priore ir Kaplan, 2003 Kaplan, Tezel, Berger, Wolf ir Del Priore, 1997). ). Keletas tyrimų parodė, kad persodintų PSC fotoreceptorių pirmtakų gebėjimas atkurti tinklainės funkciją ir pagerinti regėjimą tinklainės degeneracijos gyvūnų modeliuose (Lamba, Gust ir Reh, 2009 Pearson ir kt., 2012 Tucker ir kt., 2011). Taikant autologinį metodą būtų galima išvengti kai kurių problemų, lemiančių prastą ilgalaikį išgyvenamumą po transplantacijos, kurią iš dalies gali lemti imuninis atsakas (Santos-Ferreira, Borsch ir Ade, 2017 West ir kt., 2010). Buddo Tuckerio laboratorija Ajovos universitete sukūrė dabartinį GMP (cGMP) lygio protokolą, skirtą pacientui specifiniams iPSC ir fotoreceptorių pirmtakams generuoti, kad būtų galima plėtoti autologinį metodą. Fibroblastų mėginiai buvo paimti iš 35 pacientų, kuriems buvo paveldėta tinklainės degeneracija, ir išplėsti cGMP atitinkančiomis sąlygomis (Wiley ir kt., 2016). Sendai virusas buvo naudojamas iPSC klonams iš pacientų mėginių generuoti. iPSC buvo diferencijuoti naudojant ∼ 16 savaičių 3D suspensijos protokolą, todėl tinklainės organoidai daugiausia sudaryti iš postmitotinių fotoreceptorių pirmtakų ląstelių. iPSC gauti fotoreceptorių pirmtakai iš aštuonių skirtingų pacientų buvo persodinti į peles, kurių imunitetas nusilpęs. Dėl transplantacijų auglys nesusiformavo ir galutinėje ląstelių populiacijoje nebuvo pluripotentinių ląstelių, o tai yra svarbus ląstelių terapijos produktų susirūpinimas (Wiley ir kt., 2016).


Impulsu pažymėtų DNR molekulių struktūrinė analizė

Vienas iš būdų yra pažymėti naujai susintetintą DNR asinchroninėje DNR molekulių populiacijoje trumpą laiką (vadinamą impulsų žymėjimas ), izoliuoti baigtas DNR molekules ir tada stebėti radioaktyviosios žymės atsiradimą konkrečiuose restrikcijos fragmentuose. Kadangi molekulės nesikartoja sinchroniškai, kai kurios DNR molekulės bus užbaigtos trumpo impulso žymėjimo metu, o kitos įtrauks radioaktyvųjį žymenį viduje. Kaip parodyta 6.2 pav., tos DNR molekulės, kurios baigė replikaciją trumpo impulso žymės metu, turės radioaktyvią žymę restrikcijos fragmente, kuriame yra replikacijos galas. Kai replikuojančios molekulės žymimos ilgesnį laiką (ilgesnis impulsas), užbaigtos DNR molekulės turės radioaktyvią žymę ne tik restrikcijos fragmentuose, turinčiuose galą, bet ir gretimuose fragmentuose. Replikacijos pradžia bus pažymėta tik tada, kai impulso laikas pratęsiamas iki laikotarpio, reikalingo pilnai DNR molekulės sintezei. Taigi šioje procedūroje, kai asinchroniškai besidauginančios molekulės žymimos ilgėjančių impulsų periodų serijai ir užbaigtos DNR molekulės tiriamos kiekvieno impulso pabaigoje, replikacijos galas bus pažymėtas anksčiausiais laiko momentais, o tos, kuriose yra kilmė bus pažymėta paskutinė.

6.2 pav. Radioaktyvumo pasiskirstymas impulsu pažymėtose dukterinėse DNR molekulėse skirtingais sintezės laikais. Plonos juodos horizontalios linijos žymi nepažymėtas, besikartojančias DNR molekules įvairiuose užbaigimo etapuose. Kilmė (ori) yra kairėje, o galas (terminas) yra dešinėje. Storos pilkos linijos yra radioaktyviai pažymėtos besidauginančių DNR molekulių dalys. Po 5 minučių impulso kai kurios DNR molekulės, parodytos 0 laiku, baigė sintezę. Jie surenkami, virškinami restrikcijos endonukleaze vertikaliomis linijomis pažymėtose vietose. Atkreipkite dėmesį, kad restrikcijos fragmentai, kuriuose yra replikacijos galas, po trumpo impulso turės radioaktyvią žymę. Trečiame skydelyje rodomi ilgesnio impulsinio ženklinimo laikotarpio rezultatai. Ženklinimo laikas buvo pakankamai ilgas, kad molekulės, kurios inicijavo sintezę po radioaktyviosios etiketės pridėjimo, užbaigtų sintezę. Šios pastarosios molekulės turės etiketę restrikcijos fragmentuose, kuriuose yra kilmė. Taigi šiame protokole etiketė rodoma restrikcijos fragmentuose, kuriuose yra kilmė tik ilgesniu impulso periodu.

Ši koncepcija kilo iš metodo, kurį Dintzis naudojo baltymų sintezės krypčiai matuoti septintojo dešimtmečio viduryje (žr. V skyrių trečiojoje dalyje). Tai gali būti painu, todėl pabandykime analogiją. Įsivaizduokite, kad 20 studentų rašo esė naudodami teksto rengyklę, kurioje naudojamos juodos raidės. Jie visi yra skirtinguose savo darbų baigimo etapuose ir neperžiūri ir neredaguoja savo esė – tik rašo juos nuo pradžios iki pabaigos. Nustatytu laiku visos teksto rengyklės perjungiamos į raudonas raides. Kai kiekvienas mokinys baigia savo darbą, jis juos atspausdina ir grąžina. Studentų, kurie buvo beveik baigti, kai buvo pakeista šrifto spalva, rašinių pabaigoje bus tik raudonas tekstas. Studentų, kurie buvo įpusėję savo rašinį, kai spalva buvo pakeista, rašinių paskutinė pusė bus raudona. Studentų, kurie tik pradėjo rašyti, kai buvo pakeista raidės spalva, tekstas bus raudonas, įskaitant pradžią. Raidžių perjungimas į raudoną yra analogiškas impulsiniam DNR molekulių žymėjimui radioaktyvumu. Kaip rašinių, baigtų netrukus po spalvos pasikeitimo, tekstas bus raudonas tik pabaigoje, taip DNR molekulės, kurios baigia replikaciją trumpo impulso etiketės metu, turės radioaktyvią etiketę savo gale.

Kai aštuntojo dešimtmečio pradžioje buvo atrasti restrikcijos fermentai, Dana ir Nathans suprato, kad gali juos panaudoti žinduolių poliomos virusui 40 (SV40) padalinti į atskirus fragmentus. Jie naudojo šią impulsų žymėjimo procedūrą, kad nustatytų viruso DNR sintezės kilmę ir galus. Beždžionių ląstelės, augančios kultūroje, buvo užkrėstos SV40 ir po to 5, 10 ir 15 minučių impulsiniu būdu pažymėtos [3H]timidinu. Užbaigtos virusinės DNR molekulės buvo išskirtos, suvirškintos restrikcijos endonukleazėmis iš H. gripas ( mišinys iš Hind II ir Hind III), atskirtas ant poliakrilamido gelio ir nustatytas į DNR įtraukto [3H] kiekis. Norint normalizuoti skirtingus restrikcijos fragmentų dydžius ir bazių sudėtį, [3H] skaičius buvo padalintas iš [32P] kiekio tuose pačiuose restrikcijos fragmentuose iš DNR, vienodai pažymėtos [32P]fosfatu. Kaip aptarta aukščiau, kai impulsinio žymėjimo ilgis yra trumpesnis nei laikas, reikalingas pilnai DNR molekulės sintezei, etiketė pirmiausia atsiras fragmentuose, esančiuose arčiau galo. Kai atsiranda impulsu pažymėta (naujai susintetinta) DNR baigtas DNR molekulėse buvo pastebėtas etiketės gradientas visose užbaigtose molekulėse, kaip parodyta toliau pateiktuose paveiksluose ir lentelėje, pritaikytoje iš jų popieriaus.

6.3 pav. SV40 apribojimų žemėlapis

6.1 lentelė. Radioaktyvaus žymens atsiradimas užbaigtų SV40 DNR molekulių restrikcijos fragmentuose. Santykinis impulsų žymės kiekis iš kiekvieno restrikcijos fragmento pateiktas žemiau (santykinis impulsinės etiketės kiekis yra kiekvieno fragmento 3 H/32 P santykis, pakoreguotas pagal timidino kiekį ir normalizuotas iki 1 fragmentui A).


Rezultatai

Rekombinantinės C. thermocellum padermės, ekspresuojančios sekrecinę LC-kutinazę, konstravimas

Termofilinė kutinazė (LCC) iš pradžių buvo išskirta iš augalų komposto metagenomo (Sulaiman, ir kt., 2012) ir pasižymi dideliu PET skaidymo aktyvumu iki 70°C temperatūroje (Sulaiman, ir kt., 2014 Wei, ir kt., 2019b). Taigi LCC buvo pasirinktas išreikšti C. thermocellum. C. thermocellum yra žinomas dėl savo gebėjimo labai efektyviai skaidyti lignoceliuliozę, gaminant tarpląstelinę daugelio baltymų struktūrą – celiuliozę (Yoav, ir kt., 2017). Kadangi egzogliukanazė Cel48S yra gausiausias celiuliozės komponentas C. thermocellum (Liu, ir kt., 2018), Cel48S signalo peptidų seka buvo naudojama sekrecinei LCC gamybai. Be to, stiprus promotorius iš konstituciškai išreikšto geno Clo1313_2638 (Olson, ir kt., 2015), buvo pasirinktas siekiant gauti aukšto lygio LCC ekspresiją C. thermocellum. Kaip parodyta 1A pav., plazmidė pHK-LCC buvo sukurta po PGR patikrinimo ir transformuota į C. thermocellum DSM1313, kad būtų sukurta tikslinė padermė DSM1313::pHK-LCC.

LCC ekspresuojančios plazmidės pHK-LCC konstravimas ir aktyvios LCC ekstraląstelinė ekspresija C. thermocellum.

A. pHK-LCC konstrukcija. SP, signalinis peptidas, P2638, promotoriaus seka iš geno Clo1313_2638, Ter, terminatorius, Rep Ori, replikono kilmė E. coli, RepB, ​​replikono kilmė C. thermocellum, CAT, tiamfenikoliui atsparus genas. Konstrukcijos „P2638-SP-lcc' buvo patikrintas PGR naudojant pradmenis seqF/R, o teorinis PGR produkto dydis buvo 1,3 kb. PGR produkto gelio analizė parodyta dešinėje.

B. DSM1313 ir DSM1313 ląstelių lizatų ir ekstraląstelinių baltymų SDS-PAGE analizė: pHK-LCC, nudažytas Coomassie Brilliant Blue.

C. Baltymų gelio, palyginti su 1-naftilacetatu, greito raudonumo dažymo dažais analizė, siekiant vizualizuoti esterolitinį aktyvumą. 1 ir 2 juostos, DSM1313 ir DSM1313::pHK-LCC kultūros supernatantas, atitinkamai 3 ir 4 juostos, atitinkamai DSM1313 ir DSM1313::pHK-LCC ląstelių lizatas. Kiekvienoje juostoje buvo įdėta dešimt µg baltymų.

Tiek modifikuota padermė, tiek laukinio tipo padermė DSM1313, kuri buvo neigiama kontrolė, buvo auginami GS-2 terpėje, siekiant ištirti LCC baltymo ekspresiją ir sekreciją. Remiantis Fast-Red dažais pagrįsto dažymo rezultatais (1C pav.), DSM1313::pHK-LCC supernatante aktyvus LCC buvo matomas kaip violetinė baltymo juosta maždaug 28 kDa, bet neaptikta atitinkamame ląstelių lizate. tai rodo, kad pagamintas LCC baltymas buvo sėkmingai išskirtas ekstraląsteliniu būdu kultūros supernatante. Priešingai, laukinio tipo padermės intra- arba ekstraląsteliniuose baltymuose LCC aktyvumo nepastebėta. Šie rezultatai parodė funkcinę LCC kaip visiškai sekrecinio baltymo ekspresiją C. thermocellum DSM1313::pHK-LCC.

PET ir PET hidrolizatų įtaka C. thermocellum augimui

Clostridium thermocellum Remiantis genomo informacija, jis neturi natūralios PET skaidymo ir asimiliacijos galimybės. Fermentinis PET skaidymas išskirs TPA ir EG kaip monomerines PET polimerų žaliavas (Wei & Zimmermann 2017a, 2017b), kurios gali turėti įtakos PET augimui. C. thermocellum. Eksperimentinėje sąrangoje anaerobiniame stikliniame mėgintuvėlyje, kuriame iš viso yra 10 ml auginimo terpės, panaudojome 50 mg PET plėvelių. Todėl apskaičiuota, kad teorinė didžiausia TPA ir EG išeiga yra 25, 9 mM, atsižvelgiant į vieno pasikartojančio PET vieneto molekulinę masę 192, 2 g mol -1 . Atitinkamai, mes nustatėme ląstelių augimą pagal optinį tankį esant 600 nm (OD600) esant 20 mM TPA, abiejų EG arba PET plėvelėms per pirmąsias 32 valandas. Kaip parodyta 2 pav. C. thermocellum DSM1313 turėjo panašią augimo kreivės formą, nepriklausomai nuo jokių su PET susijusių junginių. Trumpai tariant, vėlavimo fazė buvo stebima iki 12 valandų po inokuliacijos, po to greitas augimas iki 20 valandų auginimo laiko su maksimaliu OD600 maždaug 2,2. Vėliau buvo aiški tendencija palaipsniui mažėti OD600 iki 32 val., kad pasiektų galutinę 1, 6–1, 8 vertę, o tai rodo galimą ląstelių lizę, nepridedant jokios maistinės medžiagos. Be to, auginant su amorfine PET plėvele arba be jos, reikšmingo pH pokyčio laiko skirtumo nepastebėta (2 pav.).

Amorfinių PET plėvelių skaidymas naudojant sukurtą C. thermocellum visos ląstelės biokatalizatorių

Suprojektuotas C. thermocellum padermė DSM1313::pHK-LCC buvo naudojama PET plėvelei, kurios pradinė masė buvo maždaug 50 mg, skaidyti. Inkubacija truko 14 dienų 60°C temperatūroje. PET svorio metimo laiko eiga parodyta 3A pav. Akivaizdus svorio kritimas gali būti stebimas net po 2 inkubacijos dienų, maždaug nuosekliai didėjant iki 14 dienų, kad būtų pasiektas maksimalus svorio sumažėjimas maždaug 62 % (≈ 31 mg).

Amorfinių PET plėvelių degradacija C. thermocellum DSM1313::pHK-LCC.

A. Santykinio svorio kritimo laiko eiga, nustatyta gravimetriškai. Iš pradžių buvo papildyta apie 50 mg PET plėvelių.

B. Išsiskyrusių UV spindulius sugeriančių skilimo produktų laiko eiga, nustatyta HPLC metodu kultūros supernatante (sudėtose kolonėlėse), taip pat apskaičiuotos sumos vertės, pagrįstos svorio netekimo nustatymu (punktyrinė kreivė, iš to paties duomenų rinkinio su A skydeliu). Konkrečios TPA ir MHET koncentracijos pateiktos S1 lentelėje.

C. Tūrinio esterolitinio aktyvumo laiko kursai prieš p- NPB ir pH pokyčiai nustatyti kultūros supernatante. Klaidų juostos rodo standartinį nuokrypį, gautą iš bent trijų nustatymų.

D. Specifinio esterolitinio aktyvumo analizė, nustatyta Fast-Red dažymu. Kultūros supernatantų (10 μg baltymų įdėta į kiekvieną juostą) SDS-PAGE, pašalintų po kultivavimo skirtingą laikotarpį po esterolitinio dažymo Fast-Red dažais prieš 1-naftilacetatą kaip substratą. Violetinių juostų intensyvumas, apskaičiuotas „Quantity One“ programine įranga, rodo ekstraląstelinio LCC likutinės specifinės veiklos kiekį.

Kultūros supernatantai, pašalinti kas 2 dienas, buvo tiriami HPLC, siekiant nustatyti tirpius UV spindulius sugeriančius skilimo produktus. Standartų sulaikymo laikas, taip pat HPLC analizės kalibravimo kreivė buvo paruošti naudojant komerciškai įsigytą gryną TPA (S2 pav.). Kaip parodyta 3B pav., ir TPA, ir MHET buvo aptinkami kultūros supernatante po daugiau nei 2 dienų auginimo. Remiantis 192,2 g mol –1 PET pasikartojančio vieneto molekuline mase, 3A pav. parodyta svorio netekimo kreivė buvo paversta punktyrine kreivė, rodanti atitinkamą išsiskyrusių UV spindulius sugeriančių produktų kiekį (2B pav., S1 lentelė). , kuris yra geras kiekybinis susitarimas su nustatyta TPA ir MHET suma. Tikimasi, kad HPLC nustatytų UV spindulius sugeriančių skilimo produktų sumos vertės bus šiek tiek mažesnės, nes šiame tyrime naudotuose PET mėginiuose yra nedidelė dietilenglikolio frakcija, kaip aprašyta anksčiau (Wei, ir kt., 2019a). Taip pat buvo nustatytas pH pokytis kultūros supernatante, greitai nukritus per pirmąsias 2 dienas nuo 7,4 iki 6,5, o po to po 14 auginimo dienų lėčiau nuolat mažėjant iki maždaug 6,2 (3C pav.). Kadangi pH yra logaritminis dabartinės H koncentracijos matas3O + , šis rezultatas gerai sutapo su nustatytais TPA kiekiais, kaip rodo didelis koreliacijos koeficientas 0, 914 (duomenys nerodomi).

Kaip parodyta 3D pav., buvo manoma, kad LCC juostos intensyvumas atspindi specifinį aktyvumą, nes kiekvienoje juostoje buvo pakrautas vienodas 10 µg viso baltymo kiekis. Panašus LCC juostos intensyvumas buvo pastebėtas kultūros supernatantuose po 1, 2 ir 4 dienų inkubacijos, o 8 dienų juosta vis dar parodė 88, 2% intensyvumą, palyginti su 1 dienos juosta. Atitinkamai, tūrinis esterolitinis aktyvumas kultūros supernatante didėjo kartu su ląstelių augimu pirmąją inkubacijos dieną (2 pav.), antrąją inkubacijos dieną išlaikė maksimalią vertę (1,01 U ml -1 ) ir palaipsniui mažėjo. iki 0,39 U ml –1 po 8 dienų inkubacijos, o tai sudarė 38,9 % maksimalaus aktyvumo (3C pav.), nors išlikęs LCC specifinis aktyvumas buvo aptiktas skilimo sistemoje iki 8 dienų (3D pav.). Sumažėjusį LCC aktyvumą gali sukelti terminis dezaktyvavimas arba išsiskyrusios proteazės iš lizuotų ląstelių po ilgalaikio inkubavimo. Atsižvelgiant į skilimo efektyvumą, kaip parodyta 3A-B pav., kuris buvo matomas nuo antrosios auginimo dienos, sumažėjęs esterolitinis aktyvumas kultūros supernatante taip pat gali būti susijęs su masės perkėlimu iš laisvo LCC į sandariai absorbuojamą fermentą. PET plėvelių paviršiuje, kur jie katalizuoja poliesterių hidrolizę.

4 paveiksle buvo parodyti drastiški PET plėvelių paviršiaus morfologijos pokyčiai po 5 dienų auginimo, esant inžinerijai. C. thermocellum įtempti. Ertmės ir skylės pirmiausia pasirodė kaip pradinis paviršiaus erozijos požymis, panašiai kaip ir ankstesniuose tyrimuose parodytos biologiškai suardytos PET plėvelės SEM (Ronkvist, ir kt., 2009 Moog, ir kt., 2019 Wei, ir kt., 2019a). Vėliau atskiros erozijos skylės išsivystė į ištisinį grubų paviršių su didėjančiu netaisyklingų plyšių kiekiu dėl tolesnės fermentinės hidrolizės, kurią katalizuoja išskiriamas LCC kultūros supernatante iki galutinio 14 dienų auginimo laiko. Priešingai nei Yoshida parodytuose SEM fiksavimuose ir kt. (2016), kuriame aiškiai nurodyta I. sakaiensis ląstelių pritvirtinimas prie PET plėvelės paviršiaus, sukurtas C. thermocellum ląstelės neprisijungė prie PET plėvelės paviršiaus (S3 pav.).


Genų tipai: 6 populiariausi genų tipai | Genetika

Toliau pateikiami šeši pagrindiniai genų tipai. Tipai yra šie: 1. Papildomi genai 2. Pasikartojantys genai 3. Polimeriniai genai 4. Modifikuojantys genai 5. Mirtinai genai 6. Judantys genai.

Tipas # 1. Papildomi genai:

Batesonas ir Punnettas sukryžmino dvi skirtingas baltažiedžių saldžiųjų žirnių veisles ir gavo F1 raudonai žydinčių augalų palikuonys. Dėl savidulkos F1 augalai davė F2 9 raudonai ir 7 baltažiedžių augalų palikuonys. Pavieniai raudonai žydinčios veislės ir dviejų skirtingų baltažiedžių veislių kryžminimas parodė, kad raudonos spalvos genas buvo dominuojantis prieš kiekvienos iš dviejų baltų veislių geną.

Dviejų baltųjų veislių kryžminimą galima paaiškinti darant prielaidą, kad raudonos spalvos genai turi būti kartu, t. y. turi veikti vienas kitą papildydami. Taigi kiekvienas genas savarankiškai prisideda prie kitokio, bet būtino raudonojo pigmento sintezei. Jei vieno iš dviejų raudonos spalvos genų nėra, rezultatas yra balta gėlė. Šį paaiškinimą galima patikrinti padarius šaškių lentą.

Aleurono sluoksnio spalvos paveldėjimas kukurūzuose taip pat rodo komplementarių genų sąveiką. Išoriniai endospermo sluoksniai bręstančiose kukurūzų branduoliuose pakeičiami į specializuotą aleurono audinį, taip pavadintą, nes ląstelėse yra daug aleurono grūdelių. Kukurūzuose aleurono sluoksnis yra nuspalvintas dėl ląstelėse esančių antocianininių pigmentų ir yra kontroliuojamas dviejų genų papildomu poveikiu.

Tipas # 2. Pasikartojantys genai:

Kai du ar daugiau genų turi tokį patį poveikį tam tikram požymiui, jie vadinami pasikartojančiais genais. Kukurūzuose geltonojo endospermo genas dominuoja baltojo endospermo atžvilgiu. Grynai veisiamas geltonasis endospermas augalas, sukryžmintas su balto endospermo augalu, duoda geltoną endospermą F1.

Dėl savidulkinimo F1 hibridai ir F2 gaunama 15 geltonos ir 1 baltos spalvos endospermo karta. Geltonasis endospermas atsiranda dėl dviejų nepriklausomų dominuojančių genų Y1 ir Y2. Kai yra vienas iš šių dviejų dominuojančių genų arba abu kartu, susidaro geltonas endospermas.

Kai homozigotinėje būsenoje yra tik recesyviniai aleliai (y1y1y2y2) sudaro baltą endospermą. Taigi dominuojantys genai Y1 ir Y2 turi identišką poveikį endospermo spalvai ir dėl to yra vadinami pasikartojančiais genais arba izogenais.

Žmonėms 3 skirtingi genai gali gaminti iki 12 panašių pieno rūgšties dehidrogenazės fermentų, vadinamų izofermentais arba izofermentais. Pieno dehidrogenazę sudaro keturios polipeptidinės grandinės, kurių kiekvieną koduoja du skirtingi genai A ir B. Trečiasis genas C koduoja dar vieną polipeptidinę grandinę, esančią vyriškose lytinėse ląstelėse esančioje pieno dehidrogenazėje.

Tipas # 3. Polimeriniai genai:

Cucurbita pepo (vasarinio moliūgo) vaisiaus forma gali būti sferinė arba cilindrinė. Sferinė vaisiaus forma dominuoja prieš cilindrinę ir yra valdoma dviejų nepriklausomų genų. Taigi yra dvi skirtingos sferinių vaisinių augalų veislės.

Sukryžminus du tokius genetiškai skirtingus sferinius vaisinius augalus, F1 palikuonys turi naują vaisiaus formą - disko formos. Savaiminis F1 diskoidiniai vaisiniai augalai gamina F2 kartos su visomis trimis vaisių formomis, t. y. disko formos, sferinės ir cilindrinės, santykiu 9: 6: 1.

Iš šešių sferinių vaisinių augalų F2 kartos trys augalai priklauso vienai veislei ir turi dominuojantį geną S1. Kiti trys sferiniai vaisiniai augalai priklauso genetiškai skirtingai veislei su kitu dominuojančiu genu S2. Dėl adityvaus genų poveikio S1 ir S2 (taip pat vadinamas polimeriniu efektu), susidaro disko formos.

Tipas # 4. Genų modifikavimas:

Kadangi buvo aptikta vis daugiau genų sąveikos atvejų, reikėjo atmesti ankstesnę mintį, kad vienas genas kontroliuoja vieną fenotipą nepriklausomai nuo kitų genų. Tiesą sakant, stebimas fenotipas yra daugelio sudėtingų procesų organizme rezultatas.Todėl pagrįsta, kad daugelis genų turėtų būti įtraukti į galutinę bruožo išraišką.

Yra didelė grupė genų, kurie patenka į bendrą pavadinimą arba modifikatorius, kurie daro įtaką kitų genų veiklai ir keičia jų fenotipinį poveikį. Modifikacinis poveikis gali būti kiekybinis, kad fenotipo išraiška būtų sustiprinta arba slopinama.

Drosophiloje yra recesyvinis slopinantis genas (su), kuris slopina mutantinio plaukuoto sparno (Hw) geno poveikį, todėl net homozigotinėms musėms (HwHw) ant sparnų neatsiranda plaukų.

Tas pats genas (jis taip pat žinomas kaip su-Hw) sumažina keleto kitų mutantinių fenotipų ekspresiją, pvz., tuos, kuriuos sukelia nutrūkusių sparnų gyslų ir išsišakojusių šerių genai. Kitas Drosophila slopinantis genas (su-S) yra apribotas savo veikimu, todėl sumažina tik vieno dominuojančio geno, kuris kontroliuoja žvaigždės akių formą, ekspresiją.

Žmonėms mažas brachidaktilijas (brachidaktilo forma, kai tik rodomasis pirštas yra trumpesnis) Norvegijos šeimose atsiranda dėl dominuojančio geno B. Yra modifikuojantis genas M, kuris modifikuoja geno B poveikį, kad susidarytų kintamieji fenotipai.

Taigi asmenims, turintiems abu genus B ir M, rodomasis pirštas yra labai sutrumpintas. Asmenys, turintys geną B ir recesyvinius modifikatoriaus geno alelius (mm), rodo tik nedidelį to paties piršto sutrumpėjimą. Atrodo, kad modifikuojantys genai patys nesukuria matomo fenotipo.

Tipas # 5. Mirtinai genai:

Mendelio santykio modifikacijos, kurias sukelia genų sąveika. Mirtini genai taip pat gali pakeisti pagrindinį 9:3:3:1 santykį ir sukelti organizmo mirtį.

I. Dominuojantys mirtinai:

Geltona pelių kūno spalva dominuoja prieš rudą, tačiau geltonos pelės niekada nėra tikros veisimosi. Kai geltonos pelės yra inbreduotos, palikuonys susideda iš geltonų ir rudų pelių santykiu 2: 1, o tai neatitinka jokių Mendelio lūkesčių.

Be to, vados dydis po giminystės yra ketvirtadaliu mažesnis, palyginti su vados dydžiu, gautu sukryžminus geltoną ir rudą. Kai geltonos pelės buvo sukryžmintos su tikromis veislinėmis rudosiomis pelėmis, gautos tik heterozigotinės geltonos pelės.

Kodėl homozigotinės geltonosios pelės niekada negimė? Atsakymą pateikė prancūzų genetikas L. Cuenot. Jis paaukojo Yy nėščias pateles po giminystės ir ištyrė embrionus, kad nustatytų, ar mirtis įvyko embriono stadijose, ar ne. Iš tiesų buvo pastebėta, kad ketvirtadalis embrionų miršta vėlyvose vystymosi stadijose.

Taigi gimė tik heterozigotinės geltonos ir rudos pelės santykiu 2:1. Santykis 1:2:1, kurio tikimasi sukryžminus du heterozigotus, niekada nebuvo gautas, įrodantis mirtiną homozigotinio geltonojo geno ekspresiją.

Pelės brachiury genas (I) yra mirtinas homozigotinėje būsenoje, o būdamas heterozigotinis gyvūnas išgyvena, bet turi trumpą uodegą. Embrionai, homozigotiniai brachiurijos atžvilgiu, visiškai neturi noochordo, kai kurių anomalijų ir miršta gimdoje. Kryžminus dvi trumpas uodegas peles, heterozigotines brachiurijai, susilaukusių gyvybingų palikuonių fenotipinis santykis yra 2 trumpa uodega: 1 normali uodega (2.4 pav.).

Daugelyje augalų, įskaitant kukurūzus, sojas ir Antirrhinum (snapdragon), yra dominuojantis mirtinas genas, kuris trukdo fotosintezės procesui, o chlorofilas nėra sintezuojamas. Jauni daigai, išaugę iš sėklos, turinčios homozigotinį dominuojantį geną, yra geltonos spalvos ir miršta labai jaunos stadijos dėl bado. Heterozigotiniai daigai yra šviesiai žalios spalvos ir gali išgyventi.

Visais aukščiau aprašytais dominuojančių mirtinų genų atvejais homozigotinė geno būsena sukelia ankstyvą mirtį, o heterozigotas yra gyvybingas. Bene rimčiausias poveikis, kurį gali turėti genas, yra sukelti mirtį net ir heterozigotinėje būsenoje. Genas, sukeliantis Huntingtono chorėją žmogui, pasireiškia, kai yra vienas dominuojantis alelis.

Nesvarbu, ar homozigotinė, ar heterozigotinė, ligos fenotipas išryškėja sulaukus vidutinio amžiaus, dažniausiai po keturiasdešimties metų. Asmuo kenčia nuo raumenų nepakankamumo, protinio atsilikimo ir galiausiai mirties. Kadangi Huntingtono chorėja prasideda daug vėliau, nei prasideda reprodukcinis laikotarpis, genas gali būti perduotas kitai palikuonių kartai.

Kitas dominuojantis genas, sukeliantis epiloiją žmonėms, sukelia mirtį ankstyvose gyvenimo stadijose, net ir esant heterozigotinei būklei dėl sunkių psichikos defektų, navikų ir nenormalių odos ataugų. Dominuojantys mirtini genai, išreiškiantys mirtingumą ankstyvoje gyvenimo stadijoje, populiacijoje neaptinkami.

Ii. Recesyvinis mirtingumas:

Recesyvinis mirtinas genas populiacijoje lieka nepastebimas, nes heterozigotinėje būsenoje jis nesukuria matomo fenotipo. Tiesą sakant, jis gali būti perduodamas per heterozigotinius nešiotojus daugelį kartų, bet neaptinkamas. Todėl žinomas didesnis recesyvinių mirtinų genų skaičius, palyginti su dominuojančiais mirtinais genais.

Žmoguje yra recesyvinis mirtinas genas, dėl kurio naujagimiai miršta, nes susidaro vidinių plaučių sąaugų. Šio geno homozigotinis vaisius užbaigia savo embriono vystymąsi deguonies, tiekiamo motinos krauju, pagalba. Tačiau mirtis įvyksta netrukus po gimimo, kai plaučiai nebeveikia normaliai.

Toks recesyvinis mirtinas genas yra nešiojamas heterozigotiniuose individuose, nesukeldamas žalingo poveikio. Jis aptinkamas tik tada, kai susituokia du heterozigotiniai asmenys ir maždaug ketvirtadalis jų vaikų miršta po gimimo, nes abu recesyvinius alelius jie gauna iš savo tėvų.

Kitas recesyvinis mirtinas genas žmonėms, žinomas kaip Tay Sachs liga, sukelia mažų vaikų mirtį. Šio geno homozigotiniams asmenims trūksta vieno iš fermentų, reikalingų normaliai riebalinių medžiagų apykaitai.

Ligos fenotipas išryškėja po pirmųjų metų, kai nervų apvalkaluose susikaupia riebalinės medžiagos. Sutrinka nervinių impulsų perdavimas, todėl prarandama raumenų kontrolė ir atsiranda psichinis nepakankamumas. Per kelerius metus asmuo miršta.

Žmonėms yra didelė tikimybė, kad pirmųjų pusbrolių santuokų palikuonims pasireikš recesyviniai mirtini genai. Vienintelis geno alelis galėjo būti normaliuose protėviuose. Tik tada, kai du aleliai susijungia artimų asmenų palikuonims, išreiškiamas mirtingumas.

Pelės hidrocefalija atsiranda dėl recesyvinio mirtino geno. Embriono vystymosi metu atsiranda nenormalus kremzlės augimas. Tai sukelia kaukolės ir smegenų formavimosi nelygumus ir pernelyg didelį smegenų skysčio kaupimąsi. Embrionai, turintys homozigotinį geną, neišgyvena. Heterozigotai yra fenotipiškai normalūs.

Anglijoje jautieną auginančiuose galvijams (deksteris) yra recesyvinis mirtinas genas. Deksteris yra heterozigotinė veislė, kuri yra labai vertinama dėl didesnio jautienos kiekio, kurį gali pagaminti.

Įprasta galvijų veislė, žinoma kaip Kerry, turi du homozigotinius dominuojančius genus, yra normali kaip deksteris, bet duoda mažiau mėsos. Kryžminant du deksterius, palikuonis sudaro 1 keris: 2 deksteriai: 1 buldogas. Buldogo veršelis turi du recesyvinius mirtinus genus, turi labai trumpas kojas, keletą anomalijų ir netrukus po gimimo miršta.

Iii. Su seksu susiję mirtinai:

Tai sistema, kurioje mirtinas genas yra perneštas lytinėje chromosomoje, dažniausiai X. Drosofiloje mutacijų aptikimui dažnai naudojami su lytimi susiję recesyviniai mirtinai. Recesyvinis mirtinas genas, esantis X chromosomoje, yra ypač svarbus hemizigotiniams vyrams, nes jis gali išreikšti mirtingumą, kai yra tik vienas alelis.

Mirtinas X susieto geno buvimas taip pat gali pakeisti lyčių santykį, kad gimtų daugiau patelių, o ne tikėtino santykio 1 patelė: 1 patinas. Taigi patelė, turinti recesyvinį mirtiną geną, susilauks palikuonių, kuriuose pusė patinų palikuonių nebūtų gyvybingi.

Lyties santykio sutrikimas aiškiai matomas tokiuose organizmuose kaip Drosophila, kurie gamina didelius palikuonis. Žmonėms su lytimi susijusių mirtinų genų buvimas įtariamas tose šeimose, kuriose moterys gimsta daug dažniau nei vyrai.

Žmonėms mirtiną poveikį palikuonims gali atsitiktinai sukelti spindulinis (rentgeno) gydymas tėvų reprodukciniams organams. Remiantis R. Turpin Prancūzijoje atliktu tyrimu, kai moterys dėl pilvo negalavimų gauna rentgeno spindulius dubens srityje, kiaušialąstėje esančioje X chromosomoje sukeliamos recesyvinės mirtinos mutacijos. Tokia moteris susilaukia daugiau patelių, o palikuonių – labai mažai patinų.

Jei tėvas patinas bus veikiamas rentgeno spindulių ir jo X chromosomoje bus sukeltos dominuojančios mirtinos mutacijos, palikuonių bus daugiau berniukų ir mažai patelių. Taip yra todėl, kad viena X chromosoma perduodama dukterims, dėl kurių jos miršta.

Raumenų distrofija (Dušeno tipas) atsiranda dėl X susieto recesyvinio geno, kuris rodo matomą fenotipą praėjus daugeliui metų po gimimo. Berniukai, turintys šį geną, yra normalūs maždaug 10 metų, po to sutrinka raumenų kontrolė ir miršta.

Iv. Sąlyginiai mirtinai:

Kartais organizmas normaliai gyvena tam tikromis sąlygomis, tačiau kai jo aplinkoje atsiranda tam tikrų pokyčių, atsiranda mirtingumas. Vieną iš pirmųjų žinomų sąlyginių mirtinų atvejų Dobžanskis atpažino Drosophila pseudoobscura.

Musės normaliai gyvena 16,5°C temperatūroje, tačiau esant 25,5°C, musės žūva. Panašiai vapsvoje Bracon hebetor mutantinis genas, kuris žemesnėje temperatūroje gamina inkstų akis, išreiškia mirtingumą 30°C temperatūroje.

Suzuki 1970 m. Drosophila melanogaster aprašė daugybę sąlyginių mirtinų atvejų. Jis nurodė, kad kai kurios mutantinės padermės tapo mirtinos, kai buvo veikiamos aukštoje temperatūroje tik vėlyvosiose lervos stadijose. Tai vadinama temperatūros jautrumo stadija.

Jei lervos laikomos žemoje temperatūroje tam tikroje temperatūros jautrumo stadijoje, gimusios musės gali normaliai gyventi net esant aukštai temperatūrai visą savo gyvenimo ciklą.

Galbūt pasikeičia specifinis genų produktas – fermentas ar baltymas, sukeldamas mirtį, jei kritiniu laikotarpiu lervos yra veikiamos aukštoje temperatūroje. Tiesą sakant, atsižvelgiant į šią perspektyvą, sąlyginės mirtinos medžiagos yra plačiai tiriamos mikroorganizmuose, siekiant analizuoti genus, fermentus ir baltymus.

Naminiuose paukščiuose yra recesyvinis genas, dėl kurio nulūžta plunksnos. Šio geno homozigotinės vištos netenka plunksnų, tačiau gali normaliai gyventi, jei laikomos gana šiltoje aplinkoje. Bet jei temperatūra nukrenta žemiau optimalios, viščiukai miršta dėl izoliacijos trūkumo, kurį suteikia normalios plunksnos.

Sąlyginės mirtinos medžiagos buvo gerai ištirtos kai kuriuose haploidiniuose organizmuose, tokiuose kaip mielės, neurospora ir kt. Lengva ištirti mirtinus genus haploidiniuose organizmuose, nes net vieno alelio buvimas lemia mirtingumą.

Laukinio tipo Neurospora gali augti terpėje, kurioje trūksta aminorūgšties arginino, nes gamina visus reikalingus fermentus, reikalingus arginino sintezei iš cukraus ir amoniako.

Tačiau mutantinė Neurospora padermė negalės augti toje pačioje terpėje. Mielių štamas, kuris normaliai auga gliukozės terpėje, gali turėti mirtiną poveikį, jei auginamas terpėje, kurioje yra galaktozės. Todėl mutantinis genas veikia kaip sąlyginis mirtinas.

Prieš ankstyvuosius ir vėlyvuosius mirtinus veiksnius:

Ankstyviausia stadija, kurioje gali veikti mirtini genai, yra akivaizdi iš lytinių ląstelių mutacijų tyrimų. Normalios gametos yra gyvybingesnės ir turi daugiau galimybių apvaisinti ir gaminti zigotas. Mirtini genai galiausiai prarandami, kai miršta neapvaisintos lytinės ląstelės. Tokie genai vadinami gametiniais mirtinais genais.

Reiškinys, kai tam tikra lytinių ląstelių klasė specialiai neleidžia dalyvauti apvaisinimo procese, Sandleris ir Novitskis pavadino mejoziniu potraukiu. Antroje Drosophila chromosomoje yra genas, vadinamas segregacijos iškraipytoju (SD). Dominuojantis šio geno alelis neleidžia lytinėms ląstelėms dalyvauti apvaisinimo procese.

Taigi tik lytinės ląstelės, turinčios recesyvinį alelį (sd), gali apvaisinti kiaušinėlius ir gaminti gyvybingus zigotus. Kadangi tai taip pat sukelia tipiškų Mendelio santykių iškraipymą, šiam genui buvo suteiktas segregacijos iškraipytojo pavadinimas.

Yra mirtinų genų, kurie veikia susidarius zigotai ir sukelia embriono mirtį. Eksperimentiniams gyvūnams, pavyzdžiui, pelėms, šį mirtiną poveikį galima nustatyti paaukojus apvaisintas pateles ir išanalizavus žuvusius embrionus.

Tačiau jei mirtis įvyksta labai anksti embriono vystymosi stadijoje, šis metodas nepasiteisins, nes faktiškai stebėti abortuotų embrionų neįmanoma. Yra genas, kuris daro žudantį poveikį, užkertant kelią normaliam zigotos skilimui. Toks genas vadinamas zigotiniu mirtinu.

Žmonėms genas, aprašytas sukeliantis sukibimą plaučiuose, išreiškia mirtingumą netrukus po gimimo, kai naujagimio plaučiai neveikia normaliai. Yra žinoma, kad dauguma mirtinų genų augaluose veikia sėklų dygimo metu arba po jo.

Tarp vėlyvojo veikimo mirtinų genų galima paminėti keletą aiškių žmonių ligų pavyzdžių. Genai, sukeliantys raumenų distrofiją (Duchene tipo) ir Tay Sachs ligą, sukelia mirtį prieš arba antrąjį gyvenimo dešimtmetį, prieš prasidedant dauginimuisi. Kita vertus, Huntingtono chorėja yra mirtina, kai žmogus yra vidutinio amžiaus, o genas jau gali būti perduotas ateities kartoms.

Tipas # 6. Judantys genai:

Yra genų arba DNR segmentų, kurie gali būti įtraukti ir veikti daugelyje genomo vietų. F faktorius gali integruotis tam tikrose E. coli genomo vietose. Molekuliniai tyrimai parodė, kad F elementas susideda iš trijų skirtingų funkcinių genų blokų.

Viename regione yra genų, reikalingų F elementui pernešti per konjugaciją iš vienos bakterijos į kitą. Antroji sritis kontroliuoja autonominę F replikaciją. Trečioje srityje yra keletas skirtingų įterpimo sekų (IS). F faktoriaus integracija atsiranda dėl vienos iš IS sekų F faktoriuje ir IS sekos šeimininko chromosomoje.

Pačios IS sekos yra judantys DNR segmentai, kuriuos galima įterpti į daugybę skirtingų chromosomų vietų. Yra žinoma nemažai IS sekų, iš kurių 3, IS1, IS2 ir IS3 buvo ištirtos gana išsamiai. Jų dydis svyruoja nuo 700 iki 1400 bazinių porų.

Kai IS seka įterpiama į geną, ji nutraukia genų sekos tęstinumą ir gali slopinti arba neslopinti geno ekspresijos. IS sekos taip pat daro tam tikrą poveikį gretimiems genams.

Dažniau gretimi genai kartais būna inaktyvuojami, tačiau gali suaktyvėti anksčiau tylėjęs genas. Atrodo, kad IS sekos taip pat yra karštosios vietos (pažeidžiamos vietos) delecijoms, kurios taip pat dalyvauja daugelyje rekombinacijos reiškinių.

Kita judamųjų DNR segmentų grupė, iš kurių daugelis turi atsparumo vaistams genus, vadinami transpozonais. Tikriausiai jie pirmą kartą buvo aptikti augaluose kaip kontroliuojantys kukurūzų elementai, tačiau pirmiausia jie buvo aiškiai parodyti bakterijose. 1974 m. Hedgesas ir Jacobas išsiaiškino, kad kai atsparumo antibiotikams, pavyzdžiui, penicilinui ir ampicilinui, genas buvo perkeltas iš vienos plazmidės į kitą, tai padidino recipiento plazmidės dydį.

Įprasto transpozono ilgis yra keli kilogramai bazių, keli yra daug ilgesni. Didžioji dalis plačiai paplitusio bakterijų atsparumo antibiotikams atsiranda dėl transpozonų, kuriuose yra vienas ar daugiau atsparumo antibiotikams genų, plitimo. Kai transpozonas mobilizuojasi ir įterpiamas į konjugacinę plazmidę, jis gali būti plačiai paplitęs tarp skirtingų bakterijų šeimininkų konjugacijos būdu.

Kai kurie transpozonai turi sudėtines struktūras, kurių atsparumas antibiotikams yra tarp įterpimo sekų. Transposonai paprastai žymimi santrumpa Tn, po kurios rašomas kursyvas skaičius, pavyzdžiui, Tn5. Kai į pavadinimą būtina įtraukti geno, kurį jis nešiojasi, pavadinimą, jis tampa Tn5 (neo-r, str-r), kad atspindėtų atsparumo neomicinui ir streptomicinui genų buvimą.