Informacija

1.5: Mutantinės toksino jutiklio DNR išgryninimas iš bakterijų ląstelių ir jos kokybės įvertinimas naudojant agarozės gelio elektroforezę ir UV spektroskopiją. Biologija

1.5: Mutantinės toksino jutiklio DNR išgryninimas iš bakterijų ląstelių ir jos kokybės įvertinimas naudojant agarozės gelio elektroforezę ir UV spektroskopiją. Biologija



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

5.1 Mokymosi tikslas

Praėjusią savaitę sukūrėte plazmidės DNR, kurioje yra mutantinis toksino jutiklis, naudodami QuickChange PCR amplifikaciją. Šią savaitę sužinosite, kaip išgauti ir išvalyti šią plazmidės DNR E coli ląstelėse ir kaip patikrinti plazmidinės DNR kokybę naudojant agarozės gelio elektroforezę ir UV spektroskopiją.

5.2 Mini projekto schema

Toliau pateiktoje schemoje paryškintas blokas pabrėžia dabartinio eksperimento vaidmenį mini projekte.

5.3 Plazmidinės DNR išgryninimas iš bakterijų ląstelės (plazmidės paruošimas)

Praėjusią savaitę naudojote PGR amplifikaciją, kad susintetintumėte plazmidės DNR, kurioje yra mutantinis toksino jutiklis. PGR amplifikacija yra puiki priemonė pakeisti DNR seką, tačiau ji nesukuria pakankamai plazmidinės DNR. PGR amplifikacija paprastai duoda kelis šimtus nanogramų DNR. Nors klonavimas, transfekcija ar RNR sintezė paprastai reikalauja mikrogramų ar net miligramų DNR. Taip pat PGR amplifikacijos būdu sukurta plazmidinė DNR yra apskritas o bakterijų sintetinamos plazmidinės DNR daugiausia superspiralinis. Superspiralinė DNR turi tokią pačią molekulinę masę kaip ir žiedinė DNR, tačiau ji yra kompaktiškesnė. Superspiralinėje konformacijoje esanti DNR yra mažesnė ir geriau apsaugota nuo restrikcijos endonukleazių ar pavojų aplinkai sukeliamos žalos (5.1 pav).

Dėl šių priežasčių PGR amplifikacija paprastai nenaudojama dideliems DNR kiekiams gaminti. Norint susintetinti DNR daugeliu atvejų chemijos ir biologijos srityse, reikia naudoti bakterines ląsteles. Metu plazmidės paruošimas, paprastai naudojame bakterijų ląstelių DNR sintezės režimą E. coli, kad paruoštų mums plazmidinę DNR. Kitaip tariant, mes užgrobiame E. coli sintetinti mūsų DNR.

Plazmidinio vektoriaus sintezės, naudojant bakterijų ląsteles, etapai yra tokie:

  1. Paverskite plazmidės DNR į bakterijų ląstelę.
  2. Auginkite bakterijas, turinčias norimos plazmidės (5–500 ml).
  3. Išvalykite plazmidinę DNR iš bakterijų ląstelių.

5.4 Transformacija

Norint panaudoti bakterines ląsteles plazmidinei DNR sintetinti, plazmidinė DNR turi būti patalpinta bakterijos ląstelės viduje; tai reiškia, kad turime priversti bakterijas paimti plazmidės DNR. Tai yra problematiška, nes bakterijų ląstelių membrana yra apolinė ir yra nepralaidi kliūtis polinėms molekulėms, tokioms kaip DNR. Transformacija išduria „skyles“ ląstelės membranoje, kad galėtų patekti į DNR. Galimi du transformavimo būdai: šilumos šokas ir elektroporacija. Šilumos šokas apima greitą bakterijų ląstelių, kurios anksčiau buvo apdorotos CaCl, pašildymą ir aušinimą2. Kadangi ląstelių membranos yra pralaidžios Cl- jonų, kartą Cl- eina kaip hidratuotas anijonas, tai sukelia „ląstelės patinimą“. Dėl 42 °C karščio šoko membranoje susidaro skylės (poros), kurios leidžia patekti į DNR. Elektroporacijos metu šios skylės sukuriamos trumpu elektrošoku.

Transformacija yra mažo našumo procedūra: palyginti nedaug ląstelių paima plazmidę, nepaisant šilumos šoko ar elektroporacijos.

5.5 Ląstelių augimas

Dėl mažo derlingumo reikia naudoti selektyvųjį žymeklį, kad būtų galima atskirti ląsteles, kuriose yra plazmidė, nuo ląstelių, kuriose nėra. Dažniausiai naudojamas selektyvus žymuo su bakterinėmis sistemomis yra antibiotikų naudojimas. Plazmidėse yra atsparumo tam tikram antibiotikui genas. Tai reiškia, kad ląstelės, kurios paėmė plazmidę, augs terpėje, kurioje yra antibiotikų, o ląstelės, kurios nepasisavino plazmidės, neaugs. Todėl transformacijos mišinio padengimas kietoje terpėje, kurioje yra selektyvus antibiotikas, mūsų atveju, ampicilinas, gausime tik kolonijas iš bakterijų, kuriose yra plazmidė, kurioje yra ykkCD jutiklio RNR.

Kartą E coli ląstelės, kuriose yra plazmidinė DNR, kurioje yra mutantinis ykkCD jutiklis, yra identifikuojamos, šios ląstelės pasėjamos į skystą terpę, kurioje yra selektyvus antibiotikas (ampicilinas), ir auginamos 16 val. 37 °C temperatūroje, stipriai purtant.

5.6 Plazmidinės DNR išgryninimas iš bakterijų ląstelių

Kai plazmidinė DNR sintetinama PGR amplifikacijos būdu, gauta DNR yra labai švari. Tačiau kai DNR sintezuojama naudojant bakterijų ląsteles, plazmidinė DNR yra užteršta bakterijų ląstelių komponentais: jų ląstelės membrana, ląstelės baltymais, DNR ir RNR. Plazmidės paruošimo metu visi šie teršalai turi būti pašalinti. Plazmidžių preparatuose naudojamas faktas, kad DNR yra labai neigiamai įkrauta (palyginti su baltymais), labai tirpi vandenyje (palyginti su lipidais ir membranos baltymais) ir gana maža (palyginti su genomo DNR).

Įsitikinkite, kad laikotės plazmidės paruošimo protokolo tiksliai taip, kaip parašyta. Pirmieji keli plazmidės gryninimo etapai (nuo ląstelės lūžimo iki DNR įkėlimo į valymo kolonėlę) daro didelę įtaką plazmidės DNR grynumui ir kiekiui.

Tikslus plazmidės gryninimo protokolas priklauso nuo naudojamo rinkinio ir bus pateiktas laboratorijoje. Toliau pateikiamas bendras procedūros aprašymas.

  1. Plazmidžių paruošimas prasidėjo sulaužant bakterijų ląstelių membraną (lizę), kad būtų išlaisvinta plazmidės DNR. Šis žingsnis paprastai pasiekiamas šarminės lizės būdu. Ląstelių lūžimą taip pat galima pasiekti naudojant fermentą lizocimą. Būkite atsargūs ir NEleiskite ląstelių lizei tęstis ilgiau nei nurodyta. Ląstelių lizatą tvarkykite švelniai, kad išvengtumėte chromosomų DNR kirpimo. Tai gali sukelti plazmidės DNR užteršimą genomo DNR.
  2. Po ląstelių lizės plazmidinė DNR bus tirpale su tirpiais baltymais, tačiau viskas, kas netirpi vandenyje, genominė DNR, lipidai ir membraniniai baltymai, sudarys nuosėdas. Šios nuosėdos gali būti pašalintos centrifuguojant arba filtruojant. Bet kuriuo atveju šis žingsnis išvalo plazmidinę DNR iš baltymų, lipidų ir genominės DNR.
  3. Plazmidinė DNR toliau gryninama kolonėlėje. Dažnai naudojama silicio dioksido anijonų mainų chromatografijos kolonėlė. Šiame žingsnyje naudojamasi neigiamu DNR krūviu, kad būtų atskirta plazmidinė DNR nuo šeimininko genominės DNR. Kadangi genominė DNR yra daug didesnė, ji turi didesnį neigiamą krūvį nei plazmidinė DNR, todėl ji stipriau sąveikauja su anijonų mainų kolonėle. Dėl to genominė DNR lieka prijungta prie anijonų mainų kolonėlės, o plazmidinė DNR išplaunama.

5.7 Agarozės gelio elektroforezė

Plazmidinės DNR kokybei įvertinti bus naudojama agarozės gelio elektroforezė. Elektroforezė yra metodas, naudojamas molekulėms atskirti pagal krūvį ir formą. Atskyrimas pasiekiamas perkeliant neigiamo krūvio molekules, tokias kaip DNR, per elektrinį lauką iš neigiamo į teigiamą elektrodą. Trumpesnės molekulės migruoja greičiau nei ilgesnės. Norint išvengti mėginio plitimo elektroforezės metu, naudojama kieta terpė, pvz., agarozė arba poliakrilamidas. Agarozė yra polisacharidas, paprastai ekstrahuojamas iš jūros dumblių ir naudojamas didelėms nukleino rūgštims (> 500 bazinių porų) atskirti. Polimero porų dydis priklauso nuo panaudotos agarozės procentinės dalies (0,6–2%). Didesnis procentas sumažina porų dydį ir yra skirtas atskirti mažesnes molekules. Agarozės geliai paprastai nedenatūruoja (išskleidžia) DNR. Todėl DNR konformacija taip pat turi įtakos migracijos greičiui.

Migracijos greitis agarozės gelyje aprašomas žemiau esančia lygtimi kur v yra greitis (greitis), q yra molekulės krūvis, E yra elektrinio lauko stiprumas ir f yra trintis.

DNR, migruojanti per gelį, kurio poros yra mažesnės, patiria didesnę trintį ir nukeliauja mažesnį atstumą nei ta pati molekulė, migruojanti per gelį, kurio poros yra didesnės. Taip pat pailgesnės formos DNR gelyje nukeliauja mažesnį atstumą nei kompaktinė DNR, nes kompaktiška DNR patiria mažesnę trintį, kai ji migruoja per gelį. Todėl superspiralinė DNR (kompaktiškesnė) agarozės gelyje migruoja greičiau nei įpjova arba apskrita DNR (pailgesnė forma). Didesnės molekulinės masės DNR nukeliauja mažiau nei mažesnės molekulinės masės DNR, jei jų forma yra panaši. Ryšys tarp formos, molekulinės masės ir atstumo, nuvažiuoto agarozės gelyje, matomas 5.2 pav.

Nukleino rūgštys vizualizuojamos agarozės gelyje, naudojant dažymą etidžio bromidu (EtBr). EtBr yra fluorescencinis ir sąveikauja su DNR esančiomis nukleobazėmis (interkaliuojasi su DNR bazėmis). EtBr perteklius greitai migruoja iš gelio dėl mažo dydžio. Veikiant UV šviesai nukleino rūgštys „užsidega“ agarozės gelyje dėl EtBr fluorescencijos. SYBR žaliosios nukleino rūgšties dėmės veikia panašiai (5.3 pav).

5.8 Agarozės gelio elektroforezės taikymas

Agarozės gelio elektroforezė yra galingas metodas, naudojamas atskirti nukleino rūgštis pagal dydį ir (arba) formą. Jis turi parengiamąjį ir analitinį pritaikymą. Kaip analitinę priemonę agarozės gelio elektroforezė gali būti naudojama norint įvertinti bet kokios fermentinės reakcijos, kurios rezultatas yra reikšmingas DNR formos pasikeitimas, pvz., skilimas restrikcijos endonukleazėmis, sėkmę (išsamiau žr. 6 skyriuje). Restrikcijos endonukleazės yra fermentai, kurie skaido DNR ir tokiu būdu superspiralinę DNR (greitai migruojančią) paverčia linijine DNR (lėta migracija). Dėl to skilimo reakcijos naudojant restrikcijos endonukleazę sėkmę galima spręsti pagal tai, kiek suskaldytas DNR mėginys migruoja ant agarozės gelio, palyginti su pradine (nesupjaustyta) DNR. 5.2 pav palyginkite juostas su nupjautomis ir nenupjautomis DNR. Paruošiamasis agarozės gelio elektroforezės taikymas yra pašalinti bet kokią neatpjautą (superspiralinę) DNR iš mėginio, apdoroto restrikcijos endonukleaze. Tokiu atveju iš agarozės gelio išpjaunama lėtai migruojanti juosta (nupjauta DNR), o DNR išplaunama iš gelio gabalėlio naudojant komercinius rinkinius.

5.9 DNR kokybės kontrolė naudojant UV spektroskopiją

Plazmidinės DNR koncentracijai nustatyti dažniausiai naudojama UV spektroskopija. Nukleorūgštys dėl nukleobazių (heterociklinių aromatinių junginių) stipriai sugeria UV šviesą esant 260 nm. Pagamintos DNR koncentracija apskaičiuojama pagal šią formulę:

Kur e yra absorbcijos koeficientas (20 ml/mg*cm plazmidės DNR), l yra kelio ilgis (1 cm) ir c yra plazmidės DNR koncentracija mg/ml. Išmatuojant pagamintos plazmidės DNR absorbciją, galima apskaičiuoti koncentraciją.

PROTOKOLIAI

Reagentų ir įrangos poreikiai skaičiuojami šešioms studentų komandoms. Įskaičiuotas ~20% perviršis.

Reikalinga įranga/stiklo indai

  1. Trys 100 ml užkimštos Erlenmejerio kolbos
  2. Trys 100 ml graduotas cilindras
  3. Trys mikropipečių rinkiniai 20-100 µl ir 2-20 µl.
  4. UV spektrometras
  5. Gelio dokumentavimo sistema
  6. Vandens vonia (transformacijai)
  7. Orbitinis purtiklis (ląstelėms augti)
  8. Šešios 10-15 ml tūbelės (sterilios)
  9. Šeši 1,5 ml centrifugos mėgintuvėliai (Eppendorf)

Reikalingi sprendimai

  1. 3 l 1 x TAE (Tris-acetatas-EDTA) pH=8,0
  2. 30 ml 1% EtBr (arba lygiaverčio nukleino rūgšties dėmės)
  3. 20 ml agarozės gelio užpildymo dažai (6x, Biorad)
  4. 30 ml 1 kb molekulinės masės kopėčios (Biorad)
  5. 30 ml LB (Luria-Bertani) sultinio ir šešios LB/Ampicilino (100 mg/ml) lėkštelės
  6. 30 ml 100 mg/ml (1000 x) Ampicilinas (ląstelėms augti)

Transformacija (gali būti atlikta mokytojų padėjėjų iš anksto)

  1. Vandens vonią nustatykite iki 42 °C.
  2. Kiekvienam mutantui pažymėkite 1 sterilų stiklinį arba plastikinį mėgintuvėlį ir 1 mikrocentrifugos mėgintuvėlį.
  3. Kiekvienam mutantui pažymėkite 1 LB-agaro plokštelę, kurioje yra 100 mg/ml ampicilino.
  4. Atšildyti E. coli Dh5a kompetentingos ląstelės ant ledo (kiekvienam mutantui naudojama 100 ml kompetentingos ląstelės).
  5. Į kiekvieną mėgintuvėlį, kuriame yra kompetentingų ląstelių, įpilkite 10 μl PGR amplifikuotos mutantinės DNR. Laikykite ląsteles ant ledo 20 min.
  6. Šilumos šoko DNR taip:
    1. Ląstelę padėkite į 42 °C 2 min.
    2. Perkelkite ląsteles ant ledo 3 min.
  7. Atliekant apdorojimą terminiu šoku, pipete supilkite 900 μl LB sultinio į anksčiau paženklintus sterilius mėgintuvėlius ir įdėkite juos į 37 °C orbitinę purtytuvą, kad pašildytumėte.
  8. Sudėkite karščio paveiktas ląsteles į mėgintuvėlius, kuriuose yra 900 μl iš anksto pašildyto LB sultinio.
  9. Auginkite ląsteles švelniai purtydami (120 aps./min.) 1 val.
  10. Perkelkite ląsteles į anksčiau paženklintus centrifugos mėgintuvėlius. Ląstelių granulės 2 minutes mikrocentrifugoje, naudojant 5000 aps./min.
  11. Pašalinkite supernatantą. Pakartotinai suspenduokite ląsteles 100 μl LB sultinyje ir lėkštelėse, tada ant anksčiau pažymėtų LB/ampicilino plokštelių.
  12. Auginkite ląsteles per naktį 37 °C inkubatoriuje.

Ląstelių augimas (gali būti atliktas mokytojų padėjėjams iš anksto)

  1. Kiekvienam mutantui pažymėkite po 1 sterilų stiklinį mėgintuvėlį.
  2. Vieną koloniją pasėkite į 1 ml LB/ sultinio, papildyto 100 μg/ml ampicilino. Auginkite ląsteles 5-6 valandas. orbitinėje purtyklėje 37 °C temperatūroje, intensyviai kratant (280 aps./min.).
  3. Kiekvienam mutantui pažymėkite 1 sterilią 120 ml Erlenmejerio kolbą.
  4. Naudokite 100 μl ląstelių iš „2 žingsnio“, kad pasėtumėte 40 ml LB sultinio, papildyto 100 μg/ml ampicilino kiekvienam mutantui.
  5. Auginkite šias ląsteles per naktį energingai purtydami (280 aps./min.).
  6. Ląstelės gali būti surenkamos (10 min. centrifugavimas su 5000 x g; pašalinti supernatantą) ir laikomos -20 °C temperatūroje.

Plazmidžių gryninimas iš E. coli ląstelių

Protokolas priklauso nuo naudojamo rinkinio ir bus pateiktas laboratorijoje. Pagrindinės apžvalgos ieškokite 47 p.

Agarozės gelio elektroforezė

  1. Pasverkite 1 g agarozės ir įdėkite ją į užkimštą Erlenmejerio kolbą.
  2. Naudodami graduotą cilindrą, įpilkite 100 ml 1 x TAE buferio.
  3. Kaitinkite 1 minutę mikrobangų krosnelėje, sukite kolbą ir trumpam atvėsinkite po vandeniu.
  4. Įpilkite 10 μl EtBr (dėvėkite pirštines. EtBr yra mutageninis); sukamoji kolba maišymui.
  5. Supilkite skystį į gelio kasetę ir nustatykite šukas. Užtrunka apie 20 min., kol agarozės gelis sustings.
  6. Kai gelis sustings, įdėkite mėginį ir 10 μl molekulinės masės kopėčių (su 2 μl įkrovimo dažų). Paleiskite gelį 20 minučių su 100 V įtampa.
  7. Nufotografuokite gelį naudodami gelio dokumentavimo sistemą.

UV spektroskopija (šis protokolas skirtas nanodrop spektrometrui; įprastiniam UV spektrometrui reikia naudoti didelius DNR kiekius)

  1. Įjunkite spektrometrą ir pasirinkite nukleorūgščių tyrimo sąranką.
  2. Tuščias spektrometras su 2 μl Millipore vandens.
  3. Išmatuokite vandens mėginio absorbciją, kad įsitikintumėte, jog spektrometras yra švarus.
  4. Plazmidinės DNR koncentracijai išmatuoti naudokite 2 μl plazmidės DNR mėginio.
  5. Įrašykite DNR koncentraciją mg/ml.

Pastabos instruktoriui

5 skyriuje pateiktas eksperimentas skirtas išskirti plazmidinę DNR, turinčią mutantinę ykkCD tetraciklino jutiklio RNR, naudojant E. coli ląstelės. Tas pats protokolas su minimaliomis modifikacijomis gali būti naudojamas bet kurios DNR valymui iš plazmidės E. Autorių įstaigoje studentai buvo aprūpinti skystomis ląstelių kultūromis, kuriose buvo mutantų toksinų jutiklio DNR. Transformaciją ir ląstelių augimą atliko mokytojų padėjėjai, nesant studentų. Ši sąranka taupo laboratorijos laiką, tačiau šiek tiek apriboja studentų supratimą apie veiksmus, kurių reikia norint sukurti plazmidinę DNR. Jei pageidaujama, gali būti paskirta atskira laboratorijos sesija, kurioje studentai atlieka transformaciją ir ląstelių augimą. Bet koks parduodamas E. coli Dh5α kompetentinga ląstelė tinka transformacijai. The E. coli padermė ir protokolas, kad jie būtų kompetentingi transformuoti, kuriuos naudoja autoriai, galima gauti paprašius. Plasmid Midi Kit iš Qiagen puikiai tinka plazmidės DNR išgryninimui, tačiau panašūs kitų pardavėjų rinkiniai gali gerai veikti. Norint užtikrinti, kad būtų pagamintas pakankamas plazmidės DNR kiekis, rekomenduojamas vidutinio dydžio plazmidės gryninimo rinkinys.

Prelaboratoriniai klausimai plazmidės paruošimui

Apibrėžkite šiuos terminus.

  1. Transformacija

  2. Agarozės gelis

  3. Superspiralinė DNR vs linijinė DNR

  4. Beer-Lamber įstatymas. Apibrėžkite kiekvieną lygties terminą.

  5. Kokių atsargumo priemonių reikia laikytis tvarkydami EtBr ir kodėl?

Laboratorijos ataskaitos metmenys ir taškų paskirstymas

1. Keli sakiniai, apibrėžiantys šio eksperimento tikslą/tikslą. Nurodykite, kokį vaidmenį šis žingsnis atlieka mini projekte (5 tšk.).

2. Trumpai apibūdinkite strategiją, naudojamą plazmidinės DNR išgryninimui iš ląstelių (10 tšk.). (Kokie yra pagrindiniai teršalai? Kokios jūsų plazmidinės DNR savybės išnaudojamos gryninimo metu ir kaip? Kuo skiriasi jūsų plazmidinė DNR ir kitos ląstelės makromolekulės?)

3. Nubraižykite išsamią plazmidės paruošimo schemą. Įsitikinkite, kad nurodėte kiekvieno buferio tūrį, kurį reikia pridėti, ir kurioje frakcijoje (tirpioje / netirpioje arba kolonėlėje / filtrate) yra plazmidės DNR ir kuri frakcija yra išmetama (20 tšk.).

4. Apibrėžkite/apibūdinkite transformaciją (5 tšk.).

5. Apibrėžkite / apibūdinkite DpnI skaidymo vaidmenį Quickchange procese (5 taškai).

Plazmidės paruošimo trikčių šalinimas

6. Jūsų kolega turėjo reikšmingą genomo DNR užteršimą plazmidės paruošime. Jūsų nuomone, kuriame (-iuose) pasirengimo etape (-iuose) buvo padaryta klaida? Trumpai paaiškinkite (5 tšk.).

Elektroforezės uždavinių rinkinys

1. (9 tšk.) Apibūdinkite, kokį poveikį šie turėtų DNR agarozės gelio elektroforezei. Kokybiškai naudokite lygtį v = qE/f kaip paaiškinimo dalį.

  1. Agarozės koncentracija padidinama nuo 1% iki 1,5%.
  2. Elektroforezės įtampa sumažinama nuo 100 voltų iki 60 voltų.
  3. pH buvo pakeistas iš maždaug neutralių į rūgštines sąlygas (pH = 3,0).

2. (5 tšk.) Jūsų prašoma atskirti 1 μg DNR ant agarozės gelio. Mėginyje turi būti 1 x TAE buferis, o mėginio dydis yra 10 μl. Kokius tūrius naudotumėte ruošdami šį mėginį: 0,5 μg/μl DNR pradinio tirpalo, 10 x TAE buferio ir vandens.

3. (9 tšk.) Kelių DNR gabalėlių dydžiui nustatyti buvo paleistas agarozės gelis. „M“ juosta turi 11 pakopų DNR dydžio kopėčias (viršuje 10 kb, 9 kb, 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb apačioje). Išmatuokite nuvažiuotus atstumus milimetro tikslumu. Sukurkite log(kb) ir DNR kopėčių nuvažiuoto atstumo diagramą.

  • a) Naudodami diagramą, nustatykite DNR dydį (kb) 4 ir 1 juostose.
  • (b) Didžioji juosta 1 juostoje iš tikrųjų yra žiedinė plazmidinė DNR, kurios dydis yra toks pat kaip linijinė DNR 4 juostoje. Trumpai paaiškinkite, kodėl žiedinė plazmidė gelyje keliauja toliau nei linijinė DNR.